一种表达生物素化抗原的方法

摘要

本发明公开了一种表达生物素化抗原的方法，其使用一种表达载体，该表达载体携带两个串联的开放阅读框，每个开放阅读框都有自己独立的启动子，前面一个开放阅读框具有多克隆位点MCS，用于插入外源基因序列，表达出与谷胱甘肽-S-转移酶C端基因融合的融合蛋白，后面一个开放阅读框则在第一个开放阅读框表达的同时，表达大肠杆菌生物素连接酶；当插入的外源基因序列融合有大肠杆菌生物素连接酶底物序列基因GGT GGC GGT CTT AAT GAT ATT TTT GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA时，表达的外源蛋白通过大肠杆菌体内的代谢反应被生物素化。

权利要求

1.一种表达生物素化抗原的方法，其特征在于：使用一种表达载体，该表达载体携带两个串联的开放阅读框，每个开放阅读框都有自己独立的启动子，第一个开放阅读框具有日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶基因，其C端具有多克隆位点MCS，用于插入外源基因序列，表达出与谷胱甘肽-S-转移酶基因融合的融合蛋白，后面一个开放阅读框则在第一个开放阅读框表达的同时，表达大肠杆菌生物素连接酶；当插入的外源基因序列融合有大肠杆菌生物素连接酶底物序列基因GGT GGC GGT CTT AAT GAT ATT TTT GAG GCT CAG AAA ATC GAA TGG CAC GAA时，表达的外源蛋白通过大肠杆菌体内的代谢反应被生物素化。

2.根据权利要求1所述的表达生物素化抗原的方法，其特征在于，所述第一个开放阅读框具有pTac启动子。

3.根据权利要求1所述的表达生物素化抗原的方法，其特征在于，所述后面一个开放阅读框具有T7启动子。

4.根据权利要求1所述的表达生物素化抗原的方法，其特征在于，所述两个串联的开放阅读框之间通过以下间隔碱基序列隔开：ATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAAT。

5.根据权利要求1所述的表达生物素化抗原的方法，其特征在于，所述表达载体图谱如附图1所示。

6.根据权利要求5所述的表达生物素化抗原的方法，其特征在于，所述外源基因序列为丙肝病毒HCV核心抗原N端1-130片段。

7.根据权利要求6所述的表达生物素化抗原的方法，包括以下步骤：

步骤1：设计引物：

HCV-1：5-CATgC ggATCC ATgAgCACAAATCCAAAACCC-3；

HCV-2：5-AAA AAT ATC ATT CAg ACC gCC ACCgAAgCCgCATgTgAgggTATC-3；

HCV-3：5-TTC gTg CCA TTC gAT TTT CTg AgC CTCAAAAATATCATTCAgACC gCC-3；

HCV-4：5-TCgCA AgATCT TTA TTC gTg CCA TTC gAT TTT-3；

步骤2：以HCV核心抗原基因为模板，以引物HCV-1和HCV-2为引物进行第一次PCR扩增；

步骤3：以步骤2的PCR产物为模板，以引物HCV-1和HCV-3为引物进行第二次PCR扩增；

步骤4：以步骤3的PCR产物为模板，以引物HCV-1和HCV-4为引物进行第三次PCR扩增，得到融合了大肠杆菌生物素连接酶底物序列基因的HCV核心抗原N端1-130片段基因序列；

步骤5：使用限制性内切酶BamH I和Hind III切割HCV核心抗原N端1-130片段基因序列和生物素化表达载体，取酶切回收产物进行连接反应并转化大肠杆菌DH5α；

步骤6：鉴定出正确的克隆，提取质粒后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS。

说明书

一种表达生物素化抗原的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种表达生物素化抗原的方法，用于抗原的体内生物素化标记。

背景技术

[0002] 目前，现行市售的的抗体试剂盒中，间接ELISA(酶联免疫吸附剂测定)是主流检测技术。但是，间接法所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和IgA类，这是由酶标二抗所决定的。因而影响了抗体测定的灵敏度。目前，为提高抗体测定的灵敏度，间接法ELISA试剂盒正逐步地向双抗原夹心法转变。但由于一些抗原的性质与结构较为特殊，如丙肝病毒HCV核心抗原含有较多的碱性氨基酸，化学标记后容易丧失抗原活性。因此，目前市场上并没有HCV抗体的双抗原夹心法检测试剂盒出售。

[0003] 近年新出现的一种抗原标记技术是将生物素连接酶(BirA酶)底物肽(BSP)序列与抗原蛋白融合。然后BSP序列可在BirA酶的作用下生物素化。这种方法较温和不影响抗原活性。同时，由于酶促反应的高度特异性，仅标记特定的识别序列而不标记其它蛋白。因此，即使在后续的蛋白纯化过程中，即使残留有少量杂质蛋白也不会对测定造成干扰，提高了试剂盒的特异性。但BirA酶在大肠杆菌中的天然活性很低。这种方法需要将表达抗原纯化后使用重组的BirA酶进行体外标记，费时费力。

[0004] 因此，现有技术有待于完善和发展。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的问题在于提供一种表达生物素化抗原的方法，可直接进行抗原的体内标记。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

[0007] 一种表达生物素化抗原的方法，其中：使用一种表达载体，该表达载体携带两个串联的开放阅读框，每个开放阅读框都有自己独立的启动子，前面一个开放阅读框具有日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶基因(GST)，其C端具有多克隆位点MCS，用于插入外源基因序列，表达出与谷胱甘肽-S-转移酶基因融合的融合蛋白，后面一个开放阅读框则在第一个开放阅读框表达的同时，表达大肠杆菌生物素连接酶；当插入的外源基因序列融合有大肠杆菌生物素连接酶底物序列基因GGT GGC GGT CTT AAT GAT ATT TTT GAG GCT CAG AAAATC GAA TGG CAC GAA时，表达的外源蛋白通过大肠杆菌体内的代谢反应被生物素化。

[0008] 所述的表达生物素化抗原的方法，其中，所述第一个开放阅读框为pTac启动子。

[0009] 所述的表达生物素化抗原的方法，其中，所述后面一个开放阅读框为T7启动子。

[0010] 所述的表达生物素化抗原的方法，其中，所述两个串联的开放阅读框之间通过以下间隔碱基序列隔开：

[0011] ATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAAT。

[0012] 所述的表达生物素化抗原的方法，其中，所述表达载体图谱如附图1所示。

[0013] 所述的表达生物素化抗原的方法，其中，所述外源基因序列为丙肝病毒HCV核心抗原N端1-130片段。

[0014] 所述的表达生物素化抗原的方法，包括以下步骤：

[0015] 步骤1：设计引物：

[0016] HCV-1：5-CATgC ggATCC ATgAgCACAAATCCAAAACCC-3

[0017] HCV-2：5-AAA AAT ATC ATT CAg ACC gCC ACCgAAgCCgCATgTgAgggTATC-3[0018] HCV-3：5-TTC gTg CCA TTC gAT TTT CTg AgC CTCAAAAATATCATTCAgACC gCC-3[0019] HCV-4：5-TCgCA AgATCT TTA TTC gTg CCA TTC gAT TTT-3；

[0020] 步骤2：以HCV核心抗原基因为模板，以引物HCV-1和HCV-2为引物进行第一次PCR扩增；

[0021] 步骤3：以步骤2的PCR产物为模板，以引物HCV-1和HCV-3为引物进行第二次PCR扩增；

[0022] 步骤4：以步骤3的PCR产物为模板，以引物HCV-1和HCV-4为引物进行第三次PCR扩增，得到融合了大肠杆菌生物素连接酶底物序列基因的HCV核心抗原N端1-130片段基因序列；

[0023] 步骤5：使用限制性内切酶BamH I和Hind III切割HCV核心抗原N端1-130片段基因序列和生物素化表达载体，取酶切回收产物进行连接反应并转化大肠杆菌DH5α；

[0024] 步骤6：鉴定出正确的克隆，提取质粒后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS。

[0025] 采用上述方案，本发明不但在抗原蛋白序列上融合一段BSP序列，并且使抗原蛋白同时与大肠杆菌生物素连接酶在大肠杆菌细胞内表达，使重组抗原在大肠杆菌内部表达时，就可以通过同时表达的大肠杆菌生物素连接酶，被特异性的生物素化，并且保留其生物和免疫活性。

附图说明

[0026] 图1为本发明的空白体表达载体图谱；

[0027] 图2是本发明插入HCV C130抗原基因后的表达载体图谱；

[0028] 图3是本发明的HCV核心抗原N端1-130aa片段的生物素化表达图谱；

[0029] 图4是本发明的HCV核心抗原N端1-130aa片段的生物素化表达结果。

具体实施方式

[0030] 本发明的重组质粒表达载体上具有两个开放阅读框，可以同时表达两个不同的蛋白(抗原蛋白和大肠杆菌生物素连接酶)。

[0031] 表达后通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)可以检测到两个蛋白的表达，将SDS-PAGE后的电泳蛋白转到硝酸纤维素膜上可以检测抗原的抗原活性和被生物素化与否。

[0032] 下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。

[0033] 实施例1

[0034] 重组质粒表达载体构建方法

[0035] 1、设计引物如下：

[0036] P1：5-CCA TCT TAG TAT ATT AGT TAA GTA TAA GAA GGA GATATA CAA TGA AGG ATA ACA CCG TGC C-3

[0037] P2：5-CATGC CTCGAG TTA TTTTTCTGCACTACGCAGGG-3

[0038] P3：5-ATA CGA CTC ACT ATA GGG GAA TTG TGA GCG GAT AACAAT TCC CCA TCT TAG TAT ATT AGT-3

[0039] P4：5-CAG AAA GTA ATC GTA TTG TAC ACG GCC GCA TAA TCGAAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG-3

[0040] P5：5-CAT GTC GAC AAG CTT GCG GCC GCA TAA TGC TTA AGTCGAACA GAAAGTAAT CGTATT G-3

[0041] 2、接种大肠杆菌DH5a，在37℃下振摇培养至生长饱和；

[0042] 3、以P1，P2为引物，加入大肠杆菌DH5a菌液1ul为模板，使用高保真Taq酶PCR扩增BirA基因；

[0043] 4、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，PCR产物A；

[0044] 5、使用PCR产物A为模板，P2，P3为引物，进行PCR扩增；

[0045] 6、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，PCR产物B；

[0046] 7、使用PCR产物B为模板，P2，P4为引物，进行PCR扩增；

[0047] 8、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，PCR产物C；

[0048] 9、使用PCR产物C为模板，P2，P5为引物，进行PCR扩增；

[0049] 10、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，PCR产物D；

[0050] 11、使用限制性内切酶Sal I和Xho I对PCR产物D进行酶切，同时使用相同的限制性内切酶酶切载体质粒pTac-GST并去磷酸化，酶切结束后琼脂糖凝胶电泳回收；

[0051] 12、取酶切回收产物，做DNA连接反应；

[0052] 13、制做大肠杆菌DH5a感受态细胞，并转化；

[0053] 14、将转化平板取出，挑取单个克隆至LB培养基进行培养并提取质粒；

[0054] 15、将提取的质粒进行琼脂糖电泳，筛选出比原质粒分子量增大的质粒，然后进行DNA测序。确定插入片段的序列正确。

[0055] 获得的表达载体图谱如图1所示。

[0056] 实施例2

[0057] 重组质粒表达载体的生物素化表达

[0058] 以HCV核心抗原N端1-130aa片段的生物素化表达为例，将HCVC130抗原基因插入表达载体的多克隆位点。

[0059] HCV核心抗原N端1-130片段的生物素化表达方法：

[0060] 1、设计引物：

[0061] HCV-1：5-CATgC ggATCC ATgAgCACAAATCCAAAACCC-3

[0062] HCV-2：5-AAA AAT ATC ATT CAg ACC gCC ACCgAAgCCgCATgTgAgggTATC-3[0063] HCV-3：5-TTC gTg CCA TTC gAT TTT CTg AgC CTCAAAAATATCATTCAgACC gCC-3[0064] HCV-4：5-TCgCA AgATCT TTA TTC gTg CCA TTC gAT TTT-3

[0065] 2、以HCV核心抗原基因为模板，以引物HCV-1，HCV-2为引物进行第一次PCR扩增；

[0066] 3、以步骤2的PCR产物为模板，以引物HCV-1和HCV-3为引物进行第二次PCR扩增；

[0067] 4、以步骤3的PCR产物为模板，以引物HCV-1和HCV-4为引物进行第三次PCR扩增；得到融合了大肠杆菌生物素连接酶底物序列基因的HCV核心抗原N端1-130片段基因序列；

[0068] 5、使用限制性内切酶BamH I和Hind III切割HCV核心抗原N端1-130片段基因序列和生物素化表达载体，取酶切回收产物进行连接反应并转化大肠杆菌DH5α；

[0069] 6、鉴定出正确的克隆，提取质粒后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS。

[0070] 表达载体图谱如图2所示，其中：

[0071] HCV C130抗原基因与谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathion S Transferase，GST)基因融合在一起，其中GST基因在5’端，HCV C130抗原基因在3’端。在HCV C130抗原的3’端又融合有BirA酶底物序列(BirA Substrate Peptide，BSP)的基因序列。整个融合基因位于Tac启动子的3’端，构成第一个开放阅读框；

[0072] 在第一个开放阅读框的下游，有T7启动子和Lac操纵基因。然后是大肠杆菌生物素连接酶(BirA)基因序列，构成第二个开放阅读框；

[0073] 表达菌株为Roseta(DE3)plysS。

[0074] 表达步骤：

[0075] 1、以1∶2000的比例接种表达菌至含100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml的氯霉素的LB培养基中，37℃振摇培养(200转/分)；至OD600处的吸光度为0.8-1；

[0076] 2、以1∶100的比例将菌液转接至含100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml的氯霉素的LB培养基中，37℃振摇培养(200转/分)；至OD600处的吸光度为0.6左右时加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度0.1mM；22℃诱导16h即可。

[0077] 表达图谱如图3所示，其中：

[0078] 1号泳道表达菌为诱导前；

[0079] 2号泳道为表达菌诱导后；

[0080] 3号泳道为空白Roseta(DE3)plysS菌诱导后。

[0081] 实施例3

[0082] 表达产物的鉴定：

[0083] 表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜上，在37℃下封闭2h(PBS缓冲液，3％脱脂奶粉，0.05％吐温20)。使用封闭液稀释的抗HCV核心抗原单克隆抗体(抗原性检测)或辣根过氧化物酶标记亲合素(生物素化检测)，在4℃下作用过夜，PBST(PBS缓冲液，0.05％吐温20)洗四次。进行抗原性检测时，继续使用封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，在37℃下作用2h。最后DAB(二氨基联苯胺)显色，PBS终止反应观察结果。

[0084] 结果如图4所示，其中：

[0085] 1号泳道表达菌为抗原性检测；

[0086] 2号泳道为表达菌生物素化检测。

[0087] 表达后通过SDS-PAGE可以检测到两个蛋白的表达，将SDS-PAGE后的电泳蛋白转到硝酸纤维素膜上可以检测抗原的抗原活性和被生物素化与否。

[0088] 本发明不但在抗原蛋白序列上融合一段BSP序列，并且使抗原蛋白同时与大肠杆菌生物素连接酶在大肠杆菌细胞内表达。使重组抗原在大肠杆菌内部表达时，就可以通过同时表达的大肠杆菌生物素连接酶，被特异性的生物素化，并且保留其生物和免疫活性。

[0089] 本发明的重组质粒表达载体上具有两个开放阅读框，可以同时表达两个不同的蛋白。

[0090] 此外，还可以进一步引入表达的调控元件调控两个开放阅读框的表达。对BirA酶序列进行优化，去掉不需要的序列。

[0091] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。