一种利用电穿孔辅助基因转移的方法及装置

摘要

本发明属眼科医学技术领域，涉及一种利用电穿孔辅助基因转移的方法及装置，本发明采用双勺型电极装置，确定适宜的电刺激脉冲条件，利用电穿孔的方法将含有绿色荧光蛋白的质粒转染视网膜色素上皮细胞层。本发明方法借助电场，能有方向性的控制基因眼内转染，同时避免了病毒转基因所带来的细胞免疫源性和潜在致病性、致瘤性等弊端，采用的双勺型电极装置能降低眼球的副损伤。本发明方法具有操作便捷、高效等优点，并且可同时实现多种质粒的转染，弥补了传统方法的不足之处。本发明为眼科研究的基因导入提供了可参考的方法。

权利要求

1.一种用于电穿孔辅助基因转移方法的专用电极装置，其特征在于，所述专用电极装置为双勺型,其中角膜侧电极为大圆勺形，与角膜面积、曲率相符，巩膜侧电极为小圆勺形，置于质粒转移部位，并且采用金作为电极的导电接触面材料，铜铝合金作为支撑材料，外层涂以树脂作为绝缘层；

所述的电穿孔辅助基因转移的方法中，包括采用所述的专用电极装置确定适宜的电刺激脉冲条件，利用电穿孔的方法将含有绿色荧光蛋白的质粒转染视网膜色素上皮细胞层，其中，所述适宜的电刺激脉冲条件为：以电场10V/mm，脉宽99ms，脉冲间期0.5s，5个脉冲为一组，所述的方法包括下述步骤：

1)设计和制作电极，

根据眼科常用角膜半径和曲率参数制作系列不同规格的电极；

2)构建和制备含有绿色荧光蛋白基因的质粒，其中，含有绿色荧光蛋白基因的质粒由目的基因cDNA与pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO载体质粒连接而得；

3)设计电刺激脉冲条件

在安全电场的范围内，设计电压范围5V至35V的七组电脉冲刺激条件；

4)电穿孔辅助基因转染

将电极连接电刺激发生器，在电穿孔刺激模式下，将带负电荷的质粒在内正外负的电场作用下，转染常规处理的视网膜色素上皮细胞层；

所述的双勺型电极根据各实验动物不同周龄的角膜半径其规格分别为：小鼠：1.25mm、1.5mm、和1.75mm电极半径；

大鼠：2.5mm、3.0mm、和3.5mm电极半径；

豚鼠：3.0mm、3.5mm、和4.0mm电极半径；

新西兰大白兔：4.5mm、5.0mm、和5.5mm电极半径；

猴子：12mm、14mm、和16mm电极半径；

临床电极：8mm、10mm、和12mm电极半径。

说明书

一种利用电穿孔辅助基因转移的方法及装置

技术领域

[0001] 本发明属眼科医学技术领域，涉及视网膜基因转移的方法，具体涉及一种在体利用电穿孔辅助基因转入视网膜色素上皮细胞层的方法。

背景技术

[0002] 研究显示，以视网膜色素变性、增殖性玻璃体视网膜病变和老年性黄斑变性等为代表的一类主要累及视网膜色素上皮细胞层的病变是目前世界上主要的致盲眼病之一。虽然它们的发病机制各不相同，其包括基因缺陷，视网膜色素上皮细胞的异常增殖及代谢紊乱等，但它们累及的病变部位都位于视网膜色素上皮细胞层。

[0003] 由于视网膜色素上皮细胞层存在于封闭的眼球后半球部视网膜的最内层，视网膜还具有血眼屏障阻断来自血液的物质传输，这些特殊的结构限制了对于视网膜色素上皮细胞病变的给药途经。临床治疗中，传统的给药方式，如眼表给药，药物无法到达球后部的病变视网膜色素上皮细胞层；口服或者静脉滴注药物，药物进入血液循环后，往往在血眼屏障处被阻断；通过手术，经玻璃体腔注射药物到视网膜前或经巩膜注射入视网膜下，药物虽可直接弥散到病变的视网膜，但受药物半衰期的限制，对于上述的各类累及视网膜色素上皮细胞层的慢性疾病来说，显然不宜反复注射以维持药物浓度，因而难以达到长效治疗的目的；况且，频繁地玻璃体腔内注射或视网膜下腔注射药物，会引起诸多并发症，如眼内感染，损伤晶状体或者引起局部视网膜脱离等。所以，克服现有治疗方式所存在的弊端是近年来眼科亟待解决的难题。

[0004] 随着生命科学与技术的飞速发展，以及人类对疾病的认识不断深入，越来越多的证据表明许多疾病都与基因的结构或功能改变有关，因而从基因水平治疗上述疾病引起研究者的关注。基因治疗是指通过操作遗传物质(无论是人类本身的或外源的)来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的错乱、杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等方法，从而达到治病的目的。

[0005] 目前国内外研究者正在尝试的方案有直接基因治疗(包括病毒载体介导或非病毒载体介导)和转基因细胞移植(替代病变细胞和/或分泌神经营养因子)等。这些方案已经在眼病动物模型上取得了一定的研究进展，但是也不可避免的存在一些自身缺陷。本领域公认，较为理想的辅助基因转入视网膜色素上皮细胞层的方法，应该具有高效性，低潜在致病性，较好的靶向性并且应能根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因在适当的组织器官内以适当的水平或方式表达，

[0006] 电穿孔方法是一种物理性、非病毒性的转基因方法，其利用特定的脉冲电场瞬时可逆性地改变细胞膜的通透性，形成膜上直径20～100nm范围的开孔通道，使基因物质转入细胞。自Mir(1)报道电穿孔辅助基因治疗在活体哺乳类动物骨骼肌的成功应用以来，该方法已陆续在皮肤、肝肾等活体组织中得到运用。电穿孔方法具有操作简单、安全、转染率不受细胞增殖性的影响、靶向性强等好处，但是由于不同组织细胞的电特性差异，细胞膜的穿孔率和穿孔程度都有电场特征参数的依赖性，因此合理设计电极，确定合适的电脉冲条件，从而实现对目的细胞有效转基因的同时尽量减少对周围其他组织的损伤。对于皮肤肌肉和肝肾组织来说，设计电极相对简单。相比之下，其在眼部的设计应用却较为困难，首先，眼球本身的形状意味着简单的平板式电极将无法胜任；其次，视网膜组织内细胞层次结构复杂，因此眼部的电穿孔转染需要特制电极。有研究引入该方法辅助治疗性基因转染视网膜神经节细胞，设计了专用的勺镊式电极，并成功地为大鼠眼球营造了适宜的电场刺激条件，并获得了国际同行的认可和支持(2～3)。这些研究动向，说明了电穿孔辅助基因治疗在视网膜及其他学科领域的应用日益得到推广，是一项值得深入研究的新方法。

[0007] 与本发明相关的现有技术有下述文献(分别被引用于上文中)。

[0008] 1.Mir LM，Bureau MF，Gehl J et al.High-efficiency gene transfer into skeletalmuscle mediated by electric pulses.Proc Natl Acad Sci，1999，6(4)：508-514

[0009] 2.Mo XF，Yokoyama A，Oshitari T，et al.Rescue of axotomized retinal ganglioncells by BDNF gene electroporation in adult rats.Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43(7)：2401-2405

[0010] 3.Ishikawa H，Takano M，Matsumoto N，et al.Effect of GDNF gene transfer intoaxotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with acontact lens-type electrode.Gene Therapy.2005；12(4)：289-298

发明内容

[0011] 本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，提供一种利用电穿孔辅助基因转移的方法及装置。尤其是一种利用电穿孔辅助基因转入视网膜色素上皮细胞层的专用电极装置及脉冲参数。

[0012] 本发明采用专用的电极装置，确定最适宜的电刺激脉冲条件，利用电穿孔的方法将含有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的质粒转染视网膜色素上皮细胞层。

[0013] 本发明方法包括下述步骤：

[0014] 1、设计和制作电极

[0015] 根据眼科常用实验动物和临床患者的角膜半径和曲率参数制作一系列不同规格的电极，

[0016] 本发明中，所述的实验动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、新西兰大白兔、猴子。

[0017] 本发明中，根据每种动物不同周龄的角膜半径变化，为每种动物设计制作3组电极，具体规格如下(单位：电极半径m)：

[0018] 小鼠：1.25mm、1.5mm、1.75mm；

[0019] 大鼠：2.5mm、3.0mm、3.5mm；

[0020] 豚鼠：3.0mm、3.5mm、4.0mm；

[0021] 新西兰大白兔：4.5mm、5.0mm、5.5mm；

[0022] 猴子：12mm、14mm、16mm；

[0023] 临床电极：8mm、10mm、12mm。

[0024] 2、构建和制备含有目的基因的质粒

[0025] 从gene bank中查得目的基因序列并合成基因片段，设计并合成引物，利用PCR反应扩增目的基因，电泳并回收得到目的基因的cDNA。然后按NT-GFP Fusion TOPO TAExpression Kits(Invitrogen公司)所提供的说明书进行目的基因cDNA与pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO载体质粒的连接，转化，并PCR筛选菌落，然后对阳性菌落行质粒小抽，测序；将构建的质粒稀释至2.5μg/μl浓度备用。

[0026] 3、设计电刺激脉冲条件

[0027] 在安全电场的范围内，设计电压范围从5V至35V的七组电脉冲刺激条件，通过视网膜铺片、切片、分子生物学等方法检测，确定以电场10V/mm，脉宽99ms，脉冲间期0.5s，5个脉冲为一组的参数条件为视网膜色素上皮细胞层最适宜电脉冲刺激条件。

[0028] 4、动物实验

[0029] 实验动物常规处理，0.5％托吡卡胺滴眼散瞳，0.4％盐酸奥布卡因麻醉眼表组织，分离上方结膜及Tenon’囊至球后区，手术显微镜直视下自下方角膜缘外1mm处刺入1ml无菌注射器针头，形成巩膜上针孔大小的隧道，再用33G平钝针头微量进样器沿巩膜隧道进入玻璃体腔，直至视乳头上侧2～3 PD的视网膜时轻轻进入视网膜下腔，注射4μl质粒或TE Buffer。

[0030] 5、电穿孔辅助基因转染

[0031] 将专用的电极装置电极连接电刺激发生器，其正极处于实验动物上方分离的球后区的病变区，负极覆盖角膜(图2)，分别在上述电穿孔刺激模式下，将带负电荷的质粒在内正外负的电场作用下，转染到视网膜色素上皮细胞层。

[0032] 本发明以在体电穿孔辅助BDNF-GFP基因转染幼年RCS大鼠视网膜色素上皮细胞层作为实例，获得最佳电脉冲刺激条件，即电场10V/mm，脉宽99ms，脉冲间期0.5s，5个脉冲为一组，并建立了相应的技术体系，能满足高效率、低副作用转基因研究的需求。

[0033] 本发明方法中所使用的专用电极装置为双勺型，采用金作为电极的导电接触面材料，铜铝合金作为支撑材料，外层涂以树脂作为绝缘层，并通过测量以保证所得电极形状的规格，双勺型的电极(图1)其两极通过插头与电刺激发生器连接，正、负极可以根据需要调整。本发明中，双勺型电极的角膜侧电极主要与角膜面积、曲率相符；巩膜侧电极略小，为小圆勺形，仅置于质粒转移部位，可以减少球后区的处理分离范围并且降低对其他眼周组织的损伤。

[0034] 本发明优点在于：

[0035] (1)电极合适：合适的电极是眼内基因转染成功的关键，与现有技术的电极比较，已有报道的电极多为较简单的平板状电极，适用对象多为肌肉、皮肤等组织，因眼球结构和形状特殊，为提高眼球组织间电场的稳定性，本发明将电穿孔所需的电极设计为双勺型，并且将巩膜侧电极设计为小圆勺，能保证电极与眼球紧密帖覆的同时减少球后的处理分离区域，从而降低副损伤。

[0036] (2)确定最适电脉冲参数：电穿孔是一种物理性转基因方法，由于不同组织细胞的电特性差异，细胞膜的穿孔率和穿孔程度都有电场特征参数的依赖性，本发明通过对多组参数的检测，确定了最适合视网膜色素上皮细胞的电脉冲参数，即10V/mm，脉宽99ms，脉冲间期0.5s，5个脉冲为一组。

[0037] 本发明方法借助电场，能有方向性的控制基因眼内转染，同时避免了病毒转基因所带来的细胞免疫源性和潜在致病性、致瘤性等弊端。本发明方法具有操作便捷、高效等优点，并且可同时实现多种质粒的转染，弥补了传统转基因方法的一些不足之处。本发明为眼科研究的基因导入提供了新方法，并为眼病的基因治疗提供了新思路。

附图说明

[0038] 图1是本发明的双勺式电极图，

[0039] 其中，较大一侧电极为角膜侧电极，较小一侧为巩膜侧电极。

[0040] 图2是眼内显微手术和电极放置方法示意图。

[0041] 图3是视网膜切片观察BDNF-GFP转染层次，

[0042] 其中，A为正常对照组，B为基因转染组，箭头所示部位为视网膜色素上皮细胞层，可见对照组视网膜色素上皮细胞层无特异性荧光表达，基因转染组可见特异性荧光[0043] 图4为荧光显微镜下视网膜铺片，可见荧光均匀清楚的分布于视网膜。

[0044] 图5为TUNEL凋亡检测可见基因转染组抗凋亡效果明显优于对照组。

具体实施方式

[0045] 本发明以在体电穿孔辅助BDNF-GFP基因转染遗传性视网膜色素变性动物模型幼年RCS大鼠视网膜色素上皮细胞层作为实例，详细阐述本发明。

[0046] 实施例1制备双勺型专用电极装置

[0047] 在常规眼科用电极装置基础上，采用金作为电极的导电接触面材料，铜铝合金作为支撑材料，外层涂以树脂作为绝缘层，并通过测量以保证所得电极形状的规格，双勺型的电极(图1)其两极通过插头与电刺激发生器连接，正、负极可以根据需要调整。双勺型电极的角膜侧电极为大圆勺形，主要与角膜面积、曲率相符；巩膜侧电极略小，为小圆勺形，仅置于质粒转移部位，可以减少球后区的处理分离范围并且降低对其他眼周组织的损伤。

[0048] 实施例2

[0049] 1.构建质粒载体

[0050] 已有质粒pRc/CMV BDNF包含小鼠BDNF cDNA，片段长750bp。设计并合成序列1、些列2的引物(5’-ATG ACC ATC CTT TTC CTT ACT ATG-3’及5’-CCA CTA TCT TCCCCT TTT AAT GG-3’)。PCR反应(94℃30s，57℃30s，72℃40s，循环30次)扩增目的基因，电泳并回收得到BDNF cDNA。然后按NT-GFP Fusion TOPO TA Expression Kits所提供的说明书进行BDNF cDNA与pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO载体质粒的连接，转化，质粒小抽，测序。测序证实后，用Endofree Plasmid Purification Maxi试剂盒大抽质粒，检测所得质粒OD260/OD280值，该比值大于1.8为合格，将合格的质粒稀释至2.5μg/μl的浓度。

[0051] 2.实验动物显微手术实验及电穿孔

[0052] 选取实验动物右眼作转然质粒实验眼，左眼转然TE Buffer作为对照眼，用量均为4μl，采用美国BTX公司的ECM830电穿孔仪，具体操作参照上述方法步骤部分。

[0053] 2.视网膜切片观察BDNF-GFP转染层次

[0054] 于试验后1周处理大鼠后取眼球，在角膜缘相应部位用缝线标记质粒转然范围，采用眼球固定液固定1天，在视神经平面水平剖开眼球，石蜡包埋后作常规切片，荧光显微镜下观察GFP主要分布于视网膜色素上皮细胞层(图3)

[0055] 3.视网膜铺片观察BDNF-GFP转染范围

[0056] 于术后1周行多聚甲醛灌注固定处理大鼠，取眼球后用4％多聚甲醛固定1h，剪除角膜，取出晶状体和玻璃体，完整剥离全视网膜平铺于载玻片上，按照四个象限剪成4瓣，甘油缓冲液封片，在荧光显微镜下可以观察到GFP的表达(图4)，主要分布于质粒注射部位的两个象限。

[0057] 4.Western blot检测BDNF蛋白的表达

[0058] 于术后1周后取视网膜，加入裂解液，超声粉碎，在4℃下12000rpm离心5min，取上清，Bradford法测定蛋白浓度。样品于100℃水浴8min。加样后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移蛋白至PVDF膜上，丽春红染色，见蛋白条带，用含5％脱脂奶粉的封闭液封闭1h，加一抗37℃孵育2h，洗膜，二抗37℃孵育1h，洗膜，DAB溶液显色，水洗膜终止反应，将膜用凝胶成像仪拍照并用天能GIS凝胶图像处理系统进行数据分析，以β-actin作为内参照，结果显示，实验眼在14、41kDa处分别出现条带(图5)，前者为视网膜内源性BDNF表达，后者为电穿孔辅助外源性BDNF-GFP表达，并且外源基因表达量远高于内源基因的表达。

[0059] 5.RT-PCR检测视网膜内BDNF mRNA的表达

[0060] 于术后3天将大鼠处死后取视网膜，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明进行逆转录，设计如下顺序3、4、5、6序列引物：上游：5’-GGAGAAGAGCGACCCACA-3’，下 游：5’-CGTTTCAGTGCCACATACC-3’，GAPDH引 物：上 游：
ATCCTGTACCACCAACTGCC，下游：CAGTGTAGGAAGCAGGCTGA，PCR反应条件为：94℃ 45s，56℃
45s，72℃ 1min，72℃延伸10min，26个循环。取5μl的PCR产物进行电泳，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参照。电泳后用凝胶成像系统提取图像，计算目的条带与GADPH条带的灰度相对比值，进行mRNA半定量分析，结果显示，实验眼和对照眼均有BDNF mRNA表达，并且实验眼表达量远高于对照眼。

[0061] 6.视网膜光感受器细胞存活状态的病理观察

[0062] 于术后1、2、3、4、5周取大鼠双眼作光镜观察，采用眼球固定液固定1d，石蜡包埋后作常规切片、HE染色。选择基因治疗眼和对照眼后极部相同部位的视网膜，观察光感受器细胞核数目，经统计学分析，在各时间点实验眼均较对照眼保留更多的光感受器细胞。

[0063] 7.TUNEL凋亡检测

[0064] 于术后1周检测各组视网膜外核层细胞凋亡情况，石蜡切片常规脱蜡，按照DAB凋亡试剂盒说明步骤进行实验，光学显徽镜下观察每视野中阳性凋亡细胞数目，核内出现棕黄色颗粒为阳性标记，观察认为治疗眼视网膜细胞的凋亡情况明显好于实验组。

[0065] 结果显示，采用双勺式电极，在视网膜色素上皮细胞最佳电刺激模式：电场10V/mm，脉宽99ms，脉冲间期0.5s，5个脉冲为一组作用下，将BDNF-GFP质粒转染至RCS大鼠的视网膜色素上皮细胞层，并通过包括视网膜切片HE染色计数、Western blot、RT-PCR、TUNEL凋亡检测等多种方法确定所述的转基因治疗可以有效延缓病程。本发明方法较现有技术，具有省时省力省经费、操作简单、可重复性强、定向转染、无毒副作用等优势。

[0066] 一种利用电穿孔辅助基因转移的方法及装置序列表

[0067] SEQUENCE LISTING

[0068] <110>复旦大学附属眼耳鼻喉科医院

[0069] <120>一种利用电穿孔辅助基因转移的方法及装置

[0070] <130>11

[0071] <160>6

[0072] <170>PatentIn version 3.1

[0073] <210>1

[0074] <211>24

[0075] <212>DNA

[0076] <213>动物

[0077] <400>1

[0078] atgaccatcc ttttccttac tatg 24

[0079] <210>2

[0080] <211>23

[0081] <212>DNA

[0082] <213>动物

[0083] <400>2

[0084] ccactatctt ccccttttaa tgg 23

[0085] <210>3

[0086] <211>18

[0087] <212>DNA

[0088] <213>动物

[0089] <400>3

[0090] ggagaagagc gacccaca 18

[0091] <210>4

[0092] <211>19

[0093] <212>DNA

[0094] <213>动物

[0095] <400>4

[0096] cgtttcagtg ccacatacc 19

[0097] <210>5

[0098] <211>20

[0099] <212>DNA

[0100] <213>动物

[0101] <400>5

[0102] atcctgtacc accaactgcc 20

[0103] <210>6

[0104] <211>20

[0105] <212>DNA

[0106] <213>动物

[0107] <400>6

[0108] cagtgtagga agcaggctga 20