丁羟甲苯和/或α-亚麻酸作为前体在制备辅酶Q10中的应用

摘要

本发明提供了丁羟甲苯和/或α-亚麻酸作为前体在微生物发酵制备辅酶Q10中的应用。以丁羟甲苯和α-亚麻酸为前体物质促进微生物转化生产CoQ10的研究为首次报道，推测丁羟甲苯为CoQ10的合成提供苯环结构，而α-亚麻酸与茄尼醇的结构有相似性，为CoQ10合成提供侧链，且丁羟甲苯是一种抗氧化剂，能保护辅酶Q10不被氧化。丁羟甲苯比对羟基苯甲酸的价格便宜，而α-亚麻酸也比茄尼醇的价格低，用于制备辅酶Q10将大大降低成本。

权利要求

1.丁羟甲苯和/或α-亚麻酸作为前体在微生物发酵制备辅酶Q10中的应用。

2.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以辅酶Q10产生菌接种于液体培养基，添加适量前体于25～28℃下培养24～36h，所得发酵液分离取菌丝体，于菌丝体中获得所述辅酶Q10。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所添加的前体为丁羟甲苯和茄尼醇的混合物，丁羟甲苯添加量为20～40mg/L、茄尼醇添加量为60～100mg/L。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：丁羟甲苯添加量为30mg/L、茄尼醇添加量为

70mg/L。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所添加的前体为丁羟甲苯和α-亚麻酸的混合物，丁羟甲苯添加量为20～40mg/L、α-亚麻酸添加量为60～100mg/L。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：丁羟甲苯添加量为30mg/L、α-亚麻酸添加量为70mg/L。

7.如权利要求4～6之一所述的应用，其特征在于所述辅酶Q10产生菌为鞘氨醇单胞菌CCTCC No：M 207084。

8.如权利要求4～6之一所述的应用，其特征在于所述应用如下：以鞘氨醇单胞菌CCTCC No：M 207084接种于液体培养基，添加前体于25～28℃下培养24～36h，得发酵液，发酵液分离取菌丝体，于菌丝体中获得所述辅酶Q10；所述液体培养基按如下配方配制：每

1000mL水加入葡萄糖10～20g、(NH4)2SO45～15g、KH2PO4 0.1～1.0g、Na2HPO4 .05～2.0g和MgSO4 0.1～1.0g，pH6.0～8.0。

说明书

丁羟甲苯和/或α-亚麻酸作为前体在制备辅酶Q10中的

应用

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及用于微生物发酵制备辅酶Q10的新前体——丁羟甲苯、α-亚麻酸，及其在微生物发酵制备辅酶Q10中的应用。(二)背景技术

[0002] 辅酶Q10具有很好的医学价值，已广泛用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗，药行业不断增长的需求，辅酶Q10的工业化生产将变得更加重要。

[0003] 辅酶Q10可以通过化学合成法、半化学合成法和微生物转化法生产[5]。目前制约生物发酵法工业化生产CoQ10的主要因素是微生物细胞不能高水平的生产并累积CoQ10，导致发酵产率低、生产成本较高。近年来，不少研究者用基因工程的方法来改造微生物和使用基因重组菌发酵生产CoQ10，但由于CoQ10合成途径复杂，构建CoQ10基因工程高产菌国内外至今尚未取得突破性进展。因此，添加前体物质或发酵促进物，对发酵条件进行优化，仍是提高CoQ10产量的主要手段。李英华、吕春茂等(《前体物质对烟草细胞辅酶Q10合成的影响》，烟草科技，2009，6：51～55)研究了前体物质对烟草细胞CoQ10合成的影响，结果表明，单独添加适当浓度的几种前体物质均能在一定程度上促进NC89烟草细胞生长和辅酶Q10合成。刘萍等(《前体物质对辅酶Q10生物合成的影响》，食品与发酵工业，2005.31(4)：1～5)用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces promb)研究了添加侧链供给前体茄尼醇及醌环供给前体对羟基苯甲酸对CoQ10产量的影响。结果显示，单独添加茄尼醇能达到最大产量
33.1mg/L，比对照提高了91％；对羟基苯甲酸也能提高CoQ10产量。此外，L-半胱氨酸、蛋氨酸、维生素B1等也可以提高CoQ10产量(蒋世云，余龙江，申晓林，熊欣，简艳，《芳香族氨基酸对沼泽红假单胞菌合成CoQ10的影响》，药物生物技术，2008，15(5)：380～387)。
(三)发明内容

[0004] 本发明目的是提供新的用于微生物发酵制备辅酶Q10的前体物质，及其在微生物发酵制备辅酶Q10中的应用。

[0005] 本发明采用的技术方案是：

[0006] 丁羟甲苯和/或α-亚麻酸作为前体在微生物发酵制备辅酶Q10中的应用。丁羟甲苯、α-亚麻酸为发明人筛选发现的两种新的用于辅酶Q10微生物法制备的前体物质，可以作为唯一的前体物质添加于培养基中，也可以混合或各自与现有已知的前体(如茄尼醇、对羟基苯甲酸等)组合用于辅酶Q10的制备。

[0007] 具体的，所述应用为：以辅酶Q10产生菌接种于液体培养基，添加适量前体于25～28℃下培养24～36h，所得发酵液分离取菌丝体，于菌丝体中获得所述辅酶Q10。所述辅酶Q10产生菌可为本领域已知用于辅酶Q10制备的菌株，如背景技术中提到的粟酒裂殖酵母、沼泽红假单胞菌、鞘氨醇单胞菌等。

[0008] 优选的，所添加的前体为丁羟甲苯和茄尼醇的混合物，丁羟甲苯添加量为20～40mg/L、茄尼醇添加量为60～100mg/L。更有选的，丁羟甲苯添加量为30mg/L、茄尼醇添加量为70mg/L。

[0009] 优选的，所添加的前体为丁羟甲苯和α-亚麻酸的混合物，丁羟甲苯添加量为20～40mg/L、α-亚麻酸添加量为60～100mg/L。更有选的，丁羟甲苯添加量为30mg/L、α-亚麻酸添加量为70mg/L。

[0010] 本发明中辅酶Q10产生菌优选为鞘氨醇单胞菌CCTCC No：M207084。

[0011] 作为优选的技术方案，所述应用方法如下：以鞘氨醇单胞菌CCTCCNo：M 207084接种于液体培养基，添加前体于25～28℃下培养24～36h，得发酵液，发酵液分离取菌丝体，于菌丝体中获得所述辅酶Q10；所述液体培养基按如下配方配制：每1000mL水加入葡萄糖10～20g、(NH4)2SO4 5～15g、KH2PO4 0.1～1.0g、Na2HPO4 .05～2.0g和MgSO4 0.1～1.0g，pH6.0～8.0。

[0012] 本发明的有益效果主要体现在：提供了两种新的用于辅酶Q10微生物法制备的前体物质及其应用，丁羟甲苯比对羟基苯甲酸的价格便宜，而α-亚麻酸也比茄尼醇的价格低，用于制备辅酶Q10将大大降低成本。(四)附图说明

[0013] 图1为茄尼醇标品、粗品HPLC图谱；

[0014] 图2为不同纯度茄尼醇添加发酵产CoQ10效果；1：对照；2：茄尼醇粗品；3：茄尼醇纯品；

[0015] 图3为茄尼醇粗品硅胶柱分离后得到的样品层析图；

[0016] 图4为不同组分物质添加发酵产CoQ10效果；1：对照；2：12～25管洗脱液合并浓缩物；3：26～43管洗脱液合并浓缩物；4：色素物质；

[0017] 图5为CoQ10发酵最佳组分薄层层析图；

[0018] 图6为CoQ10发酵最佳组分中主要组分的HPLC图谱；

[0019] 图7为CoQ10发酵最佳组分中主要组分的质谱图；

[0020] 图8为不同前体对转化体系辅酶Q10产量的影响；

[0021] 图9为丁羟甲苯浓度对辅酶Q10产量的影响；

[0022] 图10为丁羟甲苯浓度对辅酶Q10转化率的影响；

[0023] 图11为茄尼醇浓度对辅酶Q10产量的影响；

[0024] 图12为茄尼醇浓度对辅酶Q10转化率的影响；(五)具体实施方式

[0025] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0026] 实施例1：

[0027] 1材料与方法

[0028] 1.1菌种

[0029] 发明人自行分离获得的产CoQ10菌株鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)ZUTE03，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 207084，已在在先申请CN200710070806.8中作为新菌种予以保护。

[0030] 1.2仪器与试剂

[0031] SPD-10AVP高效液相色谱仪，日本岛津(SHIMADZU)；Agilent5975C气质联用仪(GC-MS)，美国Agilent；CoQ10标准品(＞99％)，日本和光纯药“WAKO”工业株式会社；茄尼醇(＞99％)，山东潍坊三强集团；其余试剂均购自杭州。

[0032] 1.3培养基

[0033] 固体斜面/平板培养基：酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.0。

[0034] 种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，pH7.0。

[0035] 发酵培养基：葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 10g/L，酵母膏1g/L，KH2PO40.5g/L，Na2HPO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 8.0。以上均115℃灭菌30min。

[0036] 1.4方法

[0037] 1.4.1茄尼醇粗品的制备

[0038] 称取120g烟叶，浸泡在蒸馏水中，抽滤去除水溶性杂质，将处理过的烟叶在100℃烘箱中烘2h，在组织捣碎匀浆机中破碎2min。将上述处理后的烟叶在50℃下浸于1500ml石油醚中，搅拌萃取10h，过滤，滤液进行减压蒸馏蒸去溶剂，得茄尼醇粗品浸膏。

[0039] 1.4.2茄尼醇粗品的硅胶柱分离及组分分析

[0040] 装硅胶柱(4×60cm)高度约40cm，将皂化后的茄尼醇浸膏用少量石油醚充分溶解，加到硅胶柱中，先用石油醚缓慢冲洗柱子，使茄尼醇固定在硅胶柱上，色素物质被冲洗，待流出的石油醚无色后再用石油醚∶丙酮9∶1(v/v)洗脱，每管40ml收集洗脱液。

[0041] 将各管收集液进行薄层层析，硅胶板(GF254，青岛海洋化工厂)，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯4∶1(v/v)，用碘熏法显色。将硅胶板上相同Rf值的对应馏分收集并浓缩，得到的不同组分的物质添加到CoQ10发酵液中，并考察其对Sphingomonas sp.ZJUTE03发酵生产CoQ10的影响。将发酵最佳促进组分进行二次硅胶柱分离，相同Rf值的对应馏分收集浓缩后用HPLC检测，再将主要物质进行GC-MS分析。

[0042] 1.4.3不同前体的添加对Sphingomonas sp.ZUTE03转化产辅酶Q10的影响[0043] Sphingomonas sp.ZUTE03菌体培养：CCTCC No：M 207084接种至斜面培养基，28℃活化培养24h，活化后的菌种接种至种子培养基，30℃培养24h，获得种子液，离心，得湿菌体备用。

[0044] 用正己烷配置100mg/L α-亚麻酸(LNA)、100mg/L丁羟甲苯(BHT)、100mg/L茄尼醇(Solanesol)+100mg/L对羟基苯甲酸(PHB)、100mg/L丁羟甲苯+100mg/L茄尼醇、100mg/L α-亚麻酸+100mg/L丁羟甲苯、100mg/L对羟基苯甲酸+100mg/Lα-亚麻酸和对照组(不加前体)，分别与等体积水相组成Sphingomonas sp.ZUTE03产CoQ10两相转化体系(25ml，0.1mol/L、pH 4.6醋酸缓冲液为水相，25mL正己烷为有机相)，再加入1mL豆油作为细胞通透剂，接入170mg DCW菌体，180rpm，37℃转化，考察添加不同前体组合的转化体系对菌株产辅酶Q10的影响，HPLC测定转化8h时有机相中CoQ10的浓度，确定较优的前体或前体组合。

[0045] 1.4.4丁羟甲苯浓度对Q10产量的影响

[0046] 混合前体中设定茄尼醇浓度为100mg/L，丁羟甲苯的浓度分别为20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L，转化体系同1.4.3，测定不同丁羟甲苯的浓度下各自的辅酶Q10产量，从而确定丁羟甲苯添加的较优浓度。

[0047] 1.4.5茄尼醇浓度对Q10产量的影响

[0048] 在选定丁羟甲苯浓度的情况下，设置茄尼醇的浓度分别为60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L、100mg/L，转化体系同1.4.3，测定各自的辅酶Q10产量，确定茄尼醇添加的较优浓度。

[0049] 1.4.6CoQ10、茄尼醇、丁羟甲苯的HPLC检测

[0050] CoQ10的HPLC检测条件：ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm)，V(正己烷)+V(甲醇)＝17+83混合液为流动相，流速1.0ml/min，紫外检测波长275nm。

[0051] 茄尼 醇 及烟 叶提 取 物的 HPLC检测 条 件：Shim-pack HRC-SIL硅 胶 柱(4.6mm×150mm)，V(正己烷)+V(甲醇)＝98+2混合液为流动相，流速0.5ml/min，紫外检测波长215nm。

[0052] 丁羟甲苯(BHT)的HPLC检测条件：ZORBAX SB-C18柱(4.6×150mm，5μm)，100％色谱级乙醇为流动相，流速1.0ml/min，紫外检测波长215nm。

[0053] 2结果与分析

[0054] 2.1茄尼醇粗品中的茄尼醇含量分析

[0055] 将方法1.4.1得到茄尼醇粗品进行HPLC检测，结果如图1，经HPLC检测茄尼醇粗品中茄尼醇含量为14.43％。

[0056] 2.2添加茄尼醇粗品对Sphingomonas sp.ZUTE03发酵产CoQ10影响

[0057] 将一定量的茄尼醇粗品和标准品加入发酵培养基，使茄尼醇终浓度为100mg/L，接种Sphingomonas sp.ZUTE03培养36h，测定CoQ10产量和细胞生物量。结果由图2可知，添加茄尼醇粗品发酵产CoQ10的效果最好，能够达到3.12mg/L，而添加茄尼醇纯品的CoQ10产量只有2.09mg/L，说明茄尼醇粗品中含有促进效果更好的物质，但是茄尼醇粗品仍然是混合物质，所以本申请继续对茄尼醇粗品进行硅胶柱分离，考察粗品中对生物转化起作用的具体组分。

[0058] 2.3茄尼醇粗品的硅胶柱分离

[0059] 对茄尼醇粗品进行硅胶柱层析，用碘熏法显色，结果由图3可知，1～7号管几乎没有物质，主要是由于在加入石油醚和丙酮混合洗脱液后，基本没有物质洗出，所以未有显色；8～11号管开始出现明显Rf值大于茄尼醇Rf值的显色物质，同时还有少量茄尼醇被洗出；12～20号管在Rf值等于茄尼醇Rf值的位置上出现的斑点最深，主要物质为茄尼醇；21～25号管对应茄尼醇位置上的斑点颜色逐渐变浅，茄尼醇逐渐减少；26～43号管茄尼醇位置上几乎无斑点出现，均为Rf值均小于茄尼醇Rf值的显色物质。合并12～20管洗脱液，浓缩得纯度较高的茄尼醇，合并26～43管洗脱液，浓缩得到茄尼醇斑点以下的物质。

[0060] 2.4不同硅胶柱分离组分的添加效果研究

[0061] 将由方法1.4.2得到的不同组分的物质分别配置成0.75g/L的浓度，发酵12h后添加到发酵液中，总发酵时间36h，测定细胞生长量和CoQ10含量。结果由图4可知，添加26～43管洗脱液的浓缩物后CoQ10的发酵效果最好，CoQ10产量达11.73mg/L，是对照组的
653％，是12～25管洗脱液浓缩物添加后CoQ10产量的572％，是色素物质(柱层析分离由石油醚最先洗脱出的物质)添加后CoQ10产量的156％，优势很明显。所以确定26-43管洗脱液的浓缩物即薄板上茄尼醇斑点以下物质为最佳组分。

[0062] 2.5CoQ10发酵最佳促进组分的分离纯化

[0063] 将CoQ10发酵最佳促进组分即26～43管洗脱液的浓缩物进行二次硅胶柱分离，并硅胶板薄层层析，碘熏法显色，结果如图5所示。将图5中Rf值相同的12～17管合并后浓缩，进行HPLC检测，结果如图6，HPLC图谱显示12～17管浓缩物质有两类主要组分，保留时间分别为6.488min和9.715min。将这两类主要组分进行GC-MS分析，经过GC-MS检测，有效组分是多种物质的混合物，有较多的结构，但主要是两大类，一类是直链的烯烃，这与茄尼醇的结构有一定相似性，另一类是含苯环结构的物质，这为CoQ10的合成创造了有利的条件。图7是具有代表性的两种物质，前者是丁羟甲苯，后者为α-亚麻酸。本发明以这两种物质为前体，研究其对Sphingomonas sp.ZUTE03转化产CoQ10的促进作用。

[0064] 2.6添加不同前体对Sphingomonas sp.ZUTE03转化生产CoQ10的影响[0065] 根据方法1.4.3，添加7种不同组合的前体进行转化生产CoQ10，结果如图8。实验表明，添加两种前体均比添加一种前体的辅酶Q10产量高，其中以添加丁羟甲苯+茄尼醇的组合辅酶Q10的产量最高，达到72.05mg/L。其次，各组合中加入了α-亚麻酸或者丁羟甲苯的又明显比茄尼醇+对羟基苯甲酸产辅酶Q10的效果好，而且后者辅酶Q10的产量与单独添加α-亚麻酸或者丁羟甲苯基本持平，说明新前体α-亚麻酸、丁羟甲苯要比茄尼醇、对羟基苯甲酸的转化效果好。因此，本发明选择丁羟甲苯+茄尼醇的前体组合。

[0066] 2.7丁羟甲苯浓度对Q10产量的影响

[0067] 由图9可知，在茄尼醇浓度设定为100mg/L时，丁羟甲苯浓度为30mg/L时辅酶Q10的产量最高，达到74.52mg/L，丁羟甲苯浓度为40mg/L、50mg/L、60mg/L时，辅酶Q10的产量均未提高，说明丁羟甲苯浓度为30mg/L时前体已是过量，再提高丁羟甲苯浓度也不能提高辅酶Q10的产量。

[0068] 实验中丁羟甲苯及茄尼醇的转化率如图10，结果表明丁羟甲苯浓度为30mg/L时丁羟甲苯及茄尼醇的转化率均达到最大，其中丁羟甲苯的转化率为92.15％，茄尼醇的转化率为90.31％。所以，在茄尼醇浓度为100mg/L下，丁羟甲苯添加的较优浓度应为30mg/L，此时辅酶Q10的产量已达到最高，且丁羟甲苯及茄尼醇的转化率均达到最大。

[0069] 2.8茄尼醇浓度对Q10产量的影响

[0070] 由图11可知，在丁羟甲苯浓度一定(均为30mg/L)的情况下，茄尼醇浓度为70mg/L时辅酶Q10的产量最高，达75.81mg/L；而丁羟甲苯浓度为80mg/L、90mg/L、100mg/L时，辅酶Q10的产量均低于茄尼醇浓度为70mg/L时辅酶Q10的产量，说明茄尼醇浓度为70mg/L时前体已是过量，再提高茄尼醇浓度也不能提高辅酶Q10的产量。

[0071] 实验中丁羟甲苯及茄尼醇的转化率如图12，结果表明，茄尼醇浓度为70mg/L时，丁羟甲苯及茄尼醇的转化率均达到最大，其中丁羟甲苯的转化率为93.19％，茄尼醇的转化率为92.28％。所以，在丁羟甲苯浓度为30mg/L下，茄尼醇添加的较优浓度应为70mg/L，此时辅酶Q10的产量已达到最高，且丁羟甲苯及茄尼醇的转化率均达到最大。

[0072] 综上，前体丁羟甲苯和茄尼醇的较优浓度组合应为30mg/L丁羟甲苯、70mg/L茄尼醇，此时丁羟甲苯和茄尼醇的转化率均达到90％以上。

[0073] 4结论

[0074] 研究表明，如果两种或多种能提高次生代谢物产率的条件联合作用，将对次生代谢物产量的提高发挥协同作用。目前已发现可用于辅酶Q10合成的前体物质有茄尼醇、对羟基苯甲酸、L-苯丙氨酸，L-半胱氨酸等，其中以茄尼醇、对羟基苯甲酸为前体研究最多，茄尼醇与CoQ10的侧链——异戊二烯焦磷酸在结构上有一定的相似性，而对羟基苯甲酸则作为CoQ10合成中醌环的前体物质。本申请对烟叶来源的茄尼醇粗品进行硅胶柱分离，经促进发酵对比实验和GC-MS分析，从中获得两种新的前体物质——丁羟甲苯和α-亚麻酸，研究还发现在Sphingomonas sp.ZUTE03转化生产CoQ10的两相转化体系中，添加以30mg/L丁羟甲苯+70mg/L茄尼醇为前体组合的产量最高，可达75.81mg/L，丁羟甲苯和茄尼醇的转化率分别达93.19％和92.28％。以丁羟甲苯和α-亚麻酸为前体物质促进微生物转化生产CoQ10的研究为首次报道，推测丁羟甲苯为CoQ10的合成提供苯环结构，而α-亚麻酸与茄尼醇的结构有相似性，为CoQ10合成提供侧链，且丁羟甲苯是一种抗氧化剂，能保护辅酶Q10不被氧化。此外，丁羟甲苯比对羟基苯甲酸的价格便宜，而α-亚麻酸也比茄尼醇的价格低，对新型前体的进一步研究将有利于降低生产成本。