一种荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统及其应用

摘要

本发明属于生物检测技术领域，具体为一种荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统及其应用。该系统复合扩增分析16个X-STR基因座：GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB、DXS981、DXS8378、DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、DXS7133、DXS6810、DXS7132，这16个基因座相对独立、互不连锁，相应引物分别用FAM、HEX、TAMRA、ROX四种荧光标记。基于该复合扩增系统，本发明可制成适合中国人群的X-STR基因座复合扩增试剂盒，用于亲子鉴定、个体识别、性别鉴定、X连锁遗传病的基因定位，特别是用于姐妹认亲、同父异母的半姐妹认亲、隔代认亲等亲权鉴定。

权利要求

1.一种荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统，其特征在于该复合扩增系统的

16个基因座如下：GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB、DXS981、DXS8378、DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、DXS7133、DXS6810、DXS7132。

2.根据权利要求1所述荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统，其特征在于所述16个基因座在一个复合扩增体系中同时进行PCR扩增。

3.根据权利要求1所述荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统，其特征在于所述16个基因座引物分别用FAM、HEX、TAMRA、ROX四种荧光素标记。

4.根据权利要求3所述荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统，其特征在于四种荧光素标记16个基因座引物，具体如下：FAM标记GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB和DXS981共5个基因座；HEX标记DXS8378、DXS6795、GATA31E08和DXS6809共4个基因座，TAMRA标记DXS6803、DXS9902、DXS6807和DXS7423共4个基因座，ROX标记DXS7133、DXS6810和DXS7132共三个基因座。

5.根据权利要求1、2、3或4所述荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统，其特征在于 16个X-STR基因座及其引物序列和荧光素标记，具体对应如下：X-STR基因座 引物序列 荧光标记

GATA165B12 F: 5’-CTATGTATCATCAATCATCTATCCGTA-3’ FAM R: 5’-GGTTGACTGTGATTCCTGGTTTA-3’ DXS101 F: 5’-CTAAATCAGTCCAAATATCTCCCTT-3’ FAM R: 5’-GTGCGCATGTATCCCAGAAC-3’ GATA172D05 F: 5’-GGTTACCAGGGACTGGAGGA-3’ R: 5’-AATAATTGAAAGCCCGGATTC-3’ FAMHPRTB F: 5’-GGTGTCTCATGTAAGAGGGCAGT-3’ R: 5’-ATTCAATAAATAGGAGAAGGGCAT-3’ FAMDXS981 F: 5’-TTTCTTAGCTGGTCTGCCTTCTT-3’ FAM R: 5’-GGATGAAAGAGTTGGAGATTGTG-3’ DXS8378 F: 5’-GACAAGAACGAAACTCCAACTC-3’ R: 5’-TTAGGCAACCCGGTGGTC-3’ HEXDXS6795 F: 5’-GTGCTTGGTCACCTCAACATCA-3’ R: 5’-TTCAGTGTTTGACATGGCTTTCT-3’ HEXGATA31E08 F: 5’-AGATGTATAGACAGAGCTGGTGATG-3’ HEX R: 5’-GTAACTTTATGGCAAGTTGAGGATC-3’ DXS6809 F: 5’-TGCTTTAGGCTGATGTGAGGA-3’ HEX R: 5’-GGCATGAAAAGAAGTTGGGTT-3’ DXS6803 F: 5’-AAAGGAACATATGCTACTTTATCTCG-3’ TAMRA R: 5’-GACCTAGAAATGTGCTTTGACAGG-3’ DXS9902 F: 5’-GATGGAGTCTCTGGGTGAAGAG-3’ R: 5’-CATATCAGGAGTATGGGATCACC-3’ TAMRADXS6807 F: 5’-GTCAGTTACTCATGGTAAAGTCCG-3’ R: 5’-CAGTGGATGCCTGAAACCTC-3’ TAMRADXS7423 F: 5’-CATAGTAGGTGCCCAAAAGATATT-3’ TAMRA R: 5’-GGATTCTACTGAGCATTTCGTG-3’ DXS7133 F: 5’-AGGTGTAGCTTCCTTAGATGGC-3’ ROX R: 5’-GTTCCAAGAATCAGAAGTCTCCTAC-3’ DXS6810 F: 5’-GCCATACCCAGCCCTGAATA-3’ R: 5’-CCTTTTGGGACCTTAAGTAAAATG-3’ ROXDXS7132 F: 5’-CACTCCTGGTGCCAAACTCTA-3’ ROX R: 5’-GTTGGTTCTTCTGATTCTGACTTTC-3’ 。

6.一种基于权利要求1—4之一所述的荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统的试剂盒，其特征在于包括：PCR反应体系，反应体系总体积为12-25μL，包括PCR反应缓冲液1-2.5μL，引物混合物1-3μL，DNA聚合酶1-2.5 U，模板DNA 1-3μL，其余为超纯水；

所述的引物混合物包括：16个X-STR基因座及其引物序列和荧光素标记，具体对应如下：X-STR基因座 引物序列 荧光标记

GATA165B12 F: 5’-CTATGTATCATCAATCATCTATCCGTA-3’ FAM R: 5’-GGTTGACTGTGATTCCTGGTTTA-3’ DXS101 F: 5’-CTAAATCAGTCCAAATATCTCCCTT-3’ FAM R: 5’-GTGCGCATGTATCCCAGAAC-3’ GATA172D05 F: 5’-GGTTACCAGGGACTGGAGGA-3’ R: 5’-AATAATTGAAAGCCCGGATTC-3’ FAMHPRTB F: 5’-GGTGTCTCATGTAAGAGGGCAGT-3’ R: 5’-ATTCAATAAATAGGAGAAGGGCAT-3’ FAMDXS981 F: 5’-TTTCTTAGCTGGTCTGCCTTCTT-3’ FAM R: 5’-GGATGAAAGAGTTGGAGATTGTG-3’ DXS8378 F: 5’-GACAAGAACGAAACTCCAACTC-3’ R: 5’-TTAGGCAACCCGGTGGTC-3’ HEXDXS6795 F: 5’-GTGCTTGGTCACCTCAACATCA-3’ R: 5’-TTCAGTGTTTGACATGGCTTTCT-3’ HEXGATA31E08 F: 5’-AGATGTATAGACAGAGCTGGTGATG-3’ HEX R: 5’-GTAACTTTATGGCAAGTTGAGGATC-3’ DXS6809 F: 5’-TGCTTTAGGCTGATGTGAGGA-3’ HEX R: 5’-GGCATGAAAAGAAGTTGGGTT-3’ DXS6803 F: 5’-AAAGGAACATATGCTACTTTATCTCG-3’ TAMRA R: 5’-GACCTAGAAATGTGCTTTGACAGG-3’ DXS9902 F: 5’-GATGGAGTCTCTGGGTGAAGAG-3’ R: 5’-CATATCAGGAGTATGGGATCACC-3’ TAMRADXS6807 F: 5’-GTCAGTTACTCATGGTAAAGTCCG-3’ R: 5’-CAGTGGATGCCTGAAACCTC-3’ TAMRADXS7423 F: 5’-CATAGTAGGTGCCCAAAAGATATT-3’ TAMRA R: 5’-GGATTCTACTGAGCATTTCGTG-3’ DXS7133 F: 5’-AGGTGTAGCTTCCTTAGATGGC-3’ ROX R: 5’-GTTCCAAGAATCAGAAGTCTCCTAC-3’ DXS6810 F: 5’-GCCATACCCAGCCCTGAATA-3’ R: 5’-CCTTTTGGGACCTTAAGTAAAATG-3’ ROXDXS7132 F: 5’-CACTCCTGGTGCCAAACTCTA-3’ ROX R: 5’-GTTGGTTCTTCTGATTCTGACTTTC-3’ 。

7.权利要求1至4之一所述的荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统，在特殊的亲权关系鉴定或个体识别、性别鉴定及X连锁遗传病的基因定位中应用。

说明书

一种荧光标记的16重X-STR基因座复合扩增系统及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种染色体分型的检测系统及其应用，特别涉及一种X染色体STR基因位点分型的荧光检测系统及其应用。

背景技术

[0002] 短串联重复序列(short tandem repeats,简称STR)是由2-7个碱基对作为核心单位，串联重复形成的一类微卫星DNA序列；STR由于核心重复单位数目的变化形成了STR基因位点的遗传多态性。人类基因组中，平均每6-10kb就存在有一个STR基因位点，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因位点的丰富来源。

[0003] STR等位基因的分型在研究与实际应用中具有以下显著的特点：良好的重复性，分型结果稳定可靠，操作简单快速；片段长度一般在100-400bp，容易通过PCR扩增、电泳分型，适用于各种检材及高度降解检材的检测；三核苷酸、四核苷酸重复的STR位点PCR扩增结果稳定，产生的附加带、影子带少，容易分型；是绘制人类遗传图、疾病基因连锁分析、遗传病诊断、个体识别等分析工作的主要工具。

[0004] X染色体STR位点广泛存在于真核细胞基因组中，高度稳定且具有较高的遗传多态性，但与常染色体和Y染色体STR相比，迄今发现和应用的X染色体STR位点数量非常少，群体分布、突变率、连锁平衡、基因结构等方面的信息尚不够丰富，在法医学、医学等领域的应用受限，远不及其它DNA遗传标记广泛。但X染色体STR对于亲子鉴定、个体识别、性别鉴定、X连锁遗传致病基因定位、易感基因的检出，多基因遗传病致病基因的定位、发病的分子遗传机理研究、药物的设计及使用等方面有独特的优势。故X染色体的有关研究有重要的意义。

[0005] X染色体遗传标记的研究在国内还处于初期，目前国际上商业化检测试剂盒仅有德国Biotype Argus X-12，该类试剂盒在法医学应用实践中存在以下问题：1、采用该类试剂盒需要增加遗传标记时遇到困难；
2、这些X-STR基因座都是基于中国群体以外的群体（主要是白人群体）资料而开发的，其中有些基因座，在中国群体中的基因频率分布较差，个体识别能力较低；
3、国外商业化试剂盒价格昂贵。

[0006] 这些缺点限制了X染色体遗传标记在国内的应用，不利于进一步在基层推广。

[0007] 申请号为200810017404.6，公开号为CN101225387的中国专利公开了一种覆盖X染色体全长的11个STR基因座并公开了STR基因座结合等位基因标准物进行染色体分型的方法。但是该发明公开的STR分型为银染检测，虽然对实验设备的成本要求不高，但是在实验中人工操作较多，工作量大，实验结果易受人员操作熟练程度的影响。申请号为200810219413.3，公开号为CN101413030A的中国专利公开了一种涵盖10个X-STR基因座的荧光复合扩增系统，但该系统的10个X-STR基因座位于同一连锁群内，在亲权鉴定等实践中需要计算单倍型频率，整体的鉴别效能降低。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种在中国人群中可以快速、准确针对常染色体STR、Y-STR难以排除或认定亲权关系的特殊检案（如同父同母姐妹认亲、同父异母姐妹认亲、祖母与孙女鉴定等）进行鉴定的荧光标记的X-STR基因座复合扩增系统。

[0009] 本发明的另一个目的在于提供上述复合扩增系统用于X连锁遗传致病基因定位、亲子鉴定、同父同母姐妹认亲、同父异母姐妹认亲、祖母与孙女鉴定等领域。

[0010] 本发明建立了一种荧光标记的X-STR复合扩增系统，该系统可分析16个 X-STR基因座，这16个X-STR基因座为：GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB、DXS981、DXS8378、DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、DXS7133、DXS6810和DXS7132。

[0011] 本发明具体包括如下内容：一、等位基因分型标准物的制备。

[0012] 分别以包含16个X染色体STR基因座GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB、DXS981、DXS8378、DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、DXS7133、DXS6810和DXS7132的不同等位基因的质粒为模板，以5′端标记有荧光分子的引物对为引物，PCR扩增上述X染色体STR基因位点全部的等位基因，并确定PCR扩增出的等位基因的片段大小，将全部的等位基因的片段按照等摩尔比混合得到等位基因分型标准物。

[0013] 二、多重PCR引物的荧光标记。

[0014] 由于需要对16个X染色体STR基因座进行复合扩增，并对等位基因片段长度差异和扩增子长度的限制，多重PCR体系构建时要进行多重荧光标记，本发明采用5色荧光标记，在选择荧光标记时考虑以下要素：① 每种荧光素的激发光光谱间隔应尽可能均匀，且其间隔最好是不少于20nm，以达到最佳的分离效果；
② 一种荧光素的激发光光谱与另一种荧光素的吸收光光谱尽可能不重叠，以减少相互间的干扰；
③ 荧光素可通过商业途径获得，不受专利保护；
④ 由于未来的应用主要依据美国AB公司的遗传分析仪，要求所选择的荧光素在美国AB公司的遗传分析仪上适用。

[0015] 本发明的16个X-STR基因座分别采用FAM、HEX、TAMRA和ROX四种不同颜色的荧光素标记（第五种荧光用于内标的标记如LIZ、SIZ等）。具体为：FAM标记GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB和DXS981共5个基因座；HEX标记DXS8378、DXS6795、GATA31E08和DXS6809共4个基因座，TAMRA标记DXS6803、DXS9902、DXS6807和DXS7423共4个基因座，ROX标记DXS7133、DXS6810和DXS7132共三个基因座。

[0016] 本发明人的研究表明，可以在一个PCR单管中实现复合扩增，扩增效率高，无相互干扰。

[0017] 三、本发明体系中16个X-STR基因座的复合扩增与检测。

[0018] 本发明的复合扩增系统是采用复合PCR技术在同一PCR反应管中同时扩增上述16个X-STR基因座，从而可同时分析X染色体的STR基因座。

[0019] 复合扩增体系中的基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中的引物正链的5′端用相应的荧光素标记即用FAM、HEX、TAMRA和ROX标记，全部16个X-STR基因座的引物按照比例混合在一起（一个试管中）。

[0020] （1）PCR反应体系反应体系总体积为12-25μL，包括PCR反应缓冲液（Buffer）1-2.5μL，引物混合物（Primer pair Mix）1-3μL，DNA聚合酶1-2.5 U，模板DNA 1-3μL，超纯水补足至总体积。

[0021] （2）PCR扩增参数在9700或其他型号的PCR仪上进行扩增，多重PCR扩增参数为：95℃ 15min；94℃
30sec、57℃ 90sec、72℃ 90sec，共进行30个循环；60℃延伸60min。

[0022] 四、结果分析。

[0023] ① 样品制备混匀后瞬时离心，在96孔板中，每孔加10.0μL混合液，再加PCR产物1μL，短暂离心，
95℃变性4 min，放置冰盒中冷却3 min， 用3100或3130等型号遗传分析仪进行电泳。

[0024] ② 电泳参数的设置按照遗传分析仪的操作说明书进行样本表的编写，在样本表中，电泳参数的设置如下：
Dye Set 为E5，Run Module选择“GeneScan36vb_POP4 Default”。

[0025] ③ 结果分析采用GeneMapper ID v3.1软件或GeneMapper ID v3.2或GeneMapper ID v3.3。

[0026] 本发明提供的方法，是基于X染色体的16个STR基因座GATA165B12、DXS101、GATA172D05、HPRTB、DXS981、DXS8378、DXS6795、GATA31E08、DXS6809、DXS6803、DXS9902、DXS6807、DXS7423、DXS7133、DXS6810和DXS7132，所有位点片段大小适中，PCR复合扩增及荧光检测均得到满意的结果。

[0027] 本发明的荧光标记的16个STR基因座复合扩增系统可以制成试剂盒，为法医学亲权鉴定、个体识别等领域提供一种新的检测系统。

[0028] 上述复合扩增系统可应用于特殊的亲权关系鉴定或进行个体识别、性别鉴定及X连锁遗传致病基因定位等。

[0029] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、高灵敏度：本发明提供的16个STR基因座荧光复合扩增系统在模板量为25pg时仍可检出全部的16个STR基因座。

[0030] 2、本发明所提供的16个STR基因座荧光复合扩增系统已在本实验室用于实际检案，结果表明该系统多态性高、稳定性、重复性好，分型结果准确，能满足实际需要。

[0031] 3、本发明在国内首先研制出一组16个X-STR基因座在单一反应管中实现复合扩增的五色荧光标记复合扩增检测系统。

[0032] 4、本发明的荧光标记引物复合扩增技术快速、简便，PCR产物可用310、3100、3130等遗传分析仪电泳，结果自动分析，能标准化，可以保证不同实验室数据比较的正确性。

[0033] 5、本发明可制备一套试剂盒，进行商品化，可以填补国内没有X-STR荧光复合扩增试剂盒的空白，也可补充目前STR荧光检测试剂盒的不足，作为有中国特色的X-STR基因座荧光复合扩增试剂盒，可用于亲子鉴定、同父同母姐妹认亲、同父异母姐妹认亲、祖母与孙女鉴定、X连锁遗传致病基因定位等领域。

具体实施方式

[0034] 以下将结合实施案例对本发明作进一步阐述，该实施仅仅是用于举例说明的目的而决非以任何方式限制本发明的范围。

[0035] 实施例1 应用16个X-STR基因座荧光复合扩增系统进行亲子鉴定和个体识别操作步骤：1、DNA提取
Chelex-100法提取基因组DNA：在1.5mL离心管中加1mL 双蒸水,然后加入3μL全血或3×3mm血斑，混匀；室温保温30min, 间歇振荡；14,000 r/min离心5min；移去上清液。
在沉淀中加入10% Chelex 100 (100mesh) 200μL；56℃保温30min；高速振荡5-10Sec；沸水浴8min；14,000 r/min离心5min，取上清液用于PCR扩增。

[0036] 2、PCR扩增反应总体积为25.0μL，包括PCR反应缓冲液（Buffer）2.5μL，引物混合物（Primer pair Mix）2.5μL，DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 5.0μL(0.1ng/μL)，超纯水14.5μL。

[0037] 上述引物混合物中，各个基因座的引物序列及其荧光标记如表1所示。

[0038] 表1 16个X-STR基因座及其引物序列和荧光标记X-STR基因座 引物序列 荧光标记GATA165B12 F: 5’-CTATGTATCATCAATCATCTATCCGTA-3’ FAM
R: 5’-GGTTGACTGTGATTCCTGGTTTA-3’
DXS101 F: 5’-CTAAATCAGTCCAAATATCTCCCTT-3’ FAM
R: 5’-GTGCGCATGTATCCCAGAAC-3’
GATA172D05 F: 5’-GGTTACCAGGGACTGGAGGA-3’
R: 5’-AATAATTGAAAGCCCGGATTC-3’ FAM
HPRTB F: 5’-GGTGTCTCATGTAAGAGGGCAGT-3’
R: 5’-ATTCAATAAATAGGAGAAGGGCAT-3’ FAM
DXS981 F: 5’-TTTCTTAGCTGGTCTGCCTTCTT-3’ FAM
R: 5’-GGATGAAAGAGTTGGAGATTGTG-3’
DXS8378 F: 5’-GACAAGAACGAAACTCCAACTC-3’
R: 5’-TTAGGCAACCCGGTGGTC-3’ HEX
DXS6795 F: 5’-GTGCTTGGTCACCTCAACATCA-3’
R: 5’-TTCAGTGTTTGACATGGCTTTCT-3’ HEX
GATA31E08 F: 5’-AGATGTATAGACAGAGCTGGTGATG-3’ HEX
R: 5’-GTAACTTTATGGCAAGTTGAGGATC-3’
DXS6809 F: 5’-TGCTTTAGGCTGATGTGAGGA-3’ HEX
R: 5’-GGCATGAAAAGAAGTTGGGTT-3’
DXS6803 F: 5’-AAAGGAACATATGCTACTTTATCTCG-3’ TAMRA
R: 5’-GACCTAGAAATGTGCTTTGACAGG-3’
DXS9902 F: 5’-GATGGAGTCTCTGGGTGAAGAG-3’
R: 5’-CATATCAGGAGTATGGGATCACC-3’ TAMRA
DXS6807 F: 5’-GTCAGTTACTCATGGTAAAGTCCG-3’
R: 5’-CAGTGGATGCCTGAAACCTC-3’ TAMRA
DXS7423 F: 5’-CATAGTAGGTGCCCAAAAGATATT-3’ TAMRA
R: 5’-GGATTCTACTGAGCATTTCGTG-3’
DXS7133 F: 5’-AGGTGTAGCTTCCTTAGATGGC-3’ ROX
R: 5’-GTTCCAAGAATCAGAAGTCTCCTAC-3’
DXS6810 F: 5’-GCCATACCCAGCCCTGAATA-3’
R: 5’-CCTTTTGGGACCTTAAGTAAAATG-3’ ROX
DXS7132 F: 5’-CACTCCTGGTGCCAAACTCTA-3’ ROX
R: 5’-GTTGGTTCTTCTGATTCTGACTTTC-3’
上述16对引物依次记为SEQ.ID.NO.1--- SEQ.ID.NO.16。

[0039] 3、PCR扩增参数：在9700 PCR仪上进行扩增，PCR扩增参数为：95℃ 15min；94℃30sec、57℃ 90sec、72℃、60sec，共进行30个循环；60℃延伸60min。

[0040] 4、3100遗传分析仪电泳：按照遗传分析仪的操作说明书进行样本表的编写，在样本表中，电泳参数的设置如下：Dye Set 为E5，Run Module选择“GeneScan36vb_POP4 Default”。

[0041] 本发明的16个STR基因座已经在申请人实验室应用于群体遗传学调查并获得中国汉族、回族、维吾尔族、蒙古族、藏族人群的分型结果，证明这些基因组的多态性较高，适合于中国人群的检测，并应用到实际检案中取得了理想的结果。