一种鉴定微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌的方法

摘要

本发明提供了一种简单、快速检测和鉴定微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌的技术。本技术设计了侧孢短芽孢杆菌的特异引物，建立了这种芽孢菌的PCR鉴定方法，可以根据样品基因组DNA的PCR扩增结果，对微生物肥料中的侧孢短芽孢杆菌进行检测和鉴定。

权利要求

1.一种侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)的特异性引物对，其特征在于所述的引物对由上游引物和下游引物组成，上游引物L25 5′-TGAAGCGAAACGGAAAG-3′；

下游引物R322 5′-CGTCAAGGTGCTACCTTATT-3′。

说明书

一种鉴定微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及利用适当的引物通过PCR反应，检测微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)的方法，以及在该方法中所用的引物。技术背景

[0002] 侧孢短芽孢杆菌是自然界中广泛分布的细菌，土壤、海洋、动物、昆虫中均有存在。随着对短芽孢杆菌研究的深入，已发现其能产生多种有应用潜力的代谢产物，如杀虫蛋白、抑菌物质、抗癌免疫调节物质。另外，侧孢短芽孢杆菌在溶解无机磷、降解有机磷、防治害虫、提高作物防御能力等多种功能也逐渐被发现、研究并开发利用。

[0003] 鉴于侧孢短芽孢杆菌的多功能性，已有很多企业将其用于微生物肥料生产，并取得了很好的效果。为确保含侧孢短芽孢杆菌的微生物肥料产品的使用效果，需要保证产品的质量，尤其是产品中侧孢短芽孢杆菌的数量。常用的平板计数检测法关键在于准确识别有效菌，目前使用的传统菌种识别是以形态特征和各项生理生化方法为主，操作步骤烦琐，检测时间长，并且特异性差。因此，迫切需要研究建立快速、准确、灵敏的检测新方法，以满足侧孢短芽孢杆菌产品的质量检测的准确性和时效性。

[0004] PCR方法有着快速、准确和灵敏的特点，已经在微生物肥料领域得到了应用，关大伟等人曾建立了的特异PCR法用于沼泽红假单胞菌的鉴定和检测，并取得了良好的应用效果。为将PCR技术更广泛应用于微生物肥料检测领域，本发明人通过反复摸索实践建立了一种基于PCR技术的、快速、准确、灵敏地检测微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌的方法。该方法适用于侧孢短芽孢杆菌的鉴定和检测。本发明是通过下述的技术方案实现的。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种应用特异引物PCR技术对微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌进行鉴定的方法。在本发明的一个优选的实施方案中提供了通过特异引物PCR技术鉴定侧孢短芽孢杆菌的鉴定方法。在进一步优选的实施方案中，所述的侧孢短芽孢杆菌是纯菌种。本发明的另一目的在于提供上述鉴定方法中所用的特异引物。

[0006] 具体而言，本发明基于已知的侧孢短芽孢杆菌16S rDNA核酸序列，设计了相应于上述菌种的特异引物。通过优化PCR反应中的镁离子浓度和退火温度等条件来提高PCR方法的特异性，并根据优化结果建立了侧孢短芽孢杆菌的PCR鉴定方法，用于微生物肥料产品中侧孢短芽孢杆菌的鉴定。

[0007] 本专利发明的鉴定侧孢短芽孢杆菌的PCR方法为：

[0008] 上游引物L25：5’-TGAAGCGAAACGGAAAG-3’；

[0009] 下游引物R322：5’-CGTCAAGGTGCTACCTTATT-3’。

[0010] PCR反应体系：10×buffer 2.0μL

[0011] Mg2+(25mmol/L) 0.8μL

[0012] dNTPS(10mmol/L) 0.8μL

[0013] 上游引物L25(10μmol/L) 0.3μL

[0014] 下游引物R322(10μmol/L) 0.3μL

[0015] Taq E(2.5U/μL) 0.2μL

[0016] 模板DNA 2.0μL

[0017] 补足ddH2O 20μL

[0018] PCR扩增参数：95℃ 5min

[0019]

[0020] 72℃ 10min。

附图说明

[0021] 图为应用侧孢短芽孢杆菌特异引物对标准菌株进行PCR的实验结果(照片)如所示。其中，各泳道的具体说明如下：

[0022] 泳道1：标准分子量：100bp标准分子量

[0023] 泳道2：侧孢短芽孢杆菌(Brevibibacillus laterosporus1.2012)[0024] 泳道3：侧孢短芽孢杆菌(Brevibibacillus laterosporus10249)[0025] 泳道4：侧孢短芽孢杆菌(Brevibibacillus laterosporus1.2738)[0026] 泳道5：侧孢短芽孢杆菌(Brevibibacillus laterosporus3005)[0027] 泳道6：侧孢短芽孢杆菌(Brevibibacillus laterosporus3006)[0028] 泳道7：侧孢短芽孢杆菌(Brevibibacillus laterosporus3007)[0029] 泳道8：短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)

[0030] 泳道9：土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)

[0031] 泳道10：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)

[0032] 泳道11：胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)

[0033] 泳道12：固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)

[0034] 泳道13：土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus edaphicus)

[0035] 泳道14：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

[0036] 泳道15：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

[0037] 泳道16：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

[0038] 泳道17：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)

[0039] 泳道18：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

[0040] 泳道19：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)

[0041] 泳道20：环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)

[0042] 泳道21：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)

[0043] 泳道22：施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

[0044] 泳道23：恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)

[0045] 泳道24：绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)

[0046] 泳道25：褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)。

具体实施方式

[0047] 下面结合附图对本发明具体实施方案进一步说明。本领域的技术人员应当了解，下述的实施例方案是示例性的技术方案以说明本发明。

[0048] 实施例

[0049] 通过应用侧孢短芽孢杆菌特异性引物的PCR方法对标准菌株的检测。

[0050] (1)材料

[0051] 测试菌：下面表1所列菌株为待测标准菌株

[0052] 表1

[0053]

[0054] (2)引物的设计和合成

[0055] 根据侧孢短芽孢杆菌的16S rDNA核酸序列设计侧孢短芽孢杆菌特异性引物。所述引物如表2所示。所述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0056] 表2

[0057]种类 引物 核苷酸序列
侧孢短芽孢杆菌 上游引物L25 5′-TGAAGCGAAACGGAAAG-3′
侧孢短芽孢杆菌 下游引物R322 5′-CGTCAAGGTGCTACCTTATT-3′

[0058] (3)DNA提取：取1.5mL菌液于Eppendorf管中，9000r/min离心4min收集菌体，-20℃保存。将收集到的菌体用1×TE缓冲液洗涤菌体2次，再加入500μL GUTC缓冲液，混合均匀，静置20min后，每管加入20μL～30μL硅藻土吸附液，振荡均匀后室温放置15min。再13000r/min离心30s，弃上清液后，加入200μL GUTC缓冲液，混合均匀后室温放置10min，再13000r/min离心30s。洗涤缓冲液洗涤上述硅藻土沉淀3次，每次300μL。
再用200μL 70％的酒精洗涤硅藻土沉淀1次，13000r/min离心2min，弃上清液，干燥。最后根据每管加入硅藻土的量，向每管加入20μL～30μL 1×TE缓冲液，在涡旋振荡器上充分混合均匀，65℃保温30min后，13000r/min离心5min，然后小心将上清液移至另一支已编号的Eppendorf管，该溶液即为从菌株中提取的DNA样品。DNA样品贮藏于-20℃。

[0059] (4)PCR检测：

[0060] (4.1)PCR混合物制备

[0061] 按表3所示配方，在200uLPCR管中加入试剂和DNA溶液，制备成PCR混合液。

[0062] 表3

[0063]成分 体积
10×buffer 2μL
Mg2+(25mmol/L) 0.8μL
dNTPs(10mmol/L) 0.8μL
上游引物L25(10μmol/L) 0.3μL
下游引物R322(10μmol/L) 0.3μL
Taq E(2.5U/μL) 0.2μL
模板DNA 2.0μL
补足ddH2O 20μL

[0064] (4.2)把含有由4.1制备的混合液的200uLPCR管放入PCR仪中进行PCR反应。具体步骤是，95℃进行热变性5min后，完成如下30个循环：95℃热变性40s，61℃退火/复性40s，72℃延长反应40s。最后72℃延长反应10min。

[0065] (4.3)电泳

[0066] 完成PCR扩增后，取5μL反应混合液，与1μL上样缓冲液混合均匀后，在EB染色30min的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，140V稳压电泳40min。

[0067] (4.4)观察

[0068] 完成电泳后，通过凝胶图像分析仪下观察结果。

[0069] (4.5)结果

[0070] 该实验结果(照片)如图所示。

[0071] 根据照片所示结果，6株侧孢短芽孢杆菌均出现了一条大小为296bp的特异条带，而其他测试菌则无目标条带产生，这说明本发明的特异引物能够可靠地检测和鉴定侧孢短芽孢杆菌。