一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物、试剂盒及方法转让专利
申请号 : CN201010245885.3
文献号 : CN101956021B
文献日 : 2012-06-06
发明人 : 不公告发明人
申请人 : 成都新基因格生物科技有限公司
摘要 :
本发明公开了一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物，其中包括上游引物P1：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，和下游引物P2：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′。利用该组合物，配合适当的探针及其它试剂，使用real time PCR方法，可以特异性地检测出样品中的EV71和Cox A16型肠道病毒5′UTR区基因片断。本发明还公开了含有该组合物的试剂盒、以及利用此组合物或试剂盒检测EV71和/或Cox A16型肠道病毒的方法。利用该组合物或试剂盒、和/或方法检测样品时，能够在一个反应中，灵敏、快速地检测出样品是否存在EV71和/或Cox A16型肠道病毒；从而提检测效率和灵敏性，同时简化检测过程，节约人力、物力和检测成本。
权利要求 :
1.一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物，其特征在于：该组合物中包括下列引物：
P1：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，P2：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′，P3：5′-CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3′，P4：5′-TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3′,P5：5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′，P6：5′-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3′。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的组合物中还包括下列探针：Probe1：5′-荧光基团-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-荧光淬灭基团-3′，Probe2：5′-荧光基团-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为ECLIPSE。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的组合物中还包括下列探针：Probe3：5′-荧光基团-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-荧光淬灭基团-3′，Probe4：5′-荧光基团-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAACTT-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C；
并且在二个探针中分别使用不同的荧光基团。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述的二对荧光基团和荧光淬灭基团分别为：HEX和ECLIPSE；Cy5和BHQ3。
6.含有权利要求1-5中任一项所述的组合物的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还含有RT-PCR反应体系。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR 反应体系为实时定量PCR反应体系；反应体系为20μl，5×PCR缓冲液4μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、QIAGEN逆转录和聚合酶混合物1μl、模板1μl，加灭菌水至终体系20μl。
说明书 :
一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物、试剂盒及方
法
技术领域
[0001] 本发明涉及用于特异性检测致手足口病肠道病毒的组合物、试剂盒和检测方法。
背景技术
[0002] 手足口病(Hand-foot-mouth disease)是由肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等。个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。
[0003] 可以起手足口病的肠道病毒有多种亚型，包括柯萨奇病毒(Cox)A5、A10、A16、A19型及肠道病毒71型(Ev71型)。20世纪70年代以前，cox A16型肠道病毒被认为是引起手足口病的主要病原(何家鑫，沈晓娜。海峡预防医学杂志，2001，7(3)22-24)。日本曾经多次发生手足口病暴发流行，其主要病原为cox A16型肠道病毒。我国天津在1983-1986年，也曾发生由cox A16型肠道病毒引起的手足口病暴发流行。20世纪70年代初，美国首先发现由Ev71型肠道病毒引起的手足口病。澳大利亚和日本也陆续观察到由Ev71型肠道病毒引起的手足口病的流行，一些Ev71型重症病例伴有中枢神经系统症状(李显，汪华。江苏卫生保健，2002，4(4)：178-180)。根据世界各国手足口报道的情况来看，Ev71型和cox A16型肠道病毒是引起手足口病的主要病原(Tan EL，Chow VT，Quak SH，Yeo WC，Poh CL.Diagn Microbiol Infect Dis.2008Jul；61(3)：294-301)。
[0004] 手足口病的地区分布极为广泛，欧洲、北美洲、大洋洲和亚洲国家，均有暴发流行。一般多在夏秋季节爆发，健康带毒者和轻型散发病例是主要的传染源，主要通过飞沫经呼吸道传播和被污染的玩具、手经口传播，而大部分人群对致手足口病的肠道病毒普遍易感，尤其是婴幼儿，更易感染，因而托幼中心和小学是手足口病高发区。2008年，安徽阜阳上千名儿童感染肠道病毒EV71，引起手足口病暴发，仅3月份，就有19名患儿抢救无效死亡。全国其他省市，也不同程度的出现手足口病的暴发流行。其中，北京(2221例)、上海(1988例)、广东(13189例)、浙江(5132例)、江苏(2479例)、山东(1985例)、湖北(1424例)、河南(1385例)等省市报告病例数均超过千例。由于目前缺乏特异、高效的手足口病抗病毒药物，对症和支持治疗是手足口病的主要治疗措施。而加强实验室监测和提高监测敏感性是控制手足口病暴发流行的关键。
[0005] 随着分子生物学技术的快速发展，在病原微生物实验室和临床检测中，PCR法由于其快速、简便和特异性强的特点，逐渐呈现出要替代病原培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而相比普通PCR方法，real-time PCR更加省时，特异更强，灵敏度更高，同时无需PCR后产物分析步骤，减少了实验操作步骤，降低了实验室污染的风险，展现出了更大的应用前景。
[0006] 根据行业标准，我国目前致手足口肠道病毒的检测主要依靠普通RT-PCR。一般耗时要4-6个小时。根据PubMed查询的结果，以“Hand-foot-mouth disease real-time pcr”为查询关键词，国外仅有6篇相关的文献报道。因而，根据我国致手足口病的EV71和Cox A16型肠道病毒基因序列特征，建立一种快速简便的多重real-time PCR，在一个反应中，实现鉴别检测致手足口病的EV71和Cox A16型两种肠道病毒，可以显著提高手足口病检测效率和检测的灵敏性，同时简化检测过程，节约人力、物力和相关的检测成本。由于在一个反应中同时检测多种类型的病毒，需要考虑多对引物、探针之间是否存在交叉干扰、错配以及退火温度是否匹配等因素，并非是将分别检测各种病毒用引物等简单的组合在一起即可实现；目前尚没有可以在一个反应中同时检测EV71和CoxA16型两种肠道病毒的产品或方法。
发明内容
[0007] 本发明的主要目的就是针对上述问题，提供一种可用于特异性检测致手足口病的EV71和Cox A16型肠道病毒的组合物；利用该组合物，可在一个反应中同时检测致手足口病的EV71和Cox A16型两种肠道病毒，从而显著提高手足口病检测效率和检测的灵敏性，同时简化检测过程，节约人力、物力和相关的检测成本。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种含有上述组合物的试剂盒。
[0009] 本发明的又一个目的是提供一种利用上述组合物或者试剂盒特异性检测致手足口病肠道病毒的方法。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0011] 一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物，包括下列引物：
[0012] 上游引物(P1)：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，
[0013] 下游引物(P2)：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′。
[0014] 上述上、下游引物为针对V71和Cox A16型肠道病毒的5′UTR区基因片段设计的引物。
[0015] 利用上述组合物，配合适当的探针及其它试剂，使用real time PCR方法，可以特异性地检测出样品中的EV71和Cox A16型肠道病毒5′UTR区基因片断。
[0016] 优选的，上述组合物中同时还可以包括下列探针：
[0017] EV71病毒检测探针(Probe1)：5′-荧光基团-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-荧光淬灭基团-3′，
[0018] Cox A16病毒检测探针(Probe2)：5′-荧光基团-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C。
[0019] 上述的Probe1和Probe2的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为ECLIPSE。
[0020] 为了更准确的同时鉴别检测样品中是否含有EV71和/或Cox A16型肠道病毒，上述组合物还可进一步包括针对V71和Cox A16型肠道病毒的polyprotein基因设计的特异性引物，即该组合物中除了上述引物还包括下列引物：
[0021] EV71的polyprotein基因引物：
[0022] 上游引物(P3)：5′-CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3′，
[0023] 下游引物(P4)：5′-TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3′；
[0024] Cox A16的polyprotein基因引物：
[0025] 上游引物(P5)：5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′，
[0026] 下游引物(P6)：5′-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3′。
[0027] 进一步优选的，上述组合物中同时还可以包括下列探针：
[0028] EV71病毒检测探针(Probe3)：5′-荧光基团-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-荧光淬灭基团-3′，
[0029] Cox A16病毒检测探针(Probe4)：5′-荧光基团-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAAC TT-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C；
[0030] 并且在二个探针中分别使用不同的荧光基团。
[0031] 上述探针的两对荧光基团和荧光淬灭基团可以分别是：HEX和ECLIPSE；Cy5和BHQ3。
[0032] 含有上述组合物的试剂盒，即其中含有下述引物：
[0033] 上游引物(P1)：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，
[0034] 下游引物(P2)：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′；
[0035] 同时，该试剂盒中还含有适当的探针、荧光基团FAM和荧光淬灭基团ECLIPSE，及RT-PCR反应体系。
[0036] 优选的，所述的探针包括：
[0037] EV71病毒检测探针(Probe1)：5′-荧光基团-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-荧光淬灭基团-3′，
[0038] Cox A16病毒检测探针(Probe2)：5′-荧光基团-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C。
[0039] 进一步优选的，该试剂盒还可进一步含有下述引物：
[0040] 上游引物(P3)：5′-CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3′，
[0041] 下游引物(P4)：5′-TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3′；
[0042] Cox A16的polyprotein基因引物：
[0043] 上游引物(P5)：5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′，
[0044] 下游引物(P6)：5′-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3′。
[0045] 同时，该试剂盒还可进一步含有下述探针：
[0046] EV71病毒检测探针(Probe3)：5′-荧光基团-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-荧光淬灭基团-3′，
[0047] Cox A16 病 毒 检 测 探 针 (Probe4) ：5 ′ - 荧 光 基团-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAACTT-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C；
[0048] 相应的，该试剂盒中还含有两对不同的荧光基团和荧光淬灭基团，分别是：
[0049] 第一对：HEX和ECLIPSE；
[0050] 第二对：Cy5和BHQ3。
[0051] 上述试剂盒中的RT-PCR反应体系为实时定量PCR反应体系。反应体系为20μl，5×PCR缓冲液4μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各
0.2μl、QIAGEN逆转录和聚合酶混合物1μl、模板1ul，加灭菌水至终体系20μl。
0.2μl、QIAGEN逆转录和聚合酶混合物1μl、模板1ul，加灭菌水至终体系20μl。
[0052] 利用上述组合物或试剂盒，使用real-time PCR方法，可以在一个反应中鉴别检测样品中是否含有致手足口病的EV71和/或Cox A16型肠道病毒。这大大简化了检测流程，节省了检测成本。不再需要普通PCR后续的电泳等检测过程，而直接读取结果，可更进一步简化检测过程，提高检测效率。
[0053] 如采用上述试剂盒，除了具有上述组合物所具有的效果之外，还由于试剂盒中已经包括所需试剂等的配套配置，因此，只需要操作者提供待检样品核酸样品，进行简单的常规操作即可得到检测结果，更加方便使用。
[0054] 利用上述组合物或者试剂盒检测致手足口病肠道病毒的方法，包括下述主要步骤：
[0055] (1)、提取RNA：提取样品中的肠道病毒RNA；
[0056] (2)、real-time PCR反应：以上述步骤(1)提取得到的样品中的肠道病毒RNA为模板，使用上述组合物或试剂盒，用real-time PCR法扩增EV71和Cox A16型肠道病毒特异性基因片断；
[0057] real-time PCR反应条件中，循环参数可优选为：
[0058] 50℃，逆转录30min；95℃，10min；进入循环阶段：95℃变性15s，60℃退火延伸1min，共反应40个循环。
[0059] (3)、结果分析：对上述步骤(2)real-time PCR反应的结果进行分析，得出检测结论。
[0060] 该检测方法无需进行病毒细胞培养，整个反应可在2小时内完成，大大节省了人力与时间，可用于快速检测。
[0061] 由于使用了上述组合物或者试剂盒，该检测方法还具有上述组合物或试剂盒所能够达到的所有技术效果，可特异性检测出样品中是否含有EV71和/或Cox A16型肠道病毒。
[0062] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0063] 本发明首先针对EV71和Cox A16型肠道病毒5′UTR区设计了特异性引物及相应的探针；进一步的，还分别针对V71和Cox A16型肠道病毒的polyprotein基因设计了特异性引物及相应的探针；
[0064] 在此基础上，组成可用于特异性检测样品中EV71和Cox A16型肠道病毒的组合物、含有该组合物的试剂盒、以及利用此组合物或试剂盒用于特异性检测样品中是否EV71和/或Cox A16型肠道病毒的方法。
[0065] 利用本发明的组合物或试剂盒、和/或方法检测样品时，能够灵敏、快速地检测出1
样品是否存在EV71和/或Cox A16型肠道病毒，其检测敏感度为1.0×10 拷贝每反应体系；整个反应可在2小时内完成。
样品是否存在EV71和/或Cox A16型肠道病毒，其检测敏感度为1.0×10 拷贝每反应体系；整个反应可在2小时内完成。
[0066] 而且，利用本发明的组合物或试剂盒、和/或方法检测样品，可在一个反应中同时检测致手足口病的EV71和Cox A16型两种肠道病毒，从而显著提高手足口病检测效率和检测的灵敏性，同时简化检测过程，节约人力、物力和相关的检测成本。
[0067] 此外，本发明优选方案的组合物或试剂盒中设计的特异性探针，可利用TaqMan实时荧光PCR技术进行检测，还具有自动化程度高、无需开盖检测产物、可减少产物污染的机会等特点。
附图说明
[0068] 图1是试剂盒EV71型肠道病毒5’UTR区灵敏度检测结果图。
[0069] 图2是试剂盒Cox A16型肠道病毒5’UTR区灵敏度检测结果。
[0070] 图3是试剂盒EV71型肠道病毒polyprotein基因灵敏度检测结果图。
[0071] 图4是试剂盒Cox A16型肠道病毒polyprotein基因灵敏度检测结果图。
[0072] 图5是试剂盒EV71型肠道病毒标本检测结果图。
[0073] 图6是试剂盒Cox A16型肠道病毒标本检测结果图。
[0074] 图5中：I为5’UTR区通用区扩增结果，II为EV71型Polyprotein扩增结果，III为Cox A16型Polyprotein扩增结果。
[0075] 图6中：方框内为5’UTR区通用区扩增结果，圆形内为EV71型Polyprotein扩增结果，三角形内为Cox A16型Polyprotein扩增结果。
具体实施方式
[0076] 为了特异性检测样品中致手足口病的EV71和Cox A16型肠道病毒的能力，发明人选择了两种肠道病毒的5′UTR区基因片段作为靶标序列，针对该基因序列设计了特异性引物(P1：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，P2：5′-GTCGGTTCCGC TGCAGAGT-3′)，用于本发明中。同时，为了进一步鉴别检测样品中致手足口病的EV71和Cox A16型肠道病毒，发明人选择了polyprotein基因作为靶标序列，针对该基因设计了特异性引物(P3：5′-CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3′，P4：5′-TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3′；P5：
5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′，P6：5′-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3′)，用于本发明中。
5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′，P6：5′-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3′)，用于本发明中。
[0077] 在本发明的一个实施方式中，选择P1和P2作为特异性引物，其探针为Probe1(5′-荧光基团-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-荧光淬灭基团-3′)和Probe2(5′-荧光基团-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C)，其荧光基团和荧光淬灭基团分别是FAM和ECLIPSE；选择P3和P4作为特异性引物，其探针为Probe3(5′-荧光基团-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-荧光淬灭基团-3′)，其荧光基团和荧光淬灭基团可以分别是HEX和ECLIPSE；选择P5和P6作为特异性引物，其探针为Probe4(5′-荧光基团-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACA ACTT-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C)，其荧光基团和荧光淬灭基团分别是Cy5和BHQ3。使用本发明的real-time PCR方法，在一次检测中即可完成致手足口病的EV71和Cox A16型肠道病毒的鉴别检测。其操作简便，在加入所需试剂开始反应后，不需再次开盖加样和取样，避免了污染的发生。其结果可以直接读出，而不需要后续的诸如凝胶电泳之类的操作，大大节省了检测的时间。
[0078] 下面结合具体实施例详细说明本发明的实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。
[0079] 引物和TaqMan探针的设计与合成：
[0080] 利用Genbank的Blast工具对EV71和Cox A16型肠道病毒5′UTR区和polyprotein基因进行分析，选择其保守区域作为检测靶标序列设计上述引物和探针(P1-P6，Probe1-Probe4)，设计完成后进行人工合成。以下各实施例中涉及的引物或探针，均分别来自此系列人工合成产物。
[0081] 实施例1
[0082] 一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物，由下列引物组成：
[0083] P1：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，
[0084] P2：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′。
[0085] 实施例2
[0086] 一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物，由下列引物和探针组成：
[0087] P1：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，
[0088] P2：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′；
[0089] Probe1：5′-荧光基团-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-荧光淬灭基团-3′，[0090] Probe2：5′-荧光基团-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C。
[0091] 实施例3
[0092] 一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物，由下列引物组成：
[0093] P1：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，
[0094] P2：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′；
[0095] P3：5′-CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3′，
[0096] P4：5′-TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3′；
[0097] P5：5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′，
[0098] P6：5′-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3′。
[0099] 实施例4
[0100] 一种用于检测致手足口病肠道病毒的组合物，由下列引物和探针组成：
[0101] P1：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，
[0102] P2：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′；
[0103] P3：5′-CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3′，
[0104] P4：5′-TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3′；
[0105] P5：5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′，
[0106] P6：5′-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3′；
[0107] Probe1：5′-荧光基团-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-荧光淬灭基团-3′，[0108] Probe2：5′-荧光基团-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C；
[0109] Probe3：5′-荧光基团-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-荧光淬灭基团-3′，[0110] Probe4：5′-荧光基团-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAAC TT-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C；
[0111] 实施例5
[0112] 一种用于检测致手足口病肠道病毒的试剂盒，其中含有下述引物和探针：
[0113] 上游引物(P1)：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，
[0114] 下游引物(P2)：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′；
[0115] EV71病毒检测探针(Probe1)：5′-荧光基团-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-荧光淬灭基团-3′，
[0116] Cox A16病毒检测探针(Probe2)：5′-荧光基团-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C；
[0117] 还含有荧光基团FAM和荧光淬灭基团ECLIPSE。
[0118] 反应体系为20μl，5×PCR缓冲液4μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、QIAGEN逆转录和聚合酶混合物1μl、模板1ul，加灭菌水至终体系20μl。
[0119] 实施例6
[0120] 一种用于检测致手足口病肠道病毒的试剂盒，其中含有下述引物和探针：
[0121] 上游引物(P1)：5′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，
[0122] 下游引物(P2)：5′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′；
[0123] 上游引物(P3)：5′-CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3′，
[0124] 下游引物(P4)：5′-TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3′；
[0125] 上游引物(P5)：5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′，
[0126] 下游引物(P6)：5′-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3′；
[0127] EV71病毒检测探针(Probe1)：5′-荧光基团-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-荧光淬灭基团-3′，
[0128] Cox A16病毒检测探针(Probe2)：5′-荧光基团-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C；
[0129] EV71病毒检测探针(Probe3)：5′-荧光基团-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-荧光淬灭基团-3′，
[0130] Cox A16 病 毒 检 测 探 针 (Probe4) ：5 ′ - 荧 光 基团-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAACTT-荧光淬灭基团-3′，其中，Y＝T或者C；
[0131] 还含有三对荧光基团和荧光淬灭基团，分别是：
[0132] FAM和ECLIPSE；HEX和ECLIPSE；Cy5和BHQ3；
[0133] 反应体系为20μl，5×PCR缓冲液4μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、QIAGEN逆转录和聚合酶混合物1μl、模板1ul，加灭菌水至终体系20μl。
[0134] 实施例7
[0135] 利用本发明的组合物或试剂盒，建立三重real-time PCR方法的检测体系，并对其检测敏感度及特异性等进行评价，包括下述主要步骤：
[0136] (1)样本中RNA的抽提
[0137] 利用QIAGEN公司提供的病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)，抽提手足口病毒样本中病毒RNA。-80℃保存备用。
[0138] (2)质粒标准品的构建与制备
[0139] 采用TA克隆技术构建目的质粒。在经过电泳确认扩增片段分子量后，将EV71和Cox A16型肠道病毒5′UTR区和Polyprotein基因特异性序列的PCR产物连至pMD18-T载体(日本TaKaRa公司)上，重组阳性克隆培养后抽提质粒(Omega质粒提取试剂盒)，采用pMD18-T载体的RVM引物进行测序，利用DNASTAR软件进行序列分析，并与原目的序列进行比对。序列完全正确的目的质粒用紫外分光光度法定量(Eppendorf紫外分光光度计)后，10
用1×TE(pH8.0)TE缓冲液稀释到10 拷贝/μl作为储存液，-80℃保存备用，使用时连续
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10倍稀释至浓度在1.0×10 拷贝/μl～1.0×10 拷贝/μl之间，取1μl标准品作为实
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时定量PCR的模板，使参加每个PCR反应的质粒数形成10个拷贝到10 拷贝的梯度分布。
并且使用上述设计并合成的的引物(P1-P6)和探针(Probe1-Probe4)。
用1×TE(pH8.0)TE缓冲液稀释到10 拷贝/μl作为储存液，-80℃保存备用，使用时连续
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10倍稀释至浓度在1.0×10 拷贝/μl～1.0×10 拷贝/μl之间，取1μl标准品作为实
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时定量PCR的模板，使参加每个PCR反应的质粒数形成10个拷贝到10 拷贝的梯度分布。
并且使用上述设计并合成的的引物(P1-P6)和探针(Probe1-Probe4)。
[0140] 三重real-time PCR反应体系：
[0141] 反应体系为20μl，取5×PCR缓冲液4μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、QIAGEN逆转录和聚合酶混合物1μl、模板1ul(样本中提取的核酸或者质粒标准品)，加灭菌水至终体系20μl。
[0142] PCR循环参数：50℃逆转录30min，95℃10min，进入循环阶段：95℃变性15s，60℃退火延伸1min，共反应40个循环。
[0143] 在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。
[0144] 确立三重real-time PCR方法的检测体系。
[0145] (3)检测体系的检测敏感度的评价
[0146] 以四种质粒梯度稀释作为模板，进行三重real-time PCR检测时显示，当反应体系1
中EV71和Cox A16型肠道病毒5′UTR区和Polyprotein基因在10 拷贝及以上时，其荧
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光信号强度ΔRn高于检测域值(ΔRn＝30)，其检测范围是1.0×10 ～1.0×10 拷贝每反应体系(图1-图4)，重复实验结果稳定。20例手足口病病例疱疹液标本的检测结果如图5和6所示。
中EV71和Cox A16型肠道病毒5′UTR区和Polyprotein基因在10 拷贝及以上时，其荧
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光信号强度ΔRn高于检测域值(ΔRn＝30)，其检测范围是1.0×10 ～1.0×10 拷贝每反应体系(图1-图4)，重复实验结果稳定。20例手足口病病例疱疹液标本的检测结果如图5和6所示。
[0147] (4)检测特异性的评价
[0148] 以轮状病毒、诺如病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、水痘病毒和人体基因组为模板，使用包含上述设计引物和探针的三重反应体系，评价三重TaqMan实时荧光PCR反应体系的特异性。
[0149] 利用前述检测体系对EV71和Cox A16型肠道病毒进行检测的结果可见明确的扩增曲线；对上述轮状病毒、诺如病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、水痘病毒和人体基因组进行检测时，均未产生阳性扩增曲线，说明本发明使用的引物和探针等与轮状病毒、诺如病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、水痘病毒和人体基因组不存在交叉反应。
[0150] 通过上述各实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的real-time PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如HEX、TAMRA、ROX、BHQ、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测样品中是否存在能够致手足口病的EV71和Cox A16型肠道病毒。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。