一种利用可见光促使蛋白质结晶的方法及其装置

摘要

本发明公开了一种利用可见光促使蛋白质结晶的方法及其装置，选择一定波长的LED器件，将其插接在面包板上，组成LED点阵光源；将该点阵光源安装到一个内部温度得到控制的不透光的密闭容器上方，使其光管发光方向朝向下方；接通点阵光源电源，使LED导通；根据结晶需求，配制单个或多个蛋白质结晶溶液；将这些结晶溶液放置于LED点阵光源正下方的样品台上，并使样品与LED点阵光源之间的距离保持1～20cm；将所述样品与装置控温于0～55℃条件下，并持续照射样品1～500小时；结晶完毕后，回收结晶板，观察实验结果。本发明不使蛋白质变性，不使溶液温度显著上升，蛋白质结晶的成功率提高25％以上。

权利要求

1.一种利用可见光促使蛋白质结晶的方法，其特征在于包括以下步骤：

a.装配实验装置：选择一定波长的LED器件，将其插接在面包板上，组成LED点阵光源；将该点阵光源安装到一个内部温度得到控制的不透光的密闭容器上方，使其光管发光方向朝向下方；接通点阵光源电源，使LED导通；

b.配制蛋白质结晶溶液：根据结晶需求，配制单个或多个蛋白质结晶溶液；将这些结晶溶液放置于LED点阵光源正下方的样品台上，并使样品与LED点阵光源之间的距离保持

1～20cm；

c.结晶：将所述样品与装置控温于0～55℃条件下，并持续照射样品1～500小时；结晶完毕后，回收结晶板，观察实验结果。

2.一种实现权利要求1所述方法的装置，其特征在于：采用一个内部温度得到控制的不透光的密闭容器，该容器内上方安装有光源，下方安装有样品台；光源采用LED冷光源作为光照装置的光源元器件，插接在面包板上，组成LED点阵光源；样品台提供放置样品的位置；样品是单个或多个上端透明的容器中注入的蛋白质结晶溶液。

3.根据权利要求2所述的利用可见光促使蛋白质结晶的装置，其特征在于：所述的LED器件包括所有光波长范围为400～700nm的可见光光源。

4.根据权利要求2所述的利用可见光促使蛋白质结晶的装置，其特征在于：所述的蛋白质结晶溶液是指由拟研究的活性蛋白质和结晶剂在缓冲液中混合的液体。

说明书

一种利用可见光促使蛋白质结晶的方法及其装置

技术领域

[0001] 本发明涉及一种促使蛋白质结晶的光照方法及其装置，特别是通过可见光波段的LED(发光二极管)持续照射蛋白质结晶溶液促使蛋白质结晶的方法及装置。

背景技术

[0002] 蛋白质分子的三维结构与功能研究是目前生命科学领域的前沿问题。获取蛋白质分子的三维空间结构信息对我们从分子水平理解生命现象的本质、开展基于结构的理性药物设计等工作有很重要的意义。目前人们主要通过X射线单晶衍射技术来获得蛋白质分子的三维结构，对该技术而言，首先必须得到能够对X射线产生衍射的蛋白质单晶样品。但是由于蛋白质的相对分子质量高，几何形状复杂，表面带多种电荷等特点，使蛋白质分子之间存在很多位点可供相互作用或相互结合，从而导致蛋白质的结晶比小分子和有机物的结晶困难。因此，如何获取高质量、适合衍射的蛋白质晶体仍是阻碍成功解析分子结构的难题。不过，经过长期的努力，人们在蛋白质结晶方面已经积累了许多成功的经验。

[0003] 光照诱导结晶的方法可视为一种新颖的技术。近年来的研究证实，特定条件下的光照不仅可促使有机分子的结晶，还可促使蛋白质分子的结晶，使之有可能为蛋白质分子的三维结构解析提供高质量衍射样品。在光照促使蛋白质结晶研究方面，人们已做了大量研究工作，并取得了重要进展。已有的光照促使蛋白质结晶研究局限在两个方面：(1)利用红外波段激光进行照射(800nm附近)，(2)利用大功率紫外光源(280nm附近)进行照射。两种光源由于传递能量较大，为防照射使蛋白质变性，只能对蛋白质结晶溶液进行短暂的照射。对实际蛋白质结晶而言，使用这些光源存在如下问题：首先，使用这些光源，照射时间难以控制。照射时间过长，会导致蛋白质变性，照射时间过短，又没有促使结晶的效果。其次，这些光源造价较高，不利于推广。最后，使用这些光源过程中，会产生较大热量，导致结晶溶液的温度升高。这对多数的蛋白质结晶而言，是不利的。可见，要想在实际蛋白质结晶工作中推广应用上述光源，需要克服不少障碍。如果采用可见光冷光源，可以实现对蛋白质结晶溶液的持续照射而不使蛋白质变性，从而避免上述问题。曾有可见光短暂照射蛋白质结晶溶液的报道，但没有发现促使蛋白质结晶的作用。因此，迄今尚无利用可见光持续照射蛋白质结晶溶液以促使蛋白质结晶的报道。

发明内容

[0004] 为了克服现有技术不易控制、成本高和易产生热量的不足，本发明选择LED冷光源产生单色可见光，利用该可见光，对蛋白质结晶溶液实施持续照射，促使蛋白质结晶。

[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案包括以下步骤：

[0006] a.装配实验装置：选择一定波长的LED器件，将其插接在面包板上，组成LED点阵光源。将该点阵光源安装到一个内部温度得到控制的不透光的密闭容器上方，使其光管发光方向朝向下方。接通点阵光源电源，使LED导通。

[0007] b.配制蛋白质结晶溶液：根据结晶需求，配制单个或多个蛋白质结晶溶液。将这些结晶溶液放置于LED点阵光源正下方的样品台上，并使样品与LED点阵光源之间的距离保持1～20cm。

[0008] c.结晶：将所述样品与装置控温于0～55℃条件下，并持续照射样品1～500小时。结晶完毕后，回收结晶板，观察实验结果。

[0009] 所述的LED器件包括所有光波长范围为400～700nm的可见光光源。

[0010] 所述的蛋白质结晶溶液是指由拟研究的活性蛋白质和结晶剂(即可促使蛋白质结晶的各种化学试剂，如各种盐、有机小分子及其混合物等)在缓冲液(即维持溶液pH值的溶液，如由醋酸钠和醋酸配制的特定pH值的溶液)中混合的液体，在条件适宜时，溶液中可析出晶体，实现蛋白质结晶。

[0011] 本发明还提供实现上述方法的一种装置，包括以下内容：一个内部温度得到控制的不透光的密闭容器，该容器内上方安装有光源，下方安装有样品台。光源采用LED冷光源作为光照装置的光源元器件，插接在面包板上，组成LED点阵光源。样品台提供放置样品的位置。样品是单个或多个上端透明的容器中注入的蛋白质结晶溶液。

[0012] 本发明的有益效果是：由于采用了LED冷光源，并使光源与结晶样品保持一定距离，可以实现对样品的持续照射而不产生使蛋白质变性、使溶液温度显著上升的弊端，从而可以很好地研究可见光对蛋白质结晶的影响。利用此装置进行蛋白质结晶，蛋白质结晶的成功率与现有技术无光照条件下相比平均提高25％以上。自然条件下蛋白质无法结晶的条件，通过可见光持续照射后可以生长出晶体。此装置操作简单、高效等特点使其可以应用于所有开展蛋白质结晶研究的实验室。

[0013] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

附图说明

[0014] 图1是本发明的结构示意图；

[0015] 图中：1-面包板；2-LED冷光源；3-样品台；4-结晶板。

具体实施方式

[0016] 实施例1：可见光持续照射溶菌酶结晶溶液提高溶菌酶结晶成功率[0017] 第一步：装配实验装置：选择475nm的蓝色LED冷光源作为本次实验的光源器件，将该器件插接入面包板上，构成8×12光源点阵。接入直流18V电源，使LED导通。

[0018] 第二步：配制蛋白质结晶溶液：结晶方法为标准的悬滴法。将美国Roche AppliedSciences公司的货号为837059的溶菌酶，溶于pH为7.0、浓度为25mM Tris-HCl缓冲液中，配制成浓度为10mg/ml的溶菌酶溶液。选择96孔结晶板作为结晶用容器，选择HamptonResearch公司的名为Crystal Screen HT的96条件结晶筛选试剂，选择Hampton Research公司的名为ARI Hanging Drop Seals为悬滴密封膜。分别向结晶板的96个池液孔中各滴加100μl的结晶筛选试剂。然后自上述96个池液孔中分别取0.1μl结晶筛选试剂，与0.1μl溶菌酶溶液先后滴加到悬滴密封膜的相应位置分别混合，制成96个配方各异的结晶液滴。利用悬滴密封膜密封结晶板，使密封膜上的结晶液滴悬于相应结晶筛选试剂池液的正上方，完成结晶样品的准备。将结晶板放置于点阵光源正下方，并保持点阵光源与结晶板上端之间的距离为4em。

[0019] 第三步：结晶：分别对所述结晶板与装置进行温度控制，控制温度为20℃。48小时后，回收结晶板，观察统计结晶结果。

[0020] 结果如下：光照可促使蛋白质结晶，溶菌酶结晶的成功率与已有文献报道(ThakurAS，Robin G，Guncar G，Saunders NFW，Newman J，et al(2007)PLoS ONE 2(10)：e1091.)结果相比，成功率提高了40％。

[0021] 实施例2：可见光持续照射甜味蛋白(thaumatin)结晶溶液提高其结晶成功率[0022] 第一步：装配实验装置：选择405nm的紫色LED冷光源作为本次实验的光源器件，将该器件插接入面包板上，构成8×12光源点阵。接入直流18V电源，使LED导通。

[0023] 第二步：配制蛋白质结晶溶液：结晶方法为标准的悬滴法。将美国Sigma-Aldrich公司的货号为T7638的thaumatin，溶于pH为7.0、浓度为25mM Tris-HCl缓冲液中，配制成浓度为10mg/ml的thaumatin溶液。选择96孔结晶板作为结晶用容器，选择HamptonResearch公司的名为Crystal Screen HT的96条件结晶筛选试剂，选择Hampton Research公司的名为ARI Hanging Drop Seals为悬滴密封膜。分别向结晶板的96个池液孔中各滴加100μl的结晶筛选试剂。然后自上述96个池液孔中分别取0.1μl结晶筛选试剂，与0.1μlthaumatin溶液先后滴加到悬滴密封膜的相应位置分别混合，制成96个配方各异的结晶液滴。利用悬滴密封膜密封结晶板，使密封膜上的结晶液滴悬于相应结晶筛选试剂池液的正上方，完成结晶样品的准备。将结晶板放置于点阵光源正下方，并保持点阵光源与结晶板上端之间的距离为4cm。

[0024] 第三步：结晶：分别对所述结晶板与装置进行温度控制，控制温度为20℃。48小时后，回收结晶板，观察统计结晶结果。

[0025] 结果如下：光照可促使蛋白质结晶，thaumatin结晶的成功率与已有文献报道(Thakur AS，Robin G，Guncar G，Saunders NFW，Newman J，et al(2007)PLoS ONE 2(10)：e1091.)结果相比，成功率提高了25％。