原核生物中的糖基化蛋白表达

摘要

本发明涉及包含真核糖基转移酶活性的原核宿主细胞，其中所述真核糖基转移酶活性为真核多萜醇基连接的(dolichyl-linked)UDP-GIcNAc转移酶活性和真核甘露糖基转移酶活性。还公开了如下产生糖基化蛋白的方法：提供包含真核糖基转移酶活性的原核宿主细胞并且在有效产生糖基化蛋白的条件下培养所述原核宿主细胞。本发明的另一方面涉及如下用于筛选细菌或噬菌体的方法：在细菌的表面表达一种或多种聚糖，将标记附连在所述细菌表面或在源自所述细菌的噬菌体表面的一种或多种聚糖上，并以高通量形式分析所述标记。还公开了包含识别并结合天然抗原的Fv部分和在保守的天冬酰胺残基处被糖基化的Fc部分的糖基化抗体。

权利要求

1.一种包含真核糖基转移酶活性的原核宿主细胞，其中所述真核糖基转移酶活性为真核多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性和真核甘露糖基转移酶活性。

2.如权利要求1所述的原核宿主细胞，其中所述多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性包括Alg13活性和Alg14活性。

3.如权利要求2所述的原核宿主细胞，其中所述Alg13活性是由包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的核酸分子编码。

4.如权利要求2所述的原核宿主细胞，其中所述Alg14活性是由包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核苷酸序列的核酸分子编码。

5.如权利要求1所述的原核宿主细胞，其中所述甘露糖基转移酶活性包括Alg1活性和Alg2活性。

6.如权利要求5所述的原核宿主细胞，其中所述Alg1活性是由包含SEQID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列的核酸分子编码。

7.如权利要求2所述的原核宿主细胞，其中所述Alg2活性是由包含SEQID NO：7或SEQ ID NO：8的核苷酸序列的核酸分子编码。

8.如权利要求1所述的原核宿主细胞，所述细胞还包含真核翻转酶活性。

9.如权利要求8所述的原核宿主细胞，其中所述真核翻转酶活性包括Rft1活性。

10.如权利要求2所述的原核宿主细胞，其中所述Rft1活性是由包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的核苷酸序列的核酸分子编码。

11.如权利要求1所述的原核宿主细胞，所述细胞还包含真核寡糖基转移酶活性。

12.如权利要求11所述的原核宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶活性包括STT3活性。

13.如权利要求12所述的原核宿主细胞，其中所述STT3活性是由包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的核苷酸序列的核酸分子编码。

14.如权利要求1所述的原核宿主细胞，所述细胞还包含感兴趣的蛋白。

15.如权利要求1所述的原核宿主细胞，其中所述真核糖基转移酶活性产生选自由以下组成的组的寡糖组分：GlcNAc2、Man1GlcNAc2、Man2GlcNAc2和Man3GlcNAc2。

16.一种糖蛋白，所述糖蛋白是通过如权利要求1所述的原核宿主细胞所产生。

17.一种糖蛋白轭合物，所述糖蛋白轭合物包含蛋白和至少一种融合至所述蛋白的包含D-X1-N-X2-T基序的肽，其中D是天冬氨酸，X1和X2是除脯氨酸之外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，并且T是苏氨酸。

18.一种产生糖基化蛋白的方法，所述方法包括：提供包含真核糖基转移酶活性的原核宿主细胞，其中所述真核糖基转移酶活性为真核多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性和真核甘露糖基转移酶活性；以及在有效产生糖基化蛋白的条件下培养所述原核宿主细胞。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性包括Alg13活性和Alg14活性。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述甘露糖基转移酶活性包括Alg1活性和Alg2活性。

21.如权利要求18所述的方法，其中所述原核宿主细胞还包含真核翻转酶活性。

22.如权利要求18所述的方法，其中所述真核翻转酶活性包括Rft1活性。

23.如权利要求18所述的方法，所述方法还包含真核寡糖基转移酶活性。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述寡糖基转移酶活性包括STT3活性。

25.如权利要求18所述的方法，其中所述糖基化蛋白为糖基化抗体，所述糖基化抗体包含：识别并结合天然抗原的Fv部分和

在保守的天冬酰胺残基处被糖基化的Fc部分。

26.一种用于筛选细菌或噬菌体的方法，所述方法包括：在细菌的表面上表达一种或多种聚糖；

将标记附连在所述细菌表面或在源自所述细菌的噬菌体表面上的一种或多种聚糖上；

以及

以高通量形式分析所述标记。

27.如权利要求26所述的方法，其中细菌包含糖基转移酶活性，其中所述糖基转移酶活性为多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性和甘露糖基转移酶活性。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性包括Alg13活性和Alg14活性。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述甘露糖基转移酶活性包括Alg1活性和Alg2活性。

30.如权利要求27所述的方法，其中所述细菌还包含翻转酶活性。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述翻转酶活性包括Rft1活性或PglK活性。

32.如权利要求27所述的方法，其中所述细菌还包含寡糖基转移酶活性。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述寡糖基转移酶活性包括PglB活性或STT3活性。

34.如权利要求26所述的方法，其中对细菌进行所述标记和所述分析。

35.如权利要求26所述的方法，其中对噬菌体进行所述标记和所述分析，所述方法还包括：在有效产生表面上具有一种或多种聚糖的噬菌体的条件下，用辅助噬菌体感染在细胞表面上表达一种或多种聚糖的细菌。

36.根据权利要求35所述的方法，所述方法还包括：富集在表面上具有一种或多种聚糖的噬菌体。

37.如权利要求26所述的方法，其中所述标记是用识别所述细菌或噬菌体的表面上的聚糖并且具有可检测的标记的凝集素来进行。

38.如权利要求26所述的方法，其中所述标记是用识别所述细菌或噬菌体的表面上的聚糖并且具有可检测的标记的抗体来进行。

40.一种糖基化抗体，所述糖基化抗体包含：

识别并结合天然抗原的Fv部分和

在保守的天冬酰胺残基处被糖基化的Fc部分。

41.如权利要求39所述的糖基化抗体，其中所述抗体为单克隆的。

42.如权利要求39所述的糖基化抗体，其中所述抗体为多克隆的。

说明书

原核生物中的糖基化蛋白表达

[0001] 本申请要求2008年1月3日提交的美国临时专利申请系列第61/018,772号的优先权权益，通过引用将其整体并入本文。

技术领域

[0002] 本发明涉及原核生物中的糖基化蛋白表达。

[0003] 发明背景

[0004] 糖治疗剂(Glycotherapeutic)

[0005] 目前被FDA所批准的每四种新药中就有一种为基于蛋白的治疗剂(Walsh，G.，“Biopharmaceutical Benchmarks(生物药剂基准)，”Nat Biotechnol 18：831-3(2000)；Walsh，G，“Biopharmaceutical Benchmarks(生物药剂基准)，”Nat Biotechnol 21：
865-70(2003)；和Walsh，G，“Biopharmaceutical Benchmarks(生物药剂基准)，”Nat Biotechnol 24：769-76(2006))。

[0006] 尽管有若干蛋白治疗剂可以使用诸如大肠杆菌(E.coli)的原核表达系统生产(例如，胰岛素)，但是绝大部分的治疗性蛋白需要另外的翻译后修饰来获得它们的完整生物功能，认为这些另外的翻译后修饰在原核生物中是缺乏的。具体地，预计N-连接的蛋白糖基化影响着所有真核蛋白种类的一半以上(Apweiler等人，“On the Frequency of Protein Glycosylation，as Deduced From Analysis of the SWISS-PROT Database(如由SWISS-PROT数据库分析推论的蛋白糖基化频率)，”Biochim Biophys Acta 1473：4-8(1999))并且其通常是大量蛋白的正确折叠、药代动力学稳定性、组织靶向和效力所必需的(Helenius等人，“Intracellular Functions of N-linked Glycans(N-连接的聚糖的细胞内功能)，”Science 291：2364-9(2001))。由于大多数细菌不糖基化其自身蛋白，所以包括抗体在内的大部分治疗相关的糖蛋白的表达归属于哺乳动物细胞。然而，哺乳动物细胞培养具有许多的缺点，包括：(i)与细菌相比，真核宿主如CHO细胞的极高的制造成本和低的体积产率；(ii)逆转录病毒污染；(iii)需要相对较长的时间来产生稳定的细胞系；(iv)相对而言不能经由遗传修饰快速产生稳定的、“高产”的真核细胞系；和(v)在使用具有内源的非人糖基化途径的宿主细胞如CHO时引起的由糖形异质性而产生的高的产物变异性(Choi等人，“Use of Combinatorial Genetic Libraries to Humanize N-linked Glycosylation in the Yeast Pichia pastoris(使用组合的基因文库人源化巴斯德毕赤酵母中的N-连接的糖基化)，”Proc Natl Acad Sci U S A100：5022-7(2003))。另一方面，大肠杆菌中的表达则不具有这些局限性。

[0007] 大肠杆菌中的糖基化治疗性蛋白的表达

[0008] 目前，许多治疗性重组蛋白是使用大肠杆菌作为宿主生物体表达的。最好的例子之一是人胰岛素，它是在1982年由Eli Lilly在大肠杆菌中首次产生的。自那时起，在美国和欧洲批准了依赖于大肠杆菌表达的大量人治疗性蛋白，包括人生长激素(hGH)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素样生长因子(IGF-1、IGFBP-3)、角质形成细胞生长因子、干扰素(IFN-α、IFN-β1b、IFN-γ1b)、白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-11)、组织坏死因子(TNF-α)和组织纤溶酶原激活物(tPA)。然而，几乎所有的糖蛋白都在哺乳动物细胞中产生。当正常糖基化的蛋白在大肠杆菌中表达时，在该宿主中糖基化的缺乏可能产生功能受损的蛋白。例如，未糖基化的(aglycosylated)人单克隆抗体(mAb)(例如，抗组织因子IgG1)可以在大肠杆菌中以可溶形式和高水平表达(Simmons等人，“Expression of Full-length Immunoglobulins in Escherichia coli：Rapid and Efficient Production of Aglycosylated Antibodies(在大肠杆菌中全长免疫球蛋白的表达：非糖基化的抗体的快速且有效的产生，”J Immunol Methods 263：133-47(2002))。然而，尽管大肠杆菌来源的mAb保持与其关联抗原(cognate antigen)和新生儿受体紧密结合并且表现出与哺乳动物细胞来源的抗体相当的循环半衰期，但是它们由于缺乏N-聚糖而不能够结合C1q和FcγRI受体。

[0009] 真核和原核的N-连接的蛋白糖基化

[0010] N-连接的蛋白糖基化是在真核生物体内质网(ER)中发生的必需的且保守的过程(Burda等人，“The Dolichol Pathway of N-linked Glycosylation (N-连接的糖基化的多萜醇途径)，”Biochim Biophys Acta 1426：239-57(1999))。它对于分泌蛋白和膜蛋白的蛋白折叠、寡聚化、质量控制、分选和运输是重要的(Helenius等人，“Intracellular Functions of N-linked Glycans(N-连接的聚糖的细胞内功能)，”Science 291：2364-9(2001))。真核的N-连接的蛋白糖基化途径(图1)可以划分为两个不同的过程：
(i)在内质网膜装配脂质连接的寡糖；以及(ii)将寡糖从脂质锚定物多萜醇基焦磷酸(dolichyl pyrophosphate)转移到新生多肽的选定的天冬酰胺残基上。N-连接的蛋白糖基化的特征在真核生物中是高度保守的，所述特征即(i)使用多萜醇基焦磷酸(Dol-PP)作为寡糖装配的载体；(ii)仅转移完全装配的Glc3Man9GlcNAc2寡糖；以及(iii)以序列N-X-S/T为特征的天冬酰胺残基的识别，其中N为天冬酰胺，X为除脯氨酸外的任何氨基酸，并且S/T为丝氨酸/苏氨酸(Gavel等人，“Sequence Differences Between Glycosylated and Non-glycosylated Asn-X-Thr/Ser Acceptor Sites：Implications for Protein Engineering(糖基化和非糖基化的Asn-X-Thr/Ser受体位点之间的序列差异：对蛋白质工程的暗示)，”Protein Eng 3：433-42(1990))。寡糖基转移酶(OST)催化寡糖从脂质供体多萜醇基焦磷酸转移至受体蛋白。在酵母中，已经鉴定了在体内构成复合体的8种不同的膜蛋白(Kelleher等人，“An Evolving View of the Eukaryotic Oligosaccharyltransferase(真核寡糖基转移酶的发展观点)，”Glycobiology 16：
47R-62R(2006))。认为STT3代表OST的催化亚基(Nilsson等人，“Photocross-linking of Nascent Chains to the STT3 Subunit of the Oligosaccharyltransferase Complex(寡糖基转移酶复合体的STT3亚基的新生链的光交联)，”J Cell Biol 161：715-25(2003)和Yan等人，“Studies on the Function of Oligosaccharyl Transferase Subunits.Stt3p is Directly Involved in the Glycosylation Process(对寡糖基转移酶亚基的功能的研究，Stt3p直接参与了糖基化过程)，”J Biol Chem 277：47692-700(2002))。
它是OST复合体中最保守的亚基(Burda等人，“The Dolichol Pathway of N-linked Glycosylation(N-连接的糖基化的多萜醇途径)，”Biochim Biophys Acta1426：
239-57(1999))。

[0011] 相反地，细菌中糖基化途径的缺乏已大大限制原核表达宿主用于制备治疗性蛋白的效用，尤其是由于“最终将发现自然界中所有蛋白的一半以上是糖蛋白”的某些估计(Apweiler等人，“On the Frequency of Protein Glycosylation，as Deduced From Analysis of the SWISS-PROT Database(如由SWISS-PROT数据库分析推论的蛋白糖基化频率)，”Biochim Biophys Acta1473：4-8(1999))。然而，最近发现致病细菌空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的基因组编码N-连接的蛋白糖基化的途径(Szymanski等人，“Protein Glycosylation in Bacterial Mucosal Pathogens(细菌粘膜病原体中的蛋白糖基化)，”Nat Rev Microiol 3：225-37(2005))。用于此途径的基因是在1999年由Szymanski及其同事首次鉴定的(Szymanski等人，“Evidence for a System of General Protein Glycosylation in Campylobacter jejuni(空肠弯曲杆菌中一般蛋白糖基化系统的证据)，”Mol Microbiol 32：1022-30(1999))，所述基因包含用于蛋白糖基化的称为pgl的17-kb基因座。在pgl基因座的发现之后，2002年Linton等人鉴定出了两种空肠弯曲杆菌糖蛋白PEB3和CgpA，并且显示诸如这些的空肠弯曲杆菌来源的糖蛋白与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-特异性的凝集素大豆凝集素(SBA)结合(Linton等人，“Identification of N-acetylgalactosamine-containing Glycoproteins PEB3 and CgpA in Campylobacter jejuni(空肠弯曲杆菌中含N-乙酰半乳糖胺的糖蛋白PEB3和CgpA的鉴定，”Mol Microbiol 43：497-508(2002))。此后不久，Young等人鉴定出了30余种可能的空肠弯曲杆菌糖蛋白，包括PEB3和CgbA，并且使用质谱和NMR揭示了N-连接的聚糖是具有结构 GalNAc- 1，4-GalNAc- 1，4-[Glcβ1，3]GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，
3-Bac-β1，N-Asn(GalNAc5GlcBac，其中Bac为bacillosamine或2，4-二乙酰氨基-2，4，
6-三脱氧葡萄糖)的七糖(Young等人，“Structure of the N-linked Glycan Present on Multiple Glycoproteins in the Gram-negative Bacterium，Campylobacter jejuni(在革兰氏阴性菌空肠弯曲杆菌中的多种糖蛋白上存在的N-连接的聚糖的结构)，”J Biol Chem 277：42530-9(2002))(图2)。支链七糖是通过在内膜的胞质侧在脂质载体十一异戊二烯焦磷酸上连续添加核苷酸活化的糖而合成(Feldman等人，“Engineering N-linked Protein Glycosylation with Diverse O Antigen Lipopolysaccharide Structures in Escherichia coli(在大肠杆菌中具有不同的O抗原脂多糖结构的工程化的N-连接的蛋白的糖基化)，”Proc Natl Acad Sci U S A 102：3016-21(2005))，并且支链七糖一经装配便被推定的ATP结合盒(ABC)转运蛋白WlaB翻转跨过膜(Alaimo等人，“Two Distinct But Interchangeable Mechanisms for Flipping of Lipid-linked Oligosaccharides(翻转脂-连接的寡糖的两种不同但可互换的机制)，”Embo J 25：967-76(2006)和Kelly等人，“Biosynthesis of the N-linked Glycan in Campylobacter jejuni and Addition Onto Protein Through Block Transfer(空肠弯曲杆菌中N-连接的聚糖的生物合成及其通过整块转移向蛋白的添加)，”J Bacteriol 188：2427-34(2006))。接着，将七糖转移至周质中的底物蛋白是由被称为PglB的OST催化的，PglB是与真核OSTSTT3的催化亚基具有显著序列相似性的单一的整合膜蛋白(Young等人，“Structure of the N-linked Glycan Present on Multiple Glycoproteins in the Gram-negative Bacterium，Campylobacter jejuni(在革兰氏阴性菌空肠弯曲杆菌中的多种糖蛋白上存在的N-连接的聚糖的结构)，”J Biol Chem277：42530-9(2002))。PglB将七糖连接至基序D/E-X1-N-X2-S/T(其中D/E是天冬氨酸/谷氨酸，X1和X2是除脯氨酸之外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，并且S/T是丝氨酸/苏氨酸)中的天冬酰胺上，该基序为与真核糖基化过程中所用的(N-X-S/T)类似的序列肽段(Kowarik等人，“Definition of the Bacterial N-glycosylation Site Consensus Sequence(细菌N-糖基化位点共有序列的定义)，”Embo J 25：1957-66(2006))。

[0012] 微生物的糖工程化(Glycoengineering)

[0013] 在哺乳动物、酵母或甚至细菌宿主细胞中表达治疗性糖蛋白时遇到的主要问题是非人的聚糖的添加。例如，生产治疗性糖蛋白的两种最常用的系统之一酵母将高度免疫原性的甘露聚糖型N-聚糖(含有最多一百个甘露糖残基)转移至重组糖蛋白。哺乳动物表达系统还可以用如下的非人的糖残基修饰治疗性蛋白：例如N-糖基神经氨酸(Neu5Gc)形式的唾液酸(在CHO细胞和在牛奶中产生)或末端α(1，3)-半乳糖(Gal)(在鼠细胞中产生)。重复施用携带非人的糖的治疗性蛋白能够在人中引起不利的反应，包括免疫反应。

[0014] 作为对使用天然糖基化系统用于产生治疗性糖蛋白的替代，糖工程化的表达系统的可用性可以打开定制治疗性蛋白的糖基化之门，并且可以导致改良的治疗性糖蛋白的开发。这种系统将具有消除不希望的聚糖的可能并且进行高度均一性的人糖基化。至今为止，只对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行了糖工程化以提供具有控制和优化特定治疗功能的糖基化的能力的表达系统(Gerngross，T.U.，“Advances in the Production of Human Therapeutic Proteins in Yeasts and Filamentous fungi(在酵母和丝状真菌中生产人治疗性蛋白的进展)，”Nat Biotechnol 22：1409-14(2004)；Hamilton等人，“Glycosylation Engineering in Yeast：The Advent of Fully Humanized Yeast(酵母中的糖基化工程：完全人源化的酵母的到来)，”Curr Opin Biotechnol 18：387-92(2007)；以及Wildt等人，“The Humanization of N-glycosylation Pathways in Yeast(酵母中N-糖基化途径的人源化)，”Nat Rev Microbiol 3：119-28(2005))。

[0015] 例如，使用了一组糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株来生产多种糖形的单克隆抗体Rituxan(抗-CD20 IgG1抗体)(Li等人，“Optimization of Humanized IgGs in Glycoengineered Pichia pastoris(糖工程化的巴斯德毕赤酵母中人源化IgG的优化)，”Nat Biotechnol 24：210-5(2006))。尽管这些抗体具有与商购的Rituxan相同的氨基酸序列，但是特定的糖形显示出约100倍高的对相关FcγRIII受体的结合亲和力并且表现出改良的体外人B细胞清除(Li等人，“Optimization of Humanized IgGs in Glycoengineered Pichia pastoris(糖工程化的巴斯德毕赤酵母中人源化IgG的优化)，”Nat Biotechnol24：210-5(2006))。糖工程化的巴斯德毕赤酵母的巨大成功和潜力并非没有一些缺点。例如，在酵母和所有其他真核生物中，N-连接的糖基化是生存力所必需的(Herscovics等人，“Glycoprotein Biosynthesis in Yeast(酵母中的糖蛋白生物合成)，”FASEB J 7：540-50(1993)和Zufferey等人，“STT3，a Highly Conserved Protein Required for Yeast Oligosaccharyl Transferase Activity In Vivo(STT3，体内酵母寡糖基转移酶活性所需的高度保守的蛋白)，”EMBO J 14：4949-60(1995))。因此，Gerngross及其同事将许多不希望的酵母N-糖基化反应系统地消除并且再工程化(Choi等人，“Use of Combinatorial Genetic Libraries to Humanize N-linked Glycosylation in the Yeast Pichia pastoris(使用组合的基因文库人源化巴斯德毕赤酵母中的N-连接的糖基化)，”Proc Natl Acad Sci U S A 100：5022-7(2003))产生了与野生型先祖相比“生病”的菌株。这在高水平的糖蛋白表达期间可能恶化，因为巨大的代谢负荷被置于酵母糖基化系统上。结果，在大规模发酵期间可以获得的细胞产率受到了限制。此外，甘露聚糖型N-聚糖的消除只是酵母中糖基化事件的一半。这是因为酵母还进行O-连接的糖基化，其中O-聚糖连接在糖蛋白中的Ser或Thr残基上(Gentzsch等人，“The PMT Gene Family：Protein O-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae is Vital(PMT基因家族：酿酒酵母中的蛋白O-糖基化是至关重要的)，”EMBO J 15：5752-9(1996))。与N-连接的糖基化一样，O-糖基化是生存力所必需的(Gentzsch等人，“The PMT Gene Family：Protein O-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae is Vital(PMT基因家族：酿酒酵母中的蛋白O-糖基化是至关重要的)，”EMBOJ 15：5752-9(1996))并且因此不能从糖工程化的酵母中被基因删除。由于酵母与人的O-糖基化机制之间存在差异，所以通过糖工程化的酵母菌株对O-聚糖的可能的添加具有引发包括免疫反应在内的不利反应的可能性。

[0016] 近来，Aebi及其同事将空肠弯曲杆菌糖基化基因座转移到大肠杆菌中并且赋予这些细胞用N-聚糖在翻译后修饰蛋白的突出能力(Wacker等人，“N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化及其向大肠杆菌中的功能转移)，”Science 298：1790-3(2002))。然而，尽管原核与真核的糖基化机制具有功能类似性，但是原核糖基化机构所附连的寡糖链(GalNAc5GlcBac)在结构上与真核糖基化途径所附连的寡糖链是不同的(Szymanski等人，“Protein Glycosylation in Bacterial Mucosal Pathogens(细菌粘膜病原体中的蛋白糖基化)，”Nat Rev Microbiol 3：225-37(2005)；Young等人，“Structure of the N-linked Glycan Present on Multiple Glycoproteins in the Gram-negative Bacterium，Campylobacter jejuni(在革兰氏阴性菌空肠弯曲杆菌中的多种糖蛋白上存在的N-连接的聚糖的结构)，”J Biol Chem 277：42530-9(2002)；和Weerapana等人，“Asparagine-linked Protein Glycosylation：From Eukaryotic to Prokaryotic Systems(天冬酰胺连接的蛋白糖基化：从真核系统到原核系统)，”Glycobiology 16：
91R-101R(2006))。已进行大量尝试(未成功)来重新设计具有真核N-糖基化途径的大肠杆菌以表达具有结构上同源的类人聚糖的N-连接的糖蛋白。

[0017] 本发明针对于克服本领域内的缺陷。

[0018] 发明概述

[0019] 本发明的第一方面涉及包含真核糖基转移酶活性的原核宿主细胞，其中所述真核糖基转移酶活性为真核多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性和真核甘露糖基转移酶活性。

[0020] 本发明的一个方面涉及糖蛋白轭合物，所述糖蛋白轭合物包含蛋白和融合至所述蛋白的包含D-X1-N-X2-T基序的至少一种肽，其中D是天冬氨酸，X1和X2是除脯氨酸之外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，并且T是苏氨酸。

[0021] 本发明的另一方面涉及产生糖基化蛋白的方法。此方法包括提供包含真核糖基转移酶活性的原核宿主细胞，其中所述真核糖基转移酶活性为真核多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性和真核甘露糖基转移酶活性。然后在有效产生糖基化蛋白的条件下培养所述原核宿主细胞。

[0022] 本发明的再一方面涉及用于筛选细菌或噬菌体的方法。此方法包括在细菌的表面表达一种或多种聚糖并且将标记连接在所述细菌表面上的或在源自所述细菌的噬菌体表面上的一种或多种聚糖上。然后以高通量形式分析所述标记。

[0023] 本发明的另一方面涉及糖基化的抗体，所述糖基化的抗体包含识别并结合天然抗原的Fv部分和在保守的天冬酰胺残基处被糖基化的Fc部分。

[0024] 本发明的一个方面涉及重新设计的具有表达N-连接的糖蛋白的N-糖基化途径的原核宿主，所述N-连接的糖蛋白具有结构上同源的类人聚糖。原核宿主细胞可以包含多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶和甘露糖基转移酶形式的糖基转移酶活性。在一些实施方式中，UDP-GlcNAc转移酶包括alg13和alg14基因活性。在其他实施方式中，甘露糖基转移酶包括alg1和alg2基因活性。在另外的实施方式中，原核宿主细胞包含翻转酶活性，包括pglK和rft1。在其他实施方式中，原核宿主细胞包含至少一种寡糖基转移酶活性，如pglB和STT3。

[0025] 在优选的方面，本发明使得用于设计、发现和开发糖蛋白诊断剂和治疗剂的技术商业化。具体地，本发明提供了用于开发在微生物细胞中有效产生可靠的人糖蛋白的低成本策略，有可能彻底改革制造治疗性蛋白的相关企业。在多个方面，本发明的糖工程化细菌能够立体特异性地产生N-连接的糖蛋白。在一个实施方式中，细菌被编码新颖糖基化途径的一组基因遗传工程化，所述新颖糖基化途径能够在特定天冬酰胺受体位点有效地糖基化靶蛋白(例如，N-连接的糖基化)。使用这些特定工程化的细胞系，实质上可以表达和糖基化任何任何感兴趣的重组蛋白，因此产生大量可靠的人糖蛋白是可能的。

[0026] 此外，本发明提供了用于使糖结构的变换工程化的专有平台技术，从而首次使得“细菌糖蛋白工程化”成为可能。糖工程化的一个期望-有意操纵蛋白缔合的碳水化合物来改变蛋白的药代动力学性质-是阐明生物学现象中的糖基化作用。因此，在多个方面，本发明提供用于研究、工业和治疗应用的新颖糖轭合物和免疫刺激剂的生物技术合成。

[0027] 不像酵母和所有其他的真核生物，大肠杆菌作为糖蛋白表达宿主的主要优点为不存在内在糖基化系统。因此，糖基化相关基因的添加(或随后的去除)应该对糖工程化的大肠杆菌细胞的生存力具有极小的影响乃至没有影响。此外，在这些细胞中消除了通过内源性糖基化反应将非人聚糖附连至靶蛋白的可能性。

[0028] 因此，在多个实施方式中，公开了对于糖蛋白表达的替代，其中使用原核宿主细胞来产生N-连接的糖蛋白，这为避免与真核细胞培养有关的重要障碍提供了诱人的解决方法。预期细菌作为生产载体的使用产生结构上同源的类人N-聚糖，而同时显著地降低了与蛋白药物的开发和制造有关的成本和时间。

[0029] 其他重要的优点包括：(i)关于细菌遗传操作的大容量数据；(ii)建立了使用细菌生产蛋白的以往记录-自2003年以来被FDA批准的蛋白治疗剂的30％是在大肠杆菌细菌中制备的；以及(iii)在细菌生产蛋白药物的大量公司内的现有基础设施。

[0030] 与各种真核蛋白表达系统相比，使用本发明的方法和组合物所采用的方法提供了可量的有成本效益的优化的重组糖蛋白表达，其不含人病原体、不含免疫原性N-连接的和O-连接的糖基化反应、能够快速克隆并且具有快的生长速率、快的倍增时间(约20分钟)、高生长(高OD)、高的效价和蛋白产率(在50％的总可溶蛋白(TSP)的范围内)、容易从周质或上清液中纯化产物、遗传上易处理、研究彻底、与广泛的表达优化方法(例如，启动子工程化、mRNA稳定法、伴侣分子共表达、蛋白酶清除等)相容。

[0031] 附图简述

[0032] 图1图解了酿酒酵母中脂连接的寡糖的生物合成方案及其向内质网膜的蛋白的转移。指出了各反应所需的位置。指出了直接来自GDP甘露糖(浅色阴影)或是来自多萜醇磷酸甘露糖(深色阴影)的甘露糖基来源。参见Burda等人，“The Dolichol Pathway of N-linked Glycosylation(N连接的糖基化的多萜醇途径)，”Biochim Biophys Acta 1426：239-57(1999)，通过引用将其整体并入本文)。

[0033] 图2图解了在细菌中N-连接的糖蛋白的生物合成科学。在空肠弯曲杆菌中，N-连接的糖基化通过将核苷酸激活的糖连续添加至脂质载体上而进行，从而导致支链七糖的形成。然后通过PglK(以前的WlaB)这种聚糖被翻转跨过内膜，然后OTase PglB催化该聚糖转移至天冬酰胺侧链。Bac为2，4-二乙酰胺基-2，4，6-脱氧葡萄糖；GalNAc是N-乙酰半乳糖胺；HexNAc是N-乙酰己糖胺；Glc是葡萄糖。参见Szymanski等人，“Protein Glycosylation in Bacterial Mucosal Pathogens(细菌粘膜病原体中的蛋白糖基化)，”Nat Rev Microbiol 3：225-37(2005)，通过引用将其整体并入本文。

[0034] 图3A-B是糖工程化大肠杆菌中的糖基化PEB3的蛋白质印迹照片。携带C末端6×his标签的空肠弯曲杆菌糖基化底物PEB3在大肠杆菌细胞周质中表达，并从其中纯化，所述大肠杆菌细胞共表达来自pACYC184-pgl(pgl+)的一整组pgl基因或缺乏编码必需OTase的pglB基因的经修饰的pgl基因集簇(pgl-)。如通过使用抗多组氨酸抗体的蛋白质印迹所证明的，在pgl+和pgl-细胞中均检测出了纯化的PEB3(图3A)。然而，根据与GalNAc-特异性的凝集素SBA结合，PEB3只在pgl+细胞中被糖基化，而来自pgl-细胞的PEP3为未糖基化的(图3B)。纯化的PEB3被如所指示进行系列稀释。

[0035] 图4A-D显示大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)糖基化的结果。图4A显示肽的糖基化标签。图4B显示下列蛋白的抗-His蛋白质印迹(由左至右)：具有C末端GlycTag(GT)的MBP、空肠弯曲杆菌糖蛋白cjAcrA、具有N末端GT的MBP、无分泌信号肽的MBP C末端GT以及各自具有C末端GT和Tat特异性(ssTorA)信号肽的MBP & GFP。从糖工程化大肠杆菌(pgl+，泳道2除外)中Ni-纯化蛋白并用抗-HIS血清进行免疫印迹。图4C显示使用抗-Hept血清的针对细菌七糖的蛋白质印迹。图4D显示出MBP C末端GT(左)和MBP N末端GT(右)的多种N-聚糖的至少三个离散条带特征。

[0036] 图5A-C描绘pgl+大肠杆菌中的糖基化IgG M18.1的结果。图5A显示在CH2的Asn297处的糖基化导致IgG的Fc区构象改变，所述IgG的Fc区赋予对合适的受体分子的结合以引发效应物功能。使用蛋白-A-G树脂柱(Pierce)对从pgl-(图5B)和pgl+(图5C)大肠杆菌纯化的IgG M18.1进行蛋白质印迹分析。使样品在非还原性12％SDS凝胶中电泳，并用抗人IgG和hR6P抗血清进行免疫印迹。

[0037] 图6A显示了糖蛋白表面展示和经由糖蛋白特异性抗血清(hR6P)证实pgl+和pgl-细胞中CjaA糖基化的蛋白质印迹分析的示意图。图6B显示七糖经由WaaL介导的与脂质A的连接向外表面转移。图6C显示使用流式细胞术进行的SBA-Alexa Fluor标记的定量。

[0038] 图7为根据本发明的糖噬菌体(glycophage)系统的示意性实例。显示了编码用于脂连接的寡糖合成、用于寡糖转移(OTase)、和用于受体scFv-g3p融合蛋白的蛋白的质粒或噬菌粒。寡糖在质膜的胞质部位(cyt)的脂质载体细菌萜醇焦磷酸(bactoprenylpyrophosphate)上装配(由个体的糖基转移酶催化)。然后，寡糖跨越内膜(IM)易位至周质空间(Per)并通过寡糖基转移酶转移至受体蛋白的特定天冬酰胺残基。在用辅助噬菌体VCSM13感染后，使展示糖基化受体蛋白的噬菌体(糖噬菌体)结合至固定的大豆凝集素(SBA)上并用半乳糖洗脱。使用被洗脱的糖噬菌体来感染大肠杆菌(F+)细胞，针对噬菌粒上存在的抗生素抗性所述大肠杆菌细胞被选择。可以根据ori M13的存在和随后噬菌粒被包装入噬菌体粒子，将噬菌体的糖表型与任何所需步骤的基因型相联系。Dhfr为二氢叶酸还原酶；bla为β-内酰胺酶；cat为氯霉素乙酰转移酶。

[0039] 图8A-D表示通过免疫检测显像的pgl+(图8A和8C)和pglmut(图8B和8D)细胞中AcrA-g3p的时间依赖性表达和糖基化。由未诱导的细胞(泳道1)或由用50mM阿拉伯糖诱导1h(泳道2)、3h(泳道3)、5h(泳道4)和16h(泳道5)的细胞制备全细胞裂解物。通过10％SDS-PAGE分离蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜。用AcrA特异性抗体(图8A-8B)或用R12抗血清(图8C-8D)显像AcrA-g3p和糖基化的AcrA-g3p(糖-AcrA)。右侧显示MW标准参照物。

[0040] 图9A显示通过SBA生物淘选(biopanning)进行的糖噬菌体富集的定量。将由能糖基化(pgl，黑色柱)或不能糖基化(pulmut，灰色柱)的细胞制备的噬菌体应用于SBA柱纯化。如在TG1细胞感染后所测定的，表示SBA淘选步骤的各级分中存在的菌落形成单位(cfu)的总量的值为至少三次独立实验的平均值。应用于SBA淘选的噬菌体的量和大肠杆菌感染后所得的cfu改变小于6％。级分1，施加至SBA柱的cfu；级分2，SBA流穿物；级分3和4，PBS洗涤步骤；级分5、6和7，用在PBS中的30mM半乳糖进行的洗涤步骤；级分8、9和10，用在PBS中的300mM半乳糖进行的洗脱步骤。图9B是噬菌体上展示的AcrA-g3p和糖基化的AcrA-g3p(糖-AcrA-g3p)的免疫检测照片。由pgl+细胞(组a、c)或pglmut细胞(组b、d)产生噬菌体并将其应用于SBA淘选(panning)。用抗AcrA(组a、b)或用R12抗血清(组c、d)对AcrA和糖基-AcrA的存在进行显像。泳道1，粗噬菌体制备物；泳道2；
SBA流穿物；泳道3和4，用PBS进行的洗涤级分；泳道5至7，用在PBS中的30mM半乳糖进行的洗涤级分；泳道8至10，用在PBS中的300mM半乳糖进行的洗脱级分。在泳道1至4
8
中，将1×10 个噬菌体应用于SDS-PAGE。在泳道5至10中，分别使用了从pgl+(部分a、c)
7 4 3 6 6 6
制备的3.5×10、1.2×10、4.0×10、1.3×10、2.5×10、1.2×10 个噬菌体或从pglmut
6 3 3 3 4 3
细胞(部分b、d)制备的1.5×10、3.5×10、3.0×10、4.5×10、0.5×10、1.5×10 个噬菌体。右侧显示MW标准参照物。通过SBA淘选获得的噬菌体的量和应用于SDS-PAGE的噬菌体的量改变小于±6％。

[0041] 图10A-10B是描绘大肠杆菌中聚糖工程化的示意图。图10A显示了从细菌糖形到哺乳动物糖形的进化轨迹。图10B显示Man3GlcNAc2核心糖形的生物合成及其向细菌底物蛋白转移的途径。

[0042] 图11A-B是描绘大肠杆菌中Alg13/14的表达的蛋白质印迹的照片。图11A显示用检测Alg13-his的抗his抗体探测来自野生型大肠杆菌细胞的可溶性胞质部分进行的蛋白质印迹分析。图11B显示用检测Alg14-FLAG的抗FLAG抗体探测从野生型细胞和ΔdnaJ细胞分离的不同部分进行的蛋白质印迹分析。在诱导后0、1、2和3小时(hours post induction，hpi)收集Alg13的样品并且在3hpi时收集Alg14的样品。通过如下制备样品：以20,000×g离心裂解的细胞20分钟并收集作为可溶性部分的上清液和作为不溶性部分的沉淀(insol)。对于Alg14，将可溶部分再以100,000×g旋转1hr，收集分别作为可溶部分(sol)和膜部分(mem)的上清液和沉淀。

[0043] 图12是描绘大肠杆菌中Alg1和Alg2的表达的蛋白质印迹照片。这些蛋白质印迹是在3、4和5hpi时从ΔdnaJ细胞收获的膜部分的蛋白质印迹。用抗his抗体探测印迹。

[0044] 图13是Alg1的野生型核苷酸序列与密码子优化的核苷酸序列之间的比对。

[0045] 图14是Alg2的野生型核苷酸序列与密码子优化的核苷酸序列之间的比对。

[0046] 图15是Alg13的野生型核苷酸序列与密码子优化的核苷酸序列之间的比对。

[0047] 图16是Alg14的野生型核苷酸序列与密码子优化的核苷酸序列之间的比对。

[0048] 图17是Rft1的野生型核苷酸序列与密码子优化的核苷酸序列之间的比对。

[0049] 图18是Sttc3的野生型核苷酸序列与密码子优化的核苷酸序列之间的比对。

[0050] 发明详述

[0051] 定义

[0052] 提供了下列术语和方法的定义以更好地描述本公开内容并在本公开内容的实施中指导本领域的普通技术人员。

[0053] 除非另外解释，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然相似于或者等同于本文描述的那些方法和材料的方法和材料可以在本公开内容的实施或测试中使用，但是下面对合适的方法和材料予以描述。材料、方法和实施例仅为示例性的并且不旨在限制。本公开内容的其他特征从下列详细说明和权利要求中是明显的。

[0054] 除非文中清楚地另外指明，否则如本文所用的“包含”意指“包括”并且单数形式“一个”或“一种”或“所述”包括多个指示物。例如，提到“包含细胞”是指包括一个或多个此类细胞。除非文中清楚地另外指明，否则术语“或”是指所陈述的替代性要素的单个要素或两个或多个要素的组合。

[0055] 关于糖蛋白的术语“类人”是指附连有连接至蛋白的天冬酰胺残基的酰胺氮(N-连接的)的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的蛋白，该蛋白与人中所产生的蛋白类似或甚至相同。

[0056] “N-聚糖”或“N-连接的聚糖”是指N-连接的寡糖结构。N-聚糖可以被附连至可以在体外或体内进一步操作的蛋白或合成的糖蛋白中间体上。糖蛋白上所发现的主要的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰-神经氨酸(NeuAc))。

[0057] 除非另外指明，并且作为本文所述的在一般形式“SEQ ID NO：”之下的所有序列的实例，“包含SEQ ID NO：1的核酸”是指如下的核酸：它的至少一部分具有(i)SEQ ID NO：1的序列，或(ii)与SEQ ID NO：1互补的序列。这两者之间的选择由上下文指明。例如，如果核酸用作探针，则在这两者之间的选择通过该探针与所期望的靶互补的需求来指明。

[0058] “分离的”或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合的聚合物)或糖蛋白是基本上从与其天然的宿主细胞中天然地伴随着内在多核苷酸的其他细胞组分(例如，其天然地伴随的核糖体、聚合酶和基因组序列)中分离的核酸或多核苷酸或糖蛋白。该术语包括如下的核酸、多核苷酸：(1)从其天然存在的环境中移出的；(2)不与其中“分离的多核苷酸”在自然中被发现的多核苷酸的全部或部分缔合的；(3)可操作地连接至其自然情况下不连接的多核苷酸的；或(4)在自然中不存在的。术语“分离的”或“基本上纯的”还可以用于指重组的或克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统以生物方式合成的多核苷酸类似物。

[0059] 然而，“分离的”并非必然要求如此描述的核酸、多核苷酸或糖蛋白本身从其天然环境物理地移出。例如，如果将异源序列置于邻近内源核酸序列使得此内源核酸序列的表达被改变，则生物体基因组中的该内源核酸序列被认为是“分离的”。在此背景中，异源序列是不天然邻近于内源核酸序列的序列，无论该异源序列为本身内源的(源自相同的宿主细胞或其后代)或外源的(源自不同的宿主细胞或其后代)。通过举例，启动子序列可以替代(例如，通过同源重组)宿主细胞基因组中基因的内在启动子以使此基因具有改变的表达模式。此基因现在将变为“分离的”，因为其与至少一些天然在其两侧的序列分离。

[0060] 如果核酸含有基因组中的相应核酸非天然存在的任何修饰，则该核酸也被认为是“分离的”。例如，如果内源编码序列含有通过例如人类干涉人工引入的插入、缺失或点突变，则该内源编码序列被认为是“分离的”。“分离的核酸”还包括在异源位点整合至宿主细胞染色体中的核酸和作为附加体存在的核酸构建体。此外，“分离的核酸”在通过重组技术产生时可以基本上不含其它细胞材料或基本上不含培养基或者在化学合成时可以基本上不含化学前体或其他化学物质。

[0061] 糖基化工程

[0062] 本发明的第一方面涉及包含真核糖基转移酶活性的原核宿主细胞，其中所述真核糖基转移酶活性为真核多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性和真核甘露糖基转移酶活性。

[0063] 本发明的原核宿主细胞具有真核多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性，该转移酶活性可以包括Alg13活性和Alg14活性。所述Alg13活性和Alg14活性是用野生型核苷酸序列或密码子优化的序列获得。如图10B中所示，这些酶用于将GlcNAc单元添加至细菌萜醇。alg13野生型核酸分子具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列：

[0064] atgggtattattgaagaaaaggctctttttgttacgtgtggggcaacggtgccatttccaaagctcgtctcatgtgtgctaagcgacgaattctgccaagaattgattcaatatggattcgtacgtctaatcattcagtttgggagaaactacagttctgaatttgagcatttagtgcaagaacgcgggggccaaagagaaagccaaaaaattccaattgaccagtttggctgtggcgacaccgcaagacagtatgtcctgatgaacgggaaattaaaggtgatcgggtttgacttttcgaccaagatgcaaagtattatacgtgattattcagatttggtcatatcacacgctggaacgggctctatactagattctctacggttgaataaaccgttgatagtttgcgtaaacgattctttgatggataaccaccagcagcagatagcagacaagtttgtagagttgggctacgtatggtcttgtgcacccactgaaacaggtttgatagctggtttacgtgcatctcaaacagagaaactcaaaccattcccagtttctcataacccgtcatttgagcgattgctagttgaaactatatacagctag。

[0065] alg13密码子优化的核酸分子具有如下的SEQ ID NO：2的核苷酸序列：

[0066] ATGGGTATCATCGAAGAAAAAGCTCTGTTCGTTACCTGCGGTGCTACCGTTCCGTTCCCGAAACTGGTTTCTTGCGTTCTGTCTGACGAATTCTGCCAGGAACTGATCCAGTACGGTTTCGTTCGTCTGATCATCCAGTTCGGTCGTAACTACTCTTCTGAATTCGAACACCTGGTTCAGGAACGTGGTGGTCAGCGTGAATCTCAGAAAATCCCGATCGACCAGTTCGGTTGCGGTGACACCGCTCGTCAGTACGTTCTGATGAACGGTAAACTGAAAGTTATCGGTTTCGACTTCTCTACCAAAATGCAGTCTATCATCCGTGACTACTCTGACCTGGTTATCTCTCACGCTGGTACCGGTTCTATCCTGGACTCTCTGCGTCTGAACAAACCGCTGATCGTTTGCGTTAACGACTCTCTGATGGACAACCACCAGCAGCAGATCGCTGACAAATTCGTTGAACTGGGTTACGTTTGGTCTTGCGCTCCGACCGAAACCGGTCTGATCGCTGGTCTGCGTGCTTCTCAGACCGAAAAACTGAAACCGTTCCCGGTTTCTCACAACCCGTCTTTCGAACGTCTGCTGGTTGAAACCATCTACTCTTAA

[0067] alg14野生型核酸分子具有如下的SEQ ID NO：3的核苷酸序列：

[0068] atgaaaacggcctacttggcgtcattggtgctcatcgtatcgacagcatatgttattaggttgatagcgattctgccttttttccacactcaagcaggtacagaaaaggatacgaaagatggagttaacctactgaaaatacgaaaatcgtcaaagaaaccgctcaagatttttgtattcttaggatcgggaggtcatactggtgaaatgatccgtcttctagaaaattaccaggatcttttactgggtaagtcgattgtgtacttgggttattctgatgaggcttccaggcaaagattcgcccactttataaaaaaatttggtcattgcaaagtaaaatactatgaattcatgaaagctagggaagttaaagcgactctcctacaaagtgtaaagaccatcattggaacgttggtacaatcttttgtgcacgtggttagaatcagatttgctatgtgtggttcccctcatctgtttttattgaatgggcctggaacatgctgtataatatccttttggttgaaaattatggaacttcttttgcccctgttgggttcctcccatatagtttatgtagaatcgctggcaaggattaatactcctagtctgaccggaaaaatattatattgggtagtggatgaattcattgtccagtggcaagaattgagggacaattatttaccaagatccaagtggttcggcatccttgtttaa

[0069] alg14密码子优化的核酸分子具有如下的SEQ ID NO：4的核苷酸序列：

[0070] ATGAAAACCGCTTACCTGGCTTCTCTGGTTCTGATCGTTTCTACCGCTTACGTTATCCGTCTGATCGCTATCCTGCCGTTCTTCCACACCCAGGCTGGTACCGAAAAAGACACCAAAGACGGTGTTAACCTGCTGAAAATCCGTAAATCTTCTAAAAAACCGCTGAAAATCTTCGTTTTCCTGGGTTCTGGTGGTCACACCGGTGAAATGATCCGTCTGCTGGAAAACTACCAGGACCTGCTGCTGGGTAAATCTATCGTTTACCTGGGTTACTCTGACGAAGCTTCTCGTCAGCGTTTCGCTCACTTCATCAAAAAATTCGGTCACTGCAAAGTTAAATACTACGAATTCATGAAAGCTCGTGAAGTTAAAGCTACCCTGCTGCAGTCTGTTAAAACCATCATCGGTACCCTGGTTCAGTCTTTCGTTCACGTTGTTCGTATCCGTTTCGCTATGTGCGGTTCTCCGCACCTGTTCCTGCTGAACGGTCCGGGTACCTGCTGCATCATCTCTTTCTGGCTGAAAATCATGGAACTGCTGCTGCCGCTGCTGGGTTCTTCTCACATCGTTTACGTTGAATCTCTGGCTCGTATCAACACCCCGTCTCTGACCGGTAAAATCCTGTACTGGGTTGTTGACGAATTCATCGTTCAGTGGCAGGAACTGCGTGACAACTACCTGCCGCGTTCTAAATGGTTCGGTATCCTGGTTTAA。

[0071] 本发明的原核宿主细胞具有真核甘露糖基转移酶活性，所述真核甘露糖基转移酶活性包括Alg1活性和Alg2活性。所述Alg1活性和Alg2活性是用如下的野生型核酸分子或密码子优化的核酸分子序列获得。如图10B中所示，这些酶将甘露糖单元添加至GlcNAc单元。alg1野生型核酸分子具有如下的SEQ ID NO：5的核苷酸序列：

[0072] atgtttttggaaattcctcggtggttacttgccttaataatattatacctttccataccgttagtggtttattatgttataccctacttgttttatggcaacaagtcgaccaaaaaaaggatcatcatatttgtgctgggtgatgtaggacactctccaaggatatgctatcacgctataagtttcagtaagttaggttggcaagtcgagctatgcggttatgtggaggacactctacccaaaattatttccagtgatccaaatatcaccgtccatcatatgtcaaacttgaaaagaaagggaggcggaacatcagttatatttatggtaaagaaggtgctttttcaagttttaagtattttcaaattactttgggaattgagaggaagcgattacatactagttcaaaatccaccgagcatacccattcttccgattgctgtgctatacaagttgaccggttgtaaactaattattgattggcacaatctagcatattcgatattgcaactaaaatttaaaggaaacttttaccatcctttagtgttgatatcttacatggtagagatgatattcagcaaatttgctgattataacttgactgttactgaagcaatgaggaaatatttaattcaaagctttcacttgaatccaaagagatgtgctgttctctacgaccgcccggcttcccaatttcaacctttggcaggtgacatttctcgtcaaaaagccctaactaccaaagcctttataaagaattatattcgcgatgattttgatacagaaaaaggcgataaaattattgtgacttcaacatcattcacccctgatgaagatattggtattttattaggtgccctaaagatttacgaaaactcttatgtcaaatttgattcaagtttgcctaagatcttgtgttttataacgggtaaaggaccactaaaggagaaatatatgaagcaagtagaagaatatgactggaagcgctgtcaaatcgaatttgtgtggttgtcagcagaggattacccaaagttattacaattatgcgattacggagtttccctgcatacttcaagttcagggttggacctgccaatgaaaattttagatatgtttggctcaggtcttcctgttattgcaatgaactatccagtgcttgacgaattagtacaacacaatgtaaatgggttaaaatttgttgatagaagggagcttcatgaatctctgatttttgctatgaaagatgctgatttataccaaaaattgaagaaaaatgtaacgcaggaagctgagaacagatggcaatcaaattgggaacgaacaatgagagatttgaagctaattcattga。

[0073] alg1密码子优化的核酸分子具有如下的SEQ ID NO：6的核苷酸序列：

[0074] ATGTTCCTGGAAATCCCGCGTTGGCTGCTGGCTCTGATCATCCTGTACCTGTCTATCCCGCTGGTTGTTTACTACGTTATCCCGTACCTGTTCTACGGTAACAAATCTACCAAAAAACGTATCATCATCTTCGTTCTGGGTGACGTTGGTCACTCTCCGCGTATCTGCTACCACGCTATCTCTTTCTCTAAACTGGGTTGGCAGGTTGAACTGTGCGGTTACGTTGAAGACACCCTGCCGAAAATCATCTCTTCTGACCCGAACATCACCGTTCACCACATGTCTAACCTGAAACGTAAAGGTGGTGGTACCTCTGTTATCTTCATGGTTAAAAAAGTTCTGTTCCAGGTTCTGTCTATCTTCAAACTGCTGTGGGAACTGCGTGGTTCTGACTACATCCTGGTTCAGAACCCGCCGTCTATCCCGATCCTGCCGATCGCTGTTCTGTACAAACTGACCGGTTGCAAACTGATCATCGACTGGCACAACCTGGCTTACTCTATCCTGCAGCTGAAATTCAAAGGTAACTTCTACCACCCGCTGGTTCTGATCTCTTACATGGTTGAAATGATCTTCTCTAAATTCGCTGACTACAACCTGACCGTTACCGAAGCTATGCGTAAATACCTGATCCAGTCTTTCCACCTGAACCCGAAACGTTGCGCTGTTCTGTACGACCGTCCGGCTTCTCAGTTCCAGCCGCTGGCTGGTGACATCTCTCGTCAGAAAGCTCTGACCACCAAAGCTTTCATCAAAAACTACATCCGTGACGACTTCGACACCGAAAAAGGTGACAAAATCATCGTTACCTCTACCTCTTTCACCCCGGACGAAGACATCGGTATCCTGCTGGGTGCTCTGAAAATCTACGAAAACTCTTACGTTAAATTCGACTCTTCTCTGCCGAAAATCCTGTGCTTCATCACCGGTAAAGGTCCGCTGAAAGAAAAATACATGAAACAGGTTGAAGAATACGACTGGAAACGTTGCCAGATCGAATTCGTTTGGCTGTCTGCTGAAGACTACCCGAAACTGCTGCAGCTGTGCGACTACGGTGTTTCTCTGCACACCTCTTCTTCTGGTCTGGACCTGCCGATGAAAATCCTGGACATGTTCGGTTCTGGTCTGCCGGTTATCGCTATGAACTACCCGGTTCTGGACGAACTGGTTCAGCACAACGTTAACGGTCTGAAATTCGTTGACCGTCGTGAACTGCACGAATCTCTGATCTTCGCTATGAAAGACGCTGACCTGTACCAGAAACTGAAAAAAAACGTTACCCAGGAAGCTGAAAACCGTTGGCAGTCTAACTGGGAACGTACCATGCGTGACCTGAAACTGATCCACTAA。

[0075] Alg2野生型核酸分子具有如下的SEQ ID NO：7的核苷酸序列：

[0076] atgattgaaaaggataaaagaacgattgcttttattcatccagacctaggtattgggggcgctgaaaggttagtcgtcgatgcagcattaggtctacagcaacaaggacatagtgtaatcatctatactagtcactgtgataaatcacattgtttcgaagaagttaaaaacggccaattaaaagtcgaagtttatggtgattttttaccgacaaactttttgggtcgtttttttattgttttcgcaacaattagacagctttatttagttattcaattgatcctacagaaaaaagtgaatgcgtaccaattaattatcattgatcaactgtctacatgtattccgcttctgcatatctttagttctgccactttgatgttttattgtcatttccccgaccaattattggctcaaagagctgggctattgaagaaaatatacagactaccatttgacttaatagaacagttttccgtgagtgctgccgatactgttgtggtaaattcaaatttcactaagaatacgttccaccaaacgttcaagtatttatccaatgatccagacgtcatttatccatgcgtggatttatcaacaatcgaaattgaagatattgacaagaaatttttcaaaacagtgtttaacgaaggcgatagattttacctaagtataaatcgttttgagaaaaaaaaggatgttgcgctggctataaaggcttttgcgttatctgaagatcaaatcaatgacaacgttaagttagttatttgcggtggttatgacgagagggttgcagaaaatgtggagtacttgaaggaactacagtctctggccgatgaatacgaattatcccatacaaccatatactaccaagaaataaagcgcgtctccgatttagagtcattcaaaaccaataatagtaaaattatatttttaacttccatttcatcatctctgaaagaattactgctcgaaagaaccgaaatgttattgtatacaccagcatatgagcactttggtattgttcctttagaagccatgaaattaggtaagcctgtactagcagtaaacaatggaggtcctttggagactatcaaatcttacgttgctggtgaaaatgaaagttctgccactgggtggctaaaacctgccgtccctattcaatgggctactgcaattgatgaaagcagaaagatcttgcagaacggttctgtgaactttgagaggaatggcccgctaagagtcaagaaatacttttctagggaagcaatgactcagtcatttgaagaaaacgtcgagaaagtcatatggaaagaaaaaaagtattatccttgggaaatattcggtatttcattctctaattttattttgcatatggcatttataaaaattctacccaataatccatggcccttcctatttatggccacttttatggtattatattttaagaactacttatggggaatttactgggcatttgtattcgctctctcctacccttatgaagaaatataa。

[0077] Alg2密码子优化的核酸分子具有如下的SEQ ID NO：8的核苷酸序列：

[0078] ATGATCGAAAAAGACAAACGTACCATCGCTTTCATCCACCCGGACCTGGGTATCGGTGGTGCTGAACGTCTGGTTGTTGACGCTGCTCTGGGTCTGCAGCAGCAGGGTCACTCTGTTATCATCTACACCTCTCACTGCGACAAATCTCACTGCTTCGAAGAAGTTAAAAACGGTCAGCTGAAAGTTGAAGTTTACGGTGACTTCCTGCCGACCAACTTCCTGGGTCGTTTCTTCATCGTTTTCGCTACCATCCGTCAGCTGTACCTGGTTATCCAGCTGATCCTGCAGAAAAAAGTTAACGCTTACCAGCTGATCATCATCGACCAGCTGTCTACCTGCATCCCGCTGCTGCACATCTTCTCTTCTGCTACCCTGATGTTCTACTGCCACTTCCCGGACCAGCTGCTGGCTCAGCGTGCTGGTCTGCTGAAAAAAATCTACCGTCTGCCGTTCGACCTGATCGAACAGTTCTCTGTTTCTGCTGCTGACACCGTTGTTGTTAACTCTAACTTCACCAAAAACACCTTCCACCAGACCTTCAAATACCTGTCTAACGACCCGGACGTTATCTACCCGTGCGTTGACCTGTCTACCATCGAAATCGAAGACATCGACAAAAAATTCTTCAAAACCGTTTTCAACGAAGGTGACCGTTTCTACCTGTCTATCAACCGTTTCGAAAAAAAAAAAGACGTTGCTCTGGCTATCAAAGCTTTCGCTCTGTCTGAAGACCAGATCAACGACAACGTTAAACTGGTTATCTGCGGTGGTTACGACGAACGTGTTGCTGAAAACGTTGAATACCTGAAAGAACTGCAGTCTCTGGCTGACGAATACGAACTGTCTCACACCACCATCTACTACCAGGAAATCAAACGTGTTTCTGACCTGGAATCTTTCAAAACCAACAACTCTAAAATCATCTTCCTGACCTCTATCTCTTCTTCTCTGAAAGAACTGCTGCTGGAACGTACCGAAATGCTGCTGTACACCCCGGCTTACGAACACTTCGGTATCGTTCCGCTGGAAGCTATGAAACTGGGTAAACCGGTTCTGGCTGTTAACAACGGTGGTCCGCTGGAAACCATCAAATCTTACGTTGCTGGTGAAAACGAATCTTCTGCTACCGGTTGGCTGAAACCGGCTGTTCCGATCCAGTGGGCTACCGCTATCGACGAATCTCGTAAAATCCTGCAGAACGGTTCTGTTAACTTCGAACGTAACGGTCCGCTGCGTGTTAAAAAATACTTCTCTCGTGAAGCTATGACCCAGTCTTTCGAAGAAAACGTTGAAAAAGTTATCTGGAAAGAAAAAAAATACTACCCGTGGGAAATCTTCGGTATCTCTTTCTCTAACTTCATCCTGCACATGGCTTTCATCAAAATCCTGCCGAACAACCCGTGGCCGTTCCTGTTCATGGCTACCTTCATGGTTCTGTACTTCAAAAACTACCTGTGGGGTATCTACTGGGCTTTCGTTTTCGCTCTGTCTTACCCGTACGAAGAAATCTAA

[0079] 本发明的原核宿主细胞具有Rft1活性形式的真核翻转酶活性。如图10B中所示，Rft1(或PglK)将GlcNAc单元和甘露糖单元的寡糖装配体从原核宿主内膜的胞质侧转移至周质侧。Rft1野生型核酸分子具有SEQ ID NO：9的核苷酸序列：

[0080] atggcgaaaaaaaactcacaattgccctctactagtgagcagatcttggaaaggtccacaacaggagctaccttcctcatgatgggccaacttttcaccaaactggtaacgttcatactaaataatttgttgatcaggtttctgtcgcccagaattttcggtatcacggcctttctagaatttatacagggcacagtgttattttttagcagagatgcgattcgtctgtcgacgttgagaatctcagactccggtaatggaataatcgatgatgacgacgaggaggagtaccaggaaactcattacaagtctaaagttttgcaaaccgcagtcaattttgcttacattccgttttggatcgggtttccactgtccattggtcttatcgcctggcagtacagaaacatcaacgcgtatttcatcactcttccattcttcaggtggtcgatttttcttatctggctgagtatcatcgtggagctgttaagcgagccattcttcatcgtcaaccagtttatgttgaactatgccgcaaggtcaagatttgaaagcatcgcggtgactacaggatgtattgtcaattttatagttgtttatgccgttcagcaatcccgctacccaatgggggttgtcacatcggacattgacaaagaaggcatcgccatattggcatttgccttgggaaagttagcacattcgatcaccctgctagcatgttactactgggactatctcaagaatttcaaaccaaagaaattgttcagtaccaggctaacgaagataaaaacgcgtgaaaataacgaattgaagaaaggctacccaaagagcacatcttattttttccaaaacgacattttacagcacttcaaaaaagtttattttcaactatgttttaagcatttgttgacagagggtgataagttgattatcaattctttatgtactgtggaagaacaaggcatttacgctctattgtcgaactatggatcgctactaacaagattattatttgcgccgatcgaagaatctctgcggttatttttggcccgtttattatcctcgcataaccctaaaaatttaaaactatctattgaagtcctggtgaatttaacaaggttttacatatacttatcgttaatgatcattgtatttgggcctgccaattcatcctttttattgcagttcttgattggctcgaaatggtccactacttccgttttggacactataagagtctactgcttttacatcccatttttatcgcttaatggtatttttgaagcttttttccagagtgtagccactggtgaccaaattttgaaacattcatattttatgatggccttttctggtattttcctgctcaattcctggcttcttattgaaaaactcaaactatcaatcgaaggcttgatattgagtaacatcattaacatggtgttgagaatattgtattgtggagttttcttgaataaatttcatagggaactgtttacagattcctcttttttcttcaattttaaggatttcaaaacagttattattgctggctcaacgatctgtctacttgactggtggtttattgggtacgttaaaaatttacaacaatttgttgttaacgtattattcgcaatgggattgttagcgttaattttggtcaaggagcgccaaaccatacaatcttttattaacaagagggcggtttccaattctaaagatgtataa。

[0081] rft1密码子优化的核酸分子具有如下的SEQ ID NO：10的核苷酸序列：

[0082] ATGGCTAAAAAAAACTCTCAGCTGCCGTCTACCTCTGAACAGATCCTGGAACGTTCTACCACCGGTGCTACCTTCCTGATGATGGGTCAGCTGTTCACCAAACTGGTTACCTTCATCCTGAACAACCTGCTGATCCGTTTCCTGTCTCCGCGTATCTTCGGTATCACCGCTTTCCTGGAATTCATCCAGGGTACCGTTCTGTTCTTCTCTCGTGACGCTATCCGTCTGTCTACCCTGCGTATCTCTGACTCTGGTAACGGTATCATCGACGACGACGACGAAGAAGAATACCAGGAAACCCACTACAAATCTAAAGTTCTGCAGACCGCTGTTAACTTCGCTTACATCCCGTTCTGGATCGGTTTCCCGCTGTCTATCGGTCTGATCGCTTGGCAGTACCGTAACATCAACGCTTACTTCATCACCCTGCCGTTCTTCCGTTGGTCTATCTTCCTGATCTGGCTGTCTATCATCGTTGAACTGCTGTCTGAACCGTTCTTCATCGTTAACCAGTTCATGCTGAACTACGCTGCTCGTTCTCGTTTCGAATCTATCGCTGTTACCACCGGTTGCATCGTTAACTTCATCGTTGTTTACGCTGTTCAGCAGTCTCGTTACCCGATGGGTGTTGTTACCTCTGACATCGACAAAGAAGGTATCGCTATCCTGGCTTTCGCTCTGGGTAAACTGGCTCACTCTATCACCCTGCTGGCTTGCTACTACTGGGACTACCTGAAAAACTTCAAACCGAAAAAACTGTTCTCTACCCGTCTGACCAAAATCAAAACCCGTGAAAACAACGAACTGAAAAAAGGTTACCCGAAATCTACCTCTTACTTCTTCCAGAACGACATCCTGCAGCACTTCAAAAAAGTTTACTTCCAGCTGTGCTTCAAACACCTGCTGACCGAAGGTGACAAACTGATCATCAACTCTCTGTGCACCGTTGAAGAACAGGGTATCTACGCTCTGCTGTCTAACTACGGTTCTCTGCTGACCCGTCTGCTGTTCGCTCCGATCGAAGAATCTCTGCGTCTGTTCCTGGCTCGTCTGCTGTCTTCTCACAACCCGAAAAACCTGAAACTGTCTATCGAAGTTCTGGTTAACCTGACCCGTTTCTACATCTACCTGTCTCTGATGATCATCGTTTTCGGTCCGGCTAACTCTTCTTTCCTGCTGCAGTTCCTGATCGGTTCTAAATGGTCTACCACCTCTGTTCTGGACACCATCCGTGTTTACTGCTTCTACATCCCGTTCCTGTCTCTGAACGGTATCTTCGAAGCTTTCTTCCAGTCTGTTGCTACCGGTGACCAGATCCTGAAACACTCTTACTTCATGATGGCTTTCTCTGGTATCTTCCTGCTGAACTCTTGGCTGCTGATCGAAAAACTGAAACTGTCTATCGAAGGTCTGATCCTGTCTAACATCATCAACATGGTTCTGCGTATCCTGTACTGCGGTGTTTTCCTGAACAAATTCCACCGTGAACTGTTCACCGACTCTTCTTTCTTCTTCAACTTCAAAGACTTCAAAACCGTTATCATCGCTGGTTCTACCATCTGCCTGCTGGACTGGTGGTTCATCGGTTACGTTAAAAACCTGCAGCAGTTCGTTGTTAACGTTCTGTTCGCTATGGGTCTGCTGGCTCTGATCCTGGTTAAAGAACGTCAGACCATCCAGTCTTTCATCAACAAACGTGCTGTTTCTAACTCTAAAGACGTTTAA。

[0083] 本发明的原核宿主细胞具有STT3活性形式的真核寡糖基转移酶活性。如在图10B中所示，STT3酶(或PlgB酶)将寡糖装配体从内膜运输至受体蛋白，该受体蛋白被运输至宿主细胞的外膜。STT3野生型核酸分子具有SEQ ID NO：11的核苷酸序列：

[0084] atgggatccgaccggtcgtgtgttttgtctgtgtttcagaccatcctcaagctcgtcatcttcgtggcgatttttggggctgccatatcatcacgtttgtttgcagtcatcaaatttgagtctattatccatgaattcgacccctggttcaattatagggctaccaaatatctcgtcaacaattcgttttacaagtttttgaactggtttgacgaccgtacctggtaccccctcggaagggttactggagggactttatatcctggtttgatgacgactagtgcgttcatctggcacgccctgcgcaactggttgggcttgcccattgacatcagaaacgtttgtgtgctatttgcgccactattttctggggtcaccgcctgggcgacttacgaatttacgaaagagattaaagatgccagcgctgggcttttggctgctggttttatagccattgtccccggttatatatctagatcagtggcggggtcctacgataatgaggccattgccattacactattaatggtcactttcatgttttggattaaggcccaaaagactggctctatcatgcacgcaacgtgtgcagctttattctacttctacatggtgtcggcttggggtggatacgtgttcatcaccaacttgatcccactccatgtctttttgctgattttgatgggcagatattcgtccaaactgtattctgcctacaccacttggtacgctattggaactgttgcatccatgcagatcccatttgtcggtttcctacctatcaggtctaacgaccacatggccgcattgggtgttttcggtttgattcagattgtcgccttcggtgacttcgtgaagggccaaatcagcacagctaagtttaaagtcatcatgatggtttctctgtttttgatcttggtccttggtgtggtcggactttctgccttgacctatatggggttgattgccccttggactggtagattttattcgttatgggataccaactacgcaaagatccacattcctatcattgcctccgtttccgaacatcaacccgtttcgtggcccgctttcttctttgatacccactttttgatctggctattccccgccggtgtattcctactattcctcgacttgaaagacgagcacgtttttgtcatcgcttactccgttctgtgttcgtactttgccggtgttatggttagattgatgttgactttgacaccagtcatctgtgtgtccgccgccgtcgcattgtccaagatatttgacatctacctggatttcaagacaagtgaccgcaaatacgccatcaaacctgcggcactactggccaaattgattgtttccggatcattcatcttttatttgtatcttttcgtcttccattctacttgggtaacaagaactgcatactcttctccttctgttgttttgccatcacaaaccccagatggtaaattggcgttgatcgacgacttcagggaagcgtactattggttaagaatgaactctgatgaggacagtaaggttgcagcgtggtgggattacggttaccaaattggtggcatggcagacagaaccactttagtcgataacaacacgtggaacaatactcacatcgccatcgttggtaaagccatggcttcccctgaagagaaatcttacgaaattctaaaagagcatgatgtcgattatgtcttggtcatctttggtggtctaattgggtttggtggtgatgacatcaacaaattcttgtggatgatcagaattagcgagggaatctggccagaagagataaaagagcgtgatttctataccgcagagggagaatacagagtagatgcaagggcttctgagaccatgaggaactcgctactttacaagatgtcctacaaagatttcccacaattattcaatggtggccaagccactgacagagtgcgtcaacaaatgatcacaccattagacgtcccaccattagactacttcgacgaagtttttacttccgaaaactggatggttagaatatatcaattgaagaaggatgatgcccaaggtagaactttgagggacgttggtgagttaaccaggtcttctacgaaaaccagaaggtccataaagagacctgaattaggcttgagagtctaa

[0085] STT3密码子优化的核酸分子具有如下的SEQ ID NO：12的核苷酸序列：

[0086] ATGGGTTCTGACCGTTCTTGCGTTCTGTCTGTTTTCCAGACCATCCTGAAACTGGTTATCTTCGTTGCTATCTTCGGTGCTGCTATCTCTTCTCGTCTGTTCGCTGTTATCAAATTCGAATCTATCATCCACGAATTCGACCCGTGGTTCAACTACCGTGCTACCAAATACCTGGTTAACAACTCTTTCTACAAATTCCTGAACTGGTTCGACGACCGTACCTGGTACCCGCTGGGTCGTGTTACCGGTGGTACCCTGTACCCGGGTCTGATGACCACCTCTGCTTTCATCTGGCACGCTCTGCGTAACTGGCTGGGTCTGCCGATCGACATCCGTAACGTTTGCGTTCTGTTCGCTCCGCTGTTCTCTGGTGTTACCGCTTGGGCTACCTACGAATTCACCAAAGAAATCAAAGACGCTTCTGCTGGTCTGCTGGCTGCTGGTTTCATCGCTATCGTTCCGGGTTACATCTCTCGTTCTGTTGCTGGTTCTTACGACAACGAAGCTATCGCTATCACCCTGCTGATGGTTACCTTCATGTTCTGGATCAAAGCTCAGAAAACCGGTTCTATCATGCACGCTACCTGCGCTGCTCTGTTCTACTTCTACATGGTTTCTGCTTGGGGTGGTTACGTTTTCATCACCAACCTGATCCCGCTGCACGTTTTCCTGCTGATCCTGATGGGTCGTTACTCTTCTAAACTGTACTCTGCTTACACCACCTGGTACGCTATCGGTACCGTTGCTTCTATGCAGATCCCGTTCGTTGGTTTCCTGCCGATCCGTTCTAACGACCACATGGCTGCTCTGGGTGTTTTCGGTCTGATCCAGATCGTTGCTTTCGGTGACTTCGTTAAAGGTCAGATCTCTACCGCTAAATTCAAAGTTATCATGATGGTTTCTCTGTTCCTGATCCTGGTTCTGGGTGTTGTTGGTCTGTCTGCTCTGACCTACATGGGTCTGATCGCTCCGTGGACCGGTCGTTTCTACTCTCTGTGGGACACCAACTACGCTAAAATCCACATCCCGATCATCGCTTCTGTTTCTGAACACCAGCCGGTTTCTTGGCCGGCTTTCTTCTTCGACACCCACTTCCTGATCTGGCTGTTCCCGGCTGGTGTTTTCCTGCTGTTCCTGGACCTGAAAGACGAACACGTTTTCGTTATCGCTTACTCTGTTCTGTGCTCTTACTTCGCTGGTGTTATGGTTCGTCTGATGCTGACCCTGACCCCGGTTATCTGCGTTTCTGCTGCTGTTGCTCTGTCTAAAATCTTCGACATCTACCTGGACTTCAAAACCTCTGACCGTAAATACGCTATCAAACCGGCTGCTCTGCTGGCTAAACTGATCGTTTCTGGTTCTTTCATCTTCTACCTGTACCTGTTCGTTTTCCACTCTACCTGGGTTACCCGTACCGCTTACTCTTCTCCGTCTGTTGTTCTGCCGTCTCAGACCCCGGACGGTAAACTGGCTCTGATCGACGACTTCCGTGAAGCTTACTACTGGCTGCGTATGAACTCTGACGAAGACTCTAAAGTTGCTGCTTGGTGGGACTACGGTTACCAGATCGGTGGTATGGCTGACCGTACCACCCTGGTTGACAACAACACCTGGAACAACACCCACATCGCTATCGTTGGTAAAGCTATGGCTTCTCCGGAAGAAAAATCTTACGAAATCCTGAAAGAACACGACGTTGACTACGTTCTGGTTATCTTCGGTGGTCTGATCGGTTTCGGTGGTGACGACATCAACAAATTCCTGTGGATGATCCGTATCTCTGAAGGTATCTGGCCGGAAGAAATCAAAGAACGTGACTTCTACACCGCTGAAGGTGAATACCGTGTTGACGCTCGTGCTTCTGAAACCATGCGTAACTCTCTGCTGTACAAAATGTCTTACAAAGACTTCCCGCAGCTGTTCAACGGTGGTCAGGCTACCGACCGTGTTCGTCAGCAGATGATCACCCCGCTGGACGTTCCGCCGCTGGACTACTTCGACGAAGTTTTCACCTCTGAAAACTGGATGGTTCGTATCTACCAGCTGAAAAAAGACGACGCTCAGGGTCGTACCCTGCGTGACGTTGGTGAACTGACCCGTTCTTCTACCAAAACCCGTCGTTCTATCAAACGTCCGGAACTGGGTCTGCGTGTTTAA。

[0087] 真核蛋白尤其膜蛋白在大肠杆菌和其他细菌中的成功表达是一项非凡的任务(Baneyx等人，“Recombinant Protein Folding and Misfolding in Escherichia coli(大肠杆菌中的重组蛋白折叠和错折叠)，”Nat Biotechnol22：1399-1408((2004)，通过引用将其整体并入本文)。因此，必须对大量的问题进行考虑以获得正确折叠和正确定位的蛋白(例如，插入内膜中)的高表达产率。所有这些因素共同地限定真核蛋白在大肠杆菌细胞内表达时是否具有功能。

[0088] 在本发明的一个实施方式中，可以对真核糖基转移酶进行密码子优化以克服与大肠杆菌(和其他细菌)和更高等生物体(如酵母和哺乳动物细胞)之间密码子使用偏倚性相关的局限。密码子使用偏倚性是指生物体之间在编码蛋白的DNA序列(基因)中密码子出现频率的差异。密码子是编码多肽链中特定氨基酸残基的一系列三核苷酸(三联体)。密码子优化可以通过做出特定颠换核苷酸改变，即嘌呤至嘧啶或嘧啶至嘌呤的核苷酸改变或通过做出转换核苷酸改变，即嘌呤至嘌呤或嘧啶至嘧啶的核苷酸改变来达成。对应于野生型真核多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶(SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：3)、真核甘露糖基转移酶(SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：7)、真核翻转酶(SEQ ID NO：9)和真核寡糖基转移酶(SEQ ID NO：11)的示例性密码子优化的核酸分子分别以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12在上面列出。

[0089] 图13至18是分别显示Alg1、Alg2、Alg3、Alg4、Rft1和Sttc3的野生型序列中经受颠换和转换改变而获得密码子优化的核苷酸序列的具体核苷酸序列的比对。序列比对中显示了示例性的优化序列，并且将其识别为“优化的”并且将野生型序列识别为“问题的”。野生型序列中核苷酸改变的位置使用下列惯例来显示：“|”表示未改变的核苷酸(即，野生型序列的核苷酸在优化的序列中没有改变)；“*”表示颠换改变的位置(例如，腺嘌呤“A”改变为胞嘧啶“C”或胸腺嘧啶“T”；鸟嘌呤“G”改变为C或T；C改变为A或G；以及T改变为A或G)；并且“#”表示转换改变的位置(例如，A至G或G至A；C至T或T至C)。尽管示例性的优化序列显示在图13至18的每一个中，然而本领域的技术人员将容易理解获得密码子优化序列并不需要进行所有标记出的核苷酸改变，并且在颠换改变的情况下，在每个位置两种核苷酸的改变是可能的(即，嘌呤可以改变为任一嘧啶(C或T)并且嘧啶可以改变为任一嘌呤(A或G))。

[0090] 包含序列的alg基因的核酸分子和同源物、变体和衍生物与SEQ IDNO：6具有至少75％同一性、与SEQ ID NO：8具有至少77％同一性、与SEQ IDNO：2具有至少77％同一性并且与SEQ ID NO：4具有至少77％同一性。

[0091] 在另一实施方式中，本发明的核酸分子编码由SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的多核苷酸编码的多肽。优选地，所述核酸分子编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8至少75％、77％、80％、85％、90％或95％相同的多肽序列，并且同一性值升至80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％或甚至更高。

[0092] 在其他实施方式中，翻转酶基因的核酸分子、同源物、变体以及衍生物具有对SEQ ID NO：10至少76％同一性的核苷酸序列。此外，本发明的核酸分子编码由SEQ ID NO：10的多核苷酸编码的多肽。优选地，所述核酸分子编码与SEQ ID NO：10至少76％、80％、85％、90％或95％相同的多肽序列，并且同一性值增至98％、99％、99.9％或甚至更高。

[0093] 在多个其他实施方式中，OST基因的核酸分子和同源物、变体以及衍生物与SEQ ID NO：12具有至少79％的同一性。在另一实施方式中，本发明的核酸分子编码由SEQ ID NO：12的多核苷酸编码的多肽。优选地，所述核酸分子编码与SEQ ID NO：12至少79％、80％、
85％、90％或95％相同的多肽序列，并且同一性值增至98％、99％、99.9％或甚至更高。

[0094] 本发明还涵盖在严格条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子。如上面所定义的并且如本领域所熟知的，严格杂交是在特定的一组条件下在低于特定DNA杂交的热解链温度(Tm)约25℃的温度下进行的，其中Tm是靶序列的50％与完全匹配的探针杂交时的温度。严格洗涤可以在特定的一组条件下低于特定DNA杂交的Tm约5℃的温度下进行。

[0095] 本发明的多核苷酸或核酸分子是指至少10个碱基长度的聚合形式的核苷酸。这些包括DNA分子(例如，直链的、环状的、cDNA、染色体的、基因组的或合成的、双链的、单链的、三链的、四倍体的、部分双链的、支链的、发夹的、环状的或处于扣锁构象的)和RNA分子(例如，tRNA、rRNA、mRNA、基因组的或合成的)和所述DNA或RNA分子的类似物以及含有非天然核苷酸类似物、非内在核苷间键或含有这两者的DNA或RNA的类似物。本发明的分离的核酸分子包括不含该核酸所来源的有机体的染色体DNA中的天然侧翼序列(即，位于核酸分子的5’和3’端的序列)的核酸分子。在多个实施方式中，分离的核酸分子可以含有小于约10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp的该核酸分子所来源的微生物的天然侧翼核苷酸染色体DNA序列。

[0096] 异源核酸分子以相对于启动子和任何其他5’调节分子和正确的阅读框的正义(5’→3’)方向插入表达系统或表达载体。核酸构建体的制备可以使用本领域内所熟知的标准克隆方法进行，如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Springs Laboratory Press，Cold Springs Harbor，New York(1989)所述，通过引用将其整体并入本文。授予Cohen和Boyer的美国专利第4,237,224号(通过引用将其整体并入本文)也描述了使用限制酶切割和用DNA连接酶连接的重组质粒形式的表达系统的产生。

[0097] 合适的表达载体包括含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的载体。例如，如果使用大肠杆菌作为宿主细胞，则可以使用诸如pUC19、pUC18或pBR322的质粒。其他合适的表达载体描述于Molecular Cloning：aLaboratory Manual：3rd edition(分子克隆：实验室手册：第三版)，Sambrook和Russell，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press，通过引用将其整体并入本文。用于操作核酸的许多已知技术和方案例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白分析详细描述于Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)，Ausubel等人编辑，(1992)，通过引用将其整体并入本文。

[0098] 不同的遗传信号和加工事件控制许多水平的基因表达(例如，DNA转录和信使RNA(“mRNA”)翻译)以及随后展示在核糖体表面的融合蛋白的量。DNA转录依赖于启动子的存在，所述启动子为指导RNA聚合酶的结合并从而促进mRNA合成的DNA序列。启动子在它们的“强度”(即，它们促进转录的能力)方面不同。为了表达克隆的基因的目的，希望使用强启动子以获得高水平的转录和因此的高水平的表达和表面展示。因此，依据所采用的宿主系统，还可以将大量合适的启动子的任何一种掺入携带编码感兴趣蛋白的脱氧核糖核酸分子的表达载体中，所述脱氧核糖核酸分子与中止序列(stall sequence)偶联。例如，当使用大肠杆菌时，它的噬菌体或质粒启动子，如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体λ的PR启动子和PL启动子以及包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp及类似启动子的其他启动子可用于指导临近DNA片段的高水平转录。此外，杂合的trp-lacUV5(tac)启动子或由重组DNA或其他合成DNA技术所产生的其他大肠杆菌启动子可用于提供对插入的基因的转录。

[0099] 原核生物中的mRNA的翻译依赖于正确的原核信号的存在，该原核信号与真核生物的信号不同。mRNA在原核生物中的有效翻译需要在mRNA上称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖体结合位点。这个序列为位于起始密码子之前的短的mRNA核苷酸序列，所述起始密码子通常为AUG，它编码蛋白氨基末端的蛋氨酸。SD序列与16S rRNA(核糖体RNA)的3’端互补并且可能通过与该rRNA形成双链体来促进mRNA与核糖体结合从而容许核糖体正确定位。对于使基因表达最大化的综述，参见Roberts和Lauer，Methods in Enzymology(酶学方法)，68：473(1979)，通过引用将其整体并入本文。

[0100] 根据本发明，宿主细胞为原核生物。这些细胞充当表达重组蛋白的宿主以用于生产感兴趣的重组治疗性蛋白。示例性的宿主细胞包括：大肠杆菌和其他肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，埃希氏菌属(Escherichia sp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)、沃廉菌属(Wolinella sp.)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio sp.)弧菌属(Vibrio sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、李斯特菌属(Listeria sp.)、葡萄球菌(Staphylococcussp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、消化链球菌属(Peptostreptococcus sp.)、巨球型菌属(Megasphaera sp.)、梳状菌属(Pectinatus sp.)、月形单胞菌属(Selenomonas sp.)、嗜发酵菌属(Zymophilus sp.)、放线菌属(Actinomyces sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、弗兰克菌属(Frankia sp.)、单孢丝菌属(Micromonospora sp.)、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)、丙酸杆菌属(Propionibacterium sp.)、链霉 菌属(Streptomyces sp.)、乳杆 菌属(Lactobacillussp.)、乳 球菌 属(Lactococcus sp.)、明串珠菌属(Leuconostoc sp.)、片球菌属(Pediococcus sp.)、醋酸杆菌属(Acetobacterium sp.)、真杆菌属(Eubacteriumsp.)、太阳杆菌属(Heliobacterium sp.)、螺旋阳光菌属(Heliospirillum sp.)、鼠孢菌属(Sporomusa sp.)、螺原体属(Spiroplasma sp.)、尿枝原体属(Ureaplasma sp.)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix sp.)、棒杆菌属(Corynebacterium sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、梭菌属(Clostridium sp.)、支原体属(Mycoplasma sp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)、放线菌属(Actinobacteria sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、志贺氏菌属(Shigella sp.)、莫拉菌属(Moraxella sp.)、缠绕杆菌属(Helicobacter sp)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、奈瑟氏菌属(Neisseriasp.)、蛭弧菌属(Bdellovibrio sp.)、嗜血菌属(Hemophilus sp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)、变形菌属(Proteus sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、放线杆菌属(Actinobacillus sp.)、博德特氏菌属(Bordetella sp.)、布鲁氏菌属(Brucella sp.)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga sp.)、心杆菌属(Cardiobacterium sp.)、艾肯氏菌属(Eikenellasp.)、弗朗西丝氏菌属(Francisella sp.)、嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)、金氏菌属(Kingella sp.)、巴斯德氏菌属(Pasteurella sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)、邻单胞菌属(Plesiomonassp.)、军团菌属(Legionella sp.)和α-变形菌，如沃尔巴克氏体属(Wolbachiasp.)；蓝细菌；螺旋体；绿色硫黄菌和绿色非硫磺菌(green non-sulfur bacteria)；革兰氏阴性球菌；苛求的革兰氏阴性杆菌；肠杆菌科-葡萄糖发酵的革兰氏阴性杆菌；革兰氏阴性杆菌-非葡萄糖发酵菌；革兰氏阴性杆菌-葡糖糖发酵的氧化酶阳性菌。

[0101] 在本发明的一个实施方式中，使用大肠杆菌宿主菌株C41(DE3)，因为此菌株之前已被优化用于一般膜蛋白的过表达(Miroux等人，“Over-production of Proteins in Escherichia coli：Mutant Hosts That Allow Synthesis of Some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels(大肠杆菌中蛋白的过量产生：容许一些膜蛋白和球状蛋白高水平合成的突变宿主)，”J Mol Biol 260：289-298(1996)，通过引用将其整体并入本文)。宿主菌株的进一步优化包括编码DnaJ蛋白的基因缺失(例如，ΔdnaJ细胞)。这种缺失的原因是dnaJ的失活已知增加过表达的膜蛋白的积累并且抑制膜蛋白过表达所通常伴随的严重的细胞毒性(Skretas等人，“Genetic Analysis of G Protein-coupled Receptor Expression in Escherichia coli：Inhibitory Role of DnaJ on the Membrane Integration of the Human Central Cannabinoid Receptor(大肠杆菌中G蛋白偶联受体表达的遗传分析：DnaJ对人中枢大麻素受体的膜整合的抑制作用)，”Biotechnol Bioeng(2008)，通过引用将其整体并入本文)。申请人在Alg1和Alg2表达之后观察到了这种现象。此外，需要竞争性糖生物合成反应的缺失来确保最佳水平的N-聚糖生物合成。例如，大肠杆菌O16抗原生物合成途径中基因的缺失(Feldman等人，“The Activity of a Putative Polyisoprenol-linked Sugar Translocase (Wzx)Involved in Escherichia coli O Antigen Assembly is Independent of the Chemical Structure of the O Repeat(参与大肠杆菌O抗原装配的推定的多萜醇基连接的糖易位酶(Wzx)的活性不依赖于O重复的化学结构)，”J Biol Chem 274：35129-35138(1999)，通过引用将其整体并入本文)将确保细菌萜醇-GlcNAc-PP底物可用于所需的哺乳动物N-聚糖反应。为了消除不希望的副反应，下列是从大肠杆菌宿主菌株中缺失的代表基因：wbbL、glcT、glf、gafT、wzx、wzy、waaL。

[0102] 用表达载体转化/转染宿主细胞的方法是本领域内所熟知的并且取决于所选的宿主系统，如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Springs Laboratory Press，Cold Springs Harbor，New York(1989)中所述的，通过引用将其整体并入本文。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染和使用反转录病毒或其他病毒的转导，所述其他病毒例如痘苗病毒或用于昆虫细胞的杆状病毒。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。

[0103] 本发明的一个方面涉及糖蛋白轭合物，所述糖蛋白轭合物包含蛋白和融合至所述蛋白的包含D-X1-N-X2-T基序的至少一种肽，其中D是天冬氨酸，X1和X2是除脯氨酸之外的任何氨基酸，N是天冬酰胺，并且T是苏氨酸。

[0104] 本发明的另一方面涉及产生糖基化蛋白的方法。此方法包括提供包含真核糖基转移酶活性的原核宿主细胞，其中所述真核糖基转移酶活性为真核多萜醇基连接的UDP-GlcNAc转移酶活性和真核甘露糖基转移酶活性。然后在有效产生糖基化蛋白的条件下培养所述原核宿主细胞。

[0105] 本发明的方法可用于产生根据本发明的糖基化抗体。

[0106] 因此，在多个方面，本发明提供被工程化以使N-连接的蛋白“人源化”的原核蛋白表达系统来作为大批N-连接的糖蛋白的立体特异性生物合成的平台。在某些实施方式中，使用代谢途径和蛋白工程化技术重构大肠杆菌中的真核N-糖基化途径产生了具有结构上同质的类人聚糖的N糖蛋白。由于内在糖基化途径在大多数细菌中不存在，因此考虑糖工程化细菌能够立体特异地产生具有每个细胞所合成的均质糖形的N-连接的糖蛋白。这确保每个糖工程化细胞系将与唯一的碳水化合物标记对应。因此，本发明的一个目的是对细菌工程化以产生类人的糖基化。

[0107] 由原核糖基化机构所附连的寡糖链在结构上不同于由高等真核生物和人的糖基化途径所附连的寡糖链(Weerapana等人，“Asparagine-linked Protein Glycosylation：From Eukaryotic to Prokaryotic Systems(天冬酰胺连接的蛋白糖基化：由真核系统到原核系统)，”Glycobiology 16：91R-101R(2006)，通过引用将其整体并入本文)。在某些实施方式中，为了开始对细菌的糖基化机构“人源化”(图10A)，本发明的一个目的是产生Man3GlcNAc2寡糖结构。在第一方面，在大肠杆菌中构建了包含脂连接的Man3GlcNAc2的生物合成的重组途径(图10B)。此途径的第一部分为脂连接的Man3GlcNAc2的酶促合成。具
3 3
体地，在大肠杆菌中功能性表达几种真核糖基转移酶之一，并通过用 H-GlcNAc和 H-甘露糖或用荧光凝集素(例如，AlexaFluor-ConA)对细胞进行代谢标记来分析所得的脂连接的寡糖。Man3GlcNAc2寡糖结构代表了在真核细胞中所发现的大多数N-聚糖的核心结构。装配这种结构所需的糖基转移酶在真核生物中是已知的并且这些酶的大部分已经在大肠杆菌中被功能性表达，然而，目前还没有一个能成功地得到这种寡糖结构。此外，这些糖基转移酶的底物，即UDP-GlcNAc和GDP-Man均存在于大肠杆菌的胞质中。

[0108] Man3GlcNAc2核心向靶蛋白上的位点特异性转移。

[0109] 在原核生物中产生类人寡糖结构的途径的另一部分是使Man3GlcNAc2寡糖转移至多肽链上的N-X-S/T位点。这需要被称为寡糖基转移酶(OST)的整合膜蛋白或蛋白复合体的功能性表达，寡糖基转移酶负责将寡糖转移至靶蛋白。多种原核OST和真核OST具有将脂连接的Man3GlcNAc2寡糖转移至靶蛋白上的能力。因此，原核蛋白表达系统包含至少一种OST活性。

[0110] 在多个方面，在大肠杆菌中重构真核糖基化途径需要翻转酶和OST(在空肠弯曲杆菌中分别为PglK和PglB，并且在酵母中分别为Rft1和STT3)的活性(参见图10B)。PglK翻转酶负责将脂连接的空肠弯曲杆菌七糖易位跨越内膜。幸运地，PglK表现出对脂连接的寡糖中间体的聚糖结构松弛的特异性(Alaimo等人，“Two Distinct But Interchangeable Mechanisms for Flipping of Lipid-linked Oligosaccharides(用于翻转脂连接的寡糖的两种不同但可互换的机制)，”Embo J 25：967-76(2006)和Wacker等人，“Substrate Specificity of Bacterial Oligosaccharyltransferase Suggests a Common Transfer Mechanism for the Bacterial and Eukaryotic Systems(细菌寡糖基转移酶的底物特异性表明了细菌系统和真核系统的共同的转移机制)，”Proc Natl Acad Sci U S A 103：7088-93(2006)，通过引用将它们整体并入本文)。因此，考虑这种酶将识别脂连接的Man3GlcNAc2并且因此不需要进一步工程化。可选择地，万一PglK不识别脂连接的Man3GlcNAc2，本发明提供了真核翻转酶例如除了别的以外的Rft1的表达。

[0111] “靶蛋白”、“感兴趣的蛋白”或“治疗性蛋白”包括但不限于：促红细胞生成素、细胞因子(如干扰素、G-CSF)、凝血因子(如因子VIII、因子IX和人蛋白C)、可溶性IgE受体α-链、IgG、IgG片段、IgM、白细胞介素、尿激酶、胰凝乳蛋白酶和脲胰蛋白酶抑制剂、IGF-结合蛋白、表皮生长因子、生长激素释放因子、膜联蛋白V融合蛋白、制管张素、血管内皮生长因子-2、骨髓祖细胞抑制因子-1、护骨蛋白、α-1抗胰蛋白酶、DNA酶II、甲胎蛋白、AAT、rhTBP-1(aka TNF结合蛋白1)、TACI-Ig(跨膜激活因子和钙调节因子以及亲环蛋白配体相互作用因子)、FSH(促卵泡激素)、GM-CSF、GLP-1w/和w/o FC(胰高血糖素样蛋白1)IL-I受体激动剂、sTNFr(enbrel，aka可溶性的TNF受体Fc融合体)ATIII、rh凝血酶、葡萄糖脑苷脂酶、CTLA4-Ig(细胞毒性T淋巴细胞相关的抗原4-Ig)、受体、激素、人疫苗、动物疫苗、肽和血清白蛋白。

[0112] 未糖基化的IgG与糖基化的IgG

[0113] 本发明的另一方面涉及糖基化的抗体，所述糖基化的抗体包含识别并结合天然抗原的Fv部分和在保守的天冬酰胺残基处被糖基化的Fc部分。

[0114] 本发明的糖基化的抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体的形式。

[0115] 单个免疫球蛋白分子包含两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链。轻链由一个恒定结构域(CL)和一个可变结构域(VL)构成，而重链由三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)和一个可变结构域(VH)构成。VH和VL结构域一起组成了分子的抗原结合部分，该部分称为Fv。Fc部分在保守的Asn297残基处被糖基化(图5A由星号表示的)。在此位置的N-聚糖的附连产生了“开放”的构象，该构象是效应物相互作用所必需的。

[0116] 单克隆抗体可以使用重组DNA方法制备，如下列文献中所描述的：授予Cabilly等人的美国专利第4,816,567号和Anderson等人，“Production Technologies for Monoclonal Antibodies and their Fragments(单克隆抗体及其片段的生产技术)，”Curr Opin Biotechnol.15：456-62(2004)，通过引用将它们的整体并入本文。编码单克隆抗体的多核苷酸通过例如RT-PCR使用特异性扩增编码所述抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物从例如成熟的B细胞或杂交瘤细胞中分离，并且所述多核苷酸的序列使用常规步骤确定。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到合适的表达载体中，该表达载体随后被转染到本发明的宿主细胞中，并且产生单克隆抗体。在一个实施方式中，使用重组DNA技术用N-末端的输出信号肽(例如，PelB信号肽)修饰重链和轻链来指导重链和轻链多肽到达细菌的周质。而且，重链和轻链可以由双顺反子构建体(例如，被翻译产生两条多肽的单个mRNA)表达或者可选择地由两个顺反子系统(例如，分别制备用于重链和轻链的两个独立的mRNA)表达。为了实现在细菌周质中全长IgG的高水平表达和有效装配，可以操作双顺反子构建体和两个顺反子构建体来实现有利的表达率。例如，可以使用只插入表达载体中的双顺反子构建体和两个顺反子构建体的上游的一系列翻译起始区(TIR)来增加或降低翻译水平(Simmons等人，“Translational Level is a Critical Factor for the Secretion of Heterologous Proteins in Escherichia coli(翻译水平是大肠杆菌中异源蛋白分泌的关键因子)，”Nat Biotechnol 14：629-34(1996)，通过引用将其整体并入本文)。当将这种产生抗体的质粒被引入也具有编码表达糖基化酶的基因的质粒或基因组的细菌宿主中时，所得的抗体在周质中被糖基化。所需物种的重组单克隆抗体或其片段也可以如已描述的从噬菌体展示文库中分离(McCafferty等人，“Phage Antibodies：Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains(噬菌体抗体：展示抗体可变结构域的丝状噬菌体，”Nature 348：552-554(1990)；Clackson等人，“Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries(使用噬菌体展示文库制备抗体片段)，”Nature 352：624-628(1991)；以及Marks等人，“By-Passing Immunization.Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage(来自噬菌体展示的V-基因文库的人抗体)，”J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，通过引用将它们整体并入本文)。

[0117] 可以使用重组DNA技术以许多不同的方式进一步修饰编码单克隆抗体的一种或多种多核苷酸以产生替代性抗体。在一个实施方式中，可以用例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域来取代人抗体的那些区域以产生嵌合抗体。可选择地，可以用小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域来取代非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在其他实施方式中，恒定区被截短或被移除以产生单克隆抗体的所需抗体片段。此外，可以使用可变区的定点诱变或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性和亲和力。

[0118] 在一些实施方式中，本发明的抗体为人源化抗体。人源化抗体为在可变区内含有最少的来自非人(例如，鼠类)抗体的序列的抗体。这种抗体在施用给人受治疗者时，用于治疗性地降低抗原性和人抗小鼠抗体反应。实际上，人源化抗体通常为具有最少的乃至没有非人序列的人抗体。人抗体为由人产生的抗体或具有对应于由人所产生的抗体的氨基酸序列的抗体。

[0119] 人源化抗体可以使用本领域内的已知的多种技术来生产。抗体可以通过用具有所期望的特异性、亲和力和容量(capability)的非人抗体(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的互补决定区(CDR)取代人抗体的互补决定区而被人源化(Jones等人，“Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse(用来自小鼠的互补决定区取代人抗体中的互补决定区)，”Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，“Reshaping Human Antibodies for Therapy(改造用于治疗的人抗体)，”Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，“Reshaping Human Antibodies：Grafting an Antilysozyme Activity(改造人抗体：移植抗溶菌酶的活性)，”Science 239：1534-1536(1988)，通过引用将它们整体并入本文)。可以通过取代在Fv框架区中和/或在所取代的非人残基中的另外的残基来进一步修饰人源化抗体从而改进和优化抗体的特异性、亲和力和/或容量。

[0120] 双特异性抗体也适合于在本发明的方法中使用。双特异性抗体是能够特异性地识别并结合至少两个不同表位的抗体。双特异性抗体可以为完整抗体或抗体片段。用于制备双特异性抗体的技术是本领域中常见的(Traunecker等人，“Bispecific Single Chain Molecules(Janusins)Target Cytotoxic Lymphocytes on HIV Infected Cells(双特异性单链分子(Janusins)靶向对HIV感染的细胞上的细胞毒性淋巴细胞)，”EMBO J.10：3655-3659(1991)和 Gruber等 人，“Efficient Tumor Cell Lysis Mediated by a Bispecific Single Chain Antibody Expressed in Escherichia coli(由大肠杆菌中表达的双特异性单链抗体介导的有效的肿瘤细胞裂解)，”J. Immunol.152：5368-74(1994)，通过引用将它们整体并入本文)。

[0121] 聚糖筛选技术

[0122] 本发明的再一方面涉及用于筛选细菌或噬菌体的方法。此方法包括：在细菌表面表达一种或多种聚糖并且将标记连接至在所述细菌表面上或在源自所述细菌的噬菌体表面上的一种或多种聚糖上。在噬菌体展示中使用的最常见的噬菌体为M13和fd丝状噬菌体，然而也使用T4、T7和λ噬菌体。然后以高通量形式分析所述标记。

[0123] 当噬菌体经受标记和分析时，本发明的方法还包括在有效产生表面上具有一种或多种聚糖的噬菌体的条件下用辅助噬菌体感染在细胞表面表达一种或多种聚糖的细菌。然后，对表面上具有一种或多种聚糖的噬菌体进行富集。可选择地，可以通过使用新颖的“细菌包装细胞系(bacterial packaging cell line)”技术而消除辅助噬菌体的使用(Chasteen等人，“Eliminating Helper Phage From Phage Display(从噬菌体展示中消除辅助噬菌体)，”Nucleic Acids Res 34：e145(2006)，通过引用将其整体并入本文)。

[0124] 标记可以用识别细菌或噬菌体的表面上的聚糖并且具有可检测的标记的凝集素来进行。可选择地，标记步骤可以用识别细菌或噬菌体的表面上的聚糖并且具有检测标记的抗体来进行。可选择地，通过将一种或多种相关的蛋白靶(例如，凝集素、抗体)固定于固体支撑体上，如96孔板的表面，在表面展示与那些靶之一结合的蛋白的细胞或噬菌体通过洗涤将保留而其他的细胞或噬菌体则被移除。保留的那些细胞或噬菌体可以被洗脱、用于产生更多的细胞(通过培养细胞)或噬菌体(通过用辅助噬菌体感染细菌)并且如此生产出富含相关(即，结合的)细胞或噬菌体的细胞或噬菌体混合物。这些步骤的重复循环称为“淘选”。

[0125] 本发明的这个方面容许通过糖蛋白的细胞表面展示和糖噬菌体展示进行筛选，在所述糖蛋白的细胞表面展示和糖噬菌体展示中，工程化细胞系以快速且经济有效的方式产生多种聚糖和糖蛋白。这些测定容许进行定量的高通量聚糖分析和给予期望的表型的突变体的快速分离。这些测定的潜在前提是细胞表面展示和噬菌体展示均产生独特的基因型(即，DNA)到表型(即，蛋白的活性或修饰，如糖基化)的关联。在基因型与表型之间的这种联系使得大的蛋白文库能够被筛选并且在称为体外选择的过程中被扩增，所述体外选择与自然选择类似。这些展示技术可用于筛选至少两种不同类型的文库。第一种策略是产生糖蛋白自身的文库(即，使用易错PCR、DNA改组等)，其中可以产生具有额外的糖基化位点的变体，该变体在引入额外的(但是相同的)聚糖结构之后在活性或稳定性方面可以被改善。第二种策略是通过制备单个途径的酶的文库(即，使用易错PCR、DNA改组等)或不同酶组合的文库来制备不同聚糖结构的大的集合使得不同聚糖结构的组合文库在细胞或噬菌体的表面上产生并展示。将变体糖蛋白或变体聚糖结构的表型与分离的细胞的基因型(即，质粒的序列)或噬菌体的基因型(即，称为噬菌粒的包装DNA的序列)在物理上配对。因此，易于确定文库克隆的身份。

[0126] N-连接的糖蛋白在细菌细胞表面的展示

[0127] 用于高通量筛选的大肠杆菌中的糖基化可以用使用真核糖基转移酶活性、真核翻转酶活性和真核寡糖基活性的上述的宿主细胞和方法来进行。然而，在所述筛选实施方式中，可以使用来自其他来源的活性。例如，这种细菌表面展示可以用空肠弯曲杆菌CjaA蛋白作为外膜锚定物来进行(图6A)。这种蛋白主要地是适合的，因为其(i)定位在空肠弯曲杆菌和大肠杆菌细胞的外膜并且(ii)被大肠杆菌中的pgl系统糖基化(图6A)。为了确定在CjaA上的N-聚糖七糖是否是表面暴露的，可以用荧光标记形式的凝集素SBA(SBA-Alexa Fluor 488轭合物，Molecular Probes)处理pgl+大肠杆菌。细胞还缺乏将寡糖从细菌萜醇脂质载体转移至脂质A核心分子的内在大肠杆菌WaaL连接酶(Raetz等人，“Lipopolysaccharide endotoxins(脂多糖内毒素)，”Annu Rev Biochem 71：
635-700(2002)，通过引用将其整体并入本文)(图6B)。已知这种连接酶具有松弛的底物特异性并且其负责将细菌七糖从细菌萜醇焦磷酸转移至脂质A核心，该脂质A核心是随后被转移至外膜外侧的分子。当缺乏waaL的pgl+细胞被CjaA质粒转化并被诱导表达CjaA时，在SBA-Alexa Fluor标记后检测到强荧光信号(图6C)。重要的是，这种信号依赖于pgl系统，因为在对携带pgl-对照载体的waaL突变体进行SBA-Alexa Fluor标记后观察到荧光完全丧失(图6C)。因此，聚糖分析可以用活的大肠杆菌细胞以与高通量筛选相容的荧光形式直接进行。

[0128] 使用对核心聚糖的三甘露糖结构具有高亲和力的荧光形式的凝集素伴刀豆蛋白A(ConA)，可以测定在大肠杆菌细胞的表面上的Man3GlcNAc2。这种策略的基础是如下的观察：细菌萜醇焦磷酸连接的寡糖是将寡糖从细菌萜醇脂质载体转移至脂质A核心分子的大肠杆菌WaaL连接酶的底物(Raetz等人，“Lipopolysaccharide endotoxins(脂多糖内毒素)，”Annu Rev Biochem 71：635-700(2002)，通过引用将其整体并入本文)(参见图6B)。申请人预期Man3GlcNAc2寡糖从细菌萜醇焦磷酸转移至脂质A核心，该脂质A核心是随后被转移至外膜的外侧的分子。大肠杆菌细胞表面上Man3GlcNAc2的展示将通过使用荧光形式的ConA(AlexaFluor-ConA)的表面染色来达成。这应该使得利用荧光激活的细胞分选(FACS)检测和定量寡糖生物合成是可能的。重要的是，这种测量不依赖于翻转酶或OST的活性。如通过在用荧光的SBA标记后的强FACS信号所证明的，已观察到细菌寡糖定位在TG1pgl+细胞的外表面。TG1pglmut细胞的相同标记产生了相同的荧光特征，表明寡糖向脂质A的转移不依赖于PglB。最后，缺乏pgl表达载体的对照细胞不产生可检测的细胞荧光。申请人预计此测定将容许用不同的诱导型启动子优化大肠杆菌中的寡糖表达，并且若有必要将使用不同的信号肽来指导寡糖正确插入质膜中。例如，尽管本发明中描述了有希望的表达结果，但是采用每种Alg膜蛋白的SRP-或YidC-依赖性靶(Luirink等人，“Biogenesis of Inner Membrane Proteins in Escherichia coli(大肠杆菌中内膜蛋白的生物发生)，”Annu Rev Microbiol 59：329-55(2005)，通过引用将其整体并入本文)与大肠杆菌宿主菌株如C41(DE3)的组合可以证明是有用的，所述大肠杆菌宿主菌株已经被特定地工程化以供异源膜蛋白的高水平表达(Miroux等人，“Over-production of Proteins in Escherichia coli：Mutant Hosts That Allow Synthesis of Some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels(大肠杆菌中蛋白的过量产生：容许一些膜蛋白和球状蛋白高水平合成的突变宿主)，”J Mol Biol 260：289-98(1996)，通过引用将其整体并入本文)。此外，由于waaL的缺失消除了寡糖向脂质A的转移(图6C)，ConA标记策略可以与表面展示的糖蛋白(例如，CjaA，参见图6)组合使用来测定具有改善的性质或新性质(例如，增加的活性或稳定性)的糖蛋白变体或者测定具有改善的活性或新活性(例如，产生不同的或新颖的聚糖结构的能力)的途径酶，如糖基转移酶、翻转酶或OST(参见图10B)。这可以如下来完成：DNA编码的感兴趣的蛋白或肽自身为表面蛋白(例如，空肠弯曲杆菌CjaA)或与细胞表面蛋白框内连接(例如，大肠杆菌ClyA、OmpA、OmpX等)。有时使用多克隆位点来确保片段被插入到所有三个可能的框中以使得cDNA片段在正确的框内翻译。在表达载体中克隆编码细胞表面杂合蛋白的基因并将其转化到细菌细胞中，如TG1或XL1-Blue大肠杆菌。对于产生糖蛋白变体而言，编码任一靶糖蛋白的许多不同的DNA片段的掺入作为与细胞表面蛋白基因的融合体产生了表面展示文库，从中可以分离感兴趣的成员。对于产生具有新活性或改善的活性的途径酶而言，将所述酶的DNA文库与表达报告细胞表面展示糖蛋白(例如，CjaA)的质粒一起共转化到细菌中，所述细胞表面展示糖蛋白充当聚糖结构或聚糖结构文库的载体。然后筛选共转化的细菌中附连至表面展示载体的具体聚糖结构的存在。

[0129] 大肠杆菌糖噬菌体展示系统

[0130] 本发明的另一方面涉及聚糖的噬菌体展示系统。糖噬菌体展示系统是用于工程化新颖的糖基表型的有力工具，其中一个实施方式在图7中示出。这基于改良形式的丝状噬菌体展示(Smith，G.P.，“Filamentous Fusion Phage：Novel Expression Vectors that Display Cloned Antigens on the Virion Surface(丝状融合噬菌体：在病毒粒子表面展示克隆的抗原的新颖表达载体)，”Science 228：1315-7(1985)，通过引用将其整体并入本文)，其中构建了如下的噬菌粒：其表达与小噬菌体外壳蛋白g3p的N-末端融合的缺乏N-末端脂锚定序列(Nita-Lazar等人，“The N-X-S/T Consensus Sequence is Required But Not Sufficient for Bacterial N-linked Protein Glycosylation(N-X-S/T共有序列是细菌N-连接的蛋白糖基化所需的但非充分的)，”Glycobiology 15：361-7(2005)，通过引用将其整体并入本文)的空肠弯曲杆菌AcrA。将果胶酸裂解酶B信号序列(pelB)克隆在acrA编码序列上游用于Sec依赖性易位到大肠杆菌的周质空间。通过阿拉伯糖可诱导的且葡萄糖可抑制的pBAD启动子指导融合蛋白的表达(Miyada等人，“Regulation of the araC Gene of Escherichia coli：Catabolite Repression，Autoregulation，and Effect on araBAD Expression(大肠杆菌araC基因的调节：分解代谢物阻抑、自调节和对araBAD表达的影响)，”Proc Natl Acad Sci U S A 81：4120-4(1984)，通过引用将其整体并入本文)。将24个氨基酸的连接子并置在噬菌粒pAcrA-g3p上表达的AcrA与g3p结构域之间。此连接子序列含有6组氨酸标签和肠激酶切割位点，该位点后面直接跟随琥珀终止密码子(UAG)，该终止密码子在大肠杆菌supE菌株(例如，XL1-Blue、ER2738或TG1)中以80-90％的效率被转录为谷氨酰胺(Miller等人，“Effects of Surrounding Sequence on the Suppression of Nonsense Codons(周围序列对无义密码子的抑制的作用)，”J Mol Biol 164：59-71(1983)，通过引用将其整体并入本文)。在这些载体上包含噬菌体F1基因间区域(ori M13)容许在用辅助噬菌体重叠感染后包装单链噬菌粒。可以使用这种技术来测定具有改善的性质或新性质(例如，增加的活性或稳定性)的糖蛋白变体或测定具有改善的活性或新活性(例如，产生不同的或新颖的聚糖结构的能力)的途径酶，如糖基转移酶、翻转酶或OST(参见图10B)。对于产生糖蛋白变体而言，将编码感兴趣的蛋白或肽的DNA与pIII或pVIII基因连接。有时使用多克隆位点来确保片段被插入在所有三个可能的框中以使cDNA片段在正确的框内翻译。然后将噬菌体基因与插入DNA的杂合体转化到细菌细胞中，如TG1或XL1-Blue大肠杆菌。噬菌体粒子在用辅助噬菌体感染它们之前不会从大肠杆菌细胞中释放，这使得噬菌体DNA的包装和成熟病毒粒子用相关蛋白片段作为其外壳的部分的装配成为可能，所述外壳为次要外壳蛋白(pIII)或主要外壳蛋白(pVIII)。将许多不同的DNA片段掺入pIII或pVIII基因中产生了可以从中分离感兴趣的成员的文库。对于产生具有改善的活性或新活性(如合成不同聚糖结构的能力)的途径酶而言，将所述一种或多种酶的DNA文库与表达报告噬菌体展示糖蛋白(例如，具有N-末端或C-末端标签的AcrA或MBP)的质粒一起共转化到细菌中，所述报告噬菌体展示糖蛋白充当聚糖结构或聚糖结构文库的载体。使用共转化的细菌来产生噬菌体文库，然后筛选该噬菌体文库中附连至噬菌体展示载体的具体聚糖结构的存在。

[0131] 上述公开内容大体上描述了本发明。更具体的描述在下列实施例中提供。这些实施例仅为了示例的目的而描述，并不旨在限制本发明的范围。当情况建议或表现有利时考虑形式的改变和等同物的替换。尽管本文采用了具体的术语，但是这些术语旨在为描述性意义的而不是出于限制的目的。实施例

[0132] 实施例1：遗传修饰的大肠杆菌中的N-连接的蛋白糖基化

[0133] 此处再现了Wacker等人的实验，其中将空肠弯曲杆菌pgl基因座功能性转移至大肠杆菌中，从而赋予这些细胞进行N-连接的蛋白糖基化的能力(Wacker等人，“N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化以及其向大肠杆菌中的功能性转移)，”Science 298：1790-3(2002)，通过引用将其整体并入本文)。对于这些研究，采用质粒pACYC184-pgl(pgl+)和携带pglB基因的插入突变的源自pACYC184-pgl的对照质粒(pACYC184-pglB::kan；pgl-)，所述pglB基因编码必需的OST。用pgl+或pgl-载体与编码空肠弯曲杆菌糖蛋白PEB3的第二载体一起共转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞。His-标记的PEB3在pgl+和pgl-细胞的周质中表达，使用镍亲和色谱Ni-NTA Spin试剂盒(QIAGEN)从周质部分将其纯化。对纯化的PEB3进行系列稀释并通过蛋白质印迹使用抗多组氨酸抗体(Sigma)检测。使用与七糖聚糖的末端α-连接的GalNAc结合的GalNAc特异性凝集素大豆凝集素(SBA)检测糖基化的PEB3。如所预期的，观察到在pgl+和pgl-细胞中均有效地表达PEB3(图3A)，但是只有来自pgl+细胞的PEB3与凝集素SBA交叉反应(图3B)，凝集素SBA与聚糖的末端α-连接的GalNAc结合并且指示出完全糖基化的蛋白。

[0134] 实施例2-在糖工程化的大肠杆菌中具有肽标签的MBP的N-连接的糖基化[0135] 在pTRC99A[Amersham Biosciences]的SacI和HindIII位点中将大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)融合至编码四个连续的糖基化序列肽段的基因(GAT CAG AAC GCG ACC GGC GGT GAC CAA AAT GCC ACA GGTGGC GAT CAA AAC GCC ACC GGC GGT GAC CAG AAT GCG ACA)(SEQ ID NO：13)。该基因编码被两个甘氨酸残基隔开的四个连续的DQNAT SEQ ID NO：14肽的肽标签。在体外实验期间，DQNAT(SEQ IDNO：14)序列肽段被PglB有效地糖基化(Chen等人，“From Peptide to Protein：Comparative Analysis of the Substrate Specificity of N-linked Glycosylation in C.jejuni(从肽到蛋白：空肠弯曲杆菌中N-连接的糖基化的底物特异性的比较分析)，”Biochemistry 46：5579-85(2007)，通过引用将其整体并入本文)。此标签与MBP的C末端融合，MBP还附有用于纯化的C-末端6×His标签，使其表达在用pACYC-pgl和pACYC-pglmut(PglB W458A，D459A)转化的BL21(DE3)大肠杆菌中(Wacker等人，“N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化及其向大肠杆菌中的功能转移)，”Science 298：1790-3(2002)，通过引用将其整体并入本文)。此外，以相同的方式表达空肠弯曲杆菌糖蛋白cjAcrA、在MBP的成熟结构域之前具有N末端标签的MBP、具有C末端标签的缺乏自己的内在分泌信号肽的MBP以及具有C末端标签和Tat特异性(ssTorA)信号肽的MBP&绿色荧光蛋白(GFPmut2)，并通过镍亲和色谱将它们纯化(Ni-NTA Spin试剂盒，Quiagen)。通过蛋白质印迹来确定成熟MBP的N末端或C末端的标签被糖基化，所述蛋白质印迹使用针对该蛋白的抗HIS血清和针对细菌的七糖而产生的hR6P血清。糖基化依赖于功能性的PglB和向周质的分泌，因为在用pACYC-pglmut转化的大肠杆菌中产生的MBP和缺乏分泌信号肽的MBP均未被糖基化。如通过这种方式被靶向分泌的MBP和绿色荧光蛋白(GFP)的糖基化所证明的，糖基化是通过双-精氨酸易位(Tat)途径而发生的。抗七糖血清揭示了多种附连的N-聚糖的至少三个分离的条带特征。

[0136] 这些结果显示在体外实验期间含有4个连续的D-X1-N-X2-T序列肽段的肽被PglB有效地糖基化(Chen等人，“From Peptide to Protein：Comparative Analysis of the Substrate Specificity of N-linked Glycosylation in C.jejuni(从肽到蛋白：空肠弯曲杆菌中N-连接的糖基化的底物特异性的比较分析)，”Biochemistry 46：5579-85(2007)，通过引用将其整体并入本文)。使融合至MBP的C末端的GlycTag在pgl+和pgl-大肠杆菌中表达，并将其纯化至20mg/L。所得的蛋白在多个位点被有效地糖基化(图4C和4D)。当将GlycTag被移至MBP的N-末端时，看到了类似的结果。在pgl-大肠杆菌中产生的MBP-GlycTag或者被表达而不具有分泌信号肽的MBP-GlycTag融合体不被糖基化(图4C)，分别证实了糖基化依赖于PglB和向周质的输出。如通过靶向Tat依赖性输出的MBP和GFP的糖基化所证明的，GlycTag与诸如双精氨酸易位(Tat)途径的其他分泌途径是相容的(图4C)。在某些方面，MBP上GlycTag的糖基化甚至比天然糖蛋白空肠弯曲杆菌AcrA的糖基化更为有效(图4C)。由于最近已证明MBP作为糖轭合物疫苗的典型蛋白载体(Fernandez等人，“Potential Role for Toll-like Receptor 4 in Mediating Escherichia Coli Maltose-binding Protein Activation of Dendritic Cells(Toll样受体4在介导树突细胞的大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的激活中的可能的作用)，”Infect Immun 75：1359-63(2007)，通过引用将其整体并入本文)，所以设想MBP-GlycTag融合体可以充当抗致病菌空肠弯曲杆菌或者(当产生新的聚糖结构时)抗其他感染剂的有效的糖轭合物疫苗。如果将GlycTag引入到N末端和C末端以及插入到MBP内的许可位点中，则每个蛋白具有多至12个聚糖是可能的(Betton等人，“Creating a Bifunctional Protein by Insertion of Beta-lactamase into the Maltodextrin-binding Protein( 通 过将β-内酰胺酶插入麦芽糊精结合的蛋白中产生双功能蛋白)，”NatBiotechnol 15：
1276-9(1997)，通过引用将其整体并入本文)。这些MBP糖轭合物将含有远比天然存在的糖蛋白多的聚糖(Ben-Dor等人，“Biases and Complex Patterns in the Residues Flanking Protein N-Glycosylation Sites(在蛋白N-糖基化位点两侧的残基中的偏倚和复合模式)，”Glycobiology 14：95-101(2004)，通过引用将其整体并入本文)。

[0137] 实施例3-大肠杆菌中的IgG M18.1糖基化

[0138] 此实施例描述糖工程化的大肠杆菌周质中复合的人糖蛋白的糖基化。具体地，使抗炭疽毒素的全长人免疫球蛋白(IgG M18.1)在pMAZ360M18.1中表达(Mazor等人，“Isolation of Engineered，Full-length Antibodies from Libraries Expressed in Escherichia coli(从表达于大肠杆菌的文库中分离工程化的全长抗体)，”Nat Biotechnol 25：563-5(2007)，通过引用将其整体并入本文)，通过定点诱变(Quik Change试剂盒，Qiagen)使该免疫球蛋白突变以使得IgG重链(CH2)中在残基295处的谷氨酰胺残基被突变为天冬氨酸以便引入细菌糖基化基序D-X1-N-X2-S/T(图5A)，所用的引物为(5’-gacaaagccgcgggaggaggattacaacagcacgtaccgtg-3’和5’-cacggtacgtgctgttgtaatcctcctcccgcggctttgtc-3’)(分别为SEQ ID NO：15和SEQID NO：18)。在IgG M18.1表达在经pACYC-pgl或pACYC-pglmut(PglBW458A，D459A)转化的BL21(DE3)大肠杆菌的周质中之后(Wacker等人，“N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化以及其向大肠杆菌中的功能性转移)，”Science 298：1790-3(2002)，通过引用将其整体并入本文)，将其经由蛋白A/G亲和色谱(Nab Protein AG Spin试剂盒，Pierce)从细胞裂解物中纯化并使其在非还原性12％SDS凝胶中经历SDS-PAGE，经由抗人-IgG(Promega)和针对细菌七糖而产生的hR6P抗血清进行蛋白质印迹检测。对于从经pACYC-pgl或pACYC-pglmut转化的BL21(DE3)大肠杆菌中分离的IgG M18.1看到了特征性IgG带型。只有来自经pACYC-pgl转化的BL21(DE3)大肠杆菌的IgG M18.1与细菌N-聚糖特异性抗血清(hR6P)交叉反应。pgl+和pgl-细胞的这种IgG带型见于图5B和5C中。然而，只有来自pgl+细胞的IgG M18.1与细菌N-聚糖特异性抗血清(hR6P)交叉反应(图5B和5C)。这些结果表明人IgG可以在糖工程化的大肠杆菌细胞的周质中被糖基化。因此，在多个实施方式中，本发明提供在糖工程化的大肠杆菌细胞中产生的糖基化人IgG。

[0139] 实施例4-N-连接的糖蛋白在细菌细胞表面的展示

[0140] 表达来自质粒pCjaA的空肠弯曲杆菌CjaA蛋白作为外膜锚定物的经pACYC-pgl转 化 的 大 肠 杆 菌 BW25113 waaC：Kan(Wacker 等 人，“N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化以及其向大肠杆菌中的功能性转移)，”Science 298：1790-3(2002)，通过引用将其整体并入本文)在细胞表面展示细菌七糖。通过将空肠弯曲杆菌CjaA的编码区插入到pBAD18中来构建质粒pCjaA，该pBAD18附有C末端FLAG表位标签的编码区。通过用轭合至荧光染料的大豆凝集素(SBA-Alexa Fluor 488轭合物，Molecular Probe)孵育细胞来检测展示并用流式细胞术分析。经pCjaA和pACYC-pglmut(Wacker等人，“N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化以及其向大肠杆菌中的功能性转移)，”Science 298：1790-3(2002)，通过引用将其整体并入本文)或单独的pCjaA转化的大肠杆菌BW25113waaC：Kan不产生荧光标记。通过使来自大肠杆菌BW25113 waaC：Kan的总细胞蛋白进行蛋白质印迹分析，然后用针对细菌七糖而产生的hR6P抗血清探测来证实糖蛋白附连，该大肠杆菌BW25113 waaC：Kan表达来自质粒pCjaA的空肠弯曲杆菌CjaA蛋白并且被pACYC-pgl或pACYC-pglmut转化(Wacker等人，“N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化以及其向大肠杆菌中的功能性转移)，”Science 298：1790-3(2002)，通过引用将其整体并入本文)。

[0141] 实施例5-大肠杆菌糖噬菌体展示系统

[0142] 在携带天然形式的(pgl+)或突变形式的(pglmut)空肠弯曲杆菌糖基化基因座的大肠杆菌TG1细胞中对来自噬菌粒pAcrA-g3p的AcrA-g3p进行表达，并且在全细胞裂解物中分析AcrA-g3p的出现。用AcrA-特异性抗血清的免疫印迹分析显示用50mM阿拉伯糖诱导3小时、5小时和16小时后在TG1pgl+和TG1pglmut二者的细胞裂解物中的信号(图8A和8B，泳道3至5)。表观分子量为约80kDa的抗-AcrA交叉反应蛋白很好地对应于AcrA-g3p融合蛋白80.8kDa的计算质量。使用针对空肠弯曲杆菌全细胞提取物而产生且对糖基化形式的AcrA显示出强优选性的糖基化特异性抗血清(R12)来探测相同的裂解物(Wacker等人，N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化以及其向大肠杆菌中的功能性转移)，Science298：1790-3(2002)，通过引用将其整体并入本文)(图8C)。此处，在诱导3小时、5小时和16小时后，在TG1pgl+细胞的全细胞裂解物中仅可以检测出分子量为约80kDa的免疫反应条带(图8C，泳道3至5)。这些数据证明AcrA-g3p融合蛋白被空肠弯曲杆菌pgl系统糖基化。

[0143] 实施例6-AcrA-g3p的时间依赖性表达和糖基化

[0144] 大肠杆菌TG1从pAra-AcrA-g3p构成的质粒中表达空肠弯曲杆菌AcrA与g3p噬菌体外壳蛋白的融合体。在pAra-Acra-g3p中，将果胶酸裂解酶B信号序列(pelB)克隆在acrA编码序列的上游用于Sec依赖性的易位至大肠杆菌周质。融合蛋白的表达由阿拉伯糖可诱导的且葡萄糖可抑制的pBAD启动子指导。将24个氨基酸的连接子并置在表达的AcrA与g3p结构域之间。此连接子序列含有6组氨酸标签和肠激酶切割位点，该位点后面直接跟随琥珀终止密码子(UAG)，该终止密码子在大肠杆菌supE菌株(例如，TG1)中被转录为谷氨酰胺。在这些载体上包含噬菌体F1基因间区域(ori M13)容许在用辅助噬菌体重叠感染后包装单链噬菌粒。用pACYC-pgl或pACYC-pglmut转化具有pAra-AcrA-g3p的TG1细胞(Wacker等人，“N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化及其向大肠杆菌中的功能转移)，”Science 298：1790-3(2002)，通过引用将其整体并入本文)并且由未诱导的细胞或由用50mM阿拉伯糖孵育1h、3h、5h和16h的细胞制备全细胞裂解物。通过具有蛋白标准物的10％SDS-PAGE分离蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜，用AcrA特异性血清或用针对细菌七糖而产生的R12抗血清显像。

[0145] 实施例7-通过SBA生物淘选进行的糖噬菌体富集的定量

[0146] 将由具有pAra-AcrA-g3p和pACYC-pgl或pACYC-pglmut的TG1细胞(Wacker等人，“N-linked Glycosylation in Campylobacter jejuni and its Functional Transfer into E.coli(空肠弯曲杆菌中的N-连接的糖基化以及其向大肠杆菌中的功能性转移)，”Science 298：1790-3(2002)，通过引用将其整体并入本文)产生的噬菌体施加至固定的大豆凝集素(SBA)以用于柱纯化。SBA淘选步骤的各级分中所存在的总菌落形成单位(CFU)是通过新鲜TG1细胞的感染确定并且其是至少三次独立实验的平均值。进行SBA淘选的噬菌体数和新鲜感染后所得的CFU改变小于6％。所述级分为：级分1，应用于SBA柱的CFU；级分2，SBA流穿物；级分3和4，PBS洗涤步骤；级分5、6和7，用在PBS中的30mM半乳糖进行的洗涤步骤；级分8、9和10，用在PBS中的300mM半乳糖进行的洗脱步骤。AcrA的存在用抗AcrA血清显像并且细菌七糖的存在用针对细菌聚糖而产生的R12抗血清来显像，从而：泳道1，粗噬菌体制备物；泳道2；SBA流穿物；泳道3和4，用PBS进行的洗涤级分；泳道5至7，用在PBS中的30mM半乳糖进行的洗涤级分；泳道8至10，用在PBS中的300mM半乳糖
8
进行的洗脱级分。在泳道1至4中，将1×10 个噬菌体应用于SDSPAGE。在泳道5至10中，
7 4
分别分析了从具有pAra-AcrA-g3p和pACYC-pgl的TG1细胞中制备的3.5×10、1.2×10、
3 6 6 6
4.0×10、1.3×10、2.5×10、1.2×10 个噬菌体或从具有pAra-AcrA-g3p和pACYC-pglmut
6 3 3 3 4 3
的TG1细胞中制备的1.5×10、3.5×10、3.0×10、4.5×10、0.5×10、1.5×10 个噬菌体。

[0147] 对于各自表达pAcrA-g3p的TG1pgl+和TG1pglmut，每毫升培养物上清液获得了11 11
小于9.0×10 (TG1pgl+)和小于8.7×10 (TG1pglmut)的噬菌体效价。为了测定糖基化的AcrA-g3p融合蛋白是否存在于噬菌体制备物中，开发了容许特异性富集糖噬菌体的SBA生物淘选步骤(图7)。将来自于各自表达pAcrA-g3p的TG1pgl+或TG1pglmut的噬菌体制备物与琼脂糖结合的SBA混合，未结合的噬菌体通过用PBS和含有30mM半乳糖的PBS的连
2 -1
续洗涤步骤移除。半乳糖结合SBA的平衡缔合常数为2×10M ，因此半乳糖可用来与结合的寡糖竞争(Swamy等人，“Thermodynamic and Kinetic Studies on Saccharide Binding to Soya-Bean Agglutinin(对糖与大豆凝集素结合的热力学和动力学研究)，”Biochem J 234：515-22(1986)，通过引用将其整体并入本文)。在两种噬菌体制备物的相应洗涤级分发现了类似的效价。相比之下，在来自表达pAcrAg3p的TG1pgl+的噬菌体的具有300mM
3 3 6
半乳糖的洗脱液中观察到了10 倍的噬菌体效价增加(10 至10cfu/ml)，而对于来自表达
3
pAcrA-g3p的TG1pglmut的噬菌体，效价则保持在10cfu/ml的背景水平(图9A)。这种结合SBA的噬菌体的PglB依赖性聚集表明产生了感染性的糖噬菌体并且它们通过淘选步骤被特异性富集。接下来，证实了在两种SBA淘选实验的各级分中糖基化AcrA-g3p融合蛋白的存在。在总噬菌体蛋白的SDS-PAGE分离后进行免疫检测时，用AcrA特异性抗体检测出了对应于AcrA-g3p的信号(图9A和9B，泳道1)。在流穿步骤以及PBS洗涤步骤中也存在AcrA-g3p特异性条带(图9A和9B，泳道2、3和4)。在由表达pAcrA-g3p的TG1pgl+产生的噬菌体用于淘选时，在洗脱级分中用R12抗血清呈现出清晰的糖基化特异性信号(图9B，部分c，泳道8、9和10)。R12抗血清显示对糖基化形式的AcrA高度优选，但是在大量存在时也与非糖基化AcrA反应(图9B，部分c和d，泳道1至4)。重要的是，在用高浓度半乳糖洗脱的噬菌体制备物中检测到的AcrA融合蛋白(图9B，部分c，泳道8、9和10)比流穿物中检测到的融合蛋白(图9B，部分c，泳道1)迁移得慢，这与蛋白的糖基化是一致的。如所预期的，源自表达pAcrA-g3p的糖基化缺陷菌株TG1pglmut的噬菌体不展示与R12反应的融合蛋白(图9B，部分d，泳道8、9和10)。因此，在存在功能性空肠弯曲杆菌pgl操纵子的条件下产生的噬菌体在表面展示糖基化的AcrA并且这些糖噬菌体通过SBA淘选被富集。

[0148] 为了进一步测试此方法的特异性，将由TG1(pgl+，pAcrA-g3p)产生的纯化的糖6 4
噬菌体(8×10cfu)与由TG1(pglmut，pAcrA-g3p)产生的过量(1至10 倍)的未糖基化噬菌体混合并施用于单个SBA淘选步骤。此实验设置容许通过糖噬菌体与未糖基化的噬菌体的噬菌粒限制性分析而将它们区别开。糖噬菌体在AcrA-g3p表达盒内含有琥珀终止密码子，而未糖基化噬菌体则没有。当仅将糖噬菌体应用于SBA淘选时回收到约96％
6 6 2 4
(7.7×10±0.3×10)的噬菌体。当将糖噬菌体与等量或10 至10 倍过量的未糖基化噬
6 6 6 6
菌体混合时，分别有平均96％(7.8×10±0.2×10)、93％(7.4×10±0.5×10)和79％
6 6
(6.3×10±1.0×10)的噬菌体被SBA结合，并且随后在洗脱物中发现。仅应用未糖基化的
10 4 4
噬菌体(8×10 )显著地降低了与SBA结合的感染粒子的量(3.8×10±0.2×10)。为了证明在洗脱级分中的噬菌体确实为糖噬菌体，通过EagI-EheI消化对来自每种重构的12个噬菌粒进行分析，EagI-EheI消化容许在糖噬菌体和非糖基化噬菌体之间的区分。至少11/12的噬菌粒显示出噬菌粒pAcrA-g3p的限制图谱，该噬菌粒pAcrA-g3p被包装在由TG1(pgl+，pAcrA-g3p)细胞产生的糖噬菌体中。在仅使用糖噬菌体的洗脱级分中(阳性对照)，12/12的噬菌粒显示出糖噬菌粒(glyco-phagemid)特异性的DNA片段。这些数据明确地确定：
(i)携带N-连接的七糖的糖基化蛋白能够在丝状噬菌体上多价展示；(ii)糖噬菌体纯化步
4
骤进行得很有效，每轮SBA淘选获得了高至10 的富集因子；以及(iii)糖噬菌体即使在进行两轮SBA淘选时也不丧失感染力。

[0149] 实施例8-大肠杆菌中酵母糖基转移酶的表达与定位

[0150] Man3GlcNAc2寡糖结构的产生需要几种真核糖基转移酶在大肠杆菌中的功能性表达，并且该寡糖结构的产生代表了“途径工程化”的经典实例(参见图10B)。

[0151] WecA催化的第一GlcNAc向脂质载体的转移。

[0152] 细菌萜醇焦磷酸充当在内膜的胞质侧装配寡糖的载体(Feldman等人，“Engineering N-linked Protein Glycosylation With Diverse O Antigen Lipopolysaccharide Structures in Escherichia coli(大肠 杆菌 中具有 多种O抗原脂多糖结构的工程化N-连接蛋白糖基化)，”Proc.Nat’l Acad.Sci.USA102：3016-3021(2005)，通过引用将其整体并入本文)。在大肠杆菌中，细菌萜醇-PP-GlcNAc是由细菌萜醇-P和UDP-GlcNAc通过WecA蛋白产生的(Valvano，M.A.，“Export of O-specific Lipopolysaccharide(O-特异性脂多糖的输出)，”Frontiers in Bioscience
8：S452-S471(2003)，通过引用将其整体并入本文)。因此，这种内源的底物可以在产生Man3GlcNAc2寡糖的人工途径中用作起始分子。还原末端GlcNAc残基是由真核OST底物识别所必需的(Tai等人，“Substrate Specificity of the Glycosyl Donor for Oligosaccharyl Transferase(寡糖基转移酶的糖基供体的底物特异性)，”JOrg Chem 66：
6217-28(2001)，通过引用将其整体并入本文)，但是也满足了原核OST底物的需要(Wacker等人，“Substrate Specificity of Bacterial Oligosaccharyltransferase Suggests a Common Transfer Mechanism for the Bacterial and Eukaryotic Systems(细菌寡糖基转移酶的底物特异性表明了细菌与真核系统的共有转移机制)，”Proc.Nat’l Acad.Sci.USA103：7088-7093(2006)，通过引用将其整体并入本文)。

[0153] 实施例9-酵母Alg13/14在大肠杆菌中的表达

[0154] 最近已在酵母中鉴定出添加第二个GlcNAc残基的β1，4GlcNAc转移酶(Bickel等人，“Biosynthesis of Lipid-linked Oligosaccharides in Saccharomyces cerevisiae-Alg 13p AND Alg 14p Form a Complex Required for the Formation of GlcNAc(2)-PP-dolichol(酿酒酵母中脂连接的寡糖的生物合成-Alg13p和Alg14p形成GlcNAc(2)-PP-多萜醇的形成所需的复合体)，”J. Biol.Chem.280：34500-34506(2005)，通过引用将其整体并入本文)。这种酶是由来自酿酒酵母的ALG13和ALG14基因座编码的两种蛋白的复合体。Alg14是整合膜蛋白，而Alg13由于与Alg14缔合而在外围与ER膜的胞质侧缔合。测试ΔdnaJ细胞的原因是已知dnaJ的失活增加膜蛋白的表达并且抑制它们的表达所伴随的严重细胞毒性(Skretas等人，“Genetic Analysis of G Protein-coupled Receptor Expression in Escherichia coli：Inhibitory Role of DnaJ on the Membrane Integration of the Human Central Cannabinoid Receptor(大肠杆菌中G蛋白偶联受体表达的遗传分析：DnaJ对人中枢大麻素受体的膜整合的抑制作用)，”Biotechnol Bioeng(2008)，通过引用将其整体并入本文)。

[0155] 对来自MC4100大肠杆菌细胞的总蛋白进行以20,000×g的离心20分钟，所述MC4100大肠杆菌细胞表达附有来自质粒pBAD18-Cm的C末端6×his标签的Alg13和附有C末端FLAG表位标签的Alg14。上清液表示可溶部分，并且沉淀为不可溶部分。将可溶部分再以100,000×g旋转1hr，将上清液和沉淀分别收集作为可溶部分和膜部分。将以0.2％阿拉伯糖诱导0、1、2和3小时后收集的可溶性胞质部分用抗6×HIS抗体(Promega)探测以检测Alg13-6×HIS。使用蛋白质印迹分析来比较从MC4100和MC4100ΔdnaJ细胞分离的部分，并用抗FLAG抗体探测以检测诱导后3小时收集的Alg14-FLAG。观察到了Alg13在胞质中的可溶性表达(图11A)和内膜中Alg14的正确插入(图11B)。

[0156] 接着，将在源自转化的大肠杆菌细胞的提取物中测试GlcNAc转移酶的活性(Bickel等人，“Biosynthesis of Lipid-linked Oligosaccharides in Saccharomyces cerevisiae-Alg 13p and Alg 14p Form a Complex Required for the Formation of GlcNAc(2)-PP-dolichol(酿酒酵母中脂连接的寡糖的生物合成-Alg13p和Alg14p形成GlcNAc(2)-PP-多萜醇的形成所需的复合体)，”J.Biol.Chem.280：34500-34506(2005)，3
通过引用将其整体并入本文)并且通过用 H-GlcNAc标记细胞和使用标准方法分析糖脂来分析细菌萜醇-PP-GlcNAc2的体内形成(Bickel等人，“Biosynthesis of Lipid-linked Oligosaccharides in Saccharomyces cerevisiae-Alg 13p AND Alg 14p Form a Complex Required for the Formation of GlcNAc(2)-PP-dolichol(酿酒酵母中脂连接的寡糖的生物合成-Alg13p和Alg14p形成GlcNAc(2)-PP-多萜醇的形成所需的复合体)，”J.Biol.Chem.280：34500-34506(2005)，通过引用将其整体并入本文)。

[0157] 实施例10-Alg1和Alg2在大肠杆菌中的表达

[0158] 本发明的方法还需要表达活性Alg1蛋白、β1，4甘露糖基转移酶和催化α1，3和α1，6甘露糖残基两者添加至寡糖的双功能Alg2甘露糖基转移酶。这些酶的每一种先前都已经以活性形式在大肠杆菌中表达(O′Reilly等人，“In vitro Evidence for the Dual Function of Alg2 and Alg 11：Essential Mannosyltransferases in N-linked Glycoprotein Biosynthesis(Alg2和Alg11的双重功能的体外证据：N-连接的糖蛋白生物合成中必需的甘露糖基转移酶)，”Biochemistry 45：9593-603(2006)和Wilson等人，“Dolichol is Not a Necessary Moiety for Lipid-linked Oligosaccharide Substrates of the Mannosyltransferases Involved in In vitro N-linked-oligosaccharide Assembly(多萜醇不是参与体外N-连接的寡糖装配的甘露糖基转移酶的脂连接的寡糖底物的必需部分)，”Biochem J 310(Pt 3)：909-16(1995)，通过引用将它们整体并入本文)。

[0159] 将来自表达Alg1和Alg2的MC4100ΔdnaJ大肠杆菌细胞的总蛋白以20,000×g离心20分钟，Alg1和Alg2各自附有C末端6×HIS标签，并且Alg2附有N末端硫氧还蛋白(TrxA)溶解性标签，收集上清液并再以100,000×g旋转1小时，收集此旋转的沉淀作为膜部分。在诱导后3、4和5小时从细胞收获膜部分。用抗6×HIS抗体(Promega)探测印迹。如图12中所示，它们各自正确地定位在大肠杆菌的内膜中。

[0160] 接着，需要根据已确立的方案在源自转化的大肠杆菌细胞的提取物中测试甘露糖基转移酶的活性(O′Reilly等人，“In vitro Evidence for the Dual Function of Alg2 and Alg11：Essential Mannosyltransferases in N-linked Glycoprotein Biosynthesis(Alg2和Alg11的双重功能的体外证据：N-连接的糖蛋白生物合成中的必需的甘露糖基转移酶)，”Biochemistry 45：9593-603(2006)和Schwarz等人，“Deficiency of GDP-Man：GlcNAc2-PP-dolichol Mannosyltransferase Causes Congenital Disorder of Glycosylation Type Ik(GDP-Man：GlcNAc2-PP-多萜醇甘露糖基转移酶的缺陷引起Ik型糖基化先天疾患)，”Am J Hum Genet 74：472-81(2004)，通过引用将它们整体并入本文。预测的实施例11-人工Alg操纵子的构建

[0161] 在验证了每种酶可以在大肠杆菌中功能性表达后，编码所有四个上述酵母酶的基因簇将被构建在单个质粒骨架上。在野生型、ΔdnaJ突变体和之前已被进行膜蛋白表达优化的菌株C41(DE3)中进行四种Alg酶的共表达(Miroux等人，“Over-production of Proteins in Escherichia coli：Mutant Hosts That Allow Synthesis of Some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels(大肠杆菌中蛋白的过量产生：容许一些膜蛋白和球状蛋白高水平合成的突变宿主)，”J Mol Biol 260：289-98(1996)，通过引用将其整体并入本文)。申请人预计四种Alg酶的共表达将导
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致细菌萜醇-PP-GlcNAc2Man3的体内形成。这将通过在37℃下用 H-甘露糖对细胞进行代谢标记30分钟来证实。将细菌萜醇连接的寡糖提取、释放并通过高效液相色谱(HPLC)进行分析，如在Korner等人，“Abnormal Synthesis of Mannose 1-phosphate Derived Carbohydrates in Carbohydrate-deficient Glycoprotein Syndrome Type I Fibroblasts with Phosphomannomutase Deficiency(在具有磷酸甘露糖变位酶缺陷的I型碳水化合物缺陷型糖蛋白综合征的成纤维细胞中甘露糖-1-磷酸来源的碳水化合物的异常合成)，”Glycobiology 8：165-71(1998)，通过引用将其整体并入本文。

[0162] 尽管本文详细描绘和描述了优选的实施方式，但是对于相关领域的熟练技术人员来说明显的是可以做出各种修改、添加、替代以及诸如此类而不背离本发明的精神，并且因此这些也被认为是在如下的权利要求书所限定的本发明的范围之内。