产生IL-17的辅助T细胞检测用标记及产生IL-17的辅助T细胞的检测方法

摘要

本发明涉及一种用于特异性检测产生IL-17的辅助T细胞(Th17细胞)的多聚核苷酸标记或蛋白质标记以及Th17细胞检测方法，该方法的特征是包括检测这些物质的存在。

权利要求

1.一种IL-17产生辅助T细胞(Th17细胞)检测用多聚核苷酸标记，且该多聚核苷酸选自以下基因群和基因片段：编码白细胞介素17A、白细胞介素22和白细胞介素tifb等细胞因子的基因；

编码趋化因子CC基元配体20这一趋化因子的基因；

编码属于以下群的膜蛋白质的基因：白细胞介素17受体E、白细胞介素1受体1、白细胞介素27受体A、G蛋白偶联受体15、稳定素1、平足蛋白、含横跨膜和免疫球蛋白域1、黑素肾上腺皮质激素2受体、横跨膜蛋白质176A、孕酮和adipoQ受体家族成员VIII、含靠停蛋白域1、ELVOL家族成员7、淋巴细胞抗原6复合体基因座K、G蛋白偶联受体183(eb病毒诱导基因2)、杀伤细胞凝集素样受体亚家族B成员1F、铁传递蛋白受体2、神经元特异性基因家族成员2、横跨膜蛋白质176B、淀粉状蛋白β(A4)前体样蛋白2、免疫球蛋白J链、附着分子含Ig样域2、低亲和性Fc受体IgG IIb、大麻类受体2、肿瘤坏死因子受体超家族成员

14、水通道蛋白3、Clq及肿瘤坏死因子相关蛋白质3、突触结合蛋白XI、含钾通道四聚化域

12、载脂蛋白L7b(表达序列BC085284)、载脂蛋白L7e(载脂蛋白L3类似物)、溶质载体家族34成员3、细胞性视网膜结合蛋白1、细胞性视网膜结合蛋白I类似物、钾大电导钙活化通道(亚家族M，β成员4)、钙离子激活钾离子通道β4亚组类似物、SYS1高尔基体局限化的集成膜蛋白同系物(RIKEN cDNA 2610042O14基因)、及溶质载体家族38成员6(表达序列AW322671)；

编码属于POU域类2相关因子1、T细胞特异性转录因子7、含WW域转录调节因子1、毛发鼻指综合征1、中心体蛋白290、及共济失调蛋白2结合蛋白1之中的转录及翻译因子的基因；

编码属于以下群的信号分子的基因：Ras相关关联糖尿病、乳腺癌抗雌激素抗性3、Rab38(RAS癌基因家族成员)、矢车菊苷蛋白γ2、SH3及PX域2B、FERM，RhoGEF和血小板白细胞C激酶底物域蛋白2、失效同系物2、B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1a、B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1b及B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1d；

编码转化生长因子β引导这一粘附分子的基因；

编码属于以下物质群的酶的基因：细胞色素P450，家族1，亚家族b，多肽1、含EH结构域3、基质金属肽酶13、羧肽酶D、碳酸酐酶13、葡糖胺(N-乙酰)转移酶2，I分支酶、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A2、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A6A、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A6B、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A10、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A7C、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A5、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A9、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A1、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A8类似物、UDP-GlcNAc：βGalβ1，3-N乙酰葡糖氨基转移酶8、骨形态发生蛋白1、尿嘧啶核苷磷酸化酶1、肌浆球蛋白III B、β位点APP裂解酶2、肥大细胞蛋白酶1、COX10同系物，细胞色素c氧化酶组装蛋白，血红素A：法呢酰转移酶、发动蛋白3、前列腺酸性磷酸酶、磷酸二酯酶5A，cGMP特异、含Patatin样磷酯酶域7、RIKEN cDNA 1300007F04基因、RIKEN cDNA1810062O18基因、磷酸酶孤儿素1(表达序列AI447357、ABI基因家族成员3)及多发性外生骨疣1；

编码属于以下群体的酶抑制剂的基因：丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂B簇成员1a、蛋白磷酸酶1调节(抑制剂)亚基14c、精巢特异性cAMP依赖性蛋白激酶抑制因子β、组织抑制剂金属蛋白酶1、丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂I簇成员1、淀粉状蛋白β(A4)前体蛋白及WAP四二硫化物核心域2；

编码含半胱氨酸丰富分泌蛋白LCCL域2这一分泌蛋白的基因；

编码属于以下群体的结构蛋白的基因：肌动蛋白丝束蛋白1(表达序列AI427122)、免疫球蛋白重链复合物、免疫球蛋白重链1a(血清IgG2a)、免疫球蛋白重链2(血清IgA)、免疫球蛋白重链Ia、免疫球蛋白重链(J558家族)、免疫球蛋白重链(γ-多肽)、免疫球蛋白μ链类似物、免疫球蛋白重链V区3前体类似物、免疫球蛋白重链可变区、免疫球蛋白重链V区102前体类似物、免疫球蛋白重链3、星云状小体、内腔蛋白、杀菌性/通透性增加蛋白样2、KELCH样8、三重基序蛋白2、PDZ及LIM域5、角蛋白86、驱动蛋白家族成员3C、驱动蛋白家族成员1B及驱动蛋白家族成员5C；

属于中足性梳样4、高移动族AT钩2假基因1、RIKEN cDNA 2310007L24基因、RIKEN cDNA 2310002J15基因、序列相似家族101，成员B(RIKEN cDNA1500005K14基因)、表达序列AI646023及含GRAM域3其中之一的基因，及属于TOX高移动族框蛋白家族成员2(表达序列AI851523)、RIKEN cDNA6030439D06基因、RIKEN cDNA 9030418K01基因、表达序列AU015680、有序列号1的碱基序列的多核甙酸、及有序列号2的碱基序列的多核甙酸之一的表达序列片段(EST)。

2.权利要求1所述Th17细胞检测用多聚核苷酸标记，其特征在于，其选自以下基因群和片段群：

编码白细胞介素17A、白细胞介素22和白细胞介素tifb等细胞因子的基因；

编码选自以下群的膜蛋白质的基因：白细胞介素1受体1、白细胞介素27受体A、G-蛋白偶联受体15、稳定素1、载脂蛋白L7b(表达序列BC085284)、载脂蛋白L7e(载脂蛋白L3类似物)、Clq及肿瘤坏死因子相关蛋白质3、大麻类受体2、低亲和性Fc受体IgG IIb、G蛋白偶联受体183(eb病毒诱导基因2)、细胞性视网膜结合蛋白1、细胞性视网膜结合蛋白I类似物、淋巴细胞抗原6复合物基因座K、溶质载体家族38成员6(表达序列AW322671)、突触结合蛋白XI、横跨膜蛋白176A、横跨膜蛋白176B、及肿瘤坏死因子受体超家族成员14；

编码选自T细胞特异性转录因子7和含WW域转录调节因子1之中的转录及翻译因子的基因；

编码选自B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1a、B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1b及B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1d、失效同系物2、Ras相关关联糖尿病及SH3及PX域2B之中的信号分子的基因；

编码粘附分子-转化生长因子β引导的基因；

编码属于以下群的酶的基因：前列腺酸性磷酸酶、UDP-GlcNAc：βGal β1，3-N乙酰葡糖氨基转移酶8、骨形态发生蛋白1、碳酸酐酶13、细胞色素P450，家族1，亚家族b，多肽1、葡糖胺(N-乙酰)转移酶2，I分支酶、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A2、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A6A、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A6B、UDP葡糖醛酸基转移酶

1家族，多肽A10、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A7C、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A5、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A9、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A1、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A8类似物、基质金属肽酶13、磷酸二酯酶5A，cGMP特异、磷酸酶孤儿素1(表达序列AI447357、ABI基因家族成员3)和尿嘧啶核苷磷酸化酶1；

编码选自酶抑制剂丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂B簇成员1a和组织抑制剂金属蛋白酶1之中的基因；

编码分泌蛋白-含半胱氨酸丰富分泌蛋白LCCL域2的基因；

编码结构蛋白-选自驱动蛋白家族成员5C和内腔蛋白之中的基因，以及

属于RIKEN cDNA 6030439D06基因和RIKEN cDNA 9030418K01基因的表达序列片段(EST)。

3.权利要求1所述Th17细胞检测用多聚核苷酸标记，其特征在于，其多聚核苷酸属于以下基因群和片段群：编码细胞因子白细胞介素17A的基因；

编码选自白细胞介素1受体1、载脂蛋白L7b(表达序列BC085284)、载脂蛋白L7e(载脂蛋白L3类似物)、大麻类受体2、低亲和性Fc受体IgG IIb、溶质载体家族38成员6(表达序列AW322671)、及横跨膜蛋白176A之中的膜蛋白质的基因；

编码选自B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1a、B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1b及B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1d之中的信号分子的基因；

编码基质金属肽酶13这一酶的基因；

编码酶抑制剂——组织抑制剂金属蛋白酶1的基因，以及

编码含半胱氨酸丰富分泌蛋白LCCL域2这一分泌蛋白的基因。

4.由经权利要求1所述基因编码的蛋白质构成的Th17细胞检测用蛋白质标记。

5.一种检测Th17细胞的方法，其特征在于：在含有细胞的试样中检测是否有权利要求

1所述Th17细胞检测用多聚核苷酸标记或权利要求4所述Th17细胞检测用蛋白质标记。

6.一种DNA芯片或微阵列，其特征在于：其含有与权利要求1所述Th17细胞检测用多聚核苷酸标记特异性杂交的探针。

7.一种用于扩增权利要求1所述Th17细胞检测用多聚核苷酸标记的核酸引物。

8.一种抗体，其特征在于：能与权利要求4所述Th17细胞检测用蛋白质标记特异性结合。

9.一种Th17细胞检测用试剂盒，其特征在于：其包括权利要求6所述DNA芯片或微阵列、权利要求7所述核酸引物或权利要求8所述抗体。

说明书

产生IL-17的辅助T细胞检测用标记及产生IL-17的辅助

T细胞的检测方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及一种产生白细胞介素(IL)-17的辅助T细胞(以下称“Th17细胞”)检测用标记及检测Th17细胞的方法。背景技术：

[0002] 类风湿关节炎(以下称“RA”)是以关节炎为主要临床症状的全身性炎症性自身免疫疾病。RA虽然可以通过关节疼痛等自觉症状和肿胀程度以及观察骨X线等视觉手段判断其病情，但尚未建立一种定量性的指标。因此，目前也没有确立一种能连续监视治疗效果的定量方法。

[0003] RA虽然是自身免疫性疾病，但其原因至今尚未搞清楚。一般认为细菌感染等是诱因，通过免疫细胞群和细胞因子群的复杂网络引起关节组织炎症。

[0004] 免疫反应中最重要的是辅助T细胞群。当未成熟的辅助T细胞(幼稚T细胞)被抗原提呈细胞提呈出抗原时，分化为辅助T细胞，但此时存在特定细胞因子，于是幼稚T细胞被诱导分化为四种细胞。所谓四种细胞是产生干扰素(IFN)-γ的辅助T细胞(Th1细胞)、产生白细胞介素(IL)-4的辅助T细胞(Th2细胞)、产生白细胞介素(IL)-17的辅助T细胞(Th17细胞)和有免疫抑制效果的调节性T细胞(Treg细胞)。

[0005] 已经知道这些辅助T细胞中Th17细胞可以参与RA发病。

[0006] 据统计，在RA患者的关节滑液中的IL-17的水平比在变形关节炎患者的关节滑液中的IL-17的水平高，此外，来源于RA患者的滑液组织中的T细胞中存在IL-17阳性细胞，由此说明IL-17与RA病情形成、特别是关节和骨质破坏有密切关系(专利公开2000-186046号公报(专利文献1))。在专利文献1记载了可以将IL-17作为RA诊断标记使用。

[0007] 据专利公开2007-506100号公报(专利文献2)记述，分析从RA患者采集的末梢血血清中细胞因子发现，统计中RA患者的IFN-γ、IL-1β、TNF-α、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、IL-5和IL-7为高值，IL-2、CXCL8/IL-8、IL-12和CCL2/MCP-1则不是高值。

[0008] 另外，根据Ivanov等(细胞(Cell)，2006，126，p.1121-1133：非专利文献1)、Stumhofer等(自然免疫学(Nature Immunology)，2006，vol.7，p.937-945：非专利文献2)、Wil son等(自然免疫学(Nature Immunology)，2007，vol.8，p.950-957：非专利文献
3)等的研究，关于Th17细胞已发现如下情况。

[0009] -一种被称为RORγt的核内受体对Th17细胞分化起着重要作用。

[0010] -由未成熟辅助T细胞(幼稚T细胞)向Th17细胞的分化受IL-6、IL-23和TGF-β诱导。

[0011] -表达了IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL-26、TNF、IFN-γ、CCL20。

[0012] -Th17细胞表面有IL-23受体和IL-12受体β。

[0013] 非专利文献1-3是用对IL-17具有特异性的抗体的ELISA(酶结合免疫吸附法)测定IL-17的量。

[0014] 然而，一般认为，检测Th17细胞本身的方法的确立，不仅能够测定IL-17的量，还能够更深入地理解自我免疫疾病、特别是RA、溃疡性大肠炎、克隆病及多发性硬化症(脑炎和/或脊髓炎)，其中尤其是RA及多发性硬化症(脑炎)与Th17细胞的关系。

[0015] 专利文献1：专利公开2000-186046号公报

[0016] 专利文献2：专利公开2007-506100号公报

[0017] 非专利文献1：Ivanov等“孤儿核受体RORγt引导促炎IL-17+T辅助细胞的分化(The Orphan Nuclear Receptor RORγt Directs the Differentiation Program of Proinflammatory IL-17+T Helper Cells”)，细胞，2006，126，p.1121-1133[0018] 非专利文献2：Stumhofer等“白细胞介素27在中枢神经系统慢性炎症中消积地调节白细胞介素17-产生T辅助细胞的发育(Interleukin 27negatively regulates the development of interleukin 17-producing T helper cells during chronic inflammation of the central nervous system)”自然免疫学，2006，vol.7，p.937-945[0019] 非专利文献3：Wilson等“发育，细胞因子概述及人白细胞介素17-产生T辅助细胞的功能(Development，cytokine profile and function of human interleukin17-producing helper T cells)”自然免疫学，2007，vol.8，p.950-957发明内容：

[0020] 发明要解决的课题

[0021] 本项发明人的目的是要找到能特异性地检测出Th17细胞的分子标记、特别是在被认为与Th17细胞有关的疾病中常发现的分子标记。

[0022] 解决课题的手段

[0023] 本发明人首先认定能在使从小鼠脾分离的幼稚T细胞分化获得的Th17细胞特异性表达的基因和表达序列片段(EST)。然后，本发明人从用Th17细胞认定的基因和表达序列片段(EST)使用被认为与Th17细胞相关的疾病模型鼠(关节炎模型及/或脑脊髓炎模型)提取能在该疾病模型中高表达的基因和EST。

[0024] 因此，本项发明是一种Th17细胞检测用的多聚核苷酸标记，且该多聚核苷酸选自以下基因群和基因片段：

[0025] 编码白细胞介素17A(interleukin 17A)、白细胞介素22(interleukin22)和白细胞介素tifb(interleukin tifb)等细胞因子的基因；

[0026] 编码趋化因子CC基元配体20(chemokine CC motif ligand 20)这一趋化因子的基因；

[0027] 编码属于以下群的膜蛋白质的基因：白细胞介素17受体E(interleukin17 receptor E)、白细胞介素1受体1(interleukin 1 receptor 1)、白细胞介素27受体A(interleukin 27 receptorA)、G蛋白偶联受体15(G protein-coupled receptor 15)、稳定素1(stabilin 1)、平足蛋白(Podoplanin)、含横跨膜和免疫球蛋白域1(Transmembrane and immunoglobulin domain containing 1)、黑素肾上腺皮质激素2受体(Melanocortin2 receptor)、横跨膜蛋白质176A(Transmembrane protein 176A)、孕酮和adipoQ受体家族成员VIII(Progestin and adipoQ receptor family member VIII)、含靠停蛋白域
1(Claudin domain containing1)、ELVOL家族成员7(ELVOL family member 7)、淋巴细胞抗原6复合物基因座K(Lymphocyte antigen6 complex，locus K)、G蛋白偶联受体183(eb病毒诱导基因2)(G protein-coupled receptor 183(Epstein-Barr virus induced gene 2))、杀伤细胞凝集素样受体亚家族B成员1F(Killer cell lectin-like receptor subfamily B member 1F，KLRB1F)、铁传递蛋白受体2(Transferrin receptor 2)、神经元特异性基因家族成员2(neuron specific gene family member 2)、横跨膜蛋白质
176B(Transmembrane protein 176B)、淀粉状蛋白β(A4)前体样蛋白2(Amyloid beta(A4)precursor-like protein 2)、免疫球蛋白J链(Immunoglobulin joining chain)、附着分子含Ig样域2(Adhesion molecule with Ig like domain 2)、低亲和性Fc受体IgG IIb(Fc receptor，IgG，low affinity IIb)、大麻类受体2(Cannabinoid receptor 2)、肿瘤坏死因子受体超家族成员14(Tumor necrosis factor receptor superfamily，member
14)、水通道蛋白3(Aquaproin 3)、Clq及肿瘤坏死因子相关蛋白质3(Clq and tumor necrosis factor related protein 3)、突触结合蛋白XI(Synaptotagmin XI)、含钾通道四聚化域12(Potassium channel tetramerisation domain containing 12)、载脂蛋白L7b(表达序列BC085284)(Apolipoprotein L7b(expressed sequence BC085284))、载脂蛋白L7e(载脂蛋白L，3类似物)(Apolipoprotein L7e(similar to apolipoprotein L，
3))、溶质载体家族34成员3(Solute carrier family34(member3))、细胞性视网膜结合蛋白1(Retinol binding protein 1，cellular)、细胞性视网膜结合蛋白I类似物(similar to cellular retinol binding protein I)、钾大电导钙活化通道(亚家族M，β成员4)(Potassium large conductance calcium-activated channel(subfamily M，beta member
4)，KCNMB4)、钙离子激活钾离子通道β4亚组类似物(similar to calcium activated potassium channel beta 4 subunit)、SYS1高尔基体-局限化的集成膜蛋白同系物(RIKEN cDNA 2610042O14基因)(SYS1 Golgi-localized integral membrane protein homolog(RIKEN cDNA 2610042014 gene))、及溶质载体家族38成员6(表达序列AW322671)(Solute carrier family38，member6(expressed sequence AW322671))；

[0028] 编码选自POU域，类2，相关因子1(POU domain，class 2，associating factor1)、T细胞特异性转录因子7(Transcription factor 7(T-cell specific))、含WW域转录调节因子1(WW domain containing transcriptionregulator 1)、毛发鼻指综合征
1(Trichorhinophalangeal syndrome 1)、中心体蛋白290(Centrosomal protein 290)、及共济失调蛋白2结合蛋白1(Ataxin 2binding protein 1)之中的转录及翻译因子的基因；

[0029] 编码选自以下群的信号分子的基因：Ras相关关联糖尿病(Ras-related associated with diabetes)、乳腺癌抗雌激素抗性3(Breast cancer anti-estrogen resistance 3)、Rab38(RAS癌基因家族成员)(Rab38(member of RAS oncogene family))、矢车菊苷蛋白γ2(Centaurin，gamma 2)、SH3及PX域2B(SH3 and PX domains 2B)、FERM，RhoGEF和血小板白细胞C激酶底物域蛋白2(FERM，RhoGEF and pleckstrin domain protein 2)、失效同系物2(Disabled homolog 2)、B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1a(B-cell leukemia/lymphoma 2 related protein A1a)、B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1b(B-cell leukemia/lymphoma 2 related protein A1b)及B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1d(B-cell leukemia/lymphoma 2 relatedprotein A1d)；

[0030] 编码转化生长因子β引导(Transforming growth factor beta induced)这一粘附分子的基因；

[0031] 编码属于以下群的酶的基因：细胞色素P450，家族1，亚家族b，多肽1(Cytochrome P450，family 1，subfamily b，polypeptide 1)、含EH结构域3(EH-domain containing3)、基质金属肽酶13(Matrix metallopeptidase 13)、羧肽酶D(Carboxypeptidase D)、碳酸酐酶13(Carbonic anhydrase 13)、葡糖胺(N-乙酰)转移酶2，I分支酶(Glucosaminyl(N-acetyl)transferase 2，I-branching enzyme)、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A2(UDP glucuronosyltransferase 1 family，polypeptide A2)、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A6A(UDP glucuronosyltransferase 1 family，polypeptide A6A)、UDP葡 糖 醛 酸 基 转 移 酶1 家 族，多 肽 A6B(UDP glucuronosyltransferase
1 family，polypeptide A6B)、UDP葡 糖 醛 酸 基 转 移 酶 1 家 族，多 肽 A10(UDP glucuronosyltransferase 1 family，polypeptide A10)、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A7C(UDP glucuronosyltransferase 1 family，polypeptide A7C)、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A5(UDP glucuronosyltransferase 1 family，polypeptide A5)、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A9(UDP glucuronosyltransferase 1 family，polypeptide A9)、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A1(UDP glucuronosyltransferase
1 family，polypeptide A1)、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A8类似物(Similar to UDP glucuronosyltransferase 1family，polypeptide A8)、UDP-GlcNAc：βGal β1，3-N 乙 酰 葡 糖 氨 基 转 移 酶 8(UDP-GlcNAc：betaGal beta-1，3-N-acetylgluco saminyltransferase8)、骨形态发生蛋白1(Bone morphogenetic protein 1)、尿嘧啶核苷磷酸化酶1(Uridine phosphorylase 1)、肌浆球蛋白III B(Myosin III B)、β位点APP裂解酶2(beta-site APP-cleaving enzyme 2)、肥大细胞蛋白酶1(Mast cell protease 1)、COX10同系物，细胞色素c氧化酶组装蛋白，血红素A：法呢酰转移酶(COX10 homolog，cytochrome c oxidase assembly protein，heme A：farnesyltransferase)、发动蛋白3(Dynamin 3)、前列腺酸性磷酸酶(Acid phosphatase，prostate)、磷酸二酯酶5A，cGMP特异(Phosphodiesterase 5A(cGMP-specific))、含Patatin样磷酯酶域
7(Patatin-like phosphol ipase domain containing 7)、RIKEN cDNA1300007F04基因(RIKEN cDNA 1300007F04 gene)、RIKEN cDNA 1810062O18基因(RIKEN cDNA 1810062O18 gene)、磷酸酶孤儿素1(表达序列AI447357、ABI基因家族成员3)(Phosphatase，orphan
1(expressed sequence AI447357，ABI gene family，member3))、和多发性外生骨疣
1(Exostoses(multiple)1))；

[0032] 编码属于以下群的酶抑制剂的基因：丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂B簇成员1a(Serine(or cysteine)peptidase inhibitor，clade B，member1a)、蛋白磷酸酶1调节(抑制剂)亚基14c(Protein phosphatase 1，regulatory(inhibitor)subunit
14c)、蛋白激酶抑制因子β(cAMP依赖，精巢特异性)(Protein kinase inhibitor beta(cAMP dependent，testis specific))、组织抑制剂金属蛋白酶1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1)、丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂I簇成员1(Serine(or cysteine)peptidase inhibitor，clade I，member 1)、淀粉状蛋白β(A4)前体蛋白(Amyloid beta(A4)precursor protein)及WAP四二硫化物核心域2(WAP four-disulfide core domain 2)；

[0033] 编码含半胱氨酸丰富分泌蛋白LCCL域2(Cysteine-ri ch secretory protein LCCL domain containing 2)这一分泌蛋白的基因；

[0034] 编码属于以下群的结构蛋白的基因：肌动蛋白丝束蛋白1(表达序列AI427122)(Plastin 1(expressed sequence AI427122))、免疫球蛋白重链复合物(immunoglobulin heavy chain complex)、免疫球蛋白重链 1a(血清IgG2a)(immunoglobulin heavy chain 1a(serum IgG2a))、免疫球蛋白重链2(血清IgA)(immunoglobulin heavy chain2(serum IgA))、免疫球蛋白重链Ia(immunoglobulin heavy chain Ia)、免疫球蛋白重链(J558家族)(immunoglobulin heavy chain(J558 family))、免疫球蛋白重链(γ多肽)(immunoglobulin heavy chain(gamma polypeptide))、免疫球蛋白μ链类似物(similar to immunoglobulin mu-chain)、免疫球蛋白重链V区3前体类似物(similar to immunoglobulin heavy chain V region 3 precursor)、免疫球蛋白重链可变区(immunoglobulin heavy chain variable region)、免疫球蛋白重链V区102前体类似物(similar to immunoglobulin heavy chain V region 102 precursor)、免疫球蛋白重链
3(immunoglobulin heavy chain3)、星云状小体(Nebulette)、内腔蛋白(Lumican)、杀菌性/通透性增加蛋白样2(Bactericidal/permeability-increasing protein-like 2)、Kelch样8(Kelch-like 8)、三重基序蛋白2(Tripartite motif protein 2)、PDZ及LIM域5(PDZ and LIMdomain5)、角蛋白86(Keratin 86)、驱动蛋白家族成员3C(Kinesin family member
3C)、驱动蛋白家族成员1B(Kinesin family member 1B)及驱动蛋白家族成员5C(Kinesin family member 5C)；

[0035] 属于中足性梳样4(Sex comb on midleg-like 4)、高移动族AT钩2假基因1(High mobility group AT-hook 2，pseudogene 1)、RIKEN cDNA2310007L24基因(RIKEN cDNA2310007L24gene)、RIKEN cDNA 2310002J15基因(RIKEN cDNA 2310002J15 gene)、序列相似家族101，成员B(RIKEN cDNA1500005K14基因)(Family with sequence similarity
101，member B(RIKENcDNA 1500005K14 gene))、表达序列AI646023(expressed sequence AI646023)及含GRAM域3(GRAM domain containing 3)其中之一的基因，以及[0036] 属于TOX高移动族框蛋白家族成员2(表达序列AI851523)(TOX high mobility group box family member 2(expressed sequence AI851523))、RIKEN cDNA 6030439D06基 因 (RIKEN cDNA 6030439D06 gene)、RIKEN cDNA 9030418K01 基 因 (RIKEN cDNA
9030418K01 gene)、表达序列AU015680(expressed sequence AU015680)、有序列号1的碱基序列的多核苷酸及有序列号2的碱基序列的多核苷酸之中的表达序列片段(EST)。

[0037] 本发明的Th17细胞检测用多聚核苷酸标记以选自以下基因群和片段群的多聚核苷酸为宜：

[0038] 编码白细胞介素17A、白细胞介素22和白细胞介素tifb等细胞因子的基因；

[0039] 编码选自以下膜蛋白质的基因：白细胞介素1受体1、白细胞介素27受体A、G-蛋白偶联受体15、稳定素1、载脂蛋白L7b(表达序列BC085284)、载脂蛋白L7e(载脂蛋白L3类似物)、Clq及肿瘤坏死因子相关蛋白质3、大麻类受体2、低亲和性Fc受体IgG IIb、G蛋白偶联受体183(eb病毒诱导基因2)、细胞性视网膜结合蛋白1、细胞性视网膜结合蛋白I类似物、淋巴细胞抗原6复合物基因座K、溶质载体家族38成员6(表达序列AW322671)、突触结合蛋白XI、横跨膜蛋白176A、横跨膜蛋白176B以及肿瘤坏死因子受体超家族成员14；

[0040] 编码选自T细胞特异性转录因子7、含WW域转录调节因子1的转录及翻译因子的基因；

[0041] 编码选自B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1a、B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1b及B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1d、失效同系物2、Ras相关关联糖尿病及SH3及PX域2B之中的信号分子的基因；

[0042] 编码粘附分子-转化生长因子β引导的基因；

[0043] 编码选自以下的酶的基因：前列腺酸性磷酸酶、UDP-GlcNAc：βGalβ1，3-N乙酰葡糖氨基转移酶8、骨形态发生蛋白1、碳酸酐酶13、细胞色素P450，家族1，亚家族b，多肽1、葡糖胺(N-乙酰)转移酶2，I分支酶、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A2、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A6A、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A6B、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A10、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A7C、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A5、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A9、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A1、UDP葡糖醛酸基转移酶1家族，多肽A8类似物、基质金属肽酶13、cGMP特异性磷酸二酯酶5A、磷酸酶孤儿素1(表达序列AI447357、ABI基因家族成员3)和尿嘧啶核苷磷酸化酶
1；

[0044] 编码选自酶抑制剂丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂B簇成员1a和组织抑制剂金属蛋白酶1之中的基因；

[0045] 编码分泌蛋白-含半胱氨酸丰富分泌蛋白LCCL域2的基因；

[0046] 编码结构蛋白-选自驱动蛋白家族成员5C和内腔蛋白之中的基因，以及[0047] 选自RIKEN cDNA 6030439D06基因和RIKEN cDNA 9030418K01基因的表达序列片段(EST)。

[0048] 本发明的Th17细胞检测用多聚核苷酸标记最好是选自以下基因群和片段群的多聚核苷酸：

[0049] 编码细胞因子白细胞介素17A的基因；

[0050] 编码选自白细胞介素1受体1、载脂蛋白L7b(表达序列BC085284)、载脂蛋白L7e(载脂蛋白L3类似物)、大麻类受体2、低亲和性Fc受体IgG IIb、溶质载体家族38成员6(表达序列AW322671)和横跨膜蛋白176A的膜蛋白质的基因；

[0051] 编码选自B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1a、B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1b及B细胞白血病/淋巴瘤2相关蛋白A1d之中的信号分子的基因；

[0052] 编码酶-基质金属肽酶13的基因；

[0053] 编码酶抑制剂-组织抑制剂金属蛋白酶1的基因，以及

[0054] 编码分泌蛋白-含半胱氨酸丰富分泌蛋白LCCL域2的基因。

[0055] 本发明还提供由经上述基因编码的蛋白质构成的Th17细胞检测用蛋白质标记。

[0056] 另外，本发明提供一种在含有细胞的试样中检测Th17细胞的方法，其中包括检测是否有上述Th17细胞检测用多聚核苷酸标记或Th17细胞检测用蛋白质标记。

[0057] 此外，本发明还提供Th17细胞检测用试剂盒，其中包含检测Th17细胞检测用多聚核苷酸标记用的DNA芯片或微阵列、含引物在内的探针及检测Th17细胞检测用蛋白质标记的抗体至少其中之一。

[0058] 发明效果

[0059] 通过检测本发明的多聚核苷酸标记或蛋白质标记，可以特异性地检测出Th17细胞。因此，使用本发明的标记可以从含有各种细胞的试样中分离出Th17细胞。比如使用本发明的标记可以在含采自患者的组织等细胞的试样中特异性地检测出Th17细胞。因此，可以检查出该患者患有与Th17细胞相关的疾病、如自我免疫疾病、特别是RA、溃疡性肠炎、克隆病及多发性硬化症(脑炎和/或脊髓炎)、其中尤其是RA及多发性硬化症(脑炎)的可能性。具体实施方式：

[0060] 本发明的Th17细胞检测用多聚核苷酸标记选自上述基因和EST的多聚核苷酸、其变异型及其片段。

[0061] 上述多聚核苷酸标记物是与从幼稚T细胞分化的其他辅助T细胞(Th1、Th2和Treg细胞)相比在Th17细胞有特异性存在的多聚核苷酸、其变异型或片段。上述多聚核苷酸标记物以在上述自我免疫疾病模型鼠中呈高表达的多聚核苷酸、其变异型或片段为宜。上述多聚核苷酸标记物最好是在上述自我免疫疾病模型鼠中表现出与IL-17表达量或病情相关的多聚核苷酸、其变异型或片段。

[0062] 因此，通过检测该多聚核苷酸标记物，可以特异性地检测出与Th1、Th2和Treg细胞有别的Th17细胞，并可以探讨被认为与Th17细胞相关的疾病在生物体内的动态指标。

[0063] 在本说明书中，所谓基因具有与在该技术领域通用的同等意思，指mRNA完成转录翻译成蛋白质的基因组上的一部分。

[0064] 在本说明书中，所谓表达序列片段(EST)具有在该技术领域通用的同等意思，指某基因的部分序列、是证明该基因被mRNA翻译的序列。

[0065] 另外，所谓信号分子指在细胞膜、细胞质和核等存在、并应答来自细胞内外的刺激从而被激活的一系列信号传递物质。粘附分子指存在于细胞膜表面、与细胞外基质和其他细胞膜表面分子结合引起物理粘附、信号传递、细胞结构变化等的分子群。所谓结构蛋白指主要存在于细胞内、构建和保持细胞形态、进行运动、运送信号分子的分子群。

[0066] 在本说明书中，所谓某个多聚核苷酸在Th17细胞中“特异性地表达”指据统计该多聚核苷酸在Th17细胞的表达比该多聚核苷酸在Th17细胞以外的其他细胞中的表达高。具体而言，该多聚核苷酸在Th17细胞的表达是在Th17细胞以外的其他细胞中表达的约3倍以上。该多聚核苷酸在Th17细胞的表达最好是该多聚核苷酸在Th17细胞以外的辅助T细胞(Th1细胞、Th2细胞和Treg细胞)中的表达的三倍以上。

[0067] 本发明的多聚核苷酸标记物的碱基序列已众所周知。这些可以从比如Unigene(美国国立医学图书馆的国立生物技术信息中心(NCBI)提供的数据库)获得。本发明的多聚核苷酸标记物的碱基序列的Unigene编号如以下表2所示。

[0068] 在本说明书中，所谓多聚核苷酸的“变异型”指导入变异的多聚核苷酸，该变异不改变基因编码的蛋白质通过上述基因或EST能够检出的性质。这种变异包括从上述基因或EST周知的碱基序列中缺失或置换1个或数个核苷酸，或者增加1个或数个核苷酸。

[0069] 上述变异型同上述各基因或EST的周知碱基序列一般至少有80％相同，以至少85％相同为宜，至少约90％相同更好，最好至少有95％相同。

[0070] 在本说明书中，碱基序列及氨基酸序列的相同性指用BLASTN、BLASTP、BLASTX或TBLASTN(比如可以使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov)以标准设定算出的结果。

[0071] 上述多聚核苷酸标记物可以是DNA或RNA之一，也可以是上述基因本身(DNA)、mRNA、cDNA或cRNA其中之一。

[0072] 通过检测本发明的多聚核苷酸标记物的基因编码的蛋白质也可以检出Th17细胞。因此，由上述基因编码的蛋白质构成的Th17细胞检测用蛋白质标记物也是本发明之一。

[0073] 这种蛋白质标记物的序列可以根据从上述Unigene等获得的多聚核苷酸标记物的碱基序列获得。也可以从上述NCBI提供的数据库获得。关于本发明的蛋白质标记物的氨基酸序列的NCBI编码见以下表2。

[0074] 上述Th17细胞检测用蛋白质标记物可以选自上述基因编码的蛋白质、与其功能同等的变异型及其片段。

[0075] 所谓上述蛋白质的功能同等的变异型指导入了不改变上述蛋白质功能的变异的蛋白质。这种变异包括从上述众所周知的蛋白质的氨基酸序列中缺失或置换1个或数个核苷酸，或者增加1个或数个核苷酸。

[0076] 上述蛋白质的功能同等的变异型与上述各蛋白质的众所周知的氨基酸序列一般至少有80％相同，以至少85％相同为宜，至少约90％相同更好，最好至少有95％相同。

[0077] 能与上述多聚核苷酸标记物特异性杂交的分子可以用于检测上述标记物，因此作为Th17细胞检测用探针是有用的。该探针可以是能与上述多聚核苷酸标记物特异性杂交的DNA、RNA等核酸探针、肽探针任意一种。Th17细胞检测用探针尤以检测多聚核苷酸标记物用的核酸探针、特别是DNA探针为佳。

[0078] 在本说明书中，所谓“能特异性杂交”指在严格(stringent)条件下能与目标核酸分子(上述多聚核苷酸标记物)杂交。

[0079] 在本说明书中，所谓严格条件指在该条件下Th17细胞检测用探针与目标多聚核苷酸标记物的杂交比与该目标多聚核苷酸标记物以外的多聚核苷酸杂交的检出可能性更大(比如是背景的至少2倍以上)。严格条件通常是序列依赖型，而且在各种环境中各不相同。一般而言，严格条件选择得比在规定离子强度和pH值下的特定序列的热熔点(thermal melting point)约低5℃。此Tm是(在规定离子强度、pH和核酸组成的条件下)与上述目标序列互补的探针50％平衡杂交的温度。

[0080] 这种条件可以是在历来为人所知的多聚核苷酸之间的杂交法如PCR法、微阵列法和Southern印迹法(Southern blot)等中用于多聚核苷酸之间杂交的条件。具体而言，该条件可以是在pH7.0-9.0下，碱浓度约低于1.5M钠离子，更具体地说约为0.01-1.0M钠离子浓度(或其他碱)，至少约30℃。进一步具体地说，比如在微阵列法中的严格条件包括以37℃在50％甲酰胺、1M NaCl和1％SDS中杂交以及在60-65℃的0.1×SSC中清洗。在PCR法中的严格条件可以列举出pH7-9、0.01-0.1M的Tris HCl、0.05-0.15M K离子浓度(或其他碱)、至少约55℃。

[0081] 上述Th17细胞检测用核酸探针的序列可以由该专业人员根据该技术常识和上述多聚核苷酸标记物的序列适当决定，以使其能与上述多聚核苷酸标记物特异性杂交。

[0082] 上述Th17细胞检测用核酸探针可以用一般可利用的引物设计软件(比如引物3(可使用http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi)和DHASIS Pro(日立软件工程技术株式会社))来决定。

[0083] 上述Th17细胞检测用核酸探针可用该技术领域众所周知的多聚核苷酸合成法制作。

[0084] 上述Th17细胞检测用核酸探针也可以用在该技术领域常用的标记物标记。用标记的Th17细胞检测用核酸探针可以简便地检测出Th17细胞检测用多聚核苷酸标记物、即检出Th17细胞。

[0085] 上述标记物可以是32P等放射性同位素、荧光素等荧光物质、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶和生物素等在该技术领域通用的标记物。

[0086] 上述Th17细胞检测用核酸探针通过一种或数种组合使用可以特异性地检测出Th17细胞。比如用在该技术领域众所周知的方法将一种以上的该探针固定在基板上，可以制作出Th17细胞检测用多聚核苷酸标记物的DNA芯片或微阵列。

[0087] 上述Th17细胞检测用核酸探针可以是用于以PCR法扩增上述多聚核苷酸标记物的二种以上引物的组合。

[0088] 能够特异性地结合到上述蛋白质标记物的分子可以用于检测上述标记物，故可以用于检测Th17细胞。这种分子可以是能特异性结合蛋白质标记的DNA、RNA等核酸适配子和抗体等的任何一种，但最好是抗体。当Th17细胞特异性标记为酶时，使用基质作用于该酶，产生显色、发光、荧光等，以此即可检测。

[0089] 上述Th17细胞检测用抗体可以用以下历来为人所知的顺序制作。根据上述多聚核苷酸标记的基因碱基序列或蛋白质标记的氨基酸序列，将编码具有蛋白质标记氨基酸序列的蛋白质的DNA分子导入适当的表达载体。再将所得表达载体导入适当的宿主细胞，培养所得性状转换细胞，获得目标蛋白质。提纯所得蛋白质作为免疫原，用免疫原和所需佐剂，免疫适当的哺乳动物如大鼠和小鼠等。从经过免疫的动物脾脏细胞等筛选产生目标免疫原的抗体的抗体产生细胞。将所得抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤，经筛选即可获得产生抗体的杂交瘤，该杂交瘤能产生对经上述基因编码的蛋白质有特异结合性的抗体。培养所得产生抗体的杂交瘤即可获得目标抗体。

[0090] 可以用于检测上述Th17细胞的核酸适配子可以通过如下众所周知的步骤制作。可以用众所周知的方法构建有任意核酸碱基序列的核酸文库，再通过配体系统进化(SELEX)技术等选择可以与目标蛋白(上述蛋白质标记)特异性结合的适配子。

[0091] 能与上述Th17细胞检测用蛋白质标记特异性结合的分子也可以用在该技术领域通用的标记物标记。使用所标记的Th17细胞检测用抗体可以简便地检测出Th17细胞检测用蛋白质标记，即检测出Th17细胞。

[0092] 上述标记物可以是32P等放射性同位素、荧光素等荧光物质、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶和生物素等在该技术领域通用的标记物。

[0093] 通过在含有细胞的试样中检测上述Th17细胞检测用多聚核苷酸标记或Th17细胞检测用蛋白质标记的存在来检测Th17细胞的方法也是本发明之一。

[0094] 在本发明的方法，作为含有细胞的试样可以列举出从哺乳动物采集的生物试样或含有人工培养的细胞的试样。生物试样包括血液、组织、关节液、脑脊液、胸水、腹水等。

[0095] 下面就上述检测多聚核苷酸标记存在的方法说明其中一实施方式。首先按照提取苯酚和沉淀乙醇以及用市面上出售的DNA提取试剂盒等在该技术领域众所周知的方法从含有细胞的试样中提取核酸(DNA或RNA)。

[0096] 然后，检测获得的核酸试样中是否存在上述多聚核苷酸标记。在此检测中最好使用上述Th17细胞检测用核酸探针。

[0097] 上述多聚核苷酸标记可以通过PCR法、RT-PCR法、实时定量PCR和LAMP法等核酸扩增方法和Southern杂交、Northern杂交、FISH(荧光原位杂交)等杂交方法以及DNA芯片技术或微阵列技术等该技术领域通用的方法进行检测。在上述严格的条件下采取这些方法，通过检测上述标记物检测上述Th17细胞检测用核酸探针形成的杂交瘤，即可检测出多聚核苷酸标记的存在。

[0098] 下面就检测上述Th17细胞检测用蛋白质标记存在的方法说明一实施方式。比如，当待检蛋白质标记为位于细胞内部的蛋白质时，用该技术领域周知的方法从细胞中提取蛋白质。从细胞中提取蛋白质可以采用超声波粉碎细胞、细胞溶剂溶解细胞等众所周知的方法进行。用能与蛋白质标记特异性结合的分子可以检测出所得蛋白质试样中的上述蛋白质标记。具体而言，蛋白质标记可以通过酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹法等该技术领域通用的方法检测。在检测中，对蛋白质标记有特异性结合的分子最好用上述Th17细胞检测用抗体。

[0099] 比如，当待检蛋白质标记为分泌蛋白时，用与蛋白质标记特异性结合的分子可以检出分泌在上述含细胞的试样中的蛋白质标记。从上述含细胞的试样中采集细胞(淋巴细胞)，用抗CD3抗体、抗CD28抗体、伴刀豆球蛋白A、PHA(植物血凝素(Phytohaemagglutinin))、PMA(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate))、钙离子载体(Ionomycin)等刺激采集的细胞。再用能与蛋白质标记特异性结合的分子就能检测出分泌的蛋白质标记。具体而言，蛋白质标记可以通过ELISA、免疫印迹法等该技术领域通用的方法检测。在检测中，能与蛋白质标记特异性结合的分子最好用上述Th17细胞检测用抗体。

[0100] 例如，当待检蛋白质标记为存在于细胞表面的蛋白质时，用与蛋白质标记特异性结合的分子可以检出位于上述含细胞的试样中的细胞表面的蛋白质标记。从上述含细胞的试样中采集细胞的膜组分，用能与蛋白质标记特异性结合的分子就能检测出所得膜组分中的上述蛋白质标记。具体而言，可以通过酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹法等在该技术领域通用的方法检测。当待检蛋白质标记为存在细胞表面的蛋白质时，也可以用基于流式细胞(FCM)技术的方法检测。在检测中，能与蛋白质标记特异性结合的分子最好用上述Th17细胞检测用抗体。

[0101] 例如，当用FCM检测蛋白质标记时，可以按以下步骤检测。

[0102] 首先，让含有细胞的试样与用适当标记物标记的上述Th17细胞检测用抗体接触。如果存在，则Th17细胞在细胞表面与此标记抗体结合。让与标记物结合的含细胞的试样从流式细胞仪通过，即可检测出Th17细胞。也可以根据需要用流式细胞仪辨别和分离与标记物结合的Th17细胞。

[0103] 这种FCM的方法在该行业是众所周知的，反应条件由从业人员适当决定。实施例

[0104] 下面将以实施例详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。

[0105] 实施例1：分析来源于小鼠的培养Th17细胞中的高表达基因

[0106] 1.从小鼠脾分离幼稚T细胞

[0107] 摘取BALB/c小鼠的脾，获得含脾细胞的试样。用氯化铵对试样中的红细胞进行溶血后，用磁珠(波利塞斯(POLYSCIENCE)公司制)从试样中除去CD8、B细胞、单核细胞、巨+ +噬细胞、粒细胞和幼红细胞的细胞成分，粗制出CD4阳性(CD4)T细胞。从所得CD4T细胞+
中通过使用流式细胞仪分类，纯化幼稚T细胞的组分(CD4/CD25neg/CD44low/CD62high)。
同样，从C57/BL6小鼠的脾细胞中纯化出幼稚T细胞。

[0108] 2.从幼稚T细胞分化培养出Th1、Th2、Treg、Th17细胞

[0109] 将上述1.获得的来源于BALB/c小鼠的幼稚T细胞以0.5-2.0×106细胞/2ml/孔的细胞密度播种到含有抗CD 3抗体的24孔板上。在添加了表1所示各细胞因子和抗体以及抗CD28抗体的T细胞培养基(PRMI1640，10％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷酰氨酸、50μM2-巯基乙醇、100U/m L青霉素、100mg/ml链霉素)中，在37℃、5％CO2的恒温箱内培养细胞。培养开始第三天后在培养基添加表1所列细胞因子和抗体，再培养2-11天。如此，从来源于BALB/c小鼠的幼稚T细胞诱导分化出Th1、Th2、Treg、Th17细胞。同样方法，从上述1.获得的来源于C57/BL6小鼠的幼稚T细胞诱导分化出Th1、Th2、Treg、Th17细胞。

[0110] [表1]

[0111]

[0112] 3.用流式细胞仪确认细胞分化

[0113] 在含有如2.所述分化培养的细胞(2.5×105细胞)的溶液中加入佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA；50ng/ml)和钙离子载体(1μM)刺激细胞。四小时后添加蛋白转运抑制剂A(10μg/ml)再培养二个小时。培养结束后，用磷酸缓冲生理食盐水(PBS)清洗细胞，然后用4％三聚甲醛固定。固定后用皂草苷缓冲液(0.5皂草苷、0.5％BSA、1mM叠氮化钠(PBS中))处理细胞使细胞膜通透性亢进。然后，使抗IFNγ、抗IL-4和抗IL-17各抗体与细胞反应。反应后用皂草苷缓冲液和含0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS清洗，用FACS Canto II(BD生物科学公司)分析，确认向Th1、Th2、Treg、Th17各细胞分化。

[0114] 4.制备总RNA

[0115] 用PBS清洗在上述2中培养了五天的来源于BALB/c小鼠的Th1、Th2、Treg、Th17各细胞后，离心分离制成颗粒(pellet)，在-80℃冷冻保存。用去除基因组DNA组织RNA提取试剂盒(RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN公司))从颗粒制备总RNA，分析前一直在-80℃冷冻保存。同样，从在上述2中培养了五天的来源于C57/BL6小鼠的Th1、Th2、Treg、Th17各细胞，制备总RNA。

[0116] 5.分析微阵列表达

[0117] 利用单周期靶标记及对照物(One-Cycle Target Labeling and Control Reagents)(Affymetrix公司)将在上述4.制备的总RNA(1-5μg)逆转录为cDNA，再进行转录反应形成生物素化的cRNA。将15μg生物素化cRNA加入小鼠基因组4302.0芯片(GeneChip Mouse Genome 430 2.0Array)(Affymetrix公司)，在基因芯片杂交箱(GeneChip Hybridization Oven)640(Affymetrix公司)中，在45℃、60rpm条件下杂交16小时。杂交后，将经基因芯片洗涤工作站(GeneChip Fluidics Station)450洗涤和荧光标记的微阵列(DNA芯片)用基因芯片扫描仪(GeneChip Scanner)30007G(Affymetrix公司)分析，取得荧光强度数据。

[0118] 6.选择在小鼠Th17细胞特异性表达的基因

[0119] 根据上述5.获得的荧光强度数据，用表达分析软件Array Assist(MEDIBIC公司)将数据标准化。用管家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)荧光强度除以各基因的荧光强度，算出各基因的相对荧光强度。将Th17细胞各基因的相对荧光强度与Th1、Th2和Treg细胞的相比较。在BALB/c小鼠及C57/BL6小鼠的至少其中之一中，认定在Th17细胞中的相对荧光强度比Th1、Th2和Treg细胞都高出3倍以上的基因为在Th17细胞特异性表达的基因(Th17细胞检测用多聚核苷酸标记。

[0120] 所得基因如以下表2所示。

[0121] 另外，表2中列有各基因的Affymetrix的探针集ID、与探针集ID对应的Unigene号、与探针集ID对应的基因名称以及经基因编码的蛋白质的功能。表2还列有在BALB/c小鼠或C57/BL6小鼠Th1、Th2和Treg细胞中的相对荧光强度与Th17细胞中的相对荧光强度之比(分别为Th17/Th1、Th17/Th2和Th17/Treg)。

[0122] 表2还同时记有表示经各基因编码的蛋白质氨基酸序列的NCBI编号。

[0123] [表2-1]

[0124]

[0125]

[0126] [表2-2]

[0127]

[0128]

[0129] [表2-3]

[0130]

[0131]

[0132]

[0133] [表2-4]

[0134]

[0135]

[0136] [表2-5]

[0137]

[0138] 此外，已知在Th17细胞中有特异性表达的基因RAR相关孤儿受体γ(RAR-related orphan receptor gamma)的相对荧光强度比见表3。

[0139] [表3]

[0140]

[0141] 这些结果显示，表2所列各基因与过去已知在Th17细胞特异性表达的表3的基因一样，在Th17细胞有特异性表达。反复进行上述实验1.-5.四次的结果是上述各基因在Th17细胞的相对荧光强度比Th1、Th2或Treg细胞的任何一个都高三倍以上。

[0142] 实施例2：分析在疾病模型鼠中高表达基因

[0143] 1.制作疾病模型鼠

[0144] 1)制作SKG关节炎模型鼠(以下称“关节炎模型鼠”)

[0145] 用以下方法制作了关节炎模型鼠

[0146] a)制备菌体成分及向小鼠投放

[0147] 将由碱粪便菌(Alcaligenes faecalis)产生的热凝胶多糖(curdlan)(SIGMA公司)在PBS(磷酸盐缓冲液)中悬浊，获得热凝胶多糖制备物(50mg/ml)(以下称菌体成分)。该菌体成分给药到7-8周龄的自发性SKG关节炎鼠(雌)(Nature，vol 426，pp.454-460(2003)的腹腔中，购自clea-japan公司)每只200μl。四周后，再向每只小鼠的腹腔内给药200μl。

[0148] b)判断关节炎重症度

[0149] 0分：正常

[0150] 1分：关节轻度炎症

[0151] 2分：关节轻度炎症及肿胀

[0152] 3分：关节中度炎症及肿胀

[0153] 4分：关节重度炎症及肿胀

[0154] 5分：关节重度炎症、肿胀及关节变形

[0155] 6分：关节重度炎症、肿胀、关节变形、行走困难及虚弱

[0156] 根据上述标准，对用于分析的小鼠进行筛选。上述菌体成分给药第30天后出现关节炎症状。分析使用了菌体成分给药3周判断为0分的2个小鼠、给药8周判断为3分的2个小鼠、给药12周判断为5分的2个小鼠(以下称“发病期关节炎模型鼠”)、给药20周判断为6分的2个小鼠及未注射菌体成分经过20周判为0分的2个小鼠(共计10个)。使用了2个BALB/c鼠(东方(Oriental)酵母株式会社)作为对照鼠。

[0157] 2)制作实验性变应性脑脊髓炎(EAE)(急性)模型鼠(以下称：“脑炎模型鼠”)[0158] 用以下方法制作脑炎模型鼠。

[0159] a)制作抗原乳胶及注射到小鼠

[0160] 混合弗氏不完全佐剂(Difco Laboratories公司)与结核菌体成分结核杆菌H37Ra(Difco Laboratories公司)，制作出40mg/ml的弗氏完全佐剂(CFA)。将PLP(139位-151位)肽(PLP：髓鞘蛋白脂质蛋白)(委托北海道系统科学合成肽，氨基酸序列：HSLGKWLGHPDKF)(2mg/ml、溶于PBS)与CFA等量混合，用双筒针(化学技术株式会社)反复注射使之混合，制作抗原乳胶。用剃须刀剃掉8-10周龄的SJL鼠(雌)(日本Charles viver株式会社)背部的毛，在该小鼠腰部正中线左右各二处用1ml注射器分别皮下注射各50μl的上述抗原乳胶。再在该注射同日向该鼠尾静脉注射200μl溶解于PBS的百日咳毒素(Pertussis Toxin)(List Biological Laboratories提供)(2μg/ml)。

[0161] b)脑脊髓炎重症度评判

[0162] 用以下评分判断重症度。

[0163] 0分：正常

[0164] 1分：尾部完全麻痹

[0165] 2分：后肢部分麻痹

[0166] 3分：后肢完全麻痹

[0167] 4分：前肢麻痹

[0168] 5分：全身麻痹导致濒临死亡或死亡

[0169] 按照上述标准筛选用于分析的小鼠。接种上述抗原乳胶后第10-14天出现脑脊髓炎症状。其后，接种后第15-20天症状缓解后消失。症状发病期的分析使用了接种后第14天判断为2分以上的5个试验体(以下称“发病期脑炎模型鼠”)。症状缓解期的分析使用了接种后第18天判断为0分的5个试验体(以下称“缓解期脑炎模型鼠”)(共计10个)。使用5个仅腹腔注射百日咳毒素的SJL鼠作为对脑炎模型鼠的对照鼠。

[0170] 2.制备总RNA

[0171] 1)从关节炎模型鼠组织制备总RNA

[0172] 用剪子除去关节炎模型鼠关节部位的皮肤，切割脚趾，摘出足关节部位组织。在液体氮内冷冻保存摘取的足关节部位组织。用去处基因组DNA组织RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)和匀质器QIAshredder(QIAGEN公司)从冷冻的足关节部位组织制备总RNA。同样，制备了对照鼠的总RNA。

[0173] 2)从脑炎模型鼠的组织制备总RNA

[0174] 解剖脑炎模型鼠，切掉头和尾巴，取出脊柱。用注射器从该脊柱的尾椎椎孔注入PBS，靠其压力摘取脊髓。在液体氮内冷冻保存摘取的脊髓。用均化器(as-1株式会社)粉碎，用去处基因组DNA组织RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)和匀质器QIAshredder(QIAGEN公司)制备总RNA。同样也制备了对照鼠的总RNA。

[0175] 3.用微阵列分析各疾病模型鼠的基因表达

[0176] 用微阵列对作为Th17细胞检测用标记候补选择的115基因分析了在疾病模型鼠中的表达。分析使用了从与关节炎模型鼠、脑炎模型鼠和各种模型鼠相对应的对照鼠所制备的总RNA。

[0177] 用单周期靶标记及对照物(Affymetrix公司)或双周期靶标记及对照物(Two-Cycle Target Labeling and Control Reagent)(Affymetrix公司)，按照操作指南将上述各总RNA(单周期时，1-5μg、双周期时，10-100μg)反转录为cDNA，再转录成生物素化cRNA。将15μg生物素化cRNA放入小鼠基因组430 2.0芯片(Affymetrix公司)，在基因芯片杂交箱640(Affymetrix公司)中，在45℃、60rpm条件下杂交16小时。杂交后，将经基因芯片洗涤工作站450洗涤和荧光标记的微阵列用基因芯片扫描仪30007G(Affymetrix公司)扫描，取得荧光强度数据。

[0178] 用表达分析软件Gene Spring GX(安捷伦(Agilent)公司)将上述数据标准化。用GAPDH的荧光强度除以各基因的荧光强度，算出各基因的相对荧光强度。用分析的用个体数算出各疾病模型鼠和对照鼠的各基因的相对荧光强度平均值。在本实施例中，将该平均值作为各疾病模型鼠和对照鼠的各基因表达量。

[0179] 再用对照鼠的基因表达量除以各疾病模型鼠的基因表达量，以算出疾病模型鼠与对照鼠的基因表达比。本实施例中将所得各值作为关节炎模型鼠和脑炎模型鼠的各基因表达比。比如，当某基因表达比为2时，表示该基因在疾病模型鼠中表达量比对照鼠多2倍。

[0180] 4.区分认证(identification)在疾病模型鼠中高表达的基因

[0181] 1)通过基因表达比区分

[0182] 本发明人着眼于各疾病模型鼠在症状发病期的基因表达。即，将发病期中与健康时(对照鼠)各基因表达比在2以上作为在疾病模型鼠高表达的基因抽取条件(以下称“抽取条件1”)区分出发病期表达增加的基因。

[0183] 根据抽取条件1从已确认在培养的Th17细胞中有高表达的基因中分出发病期关节炎模型鼠有高表达的基因。其结果见表4。

[0184] 同样，根据抽取条件1也区分出在发病期脑炎模型鼠中有高表达的基因。其结果见表5。

[0185] 2)通过各基因表达量和IL-17A基因表达量之间的相关性区分

[0186] 本发明人着眼于疾病模型鼠的IL-17A基因表达量的动态。即将疾病模型鼠的各基因表达量和IL-17A基因表达量之间的“皮尔逊积差相关系数”为0.6以上作为与IL-17A基因表达相关的基因的抽取条件(以下称“抽取条件2”)区分出其表达量随IL-17A基因表达量变化的基因。在该领域，一般认为在统计中该相关系数在0.6以上。

[0187] 在本实施例中，皮尔逊积差相关系数如下算出。

[0188] 在同一疾病模型鼠中，设想算出该相关系数的基因表达量为x，设IL-17A基因表达量为y。如下设定各疾病模式中各小鼠的i值；

[0189] 在关节炎模式中

[0190] ——对照鼠为i＝1

[0191] ——上述未接种菌体成分的鼠为i＝2

[0192] ——上述接种菌体后三周的鼠为i＝3。

[0193] 在脑炎模式中

[0194] ——对照鼠为i＝1

[0195] ——接种上述抗原乳胶后9天的鼠为i＝2

[0196] ——接种上述抗原乳胶后14天的鼠为i＝3

[0197] ——接种上述抗原乳胶后18天的鼠为i＝4

[0198] ——接种上述抗原乳胶后24天的鼠为i＝5。

[0199] 根据上述定义的各值和算式(x，y)＝[(xi，yi)](i＝1，2，…，n)制出由2组数值组成的数据列。在关节炎模式中，n＝3，在脑炎模式中，n＝5。

[0200] 在计算皮尔逊积差相关系数中使用了以下算式。式中的带上划线的x和y分别为x＝{xi}及y＝{yi}的平均值。

[0201] [数字1]

[0202]

[0203] a)关于关节炎模型鼠

[0204] 关节炎模型鼠的IL-17A基因表达量，在未发病的判断为0分的鼠菌体成分接种后三周已经呈现上升。因此，算出了在对照鼠、上述未接种菌体成分鼠和上述接种菌体成分三周的关节炎模型鼠中IL-17A基因的表达量与在上述4.1)区分的各基因的表达量之间的皮尔逊积差相关系数。

[0205] 根据算出的相关系数和上述抽取条件2区分出在关节炎模型鼠中与IL-17A基因表达相关的基因。其结果在表4中加*号表示。

[0206] [表4-1]

[0207]

[0208]

[0209] [表4-2]

[0210]

[0211]

[0212] b)关于脑炎模型鼠

[0213] 计算出在对照鼠和上述接种抗原乳胶后9、14、18和24天的脑炎模型鼠中IL-17A基因表达量与上述4.1)区分的各基因的表达量之间的皮尔逊积差相关系数。

[0214] 根据计算出的相关系数和上述抽取条件2区分出在脑炎模型鼠中与IL-17A基因表达相关的基因。其结果在表5中加*号表示。

[0215] 3)根据脑炎模型鼠的病情和各基因表达量之间的相关性区分

[0216] 在脑炎模型鼠中，接种上述抗原乳胶后第10-14天出现脑脊髓炎症状，接种后第15-20天症状缓解后消失。因此，本发明人着眼于脑炎模型鼠的病情和各基因表达量之间的相关性。即，将缓解期与发病期中各基因表达量之比在0.7以下的作为脑炎模型鼠中与病情相关的基因的抽取条件(以下称为“抽取条件3”)，区分出其表达在发病期增加且在缓解期减少的基因。

[0217] 从上述4.2)b)区分的基因中，根据抽取条件3区分出在脑炎模型鼠中有高表达的基因。此结果在表5中附加#号表示。

[0218] [表5-1]

[0219]

[0220]

[0221]

[0222] [表5-2]

[0223]

[0224]

[0225] [表5-3]

[0226]

[0227]

[0228] 4)总结

[0229] 表6所示为在用关节炎模型鼠和脑炎模型鼠按抽取条件2和3区分出的模型鼠中有高表达的基因的名称。在该表中，○表示在该模型鼠中满足抽取条件的基因，-表示未满足抽取条件的基因。在关节炎模型鼠和脑炎模型鼠中都满足抽取条件的基因用*号表示。

[0230] [表6]

[0231]

[0232]

[0233] 本申请与2008年2月28日申请的日本国特许申请特申2008-048197号相关，其专利保护请求范围、说明书和摘要的全部均在本说明书中作为参考。