碱性橙半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种碱性橙半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明以间苯二胺与对氨基苯酸或间氨基苯酸通过重氮化反应生成含羧基的半抗原；通过活泼酯法或者混合酸酐法将所述半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原；以所述人工抗原制备得到碱性橙特异性抗体。所述抗体可用于碱性橙免疫检测，对实现碱性橙的安全监控具有重要实际应用意义。

权利要求

1.一种碱性橙人工抗原，其特征在于具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示结构： （Ⅲ） （Ⅳ）其中，式（Ⅲ）或式（Ⅳ）中n=0～3。

2.一种权利要求1所述抗原的制备方法，其特征在于用活泼脂法制备，步骤如下：（1）将式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的半抗原5～10mg溶解于1～3ml二氧六环或二甲基甲酰胺中，加入5～10mg二环己基碳二亚胺和5～10mgN-羟基琥珀酰亚胺，反应3.5～5h，离心除去沉淀得上清；

（2）将上清滴入2mLpH值为7.4～9.6、1mol/L含有10mg/mL载体蛋白的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，反应8～12h，用0.85%的生理盐水透析4天得所述抗原；

（Ⅰ）；或 （Ⅱ）其中，式（Ⅰ）或式（Ⅱ）中n=0～3。

3.一种权利要求1所述抗原的制备方法，其特征在于按照混合酸酐法制备，步骤如下：（1）将式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示的半抗原5～10mg溶解于1～3ml二氧六环或二甲基甲酰胺中，加入5～10mg加入氯甲酸异丁酯，搅拌反应0.5～2h，得甲液；

（2）将载体蛋白10～20mg溶于1～2mL1mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，得乙液；

（3）将甲液缓慢滴加到乙液中，搅拌反应过夜，反应液用0.85%的生理盐水透析4天得抗原；

（Ⅰ）；或 （Ⅱ）其中，式（Ⅰ）或式（Ⅱ）中n=0～3。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白或卵清白蛋白。

5.一种权利要求1所述碱性橙抗原的应用，其特征在于是应用于制备碱性橙多克隆抗体或单克隆抗体。

6.一种权利要求1所述碱性橙抗原的应用，其特征在于应用于食品样品中的碱性橙残留检测方面。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于所述碱性橙多克隆抗体或单克隆抗体应用于食品样品中的碱性橙残留检测方面。

说明书

碱性橙半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于食品安全技术领域。具体涉及碱性橙半抗原、人工抗原和抗体的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 碱性橙，化学名为2，4-二胺基偶氮苯，俗名“王金黄“，是一种偶氮类碱性工业染料，用于腈纶、蚕丝、羊毛、二醋纤单宁媒纤维的染色，也可以用于皮革麻的染色和竹、木、纸张、蚊香的着色及制造色淀、溶剂染料、阳离子染料。

[0003] 碱性橙在体内代谢成胺类，有强致癌性。根据美国卫生研究所(NIH)化学品健康与安全数据库资料表明：摄取、吸入以及皮肤接触该物质均会造成急性和慢性的中毒伤害。根据《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》(G B2760)及《中华人民共和国食品卫生法》的相关规定，该物质为禁止用作食品添加剂的化学制品。

[0004] 由于在中性及偏碱性条件下，碱性橙与蛋白质吸附较牢固，不易褪色，因此有些不法商人就将其用于豆制品的染色，使腐竹、豆皮的色泽光亮，欺骗消费者，使消费者的身体健康受到严重影响。对碱性橙残留的检测具有重要的意义。

[0005] 对碱性橙残留的检测目前主要要有薄层层析(TLC)、高效液相色谱/紫外检测器(HPLC/UVD)、高效液相色谱/光电二级管陈列(HPLC/PDA)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱-质谱联 用(GS-MS)等方法。这些仪器检测方法操作复杂、需受过专门训练的专业人员才能操作，而且存在着适用范围窄、设备昂贵、成本高等问题。目前我国相应的碱性橙检测技术不完备，很有必要研制更加简单快捷方便的检测方法和产品。

[0006] 免疫检测方法应用于碱性橙的检测相对简单快捷。免疫检测方法包括胶体金免疫层析法、ELISA法，是目前食品安全快速检测的两种重要方法，已经在食品安全检测中发挥着越来越明显的作用。免疫检测方法都必须首先制备出碱性橙半抗原、抗原及抗体，然后才能利用这些试剂建立免疫检测方法。

[0007] 胥传来等公开了一种专利《一种碱性橙II完全抗原的合成方法》(申请号：200910031728.X)，以碱性橙II为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联制备抗体；赵志磊等公开了一种专利《碱性橙人工抗原合成及抗体制备方法》(申请号：
200810079538.0)，以戊二醛为偶联剂分别与牛血清白蛋白。

[0008] 但是，碱性橙与很多偶氮类燃料很类似，其苯环上的氨基数目及位置是区别于其他染料的特征结构，在半抗原设计时若不保留特征结构，抗体的特异性将受到很大影响。 [0009] 因此，需要寻找新的方法，在半抗原设计时能保留碱性橙的特征结构，保证抗体的特异性才能获得理想的检测效果。

发明内容

[0010] 本发明的一个目的是填补碱性橙现有检测技术的不足，提供一种碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体。

[0011] 本发明的另一个目的是提供所述碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体的制备方法。

[0012] 本发明还有一个目的是提供所述碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体的应用。

[0013] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

[0014] 提供一种碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体，所述碱性橙人工半抗原具有式(I)或式(II)所示结构：

[0015]

[0016] 其中，式(I)或式(II)中n＝0～3。

[0017] 所述碱性橙人工抗原，具有式(III)或式(IV)所示结构：

[0018]

[0019] 本发明提供了所述碱性橙半抗原的制备方法，以间苯二胺为原料，与对氨基苯酸或间氨基苯酸通过重氮化反应生成含羧基的半抗原。包括以下步骤：

[0020] (1)将对氨基苯酸或间氨基苯酸1～3mmol溶于20ml水中，加入10ml0.1mol/l的盐酸，加入含114～228mg(1.15～3.3mmol)的亚硝酸钠水溶液1mL，反应2h，反应液为重氮液；

[0021] (2)将1～3倍于对(间)氨基苯酸物质的量的间苯二胺溶于5mL水中，用1mol/L盐酸调节pH值至6～7，然后逐滴加入步骤(1)制备得到的重氮液，静置过夜，离心所得沉淀即为半抗原。

[0022] 本发明所述人工抗原的制备可采用活泼脂法或者混合酸酐法与蛋白质偶联制备人工抗原，也可以根据本发明设计思想，采用本领域其他常规方法将本发明所述半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原。

[0023] 本发明所述抗原的制备方法包括以下步骤(活泼酯法)：

[0024] (1)将权利要求1所述半抗原5～10mg溶解于1～3ml二氧六环或二甲基甲酰胺中，加入5～10mg二环己基碳二亚胺和5～10mgN-羟基琥珀酰亚胺，反应3.5～5h，离心除去沉淀得上清；

[0025] (2)将上清滴入2mL pH 7.4～9.6、1mol/L含有10mg/mL载体蛋白的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，反应8～12h，用0.85％的生理盐水透析4天得所述抗原。

[0026] 或者，本发明所述抗原的制备方法包括以下步骤(混合酸酐法)：

[0027] (1)将权利要求1所述半抗原5～10mg溶解于1～3ml二氧六环或二甲基甲酰胺中，加入5～10mg加入氯甲酸异丁酯，搅拌反应 0.5～2h，得甲液；

[0028] (2)将载体蛋白10～20mg溶于1～2mL 1mol/L、pH值为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，得乙液；

[0029] (3)将甲液缓慢滴加到乙液中，搅拌反应过夜，反应液用0.85％的生理盐水透析4天得抗原。

[0030] 根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于所述的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、卵清白蛋白(OVA)等蛋白类物质。

[0031] 可用本发明制得的抗原免疫Balb/c小鼠或新西兰兔，免疫剂量为1mg/Kg，背部皮下注射，每隔15d加强免疫一次，第4次后耳缘静脉采血测定效价和特异性，待效价和特异性合格后，采集血清获得多克隆抗体；或用小鼠脾细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，细胞分泌获得单克隆抗体。

[0032] 所述多克隆抗体可应用于食品或环境样品中的碱性橙残留检测方面。

[0033] 本发明的有益效果是：

[0034] 通过设计合理的合成路线，在半抗原设计时能保留碱性橙的特征结构，从而保证获得的抗体的特异性，所述抗体可用于简单快捷方便的碱性橙免疫检测，包括胶体金免疫层析、ELISA等食品安全快速检测方法，实现碱性橙安全监控，获得理想的检测效果。 具体实施方式

[0035] 下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。实施例中碱性橙等试剂除非特别说明，都是常规市购实验室用试剂。

[0036] 本发明的总体技术方案如下

[0037] 实施例1半抗原1(hapten1)合成

[0038] 以对氨基苯甲酸作为对氨基苯酸类的代表，但不局限于对氨基苯甲酸，其余对氨基苯酸类物质为原料时，方法同下：

[0039] (1)对氨基苯甲酸411mg(3mmol)溶于20ml水中，加入10ml 0.1mol/l的盐酸，加入含114～228mg(1.15～3.3mmol)的亚硝酸钠水溶液1mL，反应2h，反应液为重氮液； [0040] (2)间苯二胺356mg(3.3mol)溶于5mL水中，用1mol/L盐酸调节pH至6～7，然后逐滴加入步骤(1)制备得到的重氮液，静置过夜，离心所得沉淀即为半抗原1(hapten 1)。 [0041] 半抗原1鉴定结果：

[0042] TLC Rf＝0.5(CHCl3∶MeOH＝15∶1)；MS(APCI positive)m/z：257[M-H]+.1H NMR(DMSO-d6，600MHz) □：8.79(s，1H)，8.58(s，1H)，7.95(d，2H)，7.82(d，4H)，6.5(d，4H)，3.59(d，2H)

[0043] 实施例2半抗原2(hapten2)的合成

[0044] 以间氨基苯乙酸作为间氨基苯酸类的代表，但不局限于胺氨基苯乙酸，其余间氨基苯酸类物质为原料时，方法同下：

[0045] (1)将433mg间氨基苯乙酸溶于20ml水中，加入10ml0.1mol/l的盐酸，加入含114～228mg(1.15～3.3mmol)的亚硝酸钠水溶液1mL，反应2h，反应液为重氮液； [0046] (2)间苯二胺356mg(3.3mol)溶于5mL水中，用1mol/L盐酸调节pH至6～7，然后逐滴加入步骤(1)制备得到的重氮液，静置过夜，离心所得沉淀即为半抗原2(hapten 2)。 [0047] 半抗原2鉴定结果：

[0048] TLC Rf＝0.5(CHCl3∶MeOH＝15∶1).MS(APCI positive)m/z：271[M-H]+.1H NMR(DMSO-d6，600MHz)□：7.61(d，2H)，7.29-7.36(d，4H)，5.86-6.00(d，2H). [0049] 实施例3免疫抗原制备

[0050] 以半抗原1为例讲述免疫原制备，其他半抗原制备时方法相同，不再赘述。 [0051] (1)将5～10mg实施例1所制备的半抗原1溶解于1ml二氧六环中，加入10mg二环己基碳二亚胺和10mg N-羟基琥珀酰亚胺，反应5h，离心除去沉淀得上清；

[0052] (2)将上清滴入2mL pH值为9.6、1mol/L含有10mg/mL牛血清白蛋白的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，反应12h，用0.85％的生理盐水透析4天得抗原hapten1-BSA。

[0053] 实施例4包被抗原制备

[0054] 以半抗原2为例讲述包被抗原制备，其他半抗原制备时方法相同，不再赘述。 [0055] (1)将10mg实施例2的半抗原2溶解于1二氧六环或二甲基甲酰胺中，加入10mg加入氯甲酸异丁酯，搅拌反应2h，得甲液；

[0056] (2)将卵清白蛋白(OVA)20mg溶于2mL 1mol/L、pH值为 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，得乙液；

[0057] (3)将甲液缓慢滴加到乙液中，搅拌反应过夜，反应液用0.85％的生理盐水透析4天得包被抗原OVA-hapten 2。

[0058] 实施例5抗血清的制备

[0059] 取实验室常规使用的1.5～2kg新西兰白兔3只，将免疫原hapten1-BSA，用生理盐水稀释，加等体积弗氏完全佐剂充分乳化，给2只新西兰兔进行背部皮下皮下多点注射，免疫剂量为0.5mg/只，两周后加强免疫，免疫剂量同基础免疫，改用弗氏不完全佐剂，每两周加强免疫一次剂量为0.3mg/只。从第三次加强免疫开始，免疫后第7d耳部动脉取血，定期监测并鉴定抗体。

[0060] 待抗体达到一定水平后，心脏采血，室温静置，待血液凝固后，转入37℃温箱中放置30min，再转入4℃冰箱内过夜，分离得到抗血清serum1。

[0061] 实施例6抗体纯化

[0062] 采用辛酸-硫酸铵法或者Protein G/A进行。辛酸-硫酸铵法是常规方法，每毫