本发明公开了一种真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，将嗜酸乳杆菌加到培养基中培养嗜酸乳杆菌；离心收集菌体后，用生理盐水清洗菌体，离心弃去清夜；用保护剂I将菌体配制成菌悬液后，加入保护剂II，最后进行冷冻干燥，所述保护剂I的配方为海藻糖10-20g/L，甘油10-20mL/L，牛血清蛋白5-15g/L，氯化钠6.5-8.5g/L，蔗糖60-100g/L，所述保护剂II的配方为：脱脂奶粉150-250g/L，葡萄糖10-40g/L，氯化钠6.5-8.5g/L，抗坏血酸0.2-0.3g/L。由本发明方法制得的菌粉的存活率最高达99.9％。
1.一种真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，其特征在于：将嗜酸乳杆菌于MRS培养基中培养，然后离心收集菌体后，用生理盐水清洗菌体，离心弃去上清液，接着，用保护
剂I将菌体配制成8±1×10 cfu/mL菌悬液后，静置30-40min，再加入保护剂II，均匀混合，其中，所述保护剂II与保护剂I的体积比为(1-2)∶(2-1)，然后，静置20-30min后装于冻干管中进行冷冻干燥，所述保护剂I的配方为海藻糖10-20g/L，甘油10-20mL/L，牛血清蛋白5-15g/L，氯化钠6.5-8.5g/L，蔗糖60-100g/L，所述保护剂II的配方为：脱脂奶粉
150-250g/L，葡萄糖10-40g/L，氯化钠6.5-8.5g/L，抗坏血酸0.2-0.3g/L；所述冷冻干燥时，首先于-35～-40℃下预冻24h，然后移转入真空冷冻干燥机中，于温度为-56℃，真空度为4-6Pa的条件下冻干24h；所述培养基中进一步添加有微孔滤膜除菌的复合抗冷冻因子；
所述复合抗冷冻因子的配方为：肌醇0.1-0.2g/L、氯化钠3-4g/L、牛血清蛋白0-0.07g/L、丙氨酸0.03-0.06g/L。
2.如权利要求1所述的真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，其特征在于：所述保护剂I的配方为：海藻糖10-15g/L，甘油10-15mL/L，牛血清蛋白5-10g/L，氯化钠
3.如权利要求1所述的真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，其特征在于：所述保护剂I的配方为：海藻糖15-20g/L，甘油15-20mL/L，牛血清蛋白10-15g/L，氯化钠
4.如权利要求1所述的真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，其特征在于：所述保护剂II的配方为：脱脂奶粉150-200g/L，葡萄糖10-30g/L，氯化钠6.5-7.5g/L，抗坏血酸0.2-0.25g/L。
5.如权利要求1所述的真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，其特征在于：所述保护剂II的配方为：脱脂奶粉200-250g/L，葡萄糖30-40g/L，氯化钠7.5-8.5g/L，抗坏血酸0.25-0.3g/L。
6.如权利要求1所述的真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，其特征在于：所述保护剂I与保护剂II的体积比为1∶1。
7.如权利要求1所述的真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，其特征在于：所述保护剂I与保护剂II的体积比为1∶2。
一种真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法。
背景技术
[0002] 随着奶业市场的发展，特别是人们健康意识的逐步增强，食品、保健品及医药等的安全性越来越受到人们的关注。含有益生菌的微生态制剂正作为一个新的领域逐步被研究和开发。嗜酸乳杆菌作为益生菌的一种，在促进人体健康和预防疾病方面具有重要作用，并日益成为乳品科学研究的热点。嗜酸乳杆菌菌粉已广泛应用于食品、医药等行业中，已经成为现代重要工业原料
[0003] 真空冷冻干燥(简称冻干)是制备和保存生物材料最有效的方法之一，冻干是冷冻和干燥技术的有机结合。然而，真空冷冻干燥会造成生物细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化。为了提高真空冷冻干燥后微生物的存活率，人们进行了大量的研究。影响乳酸菌冻干效果的因素有很多，如菌株、细胞大小及形状、生长阶段及速率、初始细胞浓度、pH值、保护剂种类与配比、预冻温度、降温速率、冷冻干燥条件、细胞含水量、细胞膜成份等，其中保护剂种类与配比的影响最为突出。保护剂在细胞周围可以避免细胞膜的冷冻损伤，提高冻干存活率。然而，如果保护剂的选择或添加比例不当，亦导致大量细胞失活。合适配比的保护剂因菌种而异，保护剂中各成分的配比及浓度达到协调时，才能达到最佳保护效果。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，由本发明制得的菌粉的存活率最高达99.9％。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供了一种真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法，将嗜酸乳杆菌于MRS培养基中培养，然后离心收集菌体后，用生理盐水清洗菌体，离心弃去10
上清液，接着，用保护剂I将菌体配制成8±1×10 cfu/mL菌悬液后，静置30-40min，再加入保护剂II，均匀混合，其中，所述保护剂II与保护剂I的体积比为(1-2)∶(2-1)，然后，静置20-30min后装于冻干管中进行冷冻干燥，所述保护剂I的配方为：海藻糖10-20g/L，甘油10-20mL/L，牛血清蛋白5-15g/L，氯化钠6.5-8.5g/L，蔗糖60-100g/L，所述保护剂II的配方为：脱脂奶粉150-250g/L，葡萄糖10-40g/L，氯化钠6.5-8.5g/L，抗坏血酸0.2-0.3g/L；所述冷冻干燥时，首先于-35～-40℃下预冻24h，然后移转入真空冷冻干燥机中，于温度为-56℃，真空度为4-6Pa的条件下冻干24h；所述培养基中进一步添加有微孔滤膜除菌的复合抗冷冻因子；所述复合抗冷冻因子的配方为：肌醇0.1-0.2g/L、氯化钠3-4g/L、牛血清蛋白0-0.07g/L、丙氨酸0.03-0.06g/L。
[0006] 作为本发明的优选实施例，所述保护剂I的配方为：海藻糖10-15g/L，甘油10-15mL/L，牛血清蛋白5-10g/L，氯化钠6.5-7.5g/L，蔗糖60-80g/L；
[0007] 作为本发明的优选实施例，所述保护剂I的配方为：海藻糖15-20g/L，甘油15-20mL/L，牛血清蛋白10-15g/L，氯化钠7.5-8.5g/L，蔗糖80-100g/L；
[0008] 作为本发明的优选实施例，所述保护剂II的配方为：脱脂奶粉150-200g/L，葡萄糖10-30g/L，氯化钠6.5-7.5g/L，抗坏血酸0.2-0.25g/L；
[0009] 作为本发明的优选实施例，所述保护剂II的配方为：脱脂奶粉200-250g/L，葡萄糖30-40g/L，氯化钠7.5-8.5g/L，抗坏血酸0.25-0.3g/L；
[0010] 作为本发明的优选实施例，所述保护剂I与保护剂II的体积比为1∶1；
[0011] 作为本发明的优选实施例，所述保护剂I与保护剂II的体积比为1∶2；
[0012] 与现有技术相比，本发明真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌菌粉的方法至少具有以下优点：本发明干燥方法中采用两种不同的保护剂I和保护剂II，且其体积比为(1-2)∶(2-1)，如此，制得的菌粉的存活率最高达99.9％。
具体实施方式
[0013] 实施例一：
[0014] 将嗜酸乳杆菌于MRS培养基中培养24h，然后以转速为6000r/min离心10min，收集菌体，然后，用生理盐水清洗菌体2次，离心弃去上清液；用保护剂I将菌体配制成10
8±1×10 cfu/mL菌悬液后，静置30-40min，再加入保护剂II均匀混合，其中，所述保护剂II与保护剂I的体积比为1∶1，然后，静置20-30min后装于冻干管中，装样高度
0.3-0.5cm，接着放入-35～-40℃的冰箱中预冻24h后，移转入真空冷冻干燥机中，于温度为-56℃，真空度为4-6Pa的条件下冻干24h；最后，用生理盐水复溶，MRS固体培养基计数，测定菌粉活性和菌体存活率。
[0015] 上述保护剂I和保护剂II的配方如下表1所述：
[0016] 表1不同配方的保护剂对冷冻干燥制备菌粉效果的验证
[0017]
[0018]
[0019] 实施例2
[0020] 实施例2与实施例1步骤相同，只是，在无菌的MRS培养基中首先添加微孔滤膜除菌的复合抗冷冻因子，然后培养嗜酸乳杆菌，其中，添加的保护剂I的配方为：海藻糖10g/L+甘油20mL/L+牛血清蛋白10g/L+氯化钠8.5g/L+蔗糖80g/L；添加的保护剂II的配方为：脱脂奶粉150g/L+葡萄糖10g/L+氯化钠8.5g/L+抗坏血酸0.2g/L，所述复合抗冷冻因子的配方如下表2所示：
[0021] 表2添加不同配比的复合抗冷冻因子发酵得到的菌体进行冻干的存活率的验证结果
[0022]
[0023] 实施例3
[0024] 实施例3的真空冷冻干燥制备嗜酸乳杆菌的方法与实施例2完全相同，其中，复合抗冷冻因子的配方采用：肌醇0.1g/L、氯化钠3g/L、牛血清蛋白0.07g/L、丙氨酸0.03g/L；保护剂I的配方采用：海藻糖10g/L+甘油20mL/L+牛血清蛋白10g/L+氯化钠8.5g/L+蔗糖80g/L；保护剂II的配方采用：脱脂奶粉150g/L+葡萄糖10g/L+氯化钠8.5g/L+抗坏血
