淋巴管内化疗药物载体

摘要

一种化疗组合物可被配置用于皮下注射给药并优先在淋巴管内积累，其也提供一种无毒的治疗学系统浓度。该组合物可包括一种药物可接受的载体，和一种配置用于在皮下注射给药后优先在淋巴管内积累的纳米共轭物；该纳米共轭物可包括一种配置用于在皮下或间隙给药后优先在淋巴管内积累的纳米载体，和大量耦合到该纳米载体的化疗剂。该纳米共轭物具有大约10nm到大约50nm的尺寸，该纳米共轭物负载有大约10％到大约50％w/w的化疗剂。该纳米载体可以是一种大约3kDa到大约50kDa的透明质烷聚合物。做为选择，该纳米载体可以是一种树枝状大分子。

权利要求

1.一种配置用于经皮肤、皮内、粘膜、粘膜下层、皮下、间隙、脂肪内、瘤周、或肌肉注射给药的化疗组合物，该组合物包括：一种药物可接受的载体；和

一种配置用于在给药后优先在淋巴管内积累的具有20-50nm尺寸的纳米共轭物；该纳米共轭物包括：一种配置用于在给药后优先在淋巴管内积累的纳米载体；所述纳米载体为3kDa到

50kDa的透明质烷聚合物；和

大量耦合到该纳米载体的化疗剂，所述化疗剂选自顺氯氨铂、其它铂药物、丝裂霉素C、阿霉素、表柔比星、道诺霉素、肽、单克隆抗体和多克隆抗体、干扰素、氮芥类药物、乙胺碘呋酮、托泊替康、魏菲灵A、HSP90抑制剂、17-AAG、VEGF抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂及其组合，其中所述透明质烷纳米载体负载有10%到50%w/w的化疗剂，且其中所述纳米共轭物提供将所述化疗剂持续的释放进入淋巴液。

2.如权利要求1所述的化疗组合物，其中，该纳米载体是一种树枝状大分子。

3.如权利要求1所述的化疗组合物，其中，该化疗剂通过一种生物可降解的连接器被耦合到该纳米载体。

4.如权利要求3所述的化疗组合物，其中，该生物可降解的连接器是酸不稳定的。

5.如权利要求3所述的化疗组合物，其中，该组合物和/或纳米共轭物缺乏PEG、HPMA、polyglutames和/或银。

6.如权利要求5所述的化疗组合物，其中，该化疗剂以一种有效治疗的量存在，以便提供一个与该化疗剂的标准静脉注射给药相比较高的淋巴管AUC和一个较低的淋巴液Cmax。

说明书

淋巴管内化疗药物载体

背景技术

[0001] 本发明要求2008年1月30日提交的美国临时申请号为61/024,837的权益，该申请在此通过具体的全面引用而结合。

[0002] 癌是疾病的一类，其中，一组细胞显示出超出正常限度的不受控制的增长和分裂，侵入和破坏相邻的组织，且有时通过淋巴管或血管转移将癌蔓延到身体内的其它位置。这些癌的恶性性质与良性肿瘤的区别在于，良性肿瘤是自我限制的、不侵入或转移的。大多数的癌形成肿瘤，但有些像白血病不会。癌可以侵袭任何年龄的人，即使是胎儿，但是，大多数种类的癌的患病风险随年龄而增加。由癌引起的死亡占死亡总数的大约13％。根据美国癌症学会的报道，2007年间，美国760万人死于癌。癌可以侵袭所有的动物。

[0003] 几乎所有的癌都是由变态细胞内遗传物质的变异而引起的。这些变异可能归因于致癌物质的影响，如烟草烟雾、放射线、化学药品、或传染性试剂。其它的癌-促进遗传变性可能是通过DNA复制出错而偶然获得、或是通过遗传并因此从出生起存在于所有的细胞中。癌的遗传力通常受致癌物质和宿主染色体组之间复杂的相互作用影响。

[0004] 诊断通常需要病理学家对一个组织活检标本的组织学检查，尽管恶性肿瘤的初始迹象可能是症状或放射照相成像异常。大多数的癌可以被治疗，其中一些可被治愈，取决于其具体的种型、位置和阶段。一旦确诊，癌通常用外科手术、化疗、和放疗综合治疗。随着研究的进展，治疗方法对于不同的种类的癌来说变得更为具体。在靶向治疗药物发展的过程中，已有重要的进步，该药物定向作用在特定肿瘤的可检测的分子变异处，使其对正常细胞的损害最小化。癌症病人的预后受癌症种类、阶段或疾病程度的影响最大。此外，组织学的分阶段和特异的分子标示的存在在确立预后，以及确定个体的治疗中也非常有用。

[0005] 顺氯氨铂(即，顺-二氯二氨铂或CDDP)已成为很多实体瘤的重要化疗剂。然而，新出现的铂药物已被发现具有更小的副作用，这些药物可能成为重要的化疗剂。顺氯氨铂和其它化疗药物或潜在化疗药物的一个缺点在于其显著的毒性。

[0006] 由于器官毒性妨碍化疗，肿瘤学家已经发展了一种将化疗药物限制在疾病区域的化疗方法，该方法是通过暂时性地从体循环中奖感染组织或器官隔离起来并用化疗药物灌注该感染组织或器官。例如，高剂量化疗药物的动脉内经皮骨盆灌注可以为晚期子宫宫颈癌提供一个具有低副作用的治疗优势。然而，这些治疗方法是高度入侵的，需要专业技能和仅为大型药物研究中心所拥有的设备。此外，在很多情况下组织隔离是不可能的，包括已显著侵入淋巴组织的局部晚期乳腺癌。

[0007] 如果化疗被集中到乳房淋巴管，且对于远处转移的治疗保持足够的系统水平，局部晚期乳腺癌的治疗方法可被改进。对于局部晚期乳腺癌(LABC)的最新辅助系统化疗是规范的，但在治疗后癌一般在其变成系统性疾病前首先通过具有小基质侵染(的淋巴管蔓延开。早期乳腺癌的外科治疗包括原发肿瘤的切除，以及引流前哨淋巴结和进一步的淋巴管切除，如果需要的话。然而，该方法可能忽略了淋巴结上纳米范围的转移，如果完全的免疫组织化学分析不是习惯性地在前哨淋巴结标本上实施，其估计具双倍的复发风险(与真实的淋巴结阴性对照相比)。对乳房和淋巴管的局部放疗加之全身系统的化疗减少了复发的风险，但这些治疗方法会导致健康组织的巨大损伤。

[0008] 不考虑病因，很多癌是通过淋巴系统(例如乳房、卵巢、黑素瘤)来转移。淋巴管是身体的排泄系统，用于清理组织中的废物，转移的癌跟随该排泄系统首先“定植”于局部淋巴管中。外科手术和化疗可以破坏这些早期转移中的很多，但对病人来说具有很大的损失(例如，毒副作用和痛苦的淋巴水肿)。因此，在癌症早期通过将化疗药物直接输送到肿瘤组织以避免这些具有副作用的化疗将是有益的。此外，化疗药物优先地定向进入淋巴管，从而避免对身体内别处正常细胞的副作用，摧毁在外科手术和全身化疗之后可能导致复发的“种子”的化疗方法也将是有益的。

发明内容

[0009] 在一个具体实施方式中，本发明包括一种化疗组合物，其被配置成经皮注射局部给药。该组合物包括一种药物可接受的载体；和一种纳米共轭物，其被配置成在经皮(其中，经皮指的是皮下、皮内、瘤周、粘膜下层或透过皮肤起作用的)给药后优先在淋巴管内积累。

[0010] 在一个具体实施方式中，本发明包括一种纳米共轭物，其包括：一种配置成在经皮或间隙给药之后优先在淋巴管内积累的纳米载体；和大量耦合到该纳米载体的化疗剂。该纳米共轭物可以具有大约10nm到大约80nm的尺寸。此外，该纳米共轭物可负载有大约10％到大约50％w/w的化疗剂。该纳米载体可以是一种大约20kDa到大约150kDa的透明质烷(HA)聚合物。做为选择，该纳米载体可以是一种树枝状大分子。该化疗剂选自顺氯氨铂、其它的铂化疗药物、苯丙氨酸氮芥、魏菲灵A、丝裂霉素C、阿霉素、表柔比星、紫杉萜、道诺霉素、及其组合等等。

[0011] 在一个具体实施方式中，该化疗剂通过一个生物可降解的连接器被耦合到该纳米载体，例如，该生物可降解的连接器是酸不稳定的或可降解的。

[0012] 在一个具体实施方式中，该化疗组合物和/或纳米共轭物基本上无PEG、HPMA、polyglutames和/或银。

[0013] 在一个具体实施方式中，该化疗剂以一个有效治疗的量存在以便提供一个与该化疗剂的标准静脉注射给药相比较高的淋巴管AUC和一个较低的淋巴液Cmax。

[0014] 在一个具体实施方式中，本发明包括一个用于治疗和/或抑制癌的方法。这种方法可以包括经皮的给药一种组合物，该组合物具有一个药物可接受的载体和一个配置为在皮下注射给药后优先在淋巴管内积累的纳米共轭物。该纳米共轭物可以是本文描述的任一具体实施方式。

[0015] 本发明的这些及其它具体实施方式和特征参照下列说明和附加的权利要求更完全的展现，或者可通过下文的阐述而了解。

附图说明

[0016] 为了进一步阐明本发明的上述及其他的优点和特征，一个更详细的发明说明将参考附图中图解的具体实施方式而给出。可以理解的是，这些附图描绘仅仅用于图解本发明的具体实施方式，而非用于限制其范围。通过使用附图，本发明将用附加的特征和细节被描述和说明，其中：

[0017] 附图1A-1B为图解该化疗剂在组织和血浆中的浓度的图表。附图1A是一个示出了在静脉注射顺氯氨铂或皮下注射HA-顺氯氨铂(3.3mg/kg顺氯氨铂-基)进入右乳房颊脂垫之后，同侧(右)腋下结点和对侧(左)腋下结点的铂的组织浓度的图表。附图1B是一个浓度-时间的药物动力学图表，其示出了在静脉注射顺氯氨铂(3.3mg/kg)或皮下注射HA-顺氯氨铂(3.3mg/kg)进入右乳房颊脂垫之后的顺氯氨铂的血浆浓度。

[0018] 附图2A-2B示出了在单剂量皮下注射HA-顺氯氨铂进入右乳房颊脂垫之后，随着时间的推移，肌氨酸酐在尿中的浓度的图标。附图2A示出了那些接受3.3mg/kg含银或不含银的HA-顺氯氨铂的动物的尿肌氨酸酐浓度的图。附图2B示出了那些接受的1.0mg/kg含银或无银HA-顺氯氨铂的动物的尿肌氨酸酐浓度图。在附图2A中，较低的尿肌氨酸酐正如所看到的用含银的高剂量样品，是肾损害的一个信号，而在附图2B中，在低剂量时两个剂型之间没有显著差异。

[0019] 附图3A-3F是肾组织单次药物化合物注射和用苏木精和曙红着色30天后的成像。附图3A示出了接受皮下注射HA的动物具有正常组织(对照)。附图3B示出了接受3.3mg/kg静脉注射顺氯氨铂的动物具有退行性病变如在皮质延髓管状细胞中的固缩核。附图3C示出了接受皮下注射3.3mg/kg无银HA-顺氯氨铂的动物具有清楚地正常外观，除了较少的在皮质延髓接点管状细胞坏死的点。附图3D示出了接受1.0mg/kg皮下注射含银HA-顺氯氨铂的动物具有广泛分布在骨髓管状上皮细胞中的固缩核。附图3E示出了接受1.0mg/kg静脉注射顺氯氨铂的动物在骨髓管状上皮细胞中具有固缩核，暗紫色着色的增加暗示核染色和细胞程序死亡传播。附图3F示出了接受1.0mg/kg皮下注射HA-顺氯氨铂的动物具有正常的外观，除了极少的肾管状细胞肿大和退化。

[0020] 附图4A-4F是单次药物注射和用H&E着色30天后的肝脏组织的成像。附图4A示出了接受皮下注射HA的动物具有正常的组织(对照)。附图4B示出了接受3.3mg/kg顺氯氨铂的动物具有适度的坏死。附图4C示出了接受3.3mg/kg皮下注射HA-顺氯氨铂的动物具有清楚地正常外观，除了非常轻微的退化。附图4D示出了接受1.0mg/kg含银HA-顺氯氨铂的动物具有清楚地正常外观，除了非常轻微的退化。附图4E示出了接受1.0mg/kg静脉注射顺氯氨铂的动物具有清楚地正常外观，除了非常轻微的退化。附图4F示出了接受1.0mg/kg皮下注射HA-顺氯氨铂的动物具有正常外观。

[0021] 附图5A-5F是单次药物注射和用H&E着色的30天后的脑组织的成像。接受皮下注射HA(对照)和所有研究化合物(例如，静脉注射顺氯氨铂3.3mg/kg，皮下注射HA-顺氯氨铂3.3mg/kg，皮下注射含银HA-顺氯氨铂1mg/kg，静脉注射顺氯氨铂1mg/kg，皮下注射HA-顺氯氨铂1mg/kg)的动物具有正常所见。

[0022] 附图6A-6F是单次药物注射和用H&E着色的30天后的淋巴组织的成像。接受皮下注射HA(对照)和所有研究化合物(例如，静脉注射顺氯氨铂3.3mg/kg，皮下注射HA-顺氯氨铂3.3mg/kg，皮下注射含银HA-顺氯氨铂1mg/kg，静脉注射顺氯氨铂1mg/kg，皮下注射HA-顺氯氨铂1mg/kg)的动物具有正常所见。

[0023] 附图7A-7D是单次注射30天后的注射部位的下层组织成像。接受皮下注射HA(对照)和所有研究化合物(例如，皮下注射HA-顺氯氨铂3.3mg/kg，皮下注射含银HA-顺氯氨铂1mg/kg，HA-顺氯氨铂1mg/kg)的动物具有正常所见。

[0024] 附图8A-8H是图解在静脉注射顺氯氨铂(3.3mg/kg顺氯氨铂基)或皮下注射HA-顺氯氨铂(3.3mg/kg顺氯氨铂基)进入右乳房颊脂垫之后的铂的组织浓度图。附图8A是膀胱的，附图8B是脑的，附图8C是心脏的，附图8D是肾的，附图8E是肝的，附图8F是肺的，附图8G是肌肉的，附图8H是脾的。

[0025] 附图9是一个淋巴管内化疗药物的合成和其在化疗上的作用的示意图。

[0026] 附图10A-10B是图解在皮下注射之后药物总量的图。附图10A示出了右腋下淋巴结(RLN)和左腋下淋巴结(LLN)在皮下注射顺氯氨铂或顺氯氨铂-HA(3.3mg/kg顺氯氨铂基)进入右乳房颊脂垫之后的顺氯氨铂的组织浓度。附图10B示出了在相同方法下的顺氯氨铂在血浆中的浓度。值得注意的是，用于静脉注射顺氯氨铂的血清Cmax大于4微克/毫升，而对于HA-顺氯氨铂，其小于3微克/毫升。高Cmax顺氯氨铂与耳毒性、肾毒性和与此药物有联系的周围神经病直接关联。此数据支持了HA-顺氯氨铂可能比静脉注射顺氯氨铂更少中毒。

[0027] 附图11A-11H是不同组织(例如，附图11A是膀胱，附图11B是脑，附图11C是心脏，附图11D是肾，附图11E是肝，附图11F是肺，附图11G是肌肉，和附图11H是脾)在皮下注射顺氯氨铂-HA(10mg/kg顺氯氨铂基)进入右乳房颊脂垫后的顺氯氨铂浓度的组织浓度图。

[0028] 附图12是一个图解通过用顺氯氨铂和顺氯氨铂-HA抑制人类癌细胞生长72小时之后的细胞活力图。要指出的是，HA自身显示出了在该测验浓度(达到10mg/mL，数据未示出)下没有毒性。该图证明了，共轭HA到CDDP上对顺氯氨铂活体外的抗癌效果没有产生不利影响，因为所有细胞系表现出了类似的IC50水平。

[0029] 附图13A-13C是显示在对患有用绿色荧光蛋白质(GFP)标示的MDA-MB-468乳房淋巴管肿瘤的裸鼠皮下注射之后的淋巴管内载体的定位照片。附图13A示出了该鼠在被德克萨斯红-HA 6皮下注射左乳房颊脂垫时的乳房淋巴管肿瘤4。在5小时和18小时后(分别为附图13B和附图13C)，该照片示出了在引流结点的显著的HA局部化和共同定位肿瘤(GFP通道为绿色，用4标记；德克萨斯红通道为红色，用6标记，蓝色箭头2是注射部位)。

[0030] 附图14A-14C是纳米共轭物的合成框图。

[0031] 附图15A是图解该树枝状大分子的合成框图。

[0032] 附图15B是图解靶向药剂和纳米共轭物共轭的框图。

[0033] 附图17A-17B示出了阴性对照组相比，通过HA-顺氯氨铂治疗法，肿瘤生长被推迟5周，与常规的顺氯氨铂治疗法相比。

[0034] 附图18示出了阿霉素的释放与pH之间的关系。其释放半衰期在pH为7.4时为167小时，pH为6.0时为107，pH为5.0时为45。

[0035] 附图19示出了通过纳米载体-DOX治疗两周剂量后，在第三和第五周肿瘤生长被暂停，与标准的静脉注射阿霉素(紫色线)相比是一个显著的效力改善。

[0036] 附图20A图解了一种磷酸酯-HA。

[0037] 附图20B图解了用磷酸酯-HA进行纳米共轭物合成的框图。

[0038] 附图21A是一个图解了皮下注射HA-顺氯氨铂给药体内效力的图。

[0039] 附图21B-21C是图解了标准细胞活力与药物浓度的曲线图，通过MTS试验比较活体外标准的CDDP药剂(附图21B)和HA-顺氯氨铂(附图21C)对两个人的头和颈鳞状细胞癌细胞系(JMAR和MDA-1986)抗增殖的特性。值得注意的是，两个药物的IC50水平是非常类似的，其表示了HA的再共轭没有对CDDP在活体外的抗癌活性产生不利影响。

[0040] 附图22A-22F是表示在单次注射进入鼠右乳房颊脂垫之后的HA-阿霉素分布的照片。阿霉素具有天生的荧光性，该药物-载体共轭物的分布和寿命可被很好的观察用于计时评价。值得注意的是，大部分药物-载体被输送到腋淋巴结，其经过一个9天的间隔缓慢地释放药物，即使在9天之后，仍然有残余活性。椭圆形标记在乳房中的注射部位，最深的浓度(红色)在腋下。

[0041] 附图23是一个表示肿瘤响应的图，即使是在一个相当晚期乳腺癌肿瘤体内一个单次晚期瘤周HA-阿霉素治疗之后。

[0042] 附图24A-24E是表示HA-阿霉素体内运动的照片，其在一个Maestro多通道荧光成像系统上成像。即使在注射4天后，进入局部区域组织和鼠乳房淋巴结的药物和载体的细微的摄取，其很好的停留在该淋巴管。

具体实施方式

[0043] 一般地，本发明涉及新的化疗剂、含有该化疗剂的药物组合物、制备该化疗剂的方法、和使给药的化疗剂以某种形式优先在淋巴系统积累的方法。该化疗剂包括一种纳米载体，当给药基本上进入身体内的任何一个间隙位置内时，其优先确定路线进入该淋巴系统之内，如邻近于肿瘤或皮下，但不是全身地给药。也就是说，该药剂不通过静脉注射给药而施行。因此，该化疗剂优先地瞄准任何尺寸的肿瘤、癌细胞、或其它淋巴系统内的恶性肿瘤。这样一种方式可以有效地抑制癌细胞从一个最初的癌蔓延到身体的另一部分。

[0044] 该化疗剂的设计，其为一种纳米共轭物，允许从注射/给药的部位通过淋巴系统迁移以防引起升高的有毒性的全身浓度峰值。常规的给药途径，如静脉注射，通常会通过药剂的首过药物动力学而产生有毒性的且应避免的高的全身浓度峰值。因此，该化疗剂优先迁移进入该淋巴系统之内，并可以治疗该淋巴系统内的癌细胞，其包括可能是在淋巴结内存在的细胞。该迁移模式随着从原位初始蔓延出来的许多癌细胞的路线而确定，从而可用于治疗或抑制癌细胞通过局部转移组织进行的蔓延。

[0045] 该化疗剂包括一种尺寸最佳化的纳米载体和会被优先迁移进入淋巴系统之内而非系统地蔓延和浓缩的组合物。已经发现，透明质烷聚合载体和一些树枝状的载体，如文中描述的，具有如选择性的移位特征进入该淋巴系统之内。例如，该化疗剂可以被沉积邻近于皮肤癌和进入与该癌细胞相似的淋巴系统。

[0046] 顺氯氨铂是一种最广泛使用的用于实体瘤的化疗药剂，然而，它的毒性和耐药性严重地限制了它在很多病人上的剂量和使用。系统内的顺氯氨铂进入淋巴管内的渗透性可能是较差的(小于注入药剂的1-5％)，且用于局部癌的备选治疗(例如，外科的切除或放射)可能导致严重的副作用如感染和淋巴水肿。因此，一种治疗或抑制该癌细胞在淋巴管内积累的方法是可取的，且现在可以通过在皮下的或间隙给药一种优先移位到该局部区域组织和淋巴管的纳米共轭物来实现。该纳米共轭物可包括一种美国食品与药物管理局(FDA)批准的与化疗药剂(例如，顺氯氨铂)耦合在一起的生物相容载体的纳米载体。该纳米共轭物与常规的顺氯氨铂静脉注射疗法相比还可以降低全身的毒性。当淋巴管参与到从早期到晚期的癌转移时，该纳米共轭物可用于许多对顺氯氨铂敏感的癌如乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、和头和颈鳞状细胞癌的治疗、抑制和/或预防。此处的顺氯氨铂在实施例和附图中也称为CDDP和Pt。

[0047] 先前，已有报道，靶向和纳米载体策略增加了到达带有肿瘤的细胞组织的顺氯氨铂的剂量，而使正常细胞组织免于受中毒剂量的毒。这些技术可被分类成非靶向或被动靶向载体(例如，非受体)和主动靶向载体(例如，抗体)。在非靶向载体中，如聚合胶束制剂(例如，NC-6004)已经证明减少了在临床前研究的非特定的毒性，并已经发展到早期临床试验。在第一阶段试验，一个N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HMPA)和铂(例如，AP5280)的非靶向线性共轭聚合物已经证明了铂在人体内较高的持续的血浆铂水平，与静脉注射顺氯氨铂相比，具有最小的毒性。该非靶向载体依赖提高的渗透率和滞留效应(EPR)以改进该药剂的肿瘤积累，但在非高度血管化的肿瘤内，该EPR效应大大减少，非靶向纳米载体具有更小地优点。因此，被动靶向性在具有低血管质的肿瘤的治疗上不是有效的，这样的癌细胞在该淋巴系统中可被发现。

[0048] 现在，利用本发明，非血管化的癌细胞，如在淋巴系统内发现的，可通过在该肿瘤部位皮下注射而在该肿瘤的局部转移区域淋巴管内有选择地积累一种化疗剂而被治疗或抑制，允许化疗剂被沿着很可能是该肿瘤初始转移的淋巴管通道输送。这可使用一种生物相容的纳米载体与化疗剂的纳米共轭物进行，其中，该纳米载体使无载体难以输送的药剂能够局部选择性积累。

[0049] 该可在淋巴管内细胞组织积累的纳米共轭物的皮下给药对治疗很多癌是有好处的，如乳腺癌。例如，一旦它们从该原发肿瘤传播，乳腺癌典型地蔓延到区域淋巴结，由此，该腋下淋巴结在早期患病时足够的评价和治疗是重要的。当前治疗的一个显著的问题是化疗剂系统地产生的单独或合并发生的副作用。。本发明的纳米共轭物是优越的，因为它们，令人惊讶和出人意料地，可以在存在于淋巴系统和/或淋巴管内的细胞组织内的癌细胞中积累，从而作用于淋巴转移但没有发生不希望的全身毒性。该纳米共轭物可被皮下给药用于在淋巴管内细胞组织积累。因此，该纳米共轭物可用于治疗乳腺癌，优先治疗风险区域的淋巴结并避免全身的毒性。

[0050] 本发明可包括一种多聚糖透明质烷(HA)和化疗剂(例如，顺氯氨铂或其它的铂)的纳米共轭物、与类似的特别是那些与用于实现治疗淋巴管内局部化和无毒系统浓度皮下注射相关药物组合物和方法。该HA纳米共轭物在HA的分子量/尺寸上进行了构思，所选的HA分子量能够有效地使顺氯氨铂集中到乳房淋巴管和减少具毒性的峰点血浆浓度。本文中顺氯氨铂作为一种代表性的化疗剂使用，其它的证明在化疗方面有效的药剂可以被共轭到本发明的纳米共轭物。同样，HA被用作一种代表性的纳米载体；然而，其它的具有相同或相似的生理输送外形和性质如树枝状的纳米载体，也可被使用。顺氯氨铂在此处被使用和描述，是由于其易于通过原子吸收光谱确定在器官、细胞组织和淋巴管的铂沉积。因此，顺氯氨铂在给药之后的沉积是其它可被共轭到该纳米载体的化疗药剂的代表。

[0051] 在一个具体实施方式中，该化疗药物是顺氯氨铂，其已被证明是一种用于很多实体瘤的极好的抗癌剂，但顺氯氨铂的标准药剂已经显示出其具有显著的全身毒性。现在，顺氯氨铂的纳米共轭物已经显示出能够作为一个局部区域输送系统被皮下给药以增加淋巴管内的铂水平，其中，早期转移很可能发生在该淋巴管内，同时减少了全身的毒性。该顺氯氨铂纳米共轭物令人惊讶和出人意料地，也可提供合适的全身浓度即在没有显著的全身毒性的条件下有效治疗。如在该申请附图中证明的，HA-顺氯氨铂能够提供血清和全身的AUCs，其可有效的治疗而无标准静脉注射CDDP的有毒的高Cmax水平。能够通过皮下注射给药(例如，邻近肿瘤)局部输送用于得到在治疗上有效的淋巴管内积累和系统浓度和具有毒性较低的缓释特性的组合使其比标准的CDDP更为有利。

[0052] 例如，顺氯氨铂可被共轭到一种生物相容的聚合物如透明质烷，共轭度大约为20w/w％。该纳米共轭物可通过皮下注射(例如，进入鼠类的乳房组织)输送得到在治疗上有效的淋巴管内积累和全身浓度。该HA-顺氯氨铂纳米共轭物表现出与标准顺氯氨铂药剂在体外人类乳腺癌上相似的抗增殖效力。该纳米共轭物与正常的顺氯氨铂相比增加了2.7倍血浆弧线下区域(AUC)，但具有一个减少的血浆峰值水平(Cmax)，其对减少系统毒性是有好处的。该纳米共轭物与顺氯氨铂相比增加了3.8倍身体同侧淋巴结AUC。接受该纳米共轭物治疗的动物病理学研究显示出了脑和淋巴结正常的外观，与静脉注射顺氯氨铂给药相比在肾和肝脏具有更小地坏死和炎症。因此，该纳米共轭物证明了用透明质烷基化疗药物淋巴管内施药可以比静脉注射治疗允许较低的药物剂量水平和更小的毒性，而在该肿瘤负担最高的局部区域组织骨盆提供了一个提高的化疗药物剂量。

[0053] 通常，该纳米载体可以被共轭到肽、抗体(单克隆和多克隆)、干扰素、包括苯丁酸氮芥的苯丙氨酸氮芥和其它的氮芥类药物、乙胺碘呋酮、托泊替康、魏菲灵A、包括17-AAG的HSP90抑制剂、VEGF抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、和任何包括紫杉酚、紫杉醇、紫杉萜等的紫杉烷类。可被共轭到该纳米共轭物的药物的一些例子包括顺氯氨铂、其它铂药物、苯丙氨酸氮芥、丝裂霉素C、阿霉素、表柔比星、紫杉萜、道诺霉素、苯丁酸氮芥、5FU、紫杉醇、长春新碱、Her2抗体和肽、EGFR抗体和肽、雷帕霉素、mTOR抑制剂、魏菲灵A、HDAC抑制剂、SAHA、Hsp90抑制剂、17-AAG和17-DMAG。

[0054] 在一个具体实施方式中，该纳米载体是一个透明质烷(HA)聚合物，该透明质烷(HA)聚合物是一个具有高度生物相容性的聚合物，现已被发现，其会随着淋巴管从该组织间隙排泄，如从皮下注射给药。该HA和顺氯氨铂的纳米共轭物可以通过非共价共轭或通过生物可降解的键如酯或肼键形成。该纳米共轭物可被在身体的任何地方进行皮下注射。例子包括注入女性上部乳房颊脂垫用于治疗乳腺癌。

[0055] 透明质烷(HA)聚合物是一个D-葡糖醛酸和N-乙酰D-葡糖胺交替的多聚糖，在躯体的结缔组织中发现并首先通过淋巴系统(12-72小时半衰期转换)清理。在进入淋巴管后，HA被输送到淋巴结，在那儿，它被通过受体介导的胞吞作用和溶酶体老化发生分解代谢。若干研究已将增加HA合成和摄取与癌症发展和潜在转移相互关联。众所周知，乳腺癌细胞比正常的组织具有更大的HA摄取，需要HA用于对多耐药性的主要贡献者高P-糖蛋白的表达。此外，入侵的乳腺癌细胞过分表达CD44，CD44为HA的主要的受体，该乳腺癌细胞依赖于高浓度的CD44-内在化HA用于扩散。因此，带有HA的化疗药物纳米共轭物可以有效的对抗淋巴管转移。

[0056] 相应地，HA-药物纳米共轭物可被导向到该淋巴系统，通过与在淋巴结表面和CD-44受体被过分表达的癌细胞上的CD-44受体绑定而在淋巴结上积累。透明质烷也是一种用于CD44受体的配体，主要通过该淋巴系统清理，其中，它在该结点通过CD44受体介导的胞吞作用继之以溶酶体老化被分解代谢。这允许该纳米共轭物内的药物被输送到初始肿瘤传播部位，在该淋巴结集中其效力。通过与全身吸收相反的淋巴管摄取，与目前的裸露药物化疗输送技术相比，该HA纳米共轭物提供了较低的器官和全身的毒性。

[0057] 该HA的分子量可以是不同的，但在摄取进入该淋巴系统从而影响该淋巴管药物浓度方面具有显著的影响。已经发现，透明质烷在35kDa具有优越的性能，但也可以在75和150kDa使用用于给药。由于炎症性的反应，少于10kDa可能是可行的，由于高粘度，超过700kDa可能不是实际的。

[0058] 相应地，HA的分子量可被优化到大约20kDa到大约150kDa，更优选地，大约25kDa到大约100kDa，最优选地，大约30kDa到大约75kDa。根据该药物的负载和该纳米共轭物在淋巴系统内的积累，较低分子量的HA聚合物可被进一步精制。例如，30kDA到50kDa分子量和大约35kDa的聚合物都是有益的。这些HA聚合物是充分可溶的，以便能够输送共轭其上的药物进入淋巴系统。

[0059] 此外，该纳米载体可以是一个树枝状大分子。该树枝状大分子的代可被选择用于优化淋巴管对毛细管摄取的比率。树枝状大分子纳米颗粒具有极端明确的尺寸和表面电荷，取决于材料的生成和终端基团化学性质。例如包括PAMAM树枝状大分子(polyamidoamine)，)、磷酸酯树枝状大分子、双(3-羟丙基)膦酸酯树枝状大分子、羧基酯树枝状大分子、氨基酸树枝状大分子、超树枝状聚合物(例如，树枝状的聚胺酸类、树枝状的聚酯、树枝状的聚磷酸酯)、聚糖(透明质烷、右旋糖苷及其磺化衍生物、纤维素)等等。

[0060] 该纳米共轭物可被配制用于瘤周和皮下注射，用于优先移位进入该淋巴系统，由此全身的暴露被限制。该纳米共轭物可为大约10到大约30nm以避免带有中性的或负电荷的毛细管摄取以最大化淋巴管的快速摄取量，优选大约15到25nm，最优选大约20nm。对于淋巴管摄取皮下注入颗粒而言具有一个最佳粒度范围：大于100nm的颗粒将大量地被保持限制在注射部位，10-80nm的颗粒通过该淋巴管吸收，小颗粒和分子(＜20kDa)将被毛细血管网络吸收进入全身循环。大于100nm或少于5nm的纳米共轭物不是非常可行的。优选地，该纳米共轭物可以在10到80nm之间，更优选在15到50之间，最优选在20到40nm之间。

[0061] 先前的报道已经证明HA具有与铂药物形成稳定共轭物的能力，然而，本发明的纳米共轭物具有不同的特性，如HA的分子量、药物负载和配置用于皮下注射给药的配方。以前从来没有HA-药物共轭物被设计和配制用于皮下注射给药用于淋巴管沉积和滞留以及提供合适的全身浓度。此外，在皮下注射进入该乳房颊脂垫之后，皮下注射的HA纳米共轭物现在已被发现被排放到鼠类的腋下骨盆。因此，该组合物可被配置用于直接注入肿瘤和/或皮下注射用于在淋巴系统积累以治疗那些在淋巴系统如在淋巴结可能发现的转移。

[0062] 例如，皮下注射包含达到0.25w/w顺氯氨铂的顺氯氨铂-HA纳米共轭物，其在盐水中释放药物的半衰期为10小时。顺氯氨铂-HA纳米共轭物在活体外具有与游离顺氯氨铂相似的高抗肿瘤活性：顺氯氨铂-HA IC507μg/mL在MCF7和MDA-MB-231人类乳房癌细胞(游离顺氯氨铂IC507μg/mL)。啮齿类对顺氯氨铂-HA共轭物也有良好的耐受性，，在96小时之后没有注射部位致病或主要器官中毒的征兆，。在注射顺氯氨铂-HA后在轴向淋巴结的顺氯氨铂AUC与正常的顺氯氨铂相比增加74％。

[0063] 通过该纳米共轭物输送的化疗药物的全身浓度足够高到可以实现对任何转移的或全身的癌细胞进行有效的治疗，并且其浓度足够低到基本无毒。先前，在化疗中加入裸露的铂药物与一些包括白血球减少症、恶心、毛发损失、急性肾中毒、慢性神经中毒、和贫血风险增加的毒性有关。因此，一个用于限于乳房和腋下癌症的局部区域治疗方法可以大大改进铂药物在乳腺癌化疗的利用。为此目的，透明质烷可以是一种使顺氯氨铂在淋巴结局部化的理想载体。

[0064] 在一个具体实施方式中，该纳米载体通过一个生物可降解的连接器被共轭到该化疗药物。即，该连接器可以被配置用于降解以便在临近癌细胞或在癌细胞内释放该化疗药物。在HA的情况下，该连接器可以是一个酸可降解的连接器。一个酸可降解的连接器可以用于HA，由于HA具备被内在化进入细胞内和移位到溶酶体的能力，该溶酶体酸化和降解该连接器。此外，围绕癌细胞的含氧量低的微观环境可以降解这些连接器。其释放药物直接进入内在化HA纳米共轭物的癌细胞内。

[0065] 酸可降解的连接器的例子包括腙、酯、缩醇、可生物降解的聚合物连接器、聚交酯、聚乙醇酸交酯、及其共聚物和组合物等等。除了酸可降解的二硫化物、1，6消除连接器、磷酸酯连接器，酶可裂解的连接器包括但不限于在肿瘤内和周边组织、淋巴管和淋巴结通过酶辨别的短肽序列，其在这些组织中比在大多数非目标组织中可以被以高水平表达。

[0066] 在一个具体实施方式中，纳米共轭物未被聚乙二醇化。因此，该纳米共轭物可以基本没有PEG。此外，该纳米共轭物可以没有HPMA或polyglutames。该纳米共轭物可以不被装入胶囊而配制。

[0067] 皮下给药该纳米共轭物和在该淋巴系统提供局部化疗的能力允许不同癌症的治疗。更特别的是，它允许那些已经通过淋巴系统开始转移的早期癌症的治疗。因此，该给药路线和在该淋巴系统内的积累允许该纳米共轭物提供对各种癌症如乳腺癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺、黑素瘤、头和颈癌(例如，头和颈鳞状细胞癌)、卵巢癌和淋巴瘤以及其它的局部化治疗。

[0068] 顺氯氨铂与一个银激活的顺氯氨铂纳米共轭物直接注入鼠乳房组织被研究，即使局部的顺氯氨铂注射由于组织损伤是不适宜的。另外，肿瘤研究表明该被银激活的纳米共轭物导致过早的动物死亡。因此，本发明的纳米共轭物被发展，它不需要利用银(即，该纳米载体不是被银激活的)，从而本发明的纳米共轭物没有与银有关的毒副作用。该用无银纳米共轭物化疗药物(例如，HA-顺氯氨铂纳米共轭物)在皮下注射给药后的局部化化疗，就主要的响应于不同治疗器官的病理学方面，被与标准静脉注射给药顺氯氨铂进行了比较。纳米共轭物的皮下注射给药提供了局部化纳米共轭物化疗，与全身治疗相比具有显著增加的淋巴组织浓度和减少的包括鼠类肾中毒的器官毒性。

[0069] 先前，透明质烷在与顺氯氨铂共轭之前被用硝酸银活化，因为据报道这会提高共轭效率。然而，现在发现，它很难从该共轭产物中全部删除痕量银，即使在对水进行多次延伸透渗析之后。在治疗中，银的存在导致很多动物死于银诱发毒性，这已通过病理检查被确定。这在人类治疗中是不可接受的，并导致了该配方模式的改变以从该共轭方法中消除银。该耦合反应然后被再设计无银活化以获得最高的共轭效率，其归根结底不会削弱该HA-铂共轭物的形成。这在临床研制方面是一个显著的进步，因为顺氯氨铂和HA两个都被美国食品与药物管理局批准用于人类，且不需要附加的物质用于该复合体的形成。该纳米共轭物产物在体外对多乳腺癌仍然具有极好的抑制增殖活性，表明该配方的改变不影响基于细胞的药物效力。

[0070] 纳米共轭物的药物动力学和组织分布表明，HA-顺氯氨铂纳米共轭物的淋巴管输送与定量静脉注射顺氯氨铂相比提高了局部淋巴骨盆的药物水平。在一个铂的等效剂量，HA-顺氯氨铂载体大大增加了淋巴结骨盆浓度，表明该载体能够通过该淋巴管比静脉注射药物给药路线更加有效地输送铂到该淋巴结。此外，HA-顺氯氨铂纳米共轭物看起来能在体内足够久的保持其稳定性以在释放其共轭药物之前输送或局部化进入该淋巴管之内。

[0071] 该在淋巴系统优先积累的纳米共轭物与静脉内输送顺氯氨铂相比减少了暴露于铂的全身组织，但该HA-顺氯氨铂纳米共轭物由于其持续释放的特性(例如，选择性的移位和连接器的选择性的老化)，事实上在大多数组织内与静脉注射顺氯氨铂相比平均增加了200％的铂AUC。这可能是由于铂(从该HA-顺氯氨铂皮下注射输送)从一个更加持续释放外形的超时积累，与通过一个静脉注射丸剂注入的急速衰退和消除相比。该增加的组织水平同时具有两个优点：(1)仅需要较低剂量的铂以实现相同的组织效力，由此，该HA-顺氯氨铂剂量可以减少50％且仍然保持当量组织水平；(2)保持药物的治疗学全身水平是重要的，对于利用该药物作为一个辅助的治疗，既然已经知道大多数患乳腺癌的病人如果不是全身范围转移的话已经微量转移到局部区域淋巴结。因此，该治疗可以被采用代替日常的全身静脉注射疗法，至此，利用一个更小入侵和更小频率的剂量安排，例如一周一次定量皮下注射，与当前日常的静脉注射输注治疗相比较，而同时提供了给药到该局部区域肿瘤骨盆和淋巴管的局部“促进”。该较大的HA-顺氯氨铂AUC还可以增加肿瘤细胞死亡的速率，由于延长的顺氯氨铂亚毒性水平与单次高剂量相比可以实质的提高肿瘤细胞的死亡。

[0072] 由于顺氯氨铂越多严重的副作用可能是因为在静脉注射给药之后直接经历的高的血浆峰浓度(Cmax)，近来的申请包括有节制的定量疗程已经显示出降低了毒性，尽管它们增加了病人的不便和成本。因此，局部给药纳米共轭物防止了高峰水平，其原因在于，由于药物从该载体的缓释，与标准静脉注射顺氯氨铂药剂的一个小时相比其在盐水中的半衰期为10小时；以及在其从该载体释放之后，顺氯氨铂需要时间从该组织或淋巴扩散进入该全身循环之内。皮下注射HA-顺氯氨铂与静脉注射顺氯氨铂相比具有一个低得多的血浆峰浓度(图1A-1B)，尽管总的血浆铂AUC远大于静脉注射顺氯氨铂。在皮下HA-顺氯氨铂注射之后，在血浆铂到达高点之前有一个2小时的延迟，然后趋于平稳最后停留在一个恒定的水准。该释放曲线与一个延迟的和从该淋巴组织持续的释放是一致的。

[0073] 附图2A-2B示出了肌氨酸酐水平表明静脉注射顺氯氨铂和局部化纳米共轭物之间肾毒性没有重大差别，尽管纳米共轭物铂的AUC更高。高剂量银配方导致在第一周内尿肌氨酸酐水平降低和动物死亡，其是不适宜的。银配方的严重体内毒性表明，银配方稍微更大的活体外抗增殖活性(表1)可能起因于非特异性的银中毒。尽管没有检测到损坏，肌氨酸酐测试可能不是足够灵敏的以发觉在单次适度剂量之后较小的肾损害，所以，我们实施了为更多铂毒性直接证据的病理检查。因此，在一个具体实施方式中，一个纳米共轭物配方基本上是无银的。

[0074] 单次剂量顺氯氨铂注射后30天的病理检查显示，在皮下注射HA-顺氯氨铂和静脉注射顺氯氨铂配方之间存在有显著的肾和肝的区别。尽管HA-顺氯氨铂的肾的铂AUC是顺氯氨铂的两倍，在该HA-顺氯氨铂治疗的动物中，肾细胞坏死的较低发病率和更小的严重性表明比其静脉注射顺氯氨铂提高了耐药性。肾内更大的HA-顺氯氨铂的铂AUC似乎将反驳该观察到的较低的毒性，但可能起因于其与静脉注射顺氯氨铂相比较低的通过肾过滤的峰血清药物水平(Cmax)。

[0075] 肝脏病理学显示了HA-顺氯氨铂与顺氯氨铂相比降低的毒性，没有动物在3.3mg/kg顺氯氨铂具有正常病理。顺氯氨铂诱发的肝脏毒性已知是由于反应性氧气种类的产生而发生。透明质烷在肝脏内新陈代谢，氨基多糖是已知的具有肝保护效应的抗氧化剂，所以该HA纳米共轭物可以防止铂造成肝脏中毒。

[0076] 相应地，一个具体实施方式包括一个HA和顺氯氨铂纳米共轭物，其在皮下注射进入乳房颊脂垫之后将顺氯氨铂集中在该乳房淋巴管。这些纳米共轭物具有持续释放的特征，导致较高的淋巴管AUC和较低的血浆Cmax，与标准静脉注射顺氯氨铂相比。该纳米共轭物不会导致实质的器官毒性，如肾、肝、神经或肾中毒；且在病理检查上看起来与标准静脉注射顺氯氨铂相比具有较低的器官毒性。该纳米共轭物不会导致注射部位或淋巴结中毒。该优先的淋巴管内移位和该纳米共轭物的积累提供了用其它化疗药物合并治疗乳腺癌的优势。

[0077] 根据本发明，该纳米共轭物可以有效地输送顺氯氨铂以单独或作为联合治疗的一部分使用，具有显著地更小的毒性。该使用纳米共轭物的淋巴管内输送模式不仅在局部区域结组织显著地增加了高于标准顺氯氨铂配方的药物浓度(高出74％的AUC)，而且它也显示了允许更低Cmax水平的维持释放的动力学，其能够长时间保持低器官毒性。仅有的显著的不同组织水平是同侧腋淋巴结对该药物注射。这转换几乎加倍使用纳米共轭物皮下注射直接进入该乳房内穿过该局部区域节点的顺氯氨铂的浓度。因此，优先移位到该淋巴管的纳米共轭物显著地促进了药物浓度以治疗和/或抑制淋巴管内局部区域肿瘤细胞发育。

[0078] 此外，该纳米共轭物可以成功治疗和/或抑制癌症的传播，由于化疗药物的淋巴管内输送到达腋下使用透明质烷作为一个靶向纳米载体。该优先的淋巴管内输送可以在风险区域的淋巴结优先治疗和避免与静脉注射或口服药物给药有联系的全身毒性。该优先的淋巴管内输送降低了全身浓度但保持在一个适当的水平用于治疗和/或抑制癌细胞的传播即传播进入全身循环。因此，该纳米共轭物可以提供一个用于具有包含通常不会被提供淋巴结分解的纳转移的前哨淋巴结的病人的治疗。该纳米共轭物比标准治疗提供了足够的全身药物水平在一个更维持释放的模式下，且它也提供了对处于风险的不能通过结分解去除的隐藏肿瘤细胞的局部区域结组织更加需要的促进作用。另外，该纳米共轭物能被作为一个用于局部晚期乳腺癌的最新辅助治疗，并可以治疗或抑制退化。

[0079] 在一个具体实施方式中，一个具有该纳米共轭物的药物配方不是为用于下列输送路线而配制：口服、系统、透过皮肤起作用、鼻内、栓剂、静脉注射、或管腔内给药。

[0080] 该药物可被配置用于经皮肤、皮内、粘膜或粘膜下层、皮下、间隙、脂肪内、瘤周、肌肉注射粘膜、瘤周、吸入和滴注。

[0081] 本发明的纳米共轭物在皮下注射或间隙给药后优先移位到淋巴系统是令人惊讶和出乎意外的。在某种程度上，这是由于在皮下注射或空隙给药之后，在该淋巴系统优先的移位和积累，例如进入乳房组织。化疗药物如顺氯氨铂与HA或树枝状大分子的纳米共轭物也提供了一个治疗学系统的剂量，其AUC与标准静脉注射药剂(例如，顺氯氨铂和阿霉素)相同或有时偏高，但具有较低的Cmax浓度。该综合的发现允许这些药物作为用于具有局部区域疾病的病人的高级辅助治疗，由于Cmax较低其具有能够治疗它们全身疾病的额外益处和具有更小的毒性，这毒性与顺氯氨铂和和阿霉素的毒性是有关的。也令人惊讶的是，在通过OAEs和通过肾病理学分析评价证明，局部注射部位、肾、和耳毒性方面，HA纳米共轭物基本上比标准顺氯氨铂或阿霉素具有更小的毒性。该较低的毒性允许直接注射进入、相邻的或接近地进入组织或组织间隙，而不会损坏该健康的组织。因此，该纳米共轭物可提供对原发肿瘤、淋巴管内癌细胞和全身癌细胞的治疗。

[0082] 总之，该纳米载体输送系统优越于标准药物配方在于：(1)用于治疗动物癌症的效力和能力；(2)较低的毒性轮廓；和(3)较长的定量间隔(一周一次或两周一次对每天一次静脉注射药剂)。该皮下注射相比携带药物溢出风险的静脉注射输液泵提供给病人一个微创的治疗选择。

[0083] 该纳米共轭物可被归入一种具有可接受的载体的药物组合物，配制该纳米共轭物用于适当给药如皮下注射。适当的制备用于皮下注射给药主要是具有水溶形式活性成分的水溶液如水溶盐，和另外的活性成分悬浮体，如使用适当的亲油溶剂或载体如脂肪油、芝麻油或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯的合适的油的注射悬浮体，或包含粘度增加物质如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或右旋糖苷和必要时的稳定剂的水注射悬浮体。

[0084] 根据本发明的方法，本发明的组合物可通过注射而给药，通过渐次的超时输注或通过任一其它的医学上可接受的模式。任一医学上可接受的方法可被用来给药该组合物到病人。具体的模式选择当然依赖于各种因素如具体的药物选择、要治疗的病状态的严重性、或为治疗效能需要的剂量。本发明的方法，一般而言，可以使用任一医学上可接受的的给药模式，意思是指任何可以使该活性组合物达到的有效水平且没有引起临床上不受欢迎的的副作用的模式。

[0085] 对于注射，该纳米共轭物可通过在一个水或非水溶剂如植物或其它类似的油类、合成脂肪酸甘油酯、较高的脂肪酸酯或丙二醇内溶解、悬浮或乳化而配制，如果需要，可包括传统的添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、和防腐剂。优选地，该纳米共轭物可在水溶液中配制，优选在生理学兼容的缓冲剂如Hank’s溶液、格林氏溶液(Ringer′s solution)或生理盐水缓冲剂中。

[0086] 该纳米共轭物可被配制用于通过注射皮下给药，例如，通过弹丸注射或连续输注。用于注射的配方可以以单位剂型存在，例如在安瓿或在多剂量容器中，具有附加的防腐剂。
该组合物可采取在油或水载体中的悬浮体、溶液或乳状液的形式，且可以包含配方试剂如悬浮、稳定和/或分散试剂。

[0087] 本发明的组合物无菌注射剂可以是水状的或基本上为脂肪族悬浮体状的。这些悬浮体可根据本领域已知技术使用适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。该无菌注射剂配制也可以是一个无菌注射剂溶液或悬浮体，在一个无毒的肠外接受的稀释剂或溶剂中，如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和可采用的溶剂之中，为水、格林氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、脂肪油通常作为溶剂或悬浮介质而采用。为此目的，任一刺激性少的脂肪油可被采用，包括合成的单或二甘油酯。脂肪酸如油酸和它的甘油酯衍生物可用于血管注射剂的制备，以及天然的药物可接受的油类如橄榄油或蓖麻油、特别是它们的聚氧乙烯体。这些油剂或悬浮体可同时包含一个长链醇稀释剂或分散剂。

[0088] 淋巴系统被卷入乳腺癌转移已经确立，然而没有有效的非外科治疗以克服淋巴结转移和疾病发展。淋巴结转移化疗最大的挑战实际上是使被保持在该淋巴结上的药剂的量最大化，同时避免全身的吸收和中毒。

[0089] 在乳腺癌治疗中，本发明提供给局部淋巴管化疗一个创新的飞跃。用于化疗药物的HA或树枝状大分子纳米载体可以局部地治疗晚期乳腺癌，同时利用靶向的和淋巴管输送途径。用于乳腺癌淋巴管内给药的淋巴管靶向纳米载体的利用是高度创新的和迄今为止从来没有实施的。通过增加比标准化疗药物可达到的药物局部区域AUC，该技术在局部地晚期乳腺癌提供了显著的最新辅助治疗。另外，包含具有更好的滞留和持续从该淋巴管释放药物的靶向途径应该降低了药物的全身毒性，该药物全身毒性的降低导致更好的肿瘤效力和更低的毒性。

[0090] 本发明可用其它的没有脱离其精神和本质特征的具体形式体现。所描述的具体实施方式仅仅作为说明性的与非限制性的在各个方面予以考虑。因此，本发明的范围是，通过附加的权利要求而非通过上述说明表明。所有在权利要求等价意义和范围内的变化均在其范围之内，此处所有的引用和/或描述均通过具体参考的形式予以结合。

[0091] 试验

[0092] 来自微生物发酵的透明质烷(HA)以透明质酸钠的形式购买自Lifecore Biomedical(明尼苏达州查斯卡(Chaska MN))，无需进一步提纯而使用。肝素溶液购买自AbraxisPharmaceutical Products(伊利诺斯州绍姆堡(Schaumburg IL))。所有其它试剂购买自FisherScientific(宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburgh，PA))或Sigma Aldrich(密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))，其为ACS级或更高级。Milli-Q水用于所有的试验。MDA-MB-468LN细胞系通过Ann Chambers(伦敦保健科学中心，安大略省伦敦市(London，Ontario))提供，而MCF-7和MDA-MB-231细胞从美国组织培养收集中心(ATCC，弗吉尼亚洲马纳萨斯(Manassas，VA))获得。动物方法被堪萨斯州立大学动物关心和使用委员会批准、Sprague-Dawley鼠购买自Charles River实验室(马萨诸塞州威尔明顿(Wilmington，MA))。

[0093] 1.HA-顺氯氨铂共轭物合成

[0094] 顺氯氨铂根据早先报道的方法(S.Cai，Y.Xie，T.Bagby，M.S.Cohen，and M.L.Forrest.Intralymphatic chemotherapy using a hyaluronan-cisplatin conjugate.J.Surg.Res.147：247-252(2008)；Y.I.Jeong，S.T.Kim，S.G.Jin，H.H.Ryu，Y.H.Jin，T.Y.Jung，I.Y.Kim，and S.Jung.Cisplatin-incorporated hyaluronic acid nanoparticles based on ion-complex formation.J Pharm Sci.(Epub.)：(2008))被共轭到HA(35000g/mol)，分别加入和不加入作为活性剂的硝酸银。一般地，HA(100mg)和顺氯氨铂(45mg)溶于水(20mL)，在黑暗和氩存在的条件、在环境温度(大约25℃)下搅拌四天。反应混合物在4℃避光被过滤(0.2μm尼龙膜)和透析出水(10000MWCO；Pierce，Rockford，IL)48小时。接着透渗析，半成品被浓缩和在4℃储存。顺氯氨铂取代的程度由原子吸收光谱学(AAS)(具有石墨熔炉的Varian SpectrAA GTA-110)决定。熔炉程序如下：斜面25-80℃，保持2s；斜面达到120℃，保持10s；斜面达到1000℃，保持5s；斜面达到2700℃，保持2s；经过20s冷却到25℃。石墨分隔管每40个样品通过在2800℃烘焙7s进行清理。氩被用作注入和载体气体。产物共轭物称为HA-顺氯氨铂、顺氯氨铂-HA、HA-CDDP、HA-Pt，尽管该共轭物是[PtCl(H2O)(NH3)2]OOCO-HA(附图9)。

[0095] 顺氯氨铂的结构有助于与聚羧基聚合物形成复合物，由于一个或多个该氯化物可被置换以允许形成一个不稳定的连接该聚合物的酯键。顺氯氨铂被高度共轭到HA，具有典型的0.20w/w铂/复合体(大约65％顺氯氨铂共轭效率)的共轭度。在先前的研究中，顺氯氨铂共轭物首先通过用AgNO3活化HA；然而，现在发现，省去这些步骤不会显著地减少共轭且其减少了潜在的银中毒。AAS在10-450ng/mL(R2＝0.999)范围内作出了一个线性曲线，其具有5ng/ml的检出限。浓缩样品在分析之前用水稀释使其进入该直线分析的范围之内。

[0096] HA的荧光共轭物通过德克萨斯红酰肼对HA的凝结而形成。HA(35000MW，100mg)在10mL的30％的H2O:EtOH中用2-氯-1-甲基吡啶碘化物(33mg)和三乙胺(35μL)活化。在加入德克萨斯红酰肼(AnaSpec Inc.，San Jose，CA)(2mg在0.4mLDMSO二甲亚砜)之后，该混合物被回流24小时。通过在环境温度对水透渗析48小时进行检查，继之以冷冻干燥。共轭效率用81800M-1cm-1在λ588nm的摩尔消光系数决定。

[0097] 顺氯氨铂被高度共轭到HA，具有典型的0.25w/w顺氯氨铂/复合体的共轭度，起始比率为0.5w/w顺氯氨铂/HA。达到0.75w/w顺氯氨铂/复合体被尝试，但效率降低(表4)。

[0098] 2.体内细胞毒性

[0099] 淋巴转移性的乳腺癌细胞系MDA-MB-468LN被保存在改性的阿尔法Eagle介质中(modified Eagle’s medium alpha)，补充有10％胎牛血浆、1％L-谷氨酰胺和0.4mg/mL G418(遗传霉素)。附加的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7根据ATCC提供的规程被维持。先于增殖研究，细胞被胰蛋白酶化和种入96-孔板(5000细胞/孔)。24小时之后，顺氯氨铂、HA-顺氯氨铂(用或者不用银活化)、或HA被加入(n＝12；浓度7)，加入72小时后，刃天青蓝在10μl磷酸缓冲盐水被加入每一孔(最后浓度为5mM)。4小时之后，孔荧光被用荧光光度计(SpectraMax Gemini；Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测量(λex560nm，λem 590nm)。IC50由每个板的盐溶液(阳性的)的中点和无细胞(阴性的)对照之间的中点来确定。

[0100] 当细胞增殖减少经过72小时后，细胞毒性被确定。含和不含银的HA-顺氯氨铂共轭物对细胞结构中的游离药物具有相同的细胞毒性(表1)。在使用三个不同人类乳腺癌细胞系的顺氯氨铂和HA-顺氯氨铂之间没有发现看得出的毒性区别(表1)。HA表明在10mg/ml时没有毒性，在所有细胞系中的测试上限与盐水对照相比较(数据未示出)。

[0101] 3.药物动力学和组织分布

[0102] 在异氟烷条件下，将导管插入Sprague-Dawley鼠(雌性，200-250g)左颈静脉，允许整夜恢复。动物然后被静脉注射顺氯氨铂(1.0或3.3mg/kg；n＝5)或皮下注射HA-顺氯氨铂(1.0或3.3mg/kg当量顺氯氨铂；n＝5)，在异氟烷麻醉的条件下。在该动物最上的右乳房颊脂垫皮下注射。在给药后的0、5分钟、0.5、1、2、4、6、12、24、48和96小时时从该插管中抽全血(100μl)，然后投入2ml预先用肝素处理的离心管。该插管在抽出前后被盐水洗涤，然后用肝素锁定。该全血被在17000×g离心5分钟，血浆在-80℃冷冻直至分析。动物在治疗96小时后被无痛致死。右同侧腋下结点(治疗侧)、左对侧腋下结点(控制侧)、和主要的器官(肝脏、肾、心脏、脾、肺、脑、肌肉、膀胱)被切除；用0.9％的盐水洗；在-80℃储存直至分析。组织样品使用早先报道的方法(S.Cai，Y.Xie，T.Bagby，M.S.Cohen，and M.L.Forrest.Intralymphatic chemotherapy using a hyaluronan-cisplatin conjugate.J.Surg.Res.147：247-252(2008))制备。一般地，50mg组织样品用1.5ml 6.7％的硝酸在80℃消化2小时。在消化之后，样品被均化(Tissue Tearor；BioSpec Products Inc.，Bartlesville，OK)和离心。上层清液和血浆样品用合成部分描述的AAS进行分析。在Sprague-Dawley鼠上，对皮下注射HA-顺氯氨铂和静脉注射顺氯氨铂的药物动力学进行比较。HA-顺氯氨铂在引流同侧的腋淋巴结比静脉注射顺氯氨铂更优先积累(图1A)；优先积累在注射48小时后仍然很明显，即使活体外顺氯氨铂从HA分裂的半衰期为10小时。
局部注射的HA-顺氯氨铂同侧腋下结点AUC0-96小时比静脉注射顺氯氨铂(p＜0.001)大
3.8倍，HA-顺氯氨铂结点峰浓度(Cmax)比静脉注射顺氯氨铂大6.2倍。

[0103] 最显著的，顺氯氨铂治疗的剂量限制的毒性是肾中毒，继之以神经中毒，两者都受血浆峰浓度的强烈影响。静脉注射顺氯氨铂的血浆峰浓度比皮下注射HA-顺氯氨铂大3.1倍。顺氯氨铂释放进入全身循环是缓慢的，HA-顺氯氨铂产生的血浆AUC比静脉注射顺氯氨铂大3.9倍，这与纳米载体HA-顺氯氨铂较长的淋巴管滞留是一致的(图1B，表2)。所有组织的浓度图见附图(图8A-8H)。

[0104] 另外，Sprague-Dawley鼠(200-250g，雌性，Charles River)被放置在异氟烷麻醉条件下，将顺氯氨铂-HA或在0.9％盐水中的顺氯氨铂(3.5mg/kg当量顺氯氨铂)(n＝5)皮下注射(100μL)入右乳房颊脂垫。动物被允许用食物和水进行恢复。在注射1、4、12、24、48和96小时后，动物通过过度剂量的异氟烷被无痛致死。器官和组织用0.9％盐水洗和冷冻(-80℃)直至分析。血浆通过离心作用从全血中分离和冷冻(-80℃)。顺氯氨铂共轭到HA影响顺氯氨铂在引流淋巴结的局部浓度，具有对系统浓度较小的影响(附图10A-10B，表5)。经过96小时试验时间，在右淋巴结(RLN)内的顺氯氨铂-HA共轭物弧线下的区域(AUC)，其排泄注射部位，比盐水(p＝0.0001)中的顺氯氨铂大74％，经过测验周期，RLN具有增加的组织浓度(附图10A)。顺氯氨铂-HA在非排泄左淋巴结(LLN)的AUC与顺氯氨铂在盐水(p＝0.12)中的没有显著的区别。

[0105] 游离顺氯氨铂的突然释放显示在血浆浓度曲线上(附图10B)，而顺氯氨铂-HA显示了一个较长的、持续的释放进入血浆。这是重要的，因为顺氯氨铂治疗的剂量限制毒性受血浆峰浓度的强烈影响。顺氯氨铂-HA和顺氯氨铂(p＝0.13)之间在血浆AUC上没有显著差异。因此，用顺氯氨铂-HA局部化治疗可以产生足够的血清浓度用于治疗远距离的转移，同时对乳房淋巴管提供一个促进的治疗。顺氯氨铂在其它的器官的分布在研究周期内没有显著的区别(附图11，表5)。

[0106] 4.长期的毒性

[0107] Sprague-Dawley鼠(35个雌性)被随机地分成每5只动物一组的7个研究组：1.0mg/kg皮下注射HA-顺氯氨铂(含银和无银；铂相当于1.0mg/kg顺氯氨铂)、3.3mg/kg皮下注射HA-顺氯氨铂(含银和无银)、静脉注射顺氯氨铂1.0和3.3mg/kg、以及皮下注射HA(对照；HA相当于3.3mg/kg HA-Pt)。在30天研究周期的开始，每个动物被单次给药单次剂量。在研究的开头两周内，每天收集尿样品，在研究的第三和第四周内，每隔三日收集尿样品(除了给药3.3mg/kg含银HA-顺氯氨铂的那组)。为了减少动物的压力，试验对象被放在代谢茏内12小时以收集大约5ml的尿，然后放回有垫草的笼直至下一个收集期。尿样品在17000xg离心5分钟，在80℃储存冷冻直至肌酸酐分析。

[0108] 尿肌氨酸酐用QuantiChromTM肌氨酸酐测定器材根据厂商规程(BioAssay Systems，Hayward，CA)分析。如下计算样品的肌酸酐浓度，(OD样品5-OD样品1)/(ODSTD5-ODSTD 1)x[STD](mg/dL)。OD样品5、OD样品1、ODSTD5和ODSTD1分别为在5分钟和1分钟时样品的OD510nm值和标准的OD510nm值。

[0109] 在研究(30天)的结尾，动物被无痛致死，肝、两侧的肾、脾、肺、心脏、右(同侧)及左(对侧)腋下的结点、以及脑被完整的切除，储存在80％的乙醇甲醛溶液过夜用于在载片装配前定置。Veterinary Lab Resources(Kansas City，KS)实施了使用苏木精与曙红(H&E)着色的安装。病理检查由委员会认可的未参与本项目的兽医病理学家(University of Kansas Medical Center，Kansas City，KS)实施。

[0110] 尿肌氨酸酐水平是肾功能和肾毒性的一个间接指示，肌酸酐排泄减少对应于肾功能降低和可能的肾中毒或损坏。在动物中观察的重要的肾毒性产生于高剂量银(3.3mg/kg)，3天肌酸酐排泄减少30％，4天减少70％。该组中的所有动物在治疗1周内死亡，由于与药物相关的恶病质。相反，无银高剂量HA-顺氯氨铂没有表现出高毒性，肌酸酐水平在整个研究期间保持接近用药前水平。类似的肾功能情况出现在下列两组中：当动物被低剂量(1.0mg/kg)给药含银HA-顺氯氨铂或无银HA-顺氯氨铂治疗(p＞0.05，1到30天)(图2A-2B)。

[0111] 在30天毒性研究结束时，动物被无痛致死，并实施了完全的病理检查。所有研究组的脑组织和注射部位的基础组织(underlying tissue)是正常的，没有微观的改变。对于高剂量静脉注射顺氯氨铂和皮下注射无银配制的HA-顺氯氨铂而言，发现淋巴结有非常轻微的改变。密集的几乎没有小囊结构的小淋巴细胞显示低剂量皮下注射含银HA-顺氯氨铂的淋巴组织具有正常外表(图6A-6F)。对于接受小剂量顺氯氨铂静脉注射和小剂量HA-顺氯氨铂皮下注射的动物而言，观察到的肝的非常细微的变化也被在该窦状隙上轻微炎症得到证明(图4A-4F)。对于接受高剂量静脉注射顺氯氨铂和高剂量皮下注射HA-顺氯氨铂治疗的动物而言，观察到轻微的退化伴随着一些窦状隙的坏死，在静脉注射顺氯氨铂组中，坏死更严重。另外，60％的接受低剂量静脉注射顺氯氨铂的动物观察到具有轻微的肾坏死，包括溢血进入肾小管以及管状的浮肿(图3A-3F)。相反，接受低剂量皮下注射HA-顺氯氨铂的动物均没有肾坏死。同样地，五分之四(80％)的接受高剂量静脉注射顺氯氨铂的动物与五分之一(20％)的接受高剂量皮下注射HA-顺氯氨铂的动物相比，确诊具有轻微的肾坏死(表3)。总之，病理学研究证明，无银HA-顺氯氨铂共轭物证明了肾和肝中毒的更低的发病率，与传统的静脉注射顺氯氨铂治疗在所有剂量范围内相比。另外，在治疗的动物中，没有观察到脑中的神经中毒或基础肌肉组织的局部注射部位中毒(图5A-5F和7A-7D)。

[0112] 5.活体外药物释放

[0113] 在活体外，在有和没有盐水的磷酸盐缓冲液中，确定顺氯氨铂从顺氯氨铂-HA的释放速度。顺氯氨铂-HA被加入到3500MWCO渗析袋(Pierce)和被放入一个磷酸盐-缓冲剂水浴(pH 7.4，37℃)或生理盐水(140mM)中。样品在预定时间点从该渗析袋中提取，并保存在由AAS决定的顺氯氨铂浓度。顺氯氨铂从复合物中的释放速度有其所处的磷酸盐缓冲溶液和水决定。盐溶液中的Cl-被期望更快地置换顺氯氨铂，增加释放速度。药物的释放显示了接近第一级释放动力学，在水中具有42小时的释放半衰期和在生理盐水中为10小时。AAS制出了一个从10到450ng/mL(R2＝0.9998)的线性浓度曲线，其具有5ng/mL的检测限和10ng/mL的量化限(5％标准偏差)。顺氯氨铂从顺氯氨铂-HA加标物组织的回收是：血浆，82±4％(±STD)；淋巴结，92±2％；膀胱，88±1％；脑，94±0.3％；心脏，97±1％；肾，98±1％；肝脏，100±1％；肺，94±1％；肌肉，95±1％；脾，97±1％。顺氯氨铂从顺氯氨铂加标组织的回收是：血浆，80±3％；淋巴结，92±6％；膀胱，86±3％；脑，93±10％；心脏，
93±5％；肾，100±2％；肝脏，100±7％；肺，95±8％；肌肉，100±5％；脾，96±9％。

[0114] 附图16示出了在活体外，HA-顺氯氨铂在37℃对水和PBS溶液的释放速度。表6示出了相关的半衰期。

[0115] 6.活体外细胞毒性

[0116] 细胞系被种入DMEM介质中的96孔孔板(5000细胞/孔孔)，补充有5％FBS和1％青霉素/链霉素。在24小时后，顺氯氨铂、顺氯氨铂-HA、或HA被加入(n＝12，浓度7)，在加入72小时后，在10μL PBS中的reazurin孔蓝被加入每个孔(最后浓度5mM)。4小时之后，测量孔荧光(λex 560nm，λem 590nm)(SpectraMax Gemini，Molecular Devices)，IC50由盐水(阳性的)和无细胞的(阴性的)对照之间的中点确定。

[0117] 顺氯氨铂-HA共轭物在细胞结构中具有与游离顺氯氨铂相同的毒性。毒性在高度转移性的人类乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231中评估(附图12)。在两个细胞系，在顺氯氨铂-HA(IC507μg/mL，顺氯氨铂基)和顺氯氨铂(IC507μg/mL)之间没有看得出的毒性区别。HA在测验的浓度范围(达到10mg/mL，数据未示出)内对人类细胞的无毒性。表7示出了IC50的值。

[0118] 7.原子吸收光谱(AAS)

[0119] 在活体外，释放样品(n＝3)和血浆样品(n＝5)分别被稀释200倍和10倍，用0.1％的硝酸分析。通过在80℃在1.5mL 6.7％的硝酸中消化50mg组织1小时制备组织样品(除了淋巴结)。淋巴结采用10mg组织用上述类似方法制备。在消化之后，样品被均化(Tissue Tearor，BioSpec Products Inc.，Bartlesville，OK)。所有的样品被离心(17000x g，20分钟)，上层清液被用来分析。

[0120] 分析在一个带有石墨熔炉和分隔管子的Varian SpectrAA GTA-110上实施。样品(21μL)使用自动取样器被注入，继之以19μL的0.1％的硝酸。每10个样品在150、300和450ng/mL通过检定用基准被分级，每5个样品一个质量控制样品(150或300ng/mL)。在0.1％硝酸(10浓度)中从1到450ng/mL制备一个完整的校准曲线。顺氯氨铂的回收通过顺氯氨铂或顺氯氨铂-HA(50μg/g)的标记的组织空白和上述方法确定。该熔炉程序如下：
斜面25到80℃，保持2s；斜面达到120℃，保持10s；斜面达到1000℃，保持5s；斜面达到
2700℃，保持2s；经过20s冷却到25℃。石墨分割管每40样品通过后在2800℃烘焙7s而被清理。氩被用作注入和载体气体。

[0121] 8.活体内成像

[0122] 为了使纳米载体输送抗癌药到乳房局部区域淋巴管内纳和微转移瘤，载体应该从该乳房区域排出到患病的淋巴结。为了核实阴离子纳米载体的移动，我们通过35kDa透明质烷与德克萨斯红酰肼(AnaSpec，San Jose，CA)的耦合构造了一个荧光阴离子纳米载体，使用EDAC作为媒介的酰胺耦合继之以透渗析以去除游离染料(0.1％w/w染料/载体，利用分光设备确定)。我们在带有淋巴结转移的异种移植的乳头之下皮下注射荧光纳米微粒(0.25μg在50μL盐水中)。

[0123] 荧光在10nm带通段从520到720nm进行测量，使用一个冷却的带自动曝光的CCD摄像机。成像是光谱未混合的，使用自动的反滤波工具(Maestro ver.2.4)以限制食物内叶绿素导致的皮肤和肠自身荧光。

[0124] 根据Chambers及其合作者的方法，淋巴管乳房肿瘤转移在裸鼠内被诱导，他们非常友善的提供了淋巴管转移性的乳房肿瘤细胞系MDA-MB-468LN。裸鼠(25-30g，雌性，CharlesRiver)被用戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，100μL MDA-MB-468LN(107细胞/mL)通过一个小切口被正位的注射进入左二胸乳房颊脂垫，该切口随后用一个创伤夹封口。在4-5周后，肿瘤是明显的(100-300mm3)。在成像之前，鼠被麻醉。德克萨斯红-HA(10mg/mL在盐水中，20μL)被皮下注射到左乳房颊脂垫。轻轻地按摩注射面积5分钟，在5到18小时后，荧光成像(CRI Maestro Flex，CRI Inc.，Woburn MA)，使用445到490nm滤光的卤素激发灯和515nm的长传辐射滤光器。

[0125] 注射四小时后，荧光成像(λex480，λem 500-720nm，光谱滤波)示出了阴离子纳米微粒在一个区域其腋下结点组一致的积累(图13A)。在该早期时间点，许多载体仍然处于接近注射部位，尽管一些输送到腋淋巴结肿瘤是明显的。这些成像被去重(滤波)，所以重叠的GFP和德克萨斯红信号没有显示出黄色。该软件包括一个共区域化工具证实德克萨斯红在该肿瘤区域内。德克萨斯红标记纳米载体的积累在该冠状物观察中更为明显(图13B)。

[0126] 在注射18小时后，纳米载体在环绕该肿瘤的腋下的结点集中(图13C)。值得注意的，在该注射部位，没有载体荧光出现，与很高的腋下结点水平相比，没有明显蔓延到肝脏。载体绕该肿瘤定位的明显区域在该冠状物观察中出现。Kobayashi等注意到，阳离子的PAMAM纳米微粒没有进入淋巴管肿瘤，而是围绕它们输送。然而，阴离子载体具有一个更长的滞留时间，可能允许该载体及其抗癌药物进入肿瘤。

[0127] 附图13A-13C示出了带有MDA-MB-468乳房淋巴管肿瘤用绿色荧光蛋白质(GFP)表达的裸鼠在皮下注射后的淋巴管内载体定位。附图13A示出了鼠在左乳房颊脂垫被皮下注射德克萨斯红-HA 6时的乳房淋巴管肿瘤4。在5小时和18小时之后(分别为附图13B和附图13C)，照片示出了在引流结点显著的HA局部化和与该肿瘤的共同定位(GFP通道为绿色，用4表示；德克萨斯红通道为红色，用6表示；蓝色箭头2是注射部位)。

[0128] 9.活性

[0129] 阿霉素共轭到该纳米载体没有显著地影响其在乳腺癌细胞中抗癌活性。10％w/w的共轭物被用于细胞，72小时后，使用Alamar蓝色试验(Invitrogen Corp.)确定细胞增殖。在三个侵蚀性的人类乳房癌细胞系中，共轭物和游离阿霉素之间抗癌活性没有静态地显著差异。同样地，顺氯氨铂共轭物被用于乳房癌细胞培养物。72小时后，顺氯氨铂共轭物与游离顺氯氨铂没有显著地的不同。总之，抗癌药共轭到纳米载体的共轭物没有减少其在活体外的抗增殖效果。这可能是由于抗癌药从纳米载体释放进入该培养基，继之以与游离药物一样的摄取。然而，显微学摄取研究暗示，即使共轭到一个阴离子载体，药物也许具有活性。

[0130] 10.合成方案

[0131] 附图14A示出了树枝状大分子-顺氯氨铂共轭物的合成。该树枝状大分子的双羟丙基磷酸盐末端被转化为羧酸，其然后与顺氯氨铂通过该氯化物的置换形成复合物。得到的复合物在生理条件下慢慢地释放有效的DNA交联剂顺式[Pt(NH3)2Cl(H2O)]+。在初始的研究中，我们通过氯化铂与一个载体羧酸的置换形成顺氯氨铂对透明质烷载体的共轭物，形成-C(＝O)OO-PtCl(NH3)2共轭物。一个类似的方案可用于共轭顺氯氨铂到阴离子树枝状大分子载体。该树枝状大分子的双羟丙基磷酸盐末端通过与Dess-Martin periodinane，(DMP)、IBX或IBA的轻微还原被转化为羧酸，和臭氧化成羧酸。做为选择，氢氧根可被转化成羧酸，通过与琥珀酸酐/DMAP的处理，尽管这将延伸该末端四个碳原子和扩大该纳米载体。复合物可通过透渗析或交联葡聚糖提纯，纳米载体上的药物数量通过石墨熔炉原子吸收光谱确定。顺氯氨铂共轭物最佳的量在大约10％-50％取代，更优选地大约20％-40％，最优选地大约25％-35％.。例如，达到25％w/w共轭物在活体内具有允许的主要的淋巴摄取Pt(II)-透明质烷纳米微粒。

[0132] 附图14B示出了树枝状大分子-表柔比星共轭物的合成。该树枝状大分子的双羟丙基磷酸盐末端被转变为酰肼，其然后与该表柔比星形成一个pH灵敏的腙。得到的复合物将响应于细胞(例如肿瘤细胞)吞噬容器(endocytic vessels)内减少的pH值而释放表柔比星。纳米载体共轭物可以大大增加积累在癌细胞上的蒽环类的量。

[0133] 该pH灵敏的共轭物通过在蒽环类13-羰基和纳米载体上的接枝酰肼之间使用腙连接器而形成。该酰肼连接器通过使用文献记载的方法图示一个乙二酰阱到该羧酸残留物而形成，但一个更直接的方案可转化该纳米载体氢氧根末端直接成为酰肼，其将保持该树枝状大分子的尺寸。胺末端被期待增加该载体的阳离子的特性，而低pKa酰肼(大约pH4.5)将最小化在细胞外的效果。此外，该氢氧根末端的部分的转化可以产生足够的酰肼以共轭该预定药物负载。在将该树枝状大分子的双羟丙基磷酸盐末端转化成羧酸之后，用肼实施活化，形成酰肼末端。该表柔比星共轭物通过该载体和表柔比星在pH 6.5时的培养而形成，形成可逆的腙连接器继之以透渗析或交联葡聚糖检查以去除非共轭的药物。表柔比星共轭物最佳的量在大约5％-20％，更优选大约8-15％，最优选大约10％-12％。

[0134] 附图14C示出了树枝状大分子-紫杉萜共轭物的合成。该紫杉萜被转化成一个受保护的苹果酸，该新羧酸直接与该树枝状大分子的双羟丙基磷酸盐末端通过一个酯键连接。该产生的复合物将保护组织免收紫杉萜毒性直至共轭物响应于吞噬容器(endocytic vessels)和内生的酯酶内的减少的pH而释放紫杉萜。紫杉萜可以被共轭到该树枝状大分子未改性的双羟丙基磷酸盐末端，通过使用一个使用酯键嫁接于紫杉萜C2位置的苹果酸连接器。该紫杉萜C2-OH可以用1，2-O-异亚丙基-苹果酸冷凝，形成一个受保护的紫杉萜的苹果酸。用乙酸脱保护将产生该苹果酸，其可以被直接耦合到该树枝状大分子的氢氧根臂上。得到的共轭物可以响应于酸性的pH或酸性容器中内生的酯酶而释放紫杉萜。注射后预期的半衰期期望大于4小时，根据我们对阴离子淋巴管纳米载体的初步研究，其允许淋巴管有足够的时间摄取。紫杉萜共轭物的最佳的量可以在大约5％-20％之间，更优选大约8-15％，最优选大约10％-12％。

[0135] 附图15A示出了基于本发明的树枝状大分子的合成，并示出了我们实验室的一个总的合成方案，尽管我们正在测验附加的基团和取代基以进一步的提高摄取量。从一个多支臂芯体，我们正在通过碳二亚胺耦合继之以脱保护侧羟基而制造多代聚酯芯体。更多代的生成从这些侧羟基建立。在2-4代后，我们转化成一个亚磷酸盐支化单元(P3)。四唑被用来耦合该P3枝到该侧氢氧根，继之以硒转化成该磷酸硒。当脱保护时，“缺陷”枝状物(红色星号)被有选择地包括以产生被离子化的基团，由此在该芯体之内集成被离子化的基团以限制聚集和增加溶解度。电位可通过改变缺陷枝状物的比率而被定制。在2-3代后，聚磷酸硒酯枝状物用有机过氧化物完全氧化，使用标准方法末端羟基被转化为用于顺氯氨铂共轭物的羧酸或用于阿霉素共轭物的腙。

[0136] 我们的初步研究确定，双核心方案可以促进合成。磷酸基可以被硒保护，否则，该磷酸盐是充分反应性的以在共轭期间分裂支臂基团；然而，在后代中，该内磷酸硒被为了脱保护氧化的后代所阻碍。为了克服这个问题，我们引入一个羧基酯核，其改进了生物降解性并缩小了空间拥挤，在该外部的磷酸盐基团氧化期间。完全地羧酸树枝状大分子已经很成熟，但如果用疏水的药物高度取代时这些不是水溶的。我们使用该抗癌药顺氯氨铂和阿霉素，因为它们是用于多种包括头和颈癌症(HNC)和乳腺癌的癌症的高效的第一线治疗。

[0137] 附图15B示出了靶向树枝状大分子的合成。该树枝状大分子的双羟丙基磷酸盐末端用丙炔酸冷凝以形成炔-树枝状大分子。可选择地，COOH或CONHNH2可以用炔丙基冷凝以形成炔-树枝状大分子。用一个“click”方法，该树枝状大分子和EGF的该叠氮化物在含水条件下耦合。该方案可被用于其他的靶向试剂如HER2抗体，EGFR抗体，PSMA，等等。

[0138] 该纳米共轭物可通过该表皮生长因子受体(EGFR)瞄准乳腺癌细胞，其被具有差预测的侵蚀性乳房癌过分表达。此外，EGFR被吞噬并可用于内在化纳米载体共轭物到EGF。尽管EGFR在下层通过其他的组织表达，该纳米载体被动定位到该淋巴管将最小化非特异的内反应。不同于全身的纳米载体，该靶向部分可改进细胞摄取，因为物理性质只身可在该淋巴结局部化阴离子纳米载体。

[0139] 表皮生长因子(EGF)是一个具有赖氨酸残留物的6054-Da蛋白质，其可被用于连接纳米微粒而不降低与细胞之间的相互作用。由于该树枝状大分子的末端基团取决于该树枝状大分子是否用于顺氯氨铂(COOH)、紫杉萜(OH)或表柔比星(C＝ONHNH2)，很容易使用一个“click”类型连接器，如此，所有的化学反应可在水溶液中实施，并作为最终步骤。EGF用叠氮基PEG-NHS酯(Quanta Biodesign Ltd.，Powell，OH)功能化。做为选择，其它的靶向试剂通过形成各自的叠氮化物可被容易的加入。炔可用DCC/DMAP试剂和炔丙醇(COOH末端)或丙炔酸(OH和C＝ONHNH2末端)加入到该树枝状大分子末端。得到的靶向性炔-树枝状大分子与含有少量铜催化剂的EGF叠氮化物混合以形成共轭物，继之以交联葡聚糖或者透渗析提纯以去除无束缚的EGF。

[0140] 11.肿瘤反应

[0141] 无胸腺的裸鼠(nu/nu mice)被用1x106细胞(MDA-MB-468LN人类乳房癌细胞)注入乳房颊脂垫，大约4周以后，一个100-200mm3的肿瘤在腋淋巴结外壳形成。动物被随机分成每组五个动物的共四个试验组：静脉注射盐水、皮下注射HA、静脉注射顺氯氨铂、或皮下注射HA-顺氯氨铂。此时，剂量给药该动物们。在HA-顺氯氨铂和HA组，HA-顺氯氨铂(3.3mg/kg，以Pt含量为基准)或HA(3.3mg/kg)被溶于100mcL盐水，被瘤周皮下注射。在顺氯氨铂和盐水组，顺氯氨铂(3.3mg/kg，Pt基)在100mcL盐水中或仅仅盐水被通过尾部静脉静脉注射。在所有的研究组，1周之后第二剂量给药。肿瘤体积使用卡尺和公式一周测量一次：体积＝0.52x(宽2*长)。当肿瘤体积超出1000mm2或身体评分指数降到2之下时，动物被无痛致死。

[0142] 附图17A-17B示出了，HA-顺氯氨铂治疗与阴性对照组相比肿瘤生长被推迟5周，和与传统的顺氯氨铂治疗相比肿瘤生长被推迟2周。

[0143] HA-顺氯氨铂配方与顺氯氨铂相比延迟肿瘤生长5周，且在HA-顺氯氨铂治疗动物中未观察到毒性。可以预期的是，HA-顺氯氨铂可能与静脉注射顺氯氨铂具有类似的效力，出乎意外的和重要的是HA-顺氯氨铂导致最初肿瘤生长较长时间的延迟，表明较高浓度的药物到达该肿瘤以在初步治疗周期内更有效地抑制肿瘤的生长。这提供了使人信服的支持性的佐证，HA-顺氯氨铂皮下给药，在该乳房癌活体内模式下，具有至少与标准顺氯氨铂配方相同或比其更好的效力。

[0144] 12.阿霉素释放

[0145] HA用乙二酰阱(ADH)冷凝，在HA中的葡萄糖酸的羧基上。首先，ADH和HA(每等量HA二糖1等量ADH)与2等量的N-3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺氢氯化物(EDAC)在水中混合，用HCl调节到pH 4.7，最终的HA浓度为大约1％w/w。在20分钟后，该混合物使用13000MWCO透析管对水透析2天。产品然后在pH 6.5的磷酸盐缓冲液(2等量HA二糖每1等量DOX)中在黑暗中被共轭到阿霉素(DOX)24小时。该混合物然后对pH6.5的磷酸盐缓冲液透析2天。在使用前，最终的材料被冷冻干燥和在盐水中重新组成。对于释放试验，重新组成的HA-DOX或DOX被置于透析管内和被放入一个包含pH 5、6.0或7.4的磷酸盐缓冲液且处于37deg C的水浴中。样品从该透析管中提取，整个剩余的药剂通过具有荧光检测器的HPLC使用标准的校准曲线确定。

[0146] 附图18表明阿霉素的释放是pH的函数。释放半衰期在pH 7.4时为167小时，pH6.0时为107小时，pH 5.0时为45小时。

[0147] HA-DOX提供了十足的持续释放，依赖于其环境的pH。它们可以提供实质的利益，如实性肿瘤的内部已知是含氧量低的和具有低的pH，由此，与正常细胞组织相比，DOX从HA-DOX的释放可在肿瘤组织内被提高。

[0148] 为了评价皮下注入鼠乳房的HA-阿霉素共轭物的效力，与静脉注射阿霉素相比，下列试验被实施。MDA-MB-468LN肿瘤细胞如所述的进入裸鼠，分成每5个动物一组的四组。3周后，HA-DOX被注入瘤周3.3mg/kg(DOX为基准)，DOX在盐水中通过尾部静脉被注入，HA被注入瘤周，盐水通过尾部静脉被注入。动物在注入5周后被给予一个第二剂量。

[0149] 附图19表明，通过纳米载体-DOX治疗，在第三和第五周两周剂量后，肿瘤生长被暂停。

[0150] 而可以预期的是，HA-阿霉素可能具有与静脉注射阿霉素相同的效力，出乎意外的和重要的是HA-阿霉素通过治疗导致肿瘤生长完整的阻止，表明较高浓度的药剂到达该肿瘤，允许它在治疗周期内更有效地的抑制肿瘤生长。这提供了有说服力的证据，HA-阿霉素皮下给药与标准的阿霉素配方相比，在活体内乳腺癌型时，在效力上是显而易见的优越的。

[0151] HA-DOX与静脉注射DOX或HA和盐水对照相比，大幅延迟了肿瘤在动物体内的生长。在注入6周后，DOX和HA和盐水对照组的肿瘤体积大于300mm3，而HA-DOX治疗组的肿瘤小于50mm3。该效应是一个惊奇，DOX-HA不仅提供有效的肿瘤生长局部化控制，而且防止了新局部的、区域的、或远的生长的出现。HA-DOX动物没有显示出由于剂量引起的任何一种毒性。HA-DOX可以提供出色的局部区域控制作为一个“提高”剂量到该肿瘤的局部区域淋巴管和细胞组织，缓慢的药剂释放也许能取代对很多多剂量的需要。另外，与静脉注射DOX相比，HA-DOX可以提供药剂持续的血浆水平，由此代替对附加全身治疗的需要。再次，持续的药剂释放可以减少重复剂量的需要。因为局部化化疗不被期望提供足够的药剂血浆水平以提供远的肿瘤控制，因此这个结果是令人惊奇的。

[0152] 13.磷酸酯透明质烷纳米载体

[0153] 附图20A举例说明一个高度水溶性的和生物可降解的磷酸酯透明质烷(phHA)纳米载体。这些纳米载体可如此处描述的被使用。

[0154] 附图20B举例说明phHA-药物共轭物的合成。phHA可被功能化以形成不稳定的具有抗癌药物顺氯氨铂(顶部)、表柔比星(中间)和紫杉萜(底部)的共轭物(例如酯或腙)。产生的复合物将保护细胞组织免于中毒直到共轭物由于吞噬容器和内生酯酶中降低的pH而释放药物为止。phHA通过AP在该淋巴管内的脱磷将促进该淋巴管内共轭物积累和持续释放药物。

[0155] HA(30-50kDa，相当于10-20nm)的羧基可被保护(例如，使用NMM/CDMT加入DMT)。HA的初级醇可被转化成一个磷酸酯(例如，使用1∶1的H3PO4和高铼酸溶液)。为了与顺氯氨铂共轭，该DMT能被给予羧酸的酸从phHA中去除。对于表柔比星和紫杉萜，DMT可被强亲核试剂如乙二酰阱(ADH)取代以允许pH敏感的不稳定的含有药物的腙形成。

[0156] phHA钠可使用初始研究HA的方法中的相同的过程与顺氯氨铂共轭，通过与顺氯氨铂(20-40％w/w)整夜的反应，并对水透渗析提纯。共轭的程度可通过石墨熔炉AAS确定。

[0157] 蒽环类(阿霉素、表柔比星和柔红霉素)可用于形成pH敏感的在结构上与阿霉素相似的共轭物，在蒽环类13-羰基和接枝酰肼之间在HA上使用腙连接器。该酰肼phHA(如上所述)可通过在pH 5培育被共轭到表柔比星，继之以透渗析提纯。

[0158] 包括紫杉萜和紫杉醇的紫杉烷类现在可以被制备成一个无聚山梨酸酯配方。这可通过形成与该纳米载体耦合的无C7的酯实现，不损害抗癌性。紫杉萜可使用一个不稳定的苹果酸连接器嫁接于紫杉萜的C2位置而被共轭到该phHA的COOH。

[0159] 14.活体内HA-顺氯氨铂的效力

[0160] HA-顺氯氨铂在活体内的效力被研究。一旦动物HNSCC肿瘤达到100mm3体积，所有的治疗即开始。着手治疗3周。所有动物的左侧颊的口腔粘膜被提供5x10^5MDA-1986细胞(这是一个我今年研究成功的新的正位的HNSCC型)，在，肿瘤在2-3周后发育。

[0161] 附图21A包括雌性无胸腺裸鼠(Nu/Nu)用自载的HA(皮下注射)、对照(盐水皮下注射)治疗的效果图，5只鼠用HA-顺氯氨铂每周剂量3.3mg/kg皮下注射3周，3只鼠用静脉注射顺氯氨铂(每周剂量3.3mg/kg静脉注射3周)。该图表明，在所有5只动物中，HA-顺氯氨铂延迟了肿瘤生长，其中2只(HA-顺3和HA-顺4)在重要参数上的速率是相似的，顺氯氨铂(对照)延迟了生长大约3周。然而在另一个3只动物中，2只动物对治疗具有完全的反应，第三只(HA-顺1)在它死前对治疗具有部分反应。总之，这显示出了在活体内治疗头和颈鳞状上皮细胞癌方面与标准静脉注射顺氯氨铂相比提高了的效力。

[0162] 为了评价该抗癌剂，特别是抗增殖性，将HA-顺氯氨铂在活体外在两个人类头和颈鳞状细胞癌细胞系(JMAR和MDA-1986)的效果与标准的CDDP相比，标准的MTS试验被按照厂商的说明规程被实施。

[0163] 一旦75％汇合，细胞被胰蛋白酶化(0.25％胰蛋白酶)，计数和放置在96-孔微量滴定板(Costar，Cambridge，MA，USA)(1X103细胞/孔)，在100L的生长培养基中。在一个整夜的粘附周期后，细胞被暴露在单独和组合的不同浓度的KU135和17-AAG中三天。所有的研究被实施三遍，独立地至少重复三次。在3天的治疗期之后，活细胞的数量用一个比色的细胞增殖试验(细胞滴定96含水非放射性的细胞增殖试验，Promega，Madison WI，USA)确定，其测量该MTS 3-[4，5-二甲基噻唑-2yl]-5-[3-羧基甲氧苯基]-2-[4-磺苯基]-2H四唑)(3-[4，5-dimethylthiazol-2yl]-5-[3-carboxymethoxyphenyl]-2-[4-sulfophenyl]-2H tetrazolium)的生物还原，通过代谢的活性细胞的脱氢酶进入可溶性甲臢染料(soluble formazon product)，在电子耦合试剂PMS(甲硫酸吩嗪)存在的条件下。为了实施该试验，在缓冲剂(0.2g/L KCl，8.0g/L NaCl，0.2g/L KH2PO4，1.15g/L，133mg/mL CaCl2-2H2O，100mg/mL，MgCl2.6H2O，pH7.35)中的包含2mg/mL MTS和150M PMS的20L MTS/PMS组合溶液被加入到每个孔，然后在37℃在一个加湿5％的CO2环境下经过3小时的培养之后，在微板读出器测量在490nm的吸光度。具有预定细胞数量的三倍的孔与试样一起经受上述试验，以标准化吸光度读取；这也提供了内在的证明，试验在测量的吸光度和细胞数量范围内是线性的。数据以％生命力从对照(细胞生命力)对药物浓度(X轴)的函数绘制。50％的细胞被阻止生长(IC50水平)的药物浓度确定为标准吸光度-浓度曲线上的折点。

[0164] 附图21B示出了细胞生命力对药物浓度的百分率曲线，对于标准顺氯氨铂对两个细胞系在72小时药物治疗之后，药物浓度从10nM到100微摩尔浓度改变。附图21C示出了细胞生命力对药物浓度的百分率曲线，对于HA-顺氯氨铂对两个细胞系在72小时药物治疗之后，药物浓度从10nM到100微摩尔浓度改变。IC50浓度从这些图中作为折点被计算，其中50％的细胞生长被抑制。值得注意的是，在CDDP和HA-顺氯氨铂之间的IC50水平在任一个细胞系中没有显著差异，表明在活体外，HA共轭物没有不利地影响顺氯氨铂抑制癌细胞生长和生命力的能力。

[0165] 15.活体内阿霉素的释放

[0166] 附图22A-22F是显示在一个鼠的右乳房颊脂垫单次注射之后HA-阿霉素分布的照片。阿霉素具有天生的荧光，该药物载体共轭物的分布和寿命可在评价期被很好的观察。值得注意的是，大部分药物载体被输送到腋淋巴结，其中，药物经过9天的间隔缓慢的释放，即使在9天之后，仍具有一些残余活性。椭圆形标记出在该乳房的注射部位，最深的浓度(红色)在腋下。

[0167] 附图23是一个显示肿瘤反应的图，即使在活体内严重的晚期乳房癌肿瘤单次晚期瘤周用HA-阿霉素治疗后。

[0168] 附图24A-24E是活体内HA-阿霉素运动的照片，在Maestro多通道荧光成像系统上成像。进入该鼠乳房的局部区域组织和淋巴结的药物和载体被很好的摄取，即使在注射4天后，其在该淋巴管内很好的停留。

[0169] 表格

[0170] 表1示出了在人类乳房癌细胞系MDA-MB-468LN、MDA-MB-231和MCF-7上的顺氯氨铂IC50的值。以顺氯氨铂相当的Pt基给出了HA载体的IC50s。

[0171] 表1

[0172]

[0173] 表2提供了3.3mg/kg静脉注射顺氯氨铂和皮下注射HA-顺氯氨铂研究组的组织AUC(平均数±SEM)和Cmax(平均数±SEM)。双向方差分析显示，研究组(顺氯氨铂和HA-顺氯氨铂)对于所有组织而言千差万别。第一血浆样品是5分钟。

[0174] 表2

[0175]

[0176]

[0177] *第一组织样品处于1小时，因此在此之前的Cmax不会被检测。

[0178] 表3示出了每个试验组组织损伤的分类，根据下列等级做出：肾，0级：正常(无症状)；1级：最小程度的坏死；2级：轻微的坏死(包括退化和核固缩)。肝，0级：正常(无症状)；1级：炎症(包括风湿性肉芽肿、微风湿性肉芽肿和肝炎)或内含物；2级：退化或坏死。腋下淋巴结，0级：正常(无症状)；1级：轻微的淋巴的增生或枯竭。病理学由一个对本研究不知情的兽医病理学家分级，每个试验组包含5只动物。

[0179] 表3

[0180]

[0181]

[0182] 表4示出了顺氯氨铂对HA的共轭效率。效率如此计算：(加入的顺氯氨铂/结合的顺氯氨铂)x 100％。

[0183] 表4

[0184]

[0185] 表5示出了顺氯氨铂和顺氯氨铂-HA的组织AUC。在皮下注射给药顺氯氨铂或顺氯氨铂-HA进入雌鼠右乳房颊脂垫之后，顺氯氨铂曲线下的区域(AUC)。

[0186] 表5

[0187]

[0188]

[0189] p＜0.05.

[0190] 表6

[0191]

[0192] 表7

[0193]