咖啡酸及其衍生物的新用途

摘要

本发明提供了咖啡酸及其衍生物在制备脑神经保护剂的药物中的用途。咖啡酸为原料结构修饰的咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯、3，4-二乙酰基咖啡酸均有明显脑神经保护活性，且咖啡酸甲酯和3，4-二乙酰基咖啡酸均可透过血脑屏障，直接到达靶器官，是较理想的脑神经保护剂候选药物。

权利要求

1.咖啡酸衍生物在制备脑神经保护剂的药物中的用途；所述的咖啡酸衍生物为咖啡酸甲酯、3,4-二乙酰基咖啡酸；所述的药物是治疗缺血性中风的药物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是由有效量的咖啡酸甲酯或

3,4-二乙酰基咖啡酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的药剂是注射制剂或口服制剂。

说明书

咖啡酸及其衍生物的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及咖啡酸及其衍生物的新用途。

背景技术

[0002] 中风病又名卒中，是以突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或不语、偏身麻木为主症，并具有起病急、变化快的特点，好发于中老年的一种疾病，是中老年人的常见多发病，严重威胁着人类的生存和健康。本病相当于西医学的缺血性脑血管病(Ischemic Cerebral vascular Disease，ICVD)，亦称缺血性卒中，具有较高的病死率及致残率，严重威胁着人类的健康和生命安全(饶明俐，林世和.脑血管疾病.人民卫生出版社，2002.172)。作为一种常见病、多发病，ICVD尤其是局限性脑梗死已经与心脏病、恶性肿瘤并列多数国家的三大致死疾病。流行病学调查发现，我国属于该病高发地区之一(陈捷.缺血性脑卒中的流行病学.实用心脑肺血管病杂志.2000，8(3)：179～181)。祖国医学认为，中风病其病位在脑，与心、肾、肝、脾密切相关，为本虚标实之证，病因病机复杂，本虚在于肝肾不足，气虚血少；标实乃肝风内动，风火相煽，火热内郁，痰湿壅盛，最终导致痰瘀内阻，随气机上逆，扰乱清空，蒙蔽清窍，成上实下虚，阴阳不相维系之危急证候。其突然昏仆不省人事之症状，又可纳入窍闭神昏之范畴。据统计，在中风的证候分类中，血瘀证为主导地位，占中风病的73％以上(陶根鱼，杜晓泉.益气活血法在缺血性中风病中的地位[J].陕西中医学院学报，1998，21(3)：1)。缺血性中风的病机虽然复杂，但归结起来，主要矛盾在于瘀血阻滞。近10年来，中、西医界对活血化瘀法治疗缺血性中风进行了深入的临床及实验研究，活血化瘀法治疗缺血性中风病的疗效已基本得到肯定，其临床报道也较多。

[0003] 在急性缺血性脑卒中(AIS)的治疗中，脑神经保护剂的作用在于减轻缺血后的细胞损害，延迟神经细胞死亡，争取时问恢复脑灌注，延长治疗时间窗。

[0004] 咖啡酸主要具有抗菌，抗病毒，中枢兴奋，解毒，凝血作用，咖啡酸及其衍生物还具有抗氧化等作用，但目前尚无咖啡酸及其衍生物用于脑神经保护剂的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明的技术方案是提供了咖啡酸及其衍生物的新用途，具体地，是在制备脑神经保护剂的药物中的用途。

[0006] 本发明提供了涉及咖啡酸及其衍生物在制备脑神经保护剂的药物中的用途。

[0007] 其中，所述的药物是治疗缺血性中风的药物。

[0008] 其中，所述的咖啡酸衍生物为咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯、3，4-二乙酰基咖啡酸。

[0009] 本发明还提供了一种脑神经保护剂，它是由有效量的咖啡酸及其衍生物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药剂。

[0010] 所述的咖啡酸及其衍生物为：咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯、3，4-二乙酰基咖啡酸。

[0011] 其中，所述的药剂是注射制剂或口服制剂。

[0012] 咖啡酸为原料结构修饰的咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯、3，4-二乙酰基咖啡酸均有明显脑神经保护活性，且咖啡酸甲酯和3，4-二乙酰基咖啡酸均可透过血脑屏障，直接到达靶器官，是较理想的脑神经保护剂候选药物。

[0013] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0014] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

[0015] 实施例1本发明药物的制备

[0016] 仪器 GC/MS-QP5050A气质联用仪(岛津公司)、SOR37傅里叶红外光谱仪(BRUKER公司)，核磁共振仪同第二章，XW-80A旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)，数显恒温水浴锅(金坛市金城国胜实验仪器厂)，R-124旋转蒸发仪(BUCHI)，SHZ-D循环水式真空泵(巩义市予华仪器厂)，YP202N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)等。

[0017] 试剂无水甲醇、无水乙醇、磷酸、乙酸酐、浓硫酸、乙酸乙酯、碳酸钙、正辛醇、碳酸氢钠等(均为分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂)，柱层析硅胶(100~200目，青岛海洋化工厂)

[0018] 试药 咖啡酸(武汉百思图精细化工有限公司，含量大于95％)。

[0019] 1咖啡酸乙酯的合成

[0020] 1.1合成原理

[0021] 由于本实验是制备低碳醇酯，所以采用咖啡酸与过量乙醇在浓硫酸催化剂存在下回流数小时，再对反应物进行分离精制的直接酯化法。合成原理如下：

[0022]

[0023] 咖啡酸乙酯结构式

[0024] 1.2实验步骤

[0025] 称取咖啡酸5.4g，置于250mL圆底烧瓶中，加无水乙醇80mL，待溶解后，加入催化剂浓硫酸0.5mL和脱水剂无水硫酸钠9g，在80℃搅拌回流6小时，然后冷却至室温，加入碳酸钙1.2g中和硫酸，回收乙醇。残留物用乙酸乙酯溶解，滤过，乙酸乙酯层用2.5％碳酸氢钠溶液洗涤3次，弃水层，乙酸乙酯层减压回收后，残留物用乙醇重结晶，得到白色结晶3.35g，收得率为53.67％。m.p.152.8-155℃；UV：λmax(methanol)220.8、242.0、326.2nm；
-1
IR(KBr)cm ：3435(νOH)，1659(νOH)，1600(ν 共 轭 C＝C)，1452(νC＝CAr)，1281(νC-H)；
1
H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.47(1H，d，J＝15.9Hz，H-7)、7.04(1H，d，J＝2.0Hz，H-2)、
7.00(1H，dd，J＝2.0，8.1Hz，H-6)、6.76(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)、6.25(1H，d，J＝15.9Hz，+
H-8)、4.15(2H，q，CH2)、1.24(3H，t，CH3)；MS m/z：208[M]、163、145、135、134、117、89。纯-1
度检测：采用HPLC法。条件：C18柱、柱温30℃、流速1mL·min 、波长330nm、流动相：甲醇-0.4％甲酸(1∶1)。用归一法测得咖啡酸乙酯含量大于98％。

[0026] 2咖啡酸甲酯的合成

[0027] 2.1合成原理

[0028] 采用咖啡酸与过量甲醇在浓硫酸催化剂存在下回流数小时，再对反应物进行分离精制的直接酯化法。合成原理如下：

[0029]

[0030]

[0031] 咖啡酸甲酯结构式

[0032] 2.2实验步骤

[0033] 称取咖啡酸5.4g，置于250mL圆底烧瓶中，加无水甲醇80mL，待溶解后，加入催化剂浓硫酸0.5mL和脱水剂无水硫酸钠9g，在80℃搅拌回流6小时，然后冷却至室温，加入碳酸钙1.2g中和硫酸，回收甲醇。残留物用乙酸乙酯溶解，滤过，乙酸乙酯层用2.5％碳酸氢钠溶液洗涤3次，弃水层，乙酸乙酯层减压回收后，残留物用甲醇重结晶，得到白色结晶4.77g，收得率为80.72％。m.p.163.8-166.0℃；UV：λmax(methano1)219.7、242.0、326.2nm；IR(KBr)cm-1：3477(νOH)，1674(νOH)，1720(νC＝O)，1607(ν共 轭C＝C)，
1445(νC ＝ C Ar)，1281(νC-H)，1242(νC-O-C)；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.48(1H，d，J＝15.9Hz，H-7)、7.05(1H，d，J＝2.0Hz，H-2)、7.00(1H，dd，J＝2.0，8.1Hz，H-6)、
6.67(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)、6.26(1H，d，J＝15.9Hz，H-8)、3.69(3H，s，CH3)；MS m/z：
194[M+]、163、145、135、134、117、89、77；纯度检测：采用HPLC法。条件：C18柱、柱温30℃、流速1mL·min-1、波长330nm、流动相：甲醇-0.4％甲酸(1∶1)。用归一法测得咖啡酸甲酯含量大于98％。

[0034] 3咖啡酸乙酰化物的合成

[0035] 3.1合成原理

[0036] 采用咖啡酸与过量乙酸酐在浓磷酸催化条件下反应(注：浓磷酸催化使酸酐的酰[60，61]氧键更易断裂，产生乙酰基，提高产率)；再对反应物进行分离精制的直接酰化法 。合成原理如下：

[0037]

[0038] 3，4-二乙酰基咖啡酸结构式

[0039] 3.2实验步骤

[0040] 称取咖啡酸3.6g，置于250mL圆底烧瓶中，加乙酸酐20mL和催化剂浓磷酸0.5mL，于60℃搅拌回流1小时，反应停止后，将反应物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取三次(100mL×3)，乙酸乙酯层用水洗涤至中性，减压回收乙酸乙酯，残留物用乙醇重结晶，得到白色结晶4.30g，收得率为81.49％。m.p.205.0-208.2℃；UV：λmax(methanol)220.8、-1
275.1nm；IR(KBr)cm ：1767(ν乙酰C＝O)，1690(ν羧酸C＝O)，1433(νC＝C Ar)，1116(ν芳
1
环C-O-C)；H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ：7.663(1H，d，J＝1.6Hz，H-2)、7.632(1H，dd，J＝
8.4，1.6Hz，H-6)、7.312(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)、7.575(1H，d，J＝16.0Hz，H-7)、6.536(1H，+
d，J＝16.0Hz，H-8)、2.289(3H，s，H-3-COCH3)、2.283(3H，s，H-4-COCH3)；MS m/z：264[M]、-1
222、180、134、77。纯度检测：采用HPLC法。条件：C18柱、柱温30℃、流速1mL·min 、波长
260nm、流动相：甲醇-0.4％甲酸(1∶1)。用归一法测得咖啡酸乙酰化物含量大于98％。

[0041] 以下通过药效试验证明本发明的有益效果。

[0042] 试验例1本发明化合物脑神经保护活性试验

[0043] 咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯、3，4-二乙酰基咖啡酸、野黄芩苷乙酯等均为自制。胰蛋白酶，II型胶原酶，胎牛血清(Gibco公司)，多聚赖氨酸，DMEM高糖培养基，四甲基偶氮唑盐(Sigma公司)，其余试剂均为国产分析纯。

[0044] SD乳鼠(出生1d内)，由成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(川)2004-11。实验观察室：成都医学院药理实验室。

[0045] 酶标仪(Multiskan MK3)，CO2孵箱(Thermo)，倒置相差显微镜(Nikon)，超纯水器(Sartorius)，LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)，LDZX-40BI型自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)等。

[0046] 1、实验步骤

[0047] 铺板：取96孔板，每孔加入0.1mg·mL-1多聚赖氨酸50μL，振荡均匀，室温静置过夜，备用。

[0048] 制备细胞悬液：将乳鼠断颈处死，75％酒精浸泡消毒，无菌条件分离大脑皮层组织，尽量除去脑血管膜，置入冰Hanks液中漂洗3次。将所获组织剪成1mm3组织块，用0.25％的胰蛋白酶+0.05％II型胶原酶37℃下消化，30min后加入培养液终止消化，用-1 -1
75μm细胞筛网滤过。将滤液1000r·min 离心8min，弃上清液。加入完全培养液(900mL·L -1 -1 -1
DMEM高糖培养基，100mL·L 胎牛血清，L-谷氨酰胺0.45g·L ，NaHCO3 3g·L ，HEPES -1 5 -1 5 -1
4.5g·L ，青霉素1×10U·L ，链霉素1×10U·L )，吸管吹打使之分散均匀制成单细胞
6
悬液。计数并调整培养液量使每mL含1×10 个细胞。

[0049] 接种培养和药物加入方法：将细胞悬液接种于经包被的96孔板中，每孔100μL培养24h后换液，72h后加入阿糖胞苷以抑制非神经细胞生长，以后每2d半量换液，第7d换液后根据实验要求，分别加入各种质量浓度梯度的各受试药物(设5个剂量组，按一定比例稀释)，每孔总体积200μL，同时加入培养液作为空白对照组继续培养。

[0050] 2、MTT微量自动比色法

[0051] 加入药物作用1d后，每孔加入MTT液(四甲基偶氮唑盐，5mg·mL-1)，继续培养4h后，去上清液，PBS液漂洗2次，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，充分振荡，室温静置10min，用酶标仪于492nm波长处测定吸收值。

[0052] 3、结果

[0053] 从表1-3中的统计结果可看出，咖啡酸、咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯在一定浓度范围内能促进大脑皮层神经细胞存活(P＜0.01)。具有较好的脑神经保护活性。

[0054] 表1咖啡酸对体外培养大脑皮层神经细胞存活的影响(X，n＝6)Tab.4-9 Eeffect of caffeic acid on rat cerebral cortex nerve cells invitro(X，n＝6)

[0055]

[0056] 表2咖啡酸酯化后对体外培养大脑皮层神经细胞存活的影响(X，n＝6)Tab.4-11 Eeffect of caffeoyl methyl ester and caffeoyl ethyl esteron rat cerebral cortex nerve cells in vitro(X，n＝6)

[0057]

[0058] 表3咖啡酸乙酰化后对体外培养大脑皮层神经细胞存活的影响(X，n＝6)

[0059] Tab.4-12 Eeffect of 3，4-diacetyl caffeic acid on rat cerebralcortex nerve cells in vitro(X，n＝6)

[0060]

[0061] 试验例2体外血脑屏障模型建立及透血脑屏障

[0062] 由于血脑屏障的存在，几乎所有大分子药物和98％的小分子药物都不能进入大脑及中枢神经系统，而药物能否跨越血脑屏障并达到有效的治疗浓度是至关重要的。为寻找和进一步分析灯盏细辛脑靶向神经保护的药效物质基础，本实验采用原代脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞共培养模型体外模拟血脑屏障。用高效液相色谱分析，在8h内不同时间点测定本发明化合物的透过率。

[0063] 1、材料与仪器

[0064] 日本岛津LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10AV紫外检测器；SCL-10A系统控制器；CBL恒温箱，N2000色谱数据工作站。氮吹仪(KL-512，北京康林科技有限责任公司)：高速离心机(centrifuge 5417c，eppendorf公司)：超声波清洗仪(AS10200，天津奥特赛恩斯仪器有限公司)

[0065] 甲醇、乙腈(Fisher公司，色谱纯)，野黄芩苷自制，以AC培养液溶解，0.22μm滤-1膜过滤后备用，制成0.2mg·mL 野黄芩苷。

[0066] 2、方法与结果

[0067] 2.1样品制备

[0068] 选择试漏实验阳性的孔进行通透性实验，向供池中加入咖啡酸、咖啡酸甲酯、咖啡-1酸乙酯、3，4-二乙酰基咖啡酸(0.2mg·mL )受池中加600μL AC培养液。在第0、1、2、4、8小时分别从受池中小心收集滤液各100μL、50μL、50μL、50μL、50μL于-20℃保存，待所有取样结束后做样品处理。其中0小时为空白对照，向供池内加入的药液为供池的起始浓度(参见图5-1)。将各样品氮气吹干(37℃)，分别向其中加入甲醇，超声处理20min，离心(5000r·min-1×10min)，取上清液，作HPLC分析供试品溶液。

[0069] 2.2HPLC分析

[0070] 色谱条件：岛津LC-10A高效液相色谱仪；色谱柱：为十八烷基硅烷键合硅胶柱，依-1利特SinoChrom ODS-BP 5μm(250×4.6mm)柱号：E1817666，流速：1mL·min ；柱温：室温；
流动相：乙腈：0.6％甲酸。检测波长为330nm。

[0071] 分别精密吸取20μL供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行检测。

[0072] 2.3透过率计算

[0073] 根据HPLC测定结果，取以下公式计算透过率。

[0074]

[0075] 其中A受池为受池样品的峰面积，A供池为供池峰面积，V受池为受池体积，V供池为供池