检测侵袭性真菌致病菌的基因芯片和试剂盒

摘要

本发明提供一种检测侵袭性致病真菌的基因芯片和试剂盒，其中基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，上述探针包含从白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的rDNA的18S-5.8S或5.8S-28S内转录间区(ITS)以及从上述九种真菌的5.8S rDNA中选取的DNA序列。利用本发明的基因芯片和试剂盒检测九种常见致病菌，操作简便，准确性高，重复性强。

权利要求

1.一种检测侵袭性真菌致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于该寡聚核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4、6-15、17-38所示。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于还包含阳性对照探针、阴性探针和荧光探针。

3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述阳性对照探针选自所述白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的5.8S rDNA序列。

4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述阳性对照探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

5.一种检测侵袭性真菌的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的基因芯片。

说明书

检测侵袭性真菌致病菌的基因芯片和试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测九种常见侵袭性致病真菌的基因芯片和检测用试剂盒。

背景技术

[0002] 近年来，由于抗生素、激素、免疫抑制剂和肿瘤放疗化疗的广泛应用，各种体内留置管、人工瓣膜等的大量使用，以及艾滋病(AIDS)的增多，侵袭性真菌感染发病率有明显上升的趋势，并且已成为危重病人死亡的重要原因之一。在美国，1990年住院患者深部真菌感染率是1980年的1.9倍，居各种病原体感染率上升之首位，2004年报道住院患者侵袭性真菌感染率是20世纪90年代的2.4倍，病死率为29％；在欧洲，1983～1997年间，侵袭性真菌感染死亡患者占所有死亡患者的5.1％，而1998～2002年间由侵袭性真菌感染导致死亡的患者占到了7.8％；在中国，北京协和医院1998年6月～1999年6月调查ICU282例患者中有53例发生深部真菌感染，感染率为18.8％，比1993年的5.6％上升了3.4倍。

[0003] 侵袭性真菌感染多发生在医院内，主要由念珠菌、隐球菌等所致。其中，念珠菌是血液系统感染的主要致病菌，由其导致的败血症病死率最高。在医学上常见的念珠菌除了最常见的白色念珠菌外，近年来随着新一代抗真菌药物的应用，光滑假丝酵母，克柔假丝酵母和热带假丝酵母等真菌造成的感染也日益增多。经研究发现，这些不同种类的假丝酵母对抗生素敏感性存在差异。念珠菌感染是一种人类的机会感染，它可以急性或慢性感染的形式发生。对口部粘膜的慢性增生性念珠菌疾病的研究是相当重要的，因为它与鳞状细胞癌的发生有关。除了表面器官损伤以外，像心脏内膜炎和食道炎，深部念珠菌感染疾病，很可能发生在免疫缺陷的个体中。

[0004] 对念珠菌的研究，很少将其鉴定到种的水平。在慢性增生性念珠菌病例中，研究仅限于通过观察病变组织中念珠菌的菌丝来辨别菌种。人们已经认识到念珠菌菌种和亚种在致病能力上存在很大差异。对念珠菌临床菌株进行鉴定和分类的传统方法包括形态学、生物化学分析、菌落形态学分析、抗性分析以及血清学分类，这些方法很费时，而且依赖表型特征，所以他们的可靠性不是很高。依靠基因的不同进行菌种检测是另一种可行的方法，基因型分析方法已被用在念珠菌菌株的分类和检测中，但是并不常用在种的分类中。

[0005] 隐球菌的主要致病类型是新型隐球菌，隐球菌感染是艾滋病常见的并发症，发生隐球菌脑膜炎后治愈率极低。隐球菌属包括许多种，其中新生隐球菌被认为是唯一的一种人类病原体。新生隐球菌首先侵入肺中，然后通过血流扩散到达大脑和脑膜。在未被HIV感染的隐球菌病患者中，特别是隐球菌引起的脑膜炎患者，经常有像红斑狼疮、肉状瘤病、白血病、淋巴瘤、库欣综合症等一系列并发症出现。新生隐球菌病是一种经常与AIDS相伴的疾病。新生隐球菌病和血清性感染迹象可以作为感染AIDS的一个判断依据。在将近45％的AIDS患者中，新生隐球菌病经常被用于诊断AIDS。肺部新生隐球菌病的患者通常是很难被诊断。诊断通常只能依靠检测肺部组织切片来完成，为了实现真菌的快速和简单的检测需要更加灵敏和特异的方法。其中一种方法是检测血清中的抗原，然而，检测新生隐球菌抗原的血清方法具有假阳性的缺点。在实验室中，诊断真菌感染经常很困难。培养从病人的尿液，血液以及唾液获得的样品经常很困难。在评价实验结果时，还要考虑到可能的污染问题。

[0006] 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括间区基因序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

[0007] 生物芯片作为一种病原体分子检测技术具有高通量、快速、准确、可靠的特点，能够实现对组群样品、多目标的同时检测，极大的提高检测效率。

发明内容

[0008] 本发明的一个目的是将基因芯片技术应用于侵袭性真菌的检测，利用生物芯片高通量、快速、灵敏、特异性好的特点，提高侵袭性真菌的检测速度、通量和灵敏度，大大降低成本，缩短检测时间。

[0009] 本发明所述的检测侵袭性真菌致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列：

[0010] a.从白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的rDNA的18S-5.8S或5.8S-28S内转录间区(ITS)、5.8S rDNA选取的一种或多种DNA序列；

[0011] b.所述a中选取的DNA序列的互补DNA序列；

[0012] c.a或b中所述的DNA序列的互补RNA序列。

[0013] 本发明的一优选实施例中，上述a中从白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的rDNA的18S-5.8S或5.8S-28S内转录间区(ITS)、5.8S rDNA选取的DNA片段具有SEQ ID NO：3-38、除去其中的5、16的核苷酸序列中的一种或多种。

[0014] 本发明所述的基因芯片，还包括阳性对照探针、阴性探针和荧光探针。

[0015] 本发明的优选实施例中，上述阳性对照探针选自上述白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的5.8S rDNA序列。

[0016] 本发明的优选实施例中，上述阳性对照探针具有SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。

[0017] 本发明所述的基因芯片可用于检测白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母或新生隐球菌。

[0018] 本发明还提供一种检测侵袭性真菌的试剂盒，其包含上述的基因芯片，具体地，该基因芯片可以包含具有SEQ ID NO：3-38、除去其中的5、16的核苷酸序列中的一种或多种的寡核苷酸探针。

[0019] 本发明所述的试剂盒可应用于检测白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母或新生隐球菌。

[0020] 由上述的技术方案可见，本发明将特异rDNA间区序列与基因芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测九种侵袭性真菌致病菌目的。

[0021] 本发明提供的检测侵袭性致病真菌的基因芯片，检测范围内的九种致病菌为白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌，以弥补针对真菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。

[0022] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

[0023] 图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图；

[0024] 图2为本发明基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图；

[0025] 图3A为利用本发明的基因芯片检测白色念珠菌时的杂交结果；

[0026] 图3B为利用本发明的基因芯片检测乳酒假丝酵母时的杂交结果；

[0027] 图3C为利用本发明的基因芯片检测热带假丝酵母时的杂交结果；

[0028] 图3D为利用本发明的基因芯片检测近平滑假丝酵母时的杂交结果；

[0029] 图3E为利用本发明的基因芯片检测克鲁斯假丝酵母时的杂交结果；

[0030] 图3F为利用本发明的基因芯片检测葡萄牙假丝酵母时的杂交结果；

[0031] 图3G为利用本发明的基因芯片检测季也蒙假丝酵母时的杂交结果；

[0032] 图3H为利用本发明的基因芯片检测新生隐球菌时的杂交结果；

[0033] 图3I为利用本发明的基因芯片检测光滑假丝酵母时的杂交结果；

[0034] 图3J为利用本发明的基因芯片检测异常毕赤酵母时的杂交结果。

具体实施方式

[0035] 实施例1 探针的设计和制备

[0036] 核糖体DNA序列存在于所有的生物体内，在进化过程中具有相同的起源与功能，可以反映物种间具有可比性的进化史。rDNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)是真核细胞rDNA中18S和28S rDNA基因拷贝区之间的一段区域，其中5.8S rDNA位于ITS1、ITS2之间。5.8SrDNA的核苷酸序列保守性很强，而ITS1和ITS2进化较快，但种间同源性非常小，而种内同源性很高，可用于种间的鉴定。

[0037] 1.序列获得：

[0038] (1)18S-28S间区基因序列的获得：从GenBank公共数据库分别下载得到白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的18S-28S间区基因序列。

[0039] (2)5.8S rDNA基因序列的获得：从GenBank公共数据库分别下载得到白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的5.8S rDNA基因序列。

[0040] 2.探针设计：

[0041] (1)特异基因探针：将上述从GenBank公共数据库下载得到的特异基因序列用序列比对软件Clustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入Primer premier5.0软件中，选取长度在20bp到30bp的DNA序列作为候选探针，分别将从GenBank上下载的真菌的间区与自己选取的DNA序列进行比对，选取发卡结构、二聚体结构及错误引发结构的ΔG＞-10kcl/mol并且Tm＝65℃±5℃的序列。

[0042] (2)阳性对照探针：将上述从GenBank公共数据库下载得到的待检测的九种菌的5.8S rDNA基因序列用序列比对软件Clustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入Primer premier 5.0软件中，选取长度在20bp到30bp的DNA序列作为候选探针，分别将从GenBank上下载的真菌的间区与自己选取的DNA序列进行比对。选取发卡结构、二聚体结构及错误引发结构的ΔG＞-10kcl/mol并且Tm＝65℃±5℃的序列。

[0043] 3.探针合成：将下表1中的探针序列的5’端延长10个T(表1所示的荧光探针序列中没有包含延长的10个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。

[0044] 4.探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。

[0045] 在本发明的一优选实施例中，选择了35条长度在25bp±5bp、Tm＝65℃±5℃的探针，并通过120次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO.16(SEQ ID NO：16)的探针序列选自的九种菌的5.8S rDNA，作为阳性对照用，编号为NO.2的探针为空白对照探针，编号为NO.5的探针为多聚T片段，用作阴性对照，编号为NO.1的探针为荧光探针，编号NO.3-NO.4的2条探针序列(SEQ ID NO：3-SEQID NO：4)选自乳酒假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO.6-NO.10的5条探针序列(SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：10)选自热带假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO.11-NO.15的5条探针序列(SEQ IDNO：11-SEQ ID NO：15)选自近平滑假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO.17-NO.20的4条探针序列(SEQ ID NO：17-SEQ ID NO：20)选自克鲁斯假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO.21-NO.23的3条探针序列(SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：
23)选自季也蒙假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO.24-NO.25的2条探针序列(SEQ ID NO：24-SEQID NO：25)选自葡萄牙假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO.26-NO.28的3条探针序列(SEQ ID NO：26-SEQ ID NO：28)选自新生隐球菌的18S-28S间区基因序列，编号NO.29-NO.35的7条探针序列(SEQ IDNO：29-SEQ ID NO：35)选自光滑假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO.36-NO.38的3条探针序列(SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：
38)选自白色念珠菌的18S-28S间区基因序列。

[0046] 表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌[0047]探针 SEQ 探针序列(5′-3′) 可检测出
编号 ID 的致病菌
Cy3_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
NO.1 NO：1 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 荧光探针
50％DMSO 空白
NO.2
TTTTTTTTTTTTTTTGATACTCGTCTC
乳酒假丝酵
GGGTTAACTTGAA 母
NO.3 NO：3
TTTTTTTTTTTTTAAGCTTGGGTCATA
乳酒假丝酵
GAGACTCATAGGT 母
NO.4 NO：4
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 阴性对照
TTTTTTTTTTT
NO.5 NO：5
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTGGCGG 热带假丝酵
GAGCAATCCTACC 母
NO.6 NO：6
TTTTTTTTACAGTCAAACTTGATTTA 热带假丝酵
TTATTACAATAGTC 母
NO.7 NO：7

[0048]TTTTTTTTTTTTCCAGAGGTTATAACT 热带假丝酵
AAACCAAACTTTT 母
NO.8 NO：8
TTTTTTTTTTTAATTTAACGTGGAAA 热带假丝酵
CTTATTTTAAGCGA 母
NO.9 NO：9
TTTTTTTTTTTTTTTTAGTGGCCACC 热带假丝酵
ACAATTTATTTCAT 母
NO.10 NO：10
TTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTGCTTGA 近平滑假丝
AAGAAAGGCGGAG 酵母
NO.11 NO：11
TTTTTTTTTTTTGCGGAGTATAAACT 近平滑假丝
AATGGATAGGTTTT 酵母
NO.12 NO：12
TTTTTTTTTTTTTTTTTCACTCATTGG 近平滑假丝
TACAAACTCCAAA 酵母
NO.13 NO：13
TTTTTTTTTTTTTTTTTGGTAGGCCTT 近平滑假丝
CTATATGGGGCCT 酵母
NO.14 NO：14
TTTTTTTTTTTATTTAATGTCAACCGA 近平滑假丝
TTATTTAATAGTC 酵母
NO.15 NO：15
TTTTTTTTTTTTTTTTAACTTTCAACA 阳性对照
ATGGATCTCTTGG
NO.16 NO：16
TTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCGGAG 克鲁斯假丝
CGGACGACGTGTAA 酵母
NO.17 NO：17
TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGAGCTGC 克鲁斯假丝
GACTCGCCTGAAAG 酵母
NO.18 NO：18

[0049]TTTTTTTTTTTTTTTTCGAGAGCGAG 克鲁斯假丝
酵母
NO.19 NO：19
TGTTGCGAGACAAC
TTTTTTTTTTTTGTGGAATATAGCATA 克鲁斯假丝
TAGTCGACAAGAG 酵母
NO.20 NO：20
TTTTTTTTTTTTTTTTGGATATTTCTG 季也蒙假丝
酵母
NO.21 NO：21
GTATTGTTGGCCC
TTTTTTTTTTTTTTTTAGTGCTGTCGA 季也蒙假丝
CCTCTCAATGTAT 酵母
NO.22 NO：22
TTTTTTTTTTTTGTGTCTTTTTGATAC 季也蒙假丝
AGAACTCTTGCTT 酵母
NO.23 NO：23
TTTTTTTTTTTTTTTGGTTAGGCGTT 葡萄牙假丝
GCTCCGAAATATCA 酵母
NO.24 NO：24
TTTTTTTTTTTTTTTTACCGCGCTGTC 葡萄牙假丝
AAACACGTTTACA 酵母
NO.25 NO：25
TTTTTTTTTTTTTTTCCTGTGAACTGT 新生隐球菌
TTATGTGCTTCGG
NO.26 NO：26
TTTTTTTTTTTTTGGTTTTATTACCTG 新生隐球菌
TTGGACTTGGATT
NO.27 NO：27
TTTTTTTTTTTTTTAGTCTTCGGCTT 新生隐球菌
GCTGATAACAACCA
NO.28 NO：28
TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTTCTCCCA 光滑假丝酵
GTGGATGCAAACA 母
NO.29 NO：29

[0050]TTTTTTTTTTTTTTGGAGGACCAGTG 光滑假丝酵
TAGACACTCAGGAG 母
NO.30 NO：30
TTTTTTTTTTTTTTTTATTTCTCCTGC 光滑假丝酵
NO.31 NO：31 CTGCGCTTAAGTG 母
TTTTTTTTTTTTTTTTTGTGCGTGGAT 光滑假丝酵
NO.32 NO：32 CTCTCTATTCCAA 母
TTTTTTTTTTTTTATCACACGACTCG 光滑假丝酵
NO.33 NO：33 ACACTTTCTAATTA 母
TTTTTTTTTTTTACTTTACTACTATTC 光滑假丝酵
NO.34 NO：34 TTTTGTTCGTTGG 母
TTTTTTTTTCAACACAAGATTTCTTT 光滑假丝酵
NO.35 NO：35 TAGTAGAAAACAAC 母
TTTTTTTTTTTTTATCAACTTGTCAC 白色念珠菌
NO.36 NO：36 ACCAGATTATTACT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGCGGGA 白色念珠菌
NO.37 NO：37 TCGCTTTGACAATG
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTTG 白色念珠菌
NO.38 NO：38 CGGCGGTAACGTC

[0051] 实施例2 通用引物的设计和制备

[0052] 1.通用引物序列：

[0053]

[0054] 2.引物合成：将上表中的引物序列委托引物合成公司(北京英俊)合成，备用。

[0055] 实施例3 基因芯片制备——芯片点样

[0056] 1.溶解探针：将实施例1中合成的探针分别溶解于50％DMSO溶液中，稀释使探针的终浓度达到1μg/μl。

[0057] 2.加板：将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10μl。

[0058] 3.点样：将如图1所示的75.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净的醛基化玻片放到芯片点样仪(SpotArray 72)的载物台上，使用SpotArray的控制软件，运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mm×4.5mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的八个点阵区内阵列排布规律相同。点阵区域尺寸3.75mm×2mm，该点阵内点间距250μm，矩阵：15×8，15×250μm＝3.75mm，8×250μm＝2mm，标准片基尺寸：75.5mm×25.5mm×1mm。

[0059] 4.干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。

[0060] 5.交联：用交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。

[0061] 由图2可见，每个点样区内为15(行)×8(列)个探针点。NO.1框区示意的位置为荧光探针，NO.16框区示意的位置为阳性对照探针，NO.2框区示意的位置为空白对照探针，NO.5框区示意的位置为负对照探针，NO.3-NO.38(除NO.5和NO.16外)为各致病菌的特异探针(对应于表1中的相应探针编号)。

[0062] 实施例4 利用基因芯片快速检测侵袭性真菌

[0063] 1.临床致病菌株的分离培养与冻存：将从医院获得的病人血样划单克隆培养，将获得的单菌落转接于BHI(脑心浸液)液体培养基进行培养。将获得的真菌培养物与甘油以850∶150的比例分装于1.5ml甘油管中，冻存于-80℃冰箱中，备用。

[0064] 2.真菌培养条件的确定

[0065] (1)应用YPD液体培养基28℃培养16小时

[0066] 配方：酵母浸膏 10g

[0067] 蛋白胨 20g

[0068] 葡萄糖 20g

[0069] 无菌水 1000ml

[0070] (2)培养菌体在甘油管取10μl菌液加入预先配制好的4ml YPD培养基中，28℃，200rpm振荡16小时培养菌体。

[0071] 3.提取基因组：

[0072] (1)取1.4ml培养液，12000rpm离心3分钟沉淀菌体，弃上清(尽量空干)；

[0073] (2)向沉淀中依次加入200ul 1.2M山梨醇缓冲液、10ul 0.5M EDTA以及30ul50mg/ml溶菌酶，37℃温育1小时；

[0074] (3)向温育后的溶液中，加入100ul 2％SDS，依次至于-80℃与65℃，间隔10分钟，反复冻融3次；

[0075] (4)加入6ul RNase A(10mg/ml)，37℃温育15分钟；

[0076] (5)加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)，37℃温育15分钟；

[0077] (6)加入等体积PCI溶液，4℃离心12000rpm 10分钟；

[0078] (7)吸上清液，加入等体积CI溶液，4℃离心12000rpm 10分钟；

[0079] (8)吸上清液，加入等体积异丙醇溶液，-40℃下放置20分钟；

[0080] (9)4℃离心12000rpm 10分钟，弃上清，用1ml 70％乙醇洗涤一次；

[0081] (10)将沉淀置于50℃烘箱至烘干；

[0082] (11)用30μl蒸馏水回溶基因组。

[0083] 4.扩增靶序列：取上述基因组提取方法提取的回溶产物，并将其稀释到100ng/μl，取1μl作为模板加入PCR反应混合液中，混合液配方如下表3所示。

[0084] 表3

[0085]

[0086] 将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

[0087] 94℃5分钟

[0088] 94℃30秒

[0089] 55℃30秒

[0090] 72℃1分钟回到第二步，共35个循环

[0091] 72℃5分钟

[0092] 4℃20小时

[0093] 5.纯化：将上述获得的PCR扩增产物合管用纯化柱(MILIPORE公司)纯化，具体步骤如下：

[0094] (1)将PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400μl。

[0095] (2)1000g室温离心15分钟，丢弃收集管。

[0096] (3)将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入28μL的超纯水(MilliQ)，室温放置5分钟。

[0097] (4)将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，1000g离心2分钟，收集产物。

[0098] 6.荧光标记PCR：取出25.5μL纯化产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示。

[0099] 表4标记混合液配方

[0100]

[0101] 将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

[0102] 94℃5分钟

[0103] 94℃30秒

[0104] 55℃30秒

[0105] 72℃1分钟回到第二步，共35个循环

[0106] 72℃5分钟

[0107] 4℃20小时

[0108] 7.烘干：将标记产物置65℃烘箱烘干。

[0109] 8.杂交：向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH2O以保持湿度。16μl杂交液(配方如下所示)回溶烘干产物并加在实施例三中制备的侵袭性致病菌检测基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片(博奥公司)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，37℃水浴锅中杂交16小时。

[0110] 9.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。

[0111] 杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)；6×SSPE

[0112] 洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS

[0113] 洗液B：0.05×SSC

[0114] 洗液C：95％乙醇

[0115] 10.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下：

[0116] 软件及版本：GenePix Pro 6.0

[0117] official name：575DF35

[0118] PMT Gain：650

[0119] 扫描分辨率：10μm

[0120] 扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式

[0121] 用本发明的基因芯片分别检测白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌时的杂交扫描结果如图3A-3G所示。

[0122] 11.分析判读：由于真菌数目较少，探针点也较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，判断出现荧光信号的特异探针的位置，根据不同真菌菌株18S-28S间区基因探针的信号可以坚定不同侵袭性真菌的存在。对照点阵排布图判断出致病菌。若只有阳性对照探针有信号，其它的探针无信号则不存在以上9种致病菌。

[0123] 实施例5 对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测

[0124] 对实施例3中制备的侵袭性真菌致病菌检测基因芯片的特异性进行鉴定如下：

[0125] 分别用26株标准菌株和47株待测的临床菌株，总计73株真菌菌株来鉴定实施例三中制备的侵袭性真菌致病菌基因芯片的特异性。所有的临床菌株已经经过测序验证。在该特异性鉴定试验中，使用的所有菌株情况见表5。利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，详见图3A-3J，均显示了正确的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有良好的特异性。

[0126] 表5：特异性试验用到的菌株

[0127]细菌名称 拉丁文 不同来源的菌 菌株总
株数目 数
a c d
白色念珠菌 Candida albicans 3，7，11 21
热带假丝酵母 Candida tropicalis 1a，14d 15
近平滑假丝酵母 Candida parapslosis 1a，10d 11
光滑假丝酵母 Candida glabrata 2a，2d 4
季也蒙假丝酵母 Candida guilliermondii 3a，1b，1d 5
乳酒假丝酵母 Candida kefyr 1a 1
克鲁斯假丝酵母 Candida krusei 4a，2d 6
葡萄牙假丝酵母 Candida lusitaniae 3a，5d 8
新生隐球菌 Cryptococcus neoformans 1d 1
异常毕赤酵母 Pichia pastoris 1d 1

[0128] a.中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)

[0129] b.中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)

[0130] c.中国医学科学院皮肤病研究所(ID)

[0131] d.临床菌株

[0132] 对实施例3中制备的食品中常见的致病菌检测基因芯片的灵敏度进行检测如下：

[0133] 该基因芯片的检测灵敏度经过50次杂交实验的验证，基因组DNA的检测灵敏度极限可以达到1pg/50μl就可保证上述九种侵袭性真菌具有稳定、良好的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有很高的检测灵敏度。

[0134] 根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。

[0135] 序列表

[0136] <110>天津生物芯片技术有限责任公司

[0137] <120>检测侵袭性真菌致病菌的基因芯片和试剂盒

[0138] <130>9P13006-CN

[0139] <160>36

[0140] <170>PatentIn version 3.3

[0141] <210>3

[0142] <211>40

[0143] <212>DNA

[0144] <213>检测乳酒假丝酵母的探针

[0145] <400>3

[0146] tttttttttt tttttgatac tcgtctcggg ttaacttgaa 40[0147] <210>4

[0148] <211>40

[0149] <212>DNA

[0150] <213>检测乳酒假丝酵母的探针

[0151] <400>4

[0152] tttttttttt tttaagcttg ggtcatagag actcataggt 40[0153] <210>5

[0154] <211>39

[0155] <212>DNA

[0156] <213>阴性对照

[0157] <400>5

[0158] tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttt 39[0159] <210>6

[0160] <211>40

[0161] <212>DNA

[0162] <213>检测热带假丝酵母的探针

[0163] <400>6

[0164] tttttttttt tttttttttg gtggcgggag caatcctacc 40[0165] <210>7

[0166] <211>40

[0167] <212>DNA

[0168] <213>检测热带假丝酵母的探针

[0169] <400>7

[0170] ttttttttac agtcaaactt gatttattat tacaatagtc 40

[0171] <210>8

[0172] <211>40

[0173] <212>DNA

[0174] <213>检测热带假丝酵母的探针

[0175] <400>8

[0176] tttttttttt ttccagaggt tataactaaa ccaaactttt 40

[0177] <210>9

[0178] <211>40

[0179] <212>DNA

[0180] <213>检测热带假丝酵母的探针

[0181] <400>9

[0182] tttttttttt taatttaacg tggaaactta ttttaagcga 40

[0183] <210>10

[0184] <211>40

[0185] <212>DNA

[0186] <213>检测热带假丝酵母的探针

[0187] <400>10

[0188] tttttttttt ttttttagtg gccaccacaa tttatttcat 40

[0189] <210>11

[0190] <211>40

[0191] <212>DNA

[0192] <213>检测近平滑假丝酵母的探针

[0193] <400>11

[0194] tttttttttt tttttttgtt tgcttgaaag aaaggcggag 40

[0195] <210>12

[0196] <211>40

[0197] <212>DNA

[0198] <213>检测近平滑假丝酵母的探针

[0199] <400>12

[0200] tttttttttt ttgcggagta taaactaatg gataggtttt 40

[0201] <210>13

[0202] <211>40

[0203] <212>DNA

[0204] <213>检测近平滑假丝酵母的探针

[0205] <400>13

[0206] tttttttttt tttttttcac tcattggtac aaactccaaa 40

[0207] <210>14

[0208] <211>40

[0209] <212>DNA

[0210] <213>检测近平滑假丝酵母的探针

[0211] <400>14

[0212] tttttttttt tttttttggt aggccttcta tatggggcct 40

[0213] <210>15

[0214] <211>40

[0215] <212>DNA

[0216] <213>检测近平滑假丝酵母的探针

[0217] <400>15

[0218] tttttttttt tatttaatgt caaccgatta tttaatagtc 40

[0219] <210>16

[0220] <211>40

[0221] <212>DNA

[0222] <213>阳性对照

[0223] <400>16

[0224] tttttttttt ttttttaact ttcaacaatg gatctcttgg 40

[0225] <210>17

[0226] <211>40

[0227] <212>DNA

[0228] <213>检测克鲁斯假丝酵母的探针

[0229] <400>17

[0230] tttttttttt ttttttttga gcggagcgga cgacgtgtaa 40

[0231] <210>18

[0232] <211>40

[0233] <212>DNA

[0234] <213>检测克鲁斯假丝酵母的探针

[0235] <400>18

[0236] tttttttttt ttttttttgg agctgcgact cgcctgaaag 40

[0237] <210>19

[0238] <211>40

[0239] <212>DNA

[0240] <213>检测克鲁斯假丝酵母的探针

[0241] <400>19

[0242] tttttttttt ttttttcgag agcgagtgtt gcgagacaac 40

[0243] <210>20

[0244] <211>40

[0245] <212>DNA

[0246] <213>检测克鲁斯假丝酵母的探针

[0247] <400>20

[0248] tttttttttt ttgtggaata tagcatatag tcgacaagag 40

[0249] <210>21

[0250] <211>40

[0251] <212>DNA

[0252] <213>检测季也蒙假丝酵母的探针

[0253] <400>21

[0254] tttttttttt ttttttggat atttctggta ttgttggccc 40

[0255] <210>22

[0256] <211>40

[0257] <212>DNA

[0258] <213>检测季也蒙假丝酵母的探针

[0259] <400>22

[0260] tttttttttt ttttttagtg ctgtcgacct ctcaatgtat 40

[0261] <210>23

[0262] <211>40

[0263] <212>DNA

[0264] <213>检测季也蒙假丝酵母的探针

[0265] <400>23

[0266] tttttttttt ttgtgtcttt ttgatacaga actcttgctt 40

[0267] <210>24

[0268] <211>40

[0269] <212>DNA

[0270] <213>检测葡萄牙假丝酵母的探针

[0271] <400>24

[0272] tttttttttt tttttggtta ggcgttgctc cgaaatatca 40

[0273] <210>25

[0274] <211>40

[0275] <212>DNA

[0276] <213>检测葡萄牙假丝酵母的探针

[0277] <400>25

[0278] tttttttttt ttttttaccg cgctgtcaaa cacgtttaca 40

[0279] <210>26

[0280] <211>40

[0281] <212>DNA

[0282] <213>检测新生隐球菌的探针

[0283] <400>26

[0284] tttttttttt tttttcctgt gaactgttta tgtgcttcgg 40

[0285] <210>27

[0286] <211>40

[0287] <212>DNA

[0288] <213>检测新生隐球菌的探针

[0289] <400>27

[0290] tttttttttt tttggtttta ttacctgttg gacttggatt 40

[0291] <210>28

[0292] <211>40

[0293] <212>DNA

[0294] <213>检测新生隐球菌的探针

[0295] <400>28

[0296] tttttttttt ttttagtctt cggcttgctg ataacaacca 40

[0297] <210>29

[0298] <211>40

[0299] <212>DNA

[0300] <213>检测光滑假丝酵母的探针

[0301] <400>29

[0302] tttttttttt tttttttagt tctcccagtg gatgcaaaca 40

[0303] <210>30

[0304] <211>40

[0305] <212>DNA

[0306] <213>检测光滑假丝酵母的探针

[0307] <400>30

[0308] tttttttttt ttttggagga ccagtgtaga cactcaggag 40

[0309] <210>31

[0310] <211>40

[0311] <212>DNA

[0312] <213>检测光滑假丝酵母的探针

[0313] <400>31

[0314] tttttttttt ttttttattt ctcctgcctg cgcttaagtg 40

[0315] <210>32

[0316] <211>40

[0317] <212>DNA

[0318] <213>检测光滑假丝酵母的探针

[0319] <400>32

[0320] tttttttttt tttttttgtg cgtggatctc tctattccaa 40

[0321] <210>33

[0322] <211>40

[0323] <212>DNA

[0324] <213>检测光滑假丝酵母的探针

[0325] <400>33

[0326] tttttttttt tttatcacac gactcgacac tttctaatta 40

[0327] <210>34

[0328] <211>40

[0329] <212>DNA

[0330] <213>检测光滑假丝酵母的探针

[0331] <400>34

[0332] tttttttttt ttactttact actattcttt tgttcgttgg 40

[0333] <210>35

[0334] <211>40

[0335] <212>DNA

[0336] <213>检测光滑假丝酵母的探针

[0337] <400>35

[0338] tttttttttc aacacaagat ttcttttagt agaaaacaac 40

[0339] <210>36

[0340] <211>40

[0341] <212>DNA

[0342] <213>检测白色念珠菌的探针

[0343] <400>36

[0344] tttttttttt tttatcaact tgtcacacca gattattact 40

[0345] <210>37

[0346] <211>40

[0347] <212>DNA

[0348] <213>检测白色念珠菌的探针

[0349] <400>37

[0350] tttttttttt ttttttttag gcgggatcgc tttgacaatg 40

[0351] <210>38

[0352] <211>40

[0353] <212>DNA

[0354] <213>检测白色念珠菌的探针

[0355] <400>38

[0356] tttttttttt tttttttttt ttgcttgcgg cggtaacgtc 40