一种凡纳滨对虾fx5微卫星DNA标记鉴定fx5遗传变异图谱的方法转让专利
申请号 : CN201010258780.1
文献号 : CN101967520B
文献日 : 2013-05-01
发明人 : 李朝政 , 吕玲 , 翁少萍 , 何建国
申请人 : 中山大学
摘要 :
一种凡纳滨对虾fx5微卫星DNA标记鉴定fx5遗传变异图谱的方法，其特征在于包括以下步骤：先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾fx5微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在fx5遗传标记基因座位的多态性图谱。本发明可快捷的获得凡纳滨对虾fx5遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方便简单，所得结果可直观检测出凡纳滨对虾每个个体的基因型。
权利要求 :
1.一种凡纳滨对虾fx5微卫星DNA标记鉴定fx5遗传变异图谱的方法，其特征在于包括以下步骤：先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾fx5微卫星DNA核心序列(TGA)m…(ATG)n, 其中m=5-10, n=5-15，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在fx5遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱。
2.根据权利要求1所述的凡纳滨对虾fx5微卫星DNA标记鉴定fx5遗传变异图谱的方法，其特征在于其PCR反应加样参数为：正反向引物各为0.2 uM, 0.2 mM dNTP, 1×PCR
2+
Buffer, 2.0 mM Mg , 0.6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul；使用该引物时设置PCR程序参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性 30秒，50℃退火1分钟，72℃延伸 1 分钟，重复这个循环35次；之后延伸5 分钟。
3.根据权利要求1所述的凡纳滨对虾fx5微卫星DNA标记鉴定fx5遗传变异图谱的方法，其特征在于对PCR产物的检测：基因组DNA模板进行PCR扩增，其产物在6%~8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥后再扫描保存图片，分析多态性，得到各个个体的基因型，并进一步确定fx5遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱。
4.根据权利要求3所述的凡纳滨对虾fx5微卫星DNA标记鉴定fx5遗传变异图谱的方法，其特征在于在PCR产物的检测中利用长度差异为50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker作为电泳的分子量标记。
说明书 :
一种凡纳滨对虾fx5微卫星DNA标记鉴定fx5遗传变异图
谱的方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济动物对虾属凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）fx5微卫星DNA标记鉴定fx5微卫星遗传变异图谱的方法。
背景技术
[0002] 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），俗称南美白对虾（Penaeus vannamei），属节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、游泳亚目（Natantia）、对虾科（Penaeidae）、对虾属（Penaeus）、Lito-penaeus 亚属，是广温广盐性热带虾类，是目前世界上三大养殖对虾（中国对虾、斑节对虾、凡纳滨对虾）中单产量最高的虾种，在对虾渔业及养殖业中占有重要地位。
[0003] 1988年7月，凡纳滨对虾由中国科学院海洋研究所从美国夏威夷引进我国，1992年8月人工繁殖获得了初步的成功，1994年通过人工育苗获得了小批量的虾苗，1999年深圳天俊实业股份有限公司与美国三高海洋生物技术公司合作，引进美SPF凡纳滨对虾种虾和繁育技术，成功地培育出了SPF凡纳滨对虾苗。至此，凡纳滨对虾在我国被广泛养殖。
[0004] 近年来，凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）在我国不论是海水，还是低盐度海水及淡水中养殖都取得了一定的进展。目前，凡纳滨对虾已是我国养殖对虾的绝对优势品种。2007年，我国凡纳滨对虾养殖产量101万吨，占我国对虾养殖产量的80 % , 同年，我国对虾养殖产量126万吨，占世界对虾养殖总产量的 37 %。但病害和养殖使得凡纳滨对虾资源迅速衰减，尤其自90年代虾病爆发以来，凡纳滨对虾养殖业受到重挫，虾病的流行使抗病品系选育成为必要和需要解决的问题。
[0005] 本发明做出之前，国内外有类似的研究报告，国内中科院海洋研究所徐鹏等（2001）发表的《中国对虾微卫星DNA的筛选》，张留所（2006）等发表的《凡纳滨对虾分子标记筛选、连锁图谱构建和QTL定位》国外Franklin Pérez等（2005）在凡纳滨对虾中找到了112对微卫星，目前，利用微卫星标记在凡纳滨对虾多态性图谱的构建、特异性遗传标记等方面的应用尚未报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的是为了简便快速的鉴定凡纳滨对虾fx5遗传标记基因座位的遗传变异图谱，丰富现有的凡纳滨对虾微卫星标记，寻找更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记，提供了一种凡纳滨对虾fx5微卫星DNA标记鉴定fx5遗传变异图谱的方法。
[0007] 本发明是通过以下方案实现的：一种凡纳滨对虾fx5微卫星DNA标记鉴定fx5遗传变异图谱的方法，其特征在于包括以下步骤：先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾fx5微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在fx5遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱（如图1所示）。
[0008] 提取凡纳滨对虾基因组DNA，将其稀释成50ng/ul，每个反应加入1ul，反应总体积为20ul。
[0009] fx5微卫星DNA序 列的特异性 引物核苷 酸序列分别 为：正 链 5’- TCTGGGACAATTTTGAGGATG -3’，负链 5’-GTCATCATCATTTCCATCTTTA -3’，退火温度为50℃。
[0010] 其PCR反应加样参数：正反向引物各为0.2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer,2+
2.0 mM Mg , 0.6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul。使用该引物的时设置PCR程序参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性 30秒，50℃退火1分钟，72℃延伸 1 分钟，重复这个循环35次；之后延伸5 分钟，4 ℃保存。
2.0 mM Mg , 0.6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul。使用该引物的时设置PCR程序参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性 30秒，50℃退火1分钟，72℃延伸 1 分钟，重复这个循环35次；之后延伸5 分钟，4 ℃保存。
[0011] PCR产物的检测：基因组DNA模板进行PCR扩增，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，利用长度差异为50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker（上海生工）作为分子量标记，扩增产物用6%-8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染系统进行检测： PCR产物中加上变性Buffer 之后95℃变性5分钟，之后立刻置于冰上降温，使用微量进样器上样5ul，85 W 恒功率电泳至溴酚兰带至胶板的底端，约120 分钟， 1‰的硝酸银染色，显色液（30 g NaOH，0.5g四硼酸钠， 8 ml 37 % 的甲醛溶解至2 L超纯水）显色，超纯水终止显色，干燥放在UTA-2100XL 型号扫描仪中扫描保存图片，分析多态性，确定各个个体的基因型，并进一步得到fx5遗传标记基因座位的多态性图谱。
[0012] 本发明适用于凡纳滨对虾种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定，分子群体遗传学，遗传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究，进一步用于辅助凡纳滨对虾分子遗传育种和养殖。
[0013] 现有的凡纳滨对虾微卫星标记还不够丰富，建立凡纳滨对虾遗传连锁图谱，物理图谱，以及QTL定位需要更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0014] （1）本发明可以简便快速的鉴定凡纳滨对虾fx5微卫星遗传标记基因座位的遗传变异图谱，方法简便，所得结果可直观的检测出凡纳滨对虾每个个体的基因型。
[0015] （2）本发明的核心是fx5微卫星DNA标记的特异性引物，其核苷酸序列为：正链5’- TCTGGGACAATTTTGAGGATG -3’，负链5’-GTCATCATCATTTCCATCTTTA -3’，退火温度为
50℃，可在凡纳滨对虾总群检测中呈现高度遗传变异的多态性。
50℃，可在凡纳滨对虾总群检测中呈现高度遗传变异的多态性。
[0016] （3）本发明主要应用于凡纳滨对虾种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定，分子群体遗传学，遗传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究。
附图说明
[0017] 图1 本发明的fx5微卫星DNA标记在60尾凡纳滨对虾个体中的基因型图谱，编号1-60为凡纳滨对虾的60个个体，M为PBR322标准分子量。
具体实施方式
实施例
[0018] 首先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾fx5微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在fx5遗传标记基因座位的多态性图谱（如图1所示）。
[0019] 1 提取凡纳滨对虾基因组
[0020] 1）取凡纳滨对虾肌肉30 mg置于2.0 ml的离心管中，剪碎，加入600 ul STE裂解缓冲液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA，pH 8.0），50 μl SDS以及5 μl蛋白酶K（20mg/ml），混匀
[0021] 2）56 ℃ 消化处理，直到裂解液澄清， 6000 rpm 离心3 min
[0022] 3）取上清，加入等体积饱和酚（250 μl）、氯仿/异戊醇（24:1）（250 μl），轻轻上下颠倒混匀数分钟，抽提去除蛋白， 10000转离心10 min
[0023] 4）取上清液，重复一次步骤3，直至水相和有机相之间无蛋白层为止
[0024] 5）取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇（500 μl），轻轻晃动20分钟，10000转离心10分钟
[0025] 6）取上清液，加入十分之一体积的 NaAc（3 mol/L，PH 值为 5.2），缓慢摇匀，加2倍体积的预冷的无水乙醇，放置于-80℃冰箱中大约30分钟，10000转离心10 min。将核酸沉淀于管底
[0026] 7）弃上清，加70 %乙醇（1 ml）洗涤沉淀,4℃ 离心5 min（8000 rpm）[0027] 8）弃酒精，将离心管放在真空干燥器中干燥沉淀，直到乙醇全部挥发[0028] 9）加入一定量（100 μl）无菌超纯水或1×TE缓冲液和5 μl RNaseA（10 mg/ml），37℃消化RNA 30 min，-20℃保存备用。
[0029] 2 微卫星引物的设计
[0030] 通过微卫星查找软件SSRHunter查找LV_ES_RA29A15f (GeneBank: FE058419.1)EST序列得到核心重复序列(TGA)m…(ATG)n, m=5-10, n=5-15，利用引物设计软件Primer Primer 5.0对上述EST序列上下游进行引物设计，得到LV_ES_RA29A15f微卫星引物，其核苷酸序列为：正链 5’- TCTGGGACAATTTTGAGGATG -3’，
[0031] 负链5’-GTCATCATCATTTCCATCTTTA -3’ ，退火温度：50℃。
[0032] 3 PCR扩增
[0033] PCR扩增的加样参数：正反向引物各为0.2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer,2+
2.0 mM Mg , 0.6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul。使用该引物的时设置PCR程序参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性 30s，50℃退火1 min，72℃延伸 1 min，重复这个循环35次；之后延伸5 min，4 ℃保存。
2.0 mM Mg , 0.6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul。使用该引物的时设置PCR程序参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性 30s，50℃退火1 min，72℃延伸 1 min，重复这个循环35次；之后延伸5 min，4 ℃保存。
[0034] 4电泳检测
[0035] PCR扩增产物用6%-8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染系统进行检测： PCR产物中加上变性Buffer 之后95℃变性5分钟，之后立刻置于冰上降温，使用微量进样器上样5ul，85 W 恒功率电泳至溴酚兰带至胶板的底端，约120 分钟， 1‰的硝酸银染色，显色液（30 g NaOH，0.5g四硼酸钠， 8 ml 37 % 的甲醛溶解至2 L超纯水）显色5min，超纯水终止显色，干燥放在UTA-2100XL 型号扫描仪中扫描，保存图片，分析多态性，得到fx5遗传标记基因座位的多态性图谱（如图1所示）。