基于乙酰胆碱酯酶化学发光生物反应器的传感器

摘要

本发明公开了一种基于乙酰胆碱酯酶化学发光生物反应器的传感器，属于农药残留分析领域和生物技术领域。反应器是一种两端用300目筛绢密封的玻璃管，其内装有固定化乙酰胆碱酯酶；所述的固定化乙酰胆碱酯酶是固定在CNBr活化的Sepharose4B上的纯化鲫鱼肌肉乙酰胆碱酯酶。反应器的应用，其特征在于：构建乙酰胆碱酯酶化学发光生物传感器，检测有机磷和氨基甲酸酯类农药。本发明提取的鲫鱼肌肉AChE具有较大的酶活性；纯化效果明显；固定化酶活回收率高；检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检出限底、分析时间短，酶反应器可重复使用。

权利要求

1.一种基于乙酰胆碱酯酶化学发光生物反应器的传感器，其特征在于：本传感器包括第1、2、3三通阀(1、2、3)，反应器(4)，第1、2恒流泵(5、6)，第1、2Y型三通(7、8)，螺旋管(9)，暗箱(10)，光电倍增管(11)、电脑(12)和废液的出口(13)；

磷酸盐缓冲溶液(a)，ATCh底物溶液(b)，2-PAM恢复剂(c)，样品(d)，铁氰化钾溶液(e)和鲁米诺溶液(f)；

磷酸盐缓冲溶液(a)和ATCh底物溶液(b)分别与第1三通阀1连通；

2-PAM恢复剂(c)和样品(d)分别与第2三通阀(2)连通；

第1三通阀(1)和第2三通阀(2)分别与第3三通阀(3)连通；

铁氰化钾溶液(e)、第2恒流泵(6)和第1Y型三通(7)前后依次连通；

鲁米诺溶液(f)、第2恒流泵(6)和第2Y型三通(8)前后依次连通；

第3三通阀(3)、反应器(4)、第1恒流泵(5)、第1Y型三通(7)、第2Y型三通(8)、螺旋管(9)和废液的出口(13)前后依次连通；

在暗箱(10)中设置有螺旋管(9)、光电倍增管(11)和废液的出口(13)；

光电倍增管(11)和电脑(12)连接；

所述的ATCh底物溶液(b)是含1mM ATCh的磷酸盐缓冲溶液，ATCh是指碘化硫代乙酰胆碱；

所述的2-PAM恢复剂(c)是含1mM 2-PAM的磷酸盐缓冲溶液，2-PAM是指解磷定。

说明书

基于乙酰胆碱酯酶化学发光生物反应器的传感器

技术领域

[0001] 本发明属于农药残留分析领域和生物技术领域，具体涉及一种乙酰胆碱酯酶化学发光生物反应器及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 有机磷农药是人类最早合成而且至今仍在广泛使用的一类杀虫剂，是我国目前使用最主要的农药之一。由于有机磷农药具有药效高、品种多、防治对象多、在环境中易降解等优点，在我国农业生产中得到大量应用，占农药总使用量的77.76％。20世纪70年代以来，有机氯农药品种相继被不同国家禁用或限制使用，以及抗有机磷农药的昆虫品种的日益增多，氨基甲酸酯类农药的使用量逐年增加。在我国，氨基甲酸酯杀虫剂也是一类很重要的杀虫剂，特别在种子处理方面得到了广泛的应用。可以预计，在一定时间内，氨基甲酸酯类杀虫剂仍将是杀虫剂领域中的一个重要组成部分。

[0003] 生态毒理学的研究表明，有机磷和氨基甲酸酯类农药的浓度与胆碱酯酶(ChE)活性的受抑制程度之间存在着良好的线性关系。因此，当我们亦可以用乙酰胆碱酯酶的活性来探测样品中是否存在这两类化合物。当样品中存在有机磷和氨基甲酸酯类农药时，它们会使乙酰胆碱酯酶催化中心中的丝氨酸残基中的羟基发生磷酸化和甲胺酰化，使乙酰胆碱酯酶彻底失去水解底物——乙酰胆碱酯的能力。

[0004] 鲫鱼(crucian)是一种经济性的淡水鱼种，在我国的江河湖泊中分布较广，它不仅做为水产品供人类享用，而且在净化水源过程中也起到一定作用。迄今为止，鲫鱼的乙酰胆碱酯酶的性质研究和对有机磷农药的敏感性研究鲜见报道。而选用鲫鱼作为AChE酶源，酶源广泛并且具有代表意义，在作为监控水体环境受有机磷和氨基甲酸酯类农药污染程度的研究领域有广泛应用。

[0005] 采用经过CNBr活化的Sepharose 4B来固定AChE。这种Sepharose 4B的末端带有-NH2基，可以与AChE末端的-COOH基共价结合，形成固定化AChE。这种固定化方法具有较高的酶活回收率。

[0006] 化学发光(Chemiluminescence，简称CL)，即化学发光物质经催化剂的催化或氧化剂的氧化后，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，可以利用发光测量仪测量光量子产率。由于具有灵敏、简便、快速和低成本等优点，近年来，化学发光分析法在农药残留分析上的研究应用备受关注。

[0007] 中国发明专利公开号101581670A的专利申请中公开了一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法。该方法首先对鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶进行提取分离、纯化，然后采用壳聚糖将鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶进行固定化，制备出固定化乙酰胆碱酯酶膜，即得乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器。但该专利存在以下不足：专利运用鲫鱼脑为酶源，但鲫鱼脑量太少，经过SephadexG-200纯化后量更少。专利采用戊二醛共价交联法固定AChE，虽然结合程度比较牢固，酶与载体之间的结合反应也能快速完成，但是戊二醛本身对AChE具有毒害作用，会对酶活回收率有很大的影响。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种基于乙酰胆碱酯酶化学发光生物反应器的传感器。

[0009] 本发明的目的是这样实现的：

[0010] 一、乙酰胆碱酯酶化学发光生物反应器

[0011] 反应器是一种两端用300目筛绢密封的玻璃管，其内装有固定化乙酰胆碱酯酶(AChE)；

[0012] 所述的固定化乙酰胆碱酯酶是固定在CNBr活化的Sepharose 4B上的纯化鲫鱼肌肉乙酰胆碱酯酶。

[0013] 二、固定化乙酰胆碱酯酶(AChE)的制备方法

[0014] 本制备方法包括下列步骤：

[0015] ①选择酶源为鲫鱼肌肉AChE

[0016] 鲫鱼肌肉AChE酶活为119.61μmol·min-1·g-1；

[0017] 鲫鱼肌肉AChE对两类农药的敏感性比较和时间-抑制率曲线绘制

[0018] 鲫鱼肌肉乙酰胆碱酯酶(AChE)为酶源，以辛硫磷、乐果、敌敌畏、毒死蜱、丁硫克百威、克百威为抑制剂，分析这几种农药的浓度对鲫鱼肌肉AChE的活性影响。另外，分析这几种农药对鲫鱼肌肉AChE的抑制时间与酶的活性影响。以农药对酶的抑制时间为横坐标，AChE的抑制率为纵坐标绘制曲线。

[0019] ②聚乙二醇(PEG)分级沉淀结合硫酸铵盐析纯化鲫鱼肌肉AChE

[0020] 经PEG分级沉淀后，8％PEG沉淀的AChE经硫酸铵盐析，再透析48h、冷冻干燥后具-1 -1有酶活为：1253.74μmol·min ·g 。

[0021] ③固定化条件选择为：固定化初始酶量7U，固定化时间为10h

[0022] 采用经过CNBr活化的Sepharose 4B来固定AChE，固定化酶对比于游离酶，其具有较好的稳定性，固定化酶活回收率为75％，固定化酶米氏常数Km＝0.3774mmol/L。

[0023] 三、乙酰胆碱酯酶化学发光生物传感器的应用

[0024] 乙酰胆碱酯酶化学发光生物反应器的应用主要是构建乙酰胆碱酯酶化学发光生物传感器(简称传感器)。该传感器可以检测有机磷和氨基甲酸酯类农药。应用此传感器检测敌敌畏、毒死蜱和丁硫克百威的检出限分别为0.279mg/kg、0.009mg/kg、0.068mg/kg，分析效率达50min/次。用2-PAM做为酶活恢复剂，可使固定化酶重复使用15次。

[0025] 本发明具有下列优点和积极效果：

[0026] 1、提取的鲫鱼肌肉AChE具有较大的酶活性，对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感；

[0027] 2、PEG分级沉淀结合硫酸铵盐析纯化纯化鲫鱼肌肉AChE纯化效果明显；

[0028] 3、固定化酶活回收率高，具有较好的稳定性；

[0029] 4、检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检出限底、分析时间短，酶反应器可重复使用。

附图说明

[0030] 图1是乙酰胆碱酯酶化学发光生物传感器的结构示意图；

[0031] 图2是本传感器原理反应方程式图；

[0032] 图3是肌肉AChE抑制率与浓度对数关系曲线；

[0033] 图4是肌肉AChE时间-抑制率曲线；

[0034] 图5不同浓度敌敌畏对固定化酶的抑制率图；

[0035] 图6不同浓度毒死蜱对固定化酶的抑制率图；

[0036] 图7不同浓度丁硫克百威对固定化酶的抑制率图。

[0037] 图中：

[0038] 1、2、3-第1、2、3三通阀；4-反应器；5、6-第1、2恒流泵；

[0039] 7、8-第1、2Y型三通；9-螺旋管；10-暗箱；11-光电倍增管；

[0040] 12-电脑； 13-废液的出口；

[0041] a-磷酸盐缓冲溶液；b-ATCh底物溶液；c-2-PAM恢复剂；d-样品；

[0042] e-铁氰化钾溶液；f-鲁米诺溶液；

[0043] A-辛硫磷；B-乐果；C-敌敌畏；D-毒死蜱；

[0044] E-丁硫克百威；F-克百威。

具体实施方式

[0045] 下面结合附图和实施例详细说明：

[0046] 一、基于乙酰胆碱酯酶化学发光生物反应器的传感器(简称传感器)

[0047] 1、总体

[0048] 如图1，本传感器包括第1、2、3三通阀1、2、3，反应器4，第1、2恒流泵5、6，第1、2Y型三通7、8，螺旋管9，暗箱10，光电倍增管11、电脑12和废液的出口13；

[0049] 还包括磷酸盐缓冲溶液a、ATCh底物溶液b、2-PAM恢复剂c、样品d、铁氰化钾溶液e和鲁米诺溶液f；

[0050] 磷酸盐缓冲溶液a和ATCh底物溶液b分别与第1三通阀1连通；

[0051] 2-PAM恢复剂c和样品d分别与第2三通阀2连通；

[0052] 第1三通阀1和第2三通阀2分别与第3三通阀3连通；

[0053] 铁氰化钾溶液e、第2恒流泵6和第1Y型三通7前后依次连通；

[0054] 鲁米诺溶液f、第2恒流泵6和第2Y型三通8前后依次连通；

[0055] 第3三通阀3、反应器4、第1恒流泵5、第1Y型三通7、第2Y型三通8、螺旋管9和废液的出口13前后依次连通；

[0056] 在暗箱10中设置有螺旋管9、光电倍增管11和废液的出口13；

[0057] 光电倍增管11和电脑12连接。

[0058] 2、功能部件

[0059] 1)第1、2、3三通阀

[0060] 三通阀1、2、3是一种常用部件。

[0061] 2)反应器4

[0062] 前述，反应器4是一种两端用300目筛绢密封的玻璃管，其内装有固定化乙酰胆碱酯酶(AChE)。

[0063] 3)第1、2恒流泵5、6

[0064] 第1、2恒流泵5、6是一种常用部件。

[0065] 4)第1、2Y型三通7、8

[0066] 第1、2Y型三通5、6是一种常用部件。

[0067] 5)螺旋管9

[0068] 螺旋管9是一种玻璃螺旋管。

[0069] 6)暗箱10

[0070] 暗箱10是一种避光的金属容器。

[0071] 7)光电倍增管11

[0072] 光电倍增管11是一种光电转换和放大的常用光学部件。

[0073] 8)电脑12

[0074] 电脑12是一种常用的可以读取检测信号的计算机。

[0075] 9)磷酸盐缓冲溶液a

[0076] 磷酸盐缓冲溶液a是0.01mol/L，pH 7.5的缓冲溶液。

[0077] 10)ATCh底物溶液b

[0078] ATCh底物溶液b是含1mM ATCh的磷酸盐缓冲溶液。

[0079] 11)2-PAM恢复剂c

[0080] 2-PAM恢复剂c是含1mM 2-PAM的磷酸盐缓冲溶液。

[0081] 12)样品d

[0082] 样品d是待检的溶液

[0083] 13)铁氰化钾溶液e

[0084] 铁氰化钾溶液e是3mM铁氰化钾水溶液。

[0085] 14)和鲁米诺溶液f

[0086] 鲁米诺溶液c是含0.6mM鲁米诺的碳酸钠-碳酸氢钠(pH＝9.52)缓冲溶液。

[0087] 3、其工作原理是：

[0088] 本传感器为了提高化学发光分析法检测农药的选择性，在充分发挥化学发光优点的前提下，运用酶抑制法的原理，如图2，引入了AChE及其底物。酶抑制活性变化，是由于生成的硫代胆碱浓度的变化，当底物(硫代乙酰胆碱)和农药随泵通过载有固定乙酰胆碱酯酶反应器后。硫代胆碱就因在鲁米诺-铁氰化钾的化学发光体系中发光而被检测。农药通过反应器的化学发光强度之间的前后差异与农药浓度是相关的。从而可以扩大化学发光检测农残的应用范围。为了在不更换固定化酶的情况下，使传感器连续工作，本传感器将使用复活剂2-PAM对样品测定后失活的固定化酶进行恢复。

[0089] 根据农药通过反应器的化学发光强度之间的前后差异，其抑制率可以使用公式计算：

[0090]

[0091] 其中I为基线发光强度；I0为没有通过农药时的发光强度；I1为通过农药后的发光强度；

[0092] 以标准品农药的负对数浓度做横坐标，抑制率做纵坐标，绘制标准曲线，然后将样品的抑制率代入标准曲线方程得到样品浓度。以抑制率5％对应的浓度作为传感器的检出限。

[0093] 4、传感器的应用结果

[0094] 应用此传感器检测敌敌畏、毒死蜱和丁硫克百威的检出限分别为0.279mg/kg、0.009mg/kg、0.068mg/kg，分析效率达50min/次。用2-PAM做为酶活恢复剂，可使固定化酶重复使用15次。

[0095] 5、传感器的操作方法

[0096] ①打开第1、2恒流泵5、6，调整第1、3三通阀1、3，使磷酸盐缓冲溶液a、3mM铁氰化钾溶液e和0.6mM鲁米诺溶液f分别通过管道，调节光电倍增管11的负高压为400V，基线开始记录，发光强度为I；

[0097] ②调整第1三通阀1，将磷酸盐缓冲溶液a被替换为含有1mM ATCh的磷酸盐缓冲溶液b，底物注入时间为70s，然后重新注入磷酸盐缓冲溶液a。记录的化学发光强度最低值将相当于非抑制反应的发光强度I0；

[0098] ③停止第2恒流泵6，调整第2、3三通阀2、3，使磷酸盐缓冲溶液a被替换为样品d，注入时间为20min，然后调整第1、3三通阀1、3，重复第①、②步骤，记录的化学发光强度最低值将相当于抑制反应的发光强度I1；

[0099] ④恢复酶活，停止第2恒流泵6，调整第2、3三通阀2、3，使2-PAM恢复剂c通过反应器4，持续15min。

[0100] ⑤检测下一个样品；

[0101] ⑥待检测结束后用清水冲洗管道。

[0102] 二、固定化乙酰胆碱酯酶(AChE)的实验

[0103] 1、实验试剂

[0104] 在下面的实施例中如果没有特别说明，试验所用的试剂均来自下面注明的信息和厂商：

[0105] 考马斯亮蓝试剂盒(G-250) 南京建成生物工程研究所；

[0106] 碘化硫代乙酰胆碱(ATCh) Sigma公司；

[0107] 5，5-二硫代双硝基苯甲酸(DTNB) Sigma公司；

[0108] 牛血清蛋白冻干粉 Roche公司进口分装；

[0109] Triton X-100 Amresco公司；

[0110] CNBr Activated Sepharose 4B Amresco公司进口分装；

[0111] 80％敌敌畏乳油 湖北沙隆达股份有限公司；

[0112] 40％辛硫磷乳油 安徽美科达农化有限公司；

[0113] 40％乐果乳油 江苏腾龙生物药业有限公司；

[0114] 40％毒死蜱乳油 河北益海安格诺农化有限公司；

[0115] 10％丁硫克百威 青岛瀚生生物科技股份有限公司；

[0116] 3％克百威 浙江天一农化有限公司；

[0117] 碳酸钠 国家集团化学试剂有限公司[0118] 碳酸氢钠 国家集团化学试剂有限公司[0119] 铁氰化钾 天津市塘沽区德华化学试剂厂[0120] 鲁米诺 Sigma公司；

[0121] 解磷定(2-PAM) Sigma公司；

[0122] 抗坏血酸 国家集团化学试剂有限公司[0123] n-溴代丁二酰亚胺(NBS) 国家集团化学试剂有限公司[0124] 2、实验过程

[0125] 1)AChE酶源的选择

[0126] (1)酶的提取

[0127] 取驯养过的活鲫鱼10条，选取背部肌肉，以滤纸吸去血丝部分，于表面皿中称重，-1称重后按W/V为1∶5的比例与含有1％Triton X-100的0.1mol·L 磷酸缓冲液(pH值
8.0)混合。在冰浴条件下，用玻璃匀浆器充分匀浆后，装入离心管中置于高速冷冻离心机-1
在4℃条件下10000r·min 离心30min，取上清液，即得粗酶液，记录体积并在4℃下保存备用。

[0128] 测定鲫鱼肌肉AChE粗酶液的比酶活为119.61μmol·min-1·g-1；

[0129] (2)鲫鱼肌肉AChE对两类农药的敏感性比较

[0130] 将不同浓度的农药使用液加入到酶液试管中，然后按照测酶活的方法测定吸光度，计算酶活及其抑制率(与零浓度处理相比)。由图3中可见：鲫鱼肌肉AChE对不同种类农药具有较好的敏感性。

[0131] (3)鲫鱼肌肉AChE对两类农药的时间-抑制率曲线绘制

[0132] 将0.5mL 10μg/mL的不同农药使用液加入到酶液试管中，测定酶活并计算抑制率，然后做出时间-抑制率曲线。从图4可见，随着抑制时间的延长，这6种农药对肌肉AChE活性抑制率逐渐增加；并且对肌肉AChE的抑制率达到最大值的时间为12min。

[0133] 根据鲫鱼肌肉AChE对农药的的敏感性和时间-抑制率曲线结果，说明可以运用鲫鱼肌肉AChE作为酶源，且肌肉对比于脑来说，原料更加充足。因此最终选定鲫鱼肌肉AChE作为以后研究中的酶源。

[0134] 2)PEG分级沉淀结合硫酸铵盐析纯化纯化鲫鱼肌肉AChE

[0135] 取肌肉AChE粗酶液，加入50％(w/v)PEG储备液，逐步使PEG终浓度为3％，8％、16％和24％，依次冰浴静置30min。4℃10000g离心10min，沉淀部分为组分1、2、3和4。将各组分加入55％的硫酸铵，放置3h后10000g离心10min，将沉淀用少量的缓冲液溶解，放入透析袋中，4℃透析48h，再冷冻干燥，分别测定比酶活。结果表明组份2具有最高酶活，可-1 -1
达1253.74μmol·min ·g 。这也为进一步纯化AChE奠定了很好的基础。

[0136] 3)鲫鱼肌肉AChE的固定化

[0137] 称取0.1g经CNBr活化的Sepharose 4B，用10mL浓度为1mmol/L的盐酸溶液溶胀20min后，用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)洗脱盐酸。将溶胀好的凝胶加入到总酶活7U的酶液中，然后用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)定容到4mL。在4℃下振荡(150r/min)若10小时后，，依次用3.5％的NaCl溶液和蒸馏水清洗数次，最后加入3mL含
0.02％NaN3的磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝8.0)，于4℃下保存。

[0138] 固定化酶活回收率可达75％，固定化酶米氏常数Km＝0.3774mmol/L。

[0139] 4)标准曲线的建立

[0140] (1)敌敌畏农药标准曲线的建立

[0141] 分别配置0.2，0.6，1，5，10，50μg·mL-1的敌敌畏标准液50mL，按传感器的操作方法分别进行测定，以农药的负对数浓度做横坐标，抑制率做纵坐标，绘制标准曲线，如图5，得标准曲线方程为y＝18.33652x+15.15948，相关系数RW＝0.9886。

[0142] (2)毒死蜱农药标准曲线的建立

[0143] 分别配置0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，20μg·mL-1的毒死蜱标准液50mL，加入0.5mLNBS(0.4g/L)，反应5min后再加入0.5mL抗坏血酸(4g/L)，然后按传感器的操作方法分别进行测定，以农药的负对数浓度做横坐标，抑制率做纵坐标，绘制标准曲线，如图6，得
2
标准曲线方程为y＝16.72842x+39.16171，相关系数R ＝0.9829。

[0144] (3)丁硫克百威农药标准曲线的建立

[0145] 分别配置0.05，0.2，0.6，1，5，10μg·mL-1的丁硫克百威标准液50mL，按传感器的操作方法分别进行测定，以农药的负对数浓度做横坐标，抑制率做纵坐标，绘制标准曲线，2
如图7，得标准曲线方程为y＝14.16133x+21.5044，相关系数R ＝0.9851。