本发明公开一种葡萄串状微囊体系及其制备方法。它是在ACA微囊形成后，取半量继续交联壳聚糖形成ACAC，再与剩余的ACA混合通过静电吸引力自组装而形成的一个葡萄串状体系。该体系的形成没有添加微囊成分以外的化学物质，具有与原单个的微囊相同的稳定性、通透性和生物相容性。使用该微囊体系取代原来分散的微囊进行体内原位或者异位移植时，可以在微囊理化和生物相容性不变的情况下使微囊聚集在一起，避免游走分散、阻塞嵌顿脉管系统，也有利于对植入体内的微囊观察和回收。
1.一种葡萄串状微囊体系，包括海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊和海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖微囊，其特征在于海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖微囊的第四层膜壳聚糖通过静电引力与海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊外层的海藻酸钠相互交联自组装形成。
2.如权利要求1所述的一种葡萄串状微囊体系，其特征在于葡萄串状微囊体系可以根据实际需要，通过将不同数目的微囊交联自组装而调节大小。
3.如权利要求1或2所述的一种葡萄串状微囊体系的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）、海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊制备
海藻酸钠溶液在高压静电环境下通过微囊发生仪滴入氯化钙溶液中形成微球；
磷酸盐缓冲液洗涤后使用壳聚糖对微球进行交联；再用磷酸盐缓冲液洗涤后，加入海藻酸钠溶液形成海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠实心微球，柠檬酸钠溶液洗涤去核，即得海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊；
（2）、海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖微囊制备
取步骤（1）所得的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊的半量继续交联壳聚糖，磷酸盐缓冲液洗涤后，形成海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖微囊；
将步骤（2）所形成的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖微囊的第四层膜壳聚糖通过静电引力与步骤（1）剩余的半量海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊外层的海藻酸钠通过静电引力相互交联自组装，形成海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖微囊体系即葡萄串状微囊体系。
4.如权利要求3所述的一种葡萄串状微囊体系的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊制备中：
重量体积比浓度为0.1%海藻酸钠溶液在高压静电环境下，通过高压微胶囊脉冲成型仪设定U=60，f=90，PW=6和微囊发生仪以滴速=90mm/h滴入0.1M氯化钙溶液中形成微球；
磷酸盐缓冲液洗涤后使用重量体积比浓度为0.5%的壳聚糖对微球进行交联；再用磷酸盐缓冲液洗涤一次后，加入重量体积比浓度为0.15%的海藻酸钠溶液形成海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠实心微球，55mmol/L柠檬酸钠溶液洗涤5分钟去核，即得海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊；
所述步骤（2）海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖微囊微囊制备中：取步骤（1）所得的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊的半量继续交联重量体积比浓度为0.15%的壳聚糖5分钟，磷酸盐缓冲液洗涤一次，形成海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖微囊微囊。
5.如权利要求1或2所述的一种葡萄串状微囊体系作为包裹药物、生物活性酶或者细胞的应用。
6.如权利要求1或2所述的一种葡萄串状微囊体系作为包裹肝细胞的应用。
一种葡萄串状微囊体系及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种微囊交联改性后自组装构成的葡萄串状体系微囊及其制备方法。
背景技术
[0002] 微囊是具有半通透性特征的移植载体。其半通透膜通过阻止囊外免疫球蛋白、酶、免疫细胞等进入，可以有效保护其内包裹的药物、生物活性酶或者细胞；还可以使囊内包裹的或者合成分泌的小分子活性物质自由移出而发挥治疗作用。不同的使用途径对微囊的要求各不相同。微囊包裹药物口服时主要为了避免首过效应、掩盖药物原有气味、防止药物提前被酶消化等。选用稳定性良好、可以阻止大分子物质通过的微囊即可。微囊包裹生物活性酶血管移植时，需要微囊足够小、相互之间不粘连和良好的通透性、稳定性、免疫隔离。微囊包裹细胞后直径一般为300-600μm，因体积太大而无法进行血管植入，其移植途径常为原位或者异位入各个体腔或者皮下。此时不仅需要微囊具有良好的通透性、稳定性和免疫隔离作用，还需要避免微囊游走分散。微囊在体腔内或者皮下四处游走时容易堵塞脉管系统、降低局部药物浓度，并且回收困难、不利于后续研究，目前对此类问题尚无解决方法。
发明内容
[0003] 为了克服微囊移植后因相互之间分散、游走和回收研究障碍, 本发明对微囊交联改性后自组装形成一种微囊体系而取代原来的散在单个微囊。该微囊体系使得原单个微囊相互附着结合成葡萄串状，有效避免单个微囊散布体腔、堵塞脉管系统，并且不影响微囊的其他特性。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
[0005] 葡萄串状微囊体系，是由海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)微囊继续交联壳聚糖形成海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖(ACAC)微囊，ACAC微囊的第四层膜壳聚糖再与ACA微囊外层的海藻酸钠通过静电引力自组装而构成。
[0006] 上述的葡萄串状微囊体系的制备方法包括如下步骤：
[0007] （1）、ACA微囊制备
[0008] 海藻酸钠溶液在高压静电环境下通过微囊发生仪滴入氯化钙溶液中形成微球；
[0009] 磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后使用壳聚糖对微球进行交联；再用PBS洗涤后，加入海藻酸钠溶液形成海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)实心微球，柠檬酸钠溶液洗涤去核，即得ACA微囊；
[0010] （2）、ACAC微囊制备
[0011] 取步骤（1）所得的ACA微囊的半量继续交联壳聚糖，PBS洗涤后，形成ACAC微囊；
[0012] （3）、葡萄串状微囊体系制备
[0013] 将步骤（2）所形成的ACAC微囊的第四层膜壳聚糖通过静电引力步骤（1）剩余的半量ACA微囊外层的海藻酸钠通过静电引力相互结合自组装，形成ACA-ACAC微囊体系即葡萄串状微囊体系。
[0014] 单个微囊包裹细胞后直径一般为300-600μm；本发明的葡萄串状微囊体系可以根据实际需要，通过将不同数目的微囊交联自组装而调节大小。
[0015] 本发明所得的一种葡萄串状微囊体系可作为包裹药物、生物活性酶或者细胞的应用，例如奥美拉唑、氯霉素、血红蛋白、胰岛细胞和肝细胞等，特别是包裹肝细胞的应用。
[0016] 本发明的有益效果
[0017] 本发明的葡萄串状微囊体系的制备方法，可以在保证微囊原有功能的同时，改变微囊在体内易游走分散、位置不确定、易堵塞脉管并且难以回收的缺点；微囊体系甚至可以模拟实体脏器的框架结构，更加明确地发挥所包裹的内容物的功能。
附图说明
[0018] 图1是ACA微囊图。
[0019] 图2是ACAC微囊图。
[0020] 图3是ACA-ACAC微囊体系图。
[0021] 图4是ACA微囊包裹细胞图。
[0022] 图5是ACAC微囊包裹细胞图。
[0023] 图6-8是ACA-ACAC微囊体系包裹细胞图。
具体实施方式
[0024] 下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述，但并不限制本发明。
[0025] 实施例1
[0026] 制备葡萄串状微囊体系
[0027] （1）、ACA微囊制备
[0028] 0.1%（wt/v）海藻酸钠溶液在高压静电环境下（U=60，f=90，PW=6：高压静电微胶囊成型仪，上海理工大学）通过微囊发生仪（滴速=90mm/h）滴入0.1M氯化钙溶液中形成微球；磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后使用0.5%（wt/v）壳聚糖对微球进行交联；PBS洗涤一次，加入
0.15%（wt/v）海藻酸钠溶液形成海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)实心微球；55mmol/L柠檬酸钠溶液洗涤5分钟去核。
[0029] （2）、ACAC微囊制备
[0030] 取半量ACA微囊继续交联0.15%（wt/v）壳聚糖5分钟，PBS洗涤一次，形成ACAC微囊。
[0031] （3）、葡萄串状微囊体系制备
[0032] ACAC微囊与ACA微囊混合，通过外层壳聚糖的静电引力自组装，形成ACA-ACAC微囊体系，所形成的葡萄串状微囊体系作为移植细胞的载体。
[0033] 图1是步骤（1）所得的ACA微囊图；图2是步骤（2）所得的ACAC微囊图；图3是步骤（3）所得的ACA-ACAC微囊体系即葡萄串状微囊体系图。从图1、图2中可以看出ACA微囊和ACAC微囊均单个散发，而图3显示ACA-ACAC微囊体系成葡萄串状，从而说明海藻酸钠与壳聚糖之间的静电引力可以有效地将两种散发微囊自组装成一个整体体系。
[0034] 应用实施例1
[0035] 葡萄串状微囊体系包裹细胞的应用
[0036] （1）、海藻酸钠-细胞悬液
[0037] 将分离培养好的总量约1×106个小鼠原代肝细胞500rpm、5min离心，弃上清；0.1%（wt/v）海藻酸钠溶液1ml混合沉淀细胞；
[0038] （2）、包裹细胞的ACA微囊
[0039] 混合肝细胞的海藻酸钠溶液在高压静电环境下（U=60，f=90，PW=6：高压静电微胶囊成型仪，上海理工大学）通过微囊发生仪（滴速=90mm/h）滴入0.1M氯化钙溶液中形成微球；磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后使用0.5%（wt/v）壳聚糖对微球进行交联；PBS洗涤一次，加入0.15%（wt/v）海藻酸钠溶液形成海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)实心微球；55mmol/L柠檬酸钠溶液洗涤5分钟去核，即得包裹细胞的ACA微囊；
[0040] （3）、包裹细胞的ACAC微囊
[0041] 将半量包裹细胞的ACA微囊继续交联0.15%（wt/v）壳聚糖5分钟，PBS洗涤一次，形成包裹细胞的ACAC微囊；
[0042] （4）、包裹细胞的ACA-ACAC微囊体系
[0043] 将上述包裹细胞后的ACAC微囊与ACA微囊混合，通过外层壳聚糖的静电引力自组装，形成包裹细胞的ACA-ACAC微囊体系。
[0044] 图4是步骤（2）所得的包裹细胞的ACA微囊图；图5是步骤（3）所得的包裹细胞的ACAC微囊图；图6-8是步骤（4）所得的包裹细胞的ACA-ACAC微囊体系，即包裹细胞的葡萄串状微囊体系图。从图4、图5中可以看出包裹细胞后的ACA和ACAC微囊均呈均匀的散发状态；图6-8显示包裹细胞后的单个散发微囊相互自组装结合成葡萄串状体系，从而说明在包裹内容物情况下，本发明可以有效地促使微囊体系化。
[0045] 以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所做的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
