一种超高麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂

摘要

一种超高麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂，属于淀粉糖生成技术和微生物基因工程技术领域。用本发明提供的真菌a-淀粉酶RoAmy，以各种植物淀粉质为原料，淀粉乳经耐高温酸性a-淀粉酶液化后，冷却至55-65℃，调整pH为4.5-6.5，加入真菌a-淀粉酶RoAmy，保温30-60小时，制得65%-75%的超高麦芽糖浆；所用真菌a-淀粉酶RoAmy，其基因来源于米根霉，通过基因工程手段获得重组的真菌a-淀粉酶RoAmy。本发明还提供了RoAmy基因用酵母进行高效制备的方法。用真菌a-淀粉酶RoAmy对淀粉进行糖化获得超高麦芽糖浆，与传统的超高麦芽糖制备方法相比较，具有工艺简单，成本低廉，利于放大等优点。

权利要求

1.一种利用真菌a-淀粉酶RoAmy制备超高麦芽糖浆的方法，其特征在于：以植物淀粉质为原料，利用真菌a-淀粉酶RoAmy进行糖化而直接获得超高麦芽糖浆；工艺为：

1）液化：在质量浓度为10%-30%、pH为4.5-6.5的淀粉乳中加入耐高温酸性a-淀粉酶，酸性a-淀粉酶用量为2-8 LU/g干淀粉，于95-105℃液化10-25分钟，135℃灭酶5分钟，DE值控制在1-8之间；

2）糖化：液化后冷却至55-65℃，加入真菌a-淀粉酶RoAmy，用量为4-15 U/g干淀粉，糖化30-60小时，经脱色、离子交换、真空浓缩，得到质量浓度65%-75%的超高麦芽糖浆，其中葡萄糖含量为7%-13%，几乎不含麦芽三糖和其它低聚糖；

所述真菌a-淀粉酶RoAmy是通过基因工程手段构建重组体细胞实现来源于米根霉ATCC 9363的一种真菌a-淀粉酶基因的过量表达，其基因编码为：SEQ ID NO: 1。

说明书

一种超高麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂

技术领域

[0001] 本发明涉及一种超高麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂，更详细地说是涉及一种超高浓度麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂的基本特性和制备方法，属于淀粉糖生成技术和微生物基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 麦芽糖浆是以淀粉质为原料，经酶、或酸与酶结合的方法水解而成的以麦芽糖为主的糖浆，根据麦芽糖的含量不同大致可以分为饴糖（麦芽糖含量20%-30%）、高麦芽糖浆（麦芽糖含量40%-60%）、超高麦芽糖浆（麦芽糖含量大于65%）和结晶麦芽糖等。

[0003] 高麦芽糖浆的甜度低而温和，可口性强，在高温和酸性条件下比较稳定，具有熬煮温度高、不易发生美拉德反应等优点。在食品行业，对面包、糕点、烘焙食品等加工过程具有防止淀粉老化、保湿、延长保质期等作用；在蜜饯、方便食品、酱油、糖果、口服液、保健饮品、麦乳精、冷冻食品等食品行业作为营养甜味剂、填充剂得到广泛应用；在医药行业，可添加至多种中药中使用，具有润肺、补虚、止咳、治疗腰痛等作用。此外，超高麦芽糖浆在加氢氢化后可生成麦芽糖醇，麦芽糖醇是一种甜度和蔗糖相当而热量值较低的甜味剂，也是制备另一种功能性食品原料麦芽糖酮糖和低聚异麦芽糖的原料。

[0004] 目前，欧美各国大多采用真菌a-淀粉酶（结合b-淀粉酶和普鲁兰酶）做为糖化剂来生产高麦芽糖浆，得到的麦芽糖浆其组成中麦芽糖占40%-60%，麦芽三糖约10%-20%，其它为葡萄糖及其它低聚糖和糊精等。对超高麦芽糖浆的生产，在糖化过程中则需要b—淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶或麦芽糖生成酶等酶制剂的协同作用。

[0005] 目前，国内外在制备高麦芽糖浆的过程中所使用的真菌a-淀粉酶均为米曲霉(A.oryzae)所生产，使用此酶的缺点是必须结合其它酶种一起使用，且在所制备的高麦芽糖浆中仍含有较高浓度的麦芽三糖（约10%-20%）。在超高麦芽糖浆生产中，糖化过程中必须有多种酶制剂协同作用，工艺复杂。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种制备超高麦芽糖浆的方法及其专用酶制剂的基本特性和制备方法，以达到简化超高麦芽糖浆制备工艺的目的。

[0007] 本发明提供的一种制备超高麦芽糖浆的方法，是能以多种淀粉质（大米淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉）为原料，经液化后通过单一酶种进行糖化，直接制备超高麦芽糖浆，麦芽糖含量可达65%-75%。

[0008] 本发明提供的一种专用酶制剂的制备方法，是一种特殊的真菌a-淀粉酶RoAmy，通过基因工程手段从米根霉（ATCC9363）基因组中获得真菌a-淀粉酶RoAmy编码基因，并在黑曲霉菌株或酵母菌株中实现过量表达，通过微滤、超滤等手段获得液态酶制剂。

[0009] 本发明的技术方案：一种制备超高麦芽糖浆的专用酶制剂真菌a-淀粉酶RoAmy，其通过基因工程手段构建重组体细胞实现来源于米根霉（ATCC9363）的一种真菌a-淀粉酶基因的过量表达，其基因编码为：SEQ ID NO: 1。

[0010] 一种利用所述真菌a-淀粉酶RoAmy制备超高麦芽糖浆的方法，以植物淀粉质为原料，利用真菌a-淀粉酶RoAmy进行糖化而直接获得超高麦芽糖浆；工艺为：

[0011] 1）液化：在质量浓度为10%-30%，pH为4.5-6.5的淀粉乳中加入耐高温酸性a-淀粉酶，酸性a-淀粉酶用量为2-8 LU/g干淀粉，于95-105℃液化10-25分钟，135℃灭酶5分钟，DE值控制在1-8之间；

[0012] 2）糖化：液化后冷却至55-65℃，加入真菌a-淀粉酶RoAmy，用量为4-15 U/g干淀粉，糖化30-60小时，经脱色、离子交换、真空浓缩，得到质量浓度65%-75%的超高麦芽糖浆，其中葡萄糖含量为7%-13%，几乎不含麦芽三糖和其它低聚糖。

[0013] 本发明提供的一种专用酶制剂真菌a-淀粉酶RoAmy的制备方法包括以下步骤：

[0014] （1）使用反转录PCR试剂盒提取米根霉（ATCC9363，“Lactate and Ethanol Productions by Rhizopus oryzae ATCC 9363 and Activities of Related Pyruvate Branch Point Enzymes” JOURNAL of BIOSCHENCE AND BIOENGINEERING Vol 102，No.5，464-466，2006.已公开）菌丝组织总RNA并扩增得到大小为1.4 kb的RoAmy 基因的cDNA片段，回收并克隆入pMD19（大连宝公司），在大肠杆菌JM 109中构建得到重组质粒pMD-RoAmy，提取重组质粒并使用T-载体通用引物测序，获得淀粉酶的编码基因序列：SEQ ID NO: 1。

[0015] 其中ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。

[0016] 根据以上核苷酸序列，获得该淀粉酶氨基酸组成为：SEQ ID NO: 2。

[0017] 该淀粉酶由462个氨基酸组成，从蛋白质一级结构分析，该蛋白质前20个氨基酸为信号肽序列，成熟肽含有三个糖基化位点Asn和淀粉酶所具有的四个典型的保守区域：Asp Val Val Ala Asn His、Asp Gly Leu Arg Ile Asp Thr Val Lys His Val、Gly Glu Val Leu Ser和Phe Ile Asp Asn His Asp。

[0018] （2）将该淀粉酶编码基因插入表达载体（pPIC9K-RoAmy），通过电转化方式导入相应的表达宿主（黑曲霉或酵母菌株）中得到相应的重组体细胞；

[0019] （3）对重组体细胞进行发酵，发酵液经微孔滤膜过滤去除菌体，微滤液再通过超滤膜浓缩，以制备真菌a-淀粉酶RoAmy。

[0020] 本发明的有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下特点：

[0021] 1、本发明在制备超高麦芽糖浆过程中，在糖化步骤中只使用一种真菌a-淀粉酶RoAmy，麦芽糖浓度可达65%-75%，几乎不含有麦芽三糖和其它低聚糖，与常规超高麦芽糖浆的制备工艺相比，不需要其它酶制剂的协同作用，具有工艺简单、生产成本低等特点。

[0022] 2、本发明中提供了一种特殊的米根霉来源的真菌a-淀粉酶RoAmy的制备方法，通过该酶制剂将淀粉质糖化后，可直接制备超高麦芽糖浆，且产物中几乎不含有麦芽三糖和其它低聚糖，与传统麦芽糖浆制备工艺中使用的米曲霉来源的真菌a-淀粉酶相比，具有麦芽糖生成能力强，产物相对单一等特点。

附图说明

[0023] 图1：酵母表达真菌a-淀粉酶RoAmy的表达载体；

[0024] 图2：重组酵母表达真菌a-淀粉酶RoAmy的蛋白质电泳图谱；

[0025] 图3：重组真菌a-淀粉酶RoAmy的最适反应温度；

[0026] 图4：重组真菌a-淀粉酶RoAmy的最适反应pH；

[0027] 图5：重组真菌a-淀粉酶RoAmy的热稳定性测定；

[0028] 图6：重组真菌a-淀粉酶RoAmy的pH稳定性测定。

具体实施方式

[0029] 实施例1：超高麦芽糖浆的制备

[0030] 液化：将100千克玉米淀粉，调制成浓度为10%-30%的淀粉乳，调整pH为4.5-6.5，加热至95-105℃，添加耐高温酸性a-淀粉酶，淀粉酶用量为2-8 LU/g干淀粉，液化10-25分钟，135℃灭酶5分钟，控制DE值在1-8之间；

[0031] 糖化：液化后冷却至55-65℃，加入真菌a-淀粉酶RoAmy，用量为4-15 U/g干淀粉，期间使用高压液相色谱（HPLC）法测定葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖生成量，糖化30-60小时后，经脱色、离子交换、真空浓缩至浓度70%-80%，制得125-140千克麦芽糖含量为65%-75%的超高麦芽糖糖浆。

[0032] 实施例2：真菌a-淀粉酶RoAmy的克隆

[0033] 提取米根霉组织总RNA，以如下寡核苷酸为引物：

[0034] 上游引物: 5'-ATCATGAAGTCTTTCTTAAGTCTCCTTTGCA-3',

[0035] 下游引物: 5'-CTGCCCGGGTTATTTCTTTTGGAA-3'

[0036] 使用反转录PCR试剂盒扩增得到大小为1.4 kb的RoAmy基因的cDNA片段，回收并克隆入pMD19，在大肠杆菌JM109中构建得到重组质粒pMD-RoAmy，提取重组质粒并使用T-载体通用引物测序，确定RoAmy 基因cDNA序列，为SEQ ID NO:1。

[0037] 实施例3：酵母表达真菌a-淀粉酶RoAmy载体的构建

[0038] 以重组质粒pMD-RoAmy 为模板，以如下寡核苷酸为引物

[0039] 上游引物: 5'-ATCATGAAGTCTTTCTTAAGTCTCCTTTGCA-3',

[0040] 下游引物: 5'-CTGCCCGGGTTATTTCTTTTGGAA-3'

[0041] 使用高保真DNA聚合酶（PfuDNA polymerase）扩增得到RoAmy 基因片段，回收RoAmy 基因片段，以平端方式正向插入pPIC9K载体（来自Invitrogen公司）的SnaBI位点，得到酵母表达载体pPIC9K-RoAmy。

[0042] 实施例4：表达真菌a-淀粉酶RoAmy重组酵母的构建

[0043] 接种毕赤酵母菌株Pichia pastoris GS115（来自Invitrogen公司）于100 mL YEPD 培养基中，培养至OD600=1.5，离心收集菌体并使用冰预冷的无菌水洗涤两次，再使用冰预冷的1 M 山梨醇洗涤两次。离心后使用0.3 mL 冰预冷的1 M 山梨醇悬浮置于冰上，作为感受态细胞备用。

[0044] 提取重组质粒pPIC9K-RoAmy，使用StuI酶切线性化，使用质粒纯化试剂盒纯化酶切产物。取2-10 mL纯化后的线性化质粒加入50 mL感受态细胞，冰上放置5-10分钟后使用BTX电转化仪电击，条件为7.5 Kv，25 mF，10 ms。电击后立即加入1 mL预冷的1 M 山梨醇，取200 mL涂布MD培养基（1.34%YNB，2%葡萄糖），30℃培养至转化子出现。挑取转化子并点种至MD-G418培养基（在MD培养基中加入抗生素G418至终浓度为5 mg/mL），30℃培养48小时后分别点种至MMS-G418培养基（1.34%YNB，0.5%甲醇，0.5%可溶性淀粉），培养48小时后使用稀碘液染色，选取生长情况良好并具有较强透明圈形成能力的菌落进行产真菌a-淀粉酶RoAmy摇瓶发酵实验，以进一步筛选淀粉酶高产菌株。

[0045] 实施例5：重组真菌a-淀粉酶RoAmy的制备

[0046] 通过摇瓶发酵筛选出一株高表达真菌a-淀粉酶RoAmy的重组酵母，在15 L气升式发酵罐中发酵，种子及发酵用培养基成分为：1%酵母膏，2%蛋白胨，1%-4%甘油，接种量为6%-10%。发酵过程中，温度控制在28-30℃，pH控制在5.5-6.0，通过控制溶氧（≥20%）调整甲醇流加速度，以诱导重组淀粉酶表达。发酵至100-140小时结束发酵。收集发酵液，经
0.45 mm微孔滤膜除去酵母菌体，经10 kDa超滤膜浓缩，制备获得重组真菌a-淀粉酶RoAmy制品。

[0047] 实施例6：重组真菌a-淀粉酶RoAmy酶学特性研究

[0048] 重组酶的最适反应温度

[0049] 将重组酶稀释至合适浓度，在0.04 M，pH 5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲体系中，分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃温度下测定酶活力，计算相对酶活力确定酶反应最适温度。在该反应条件下测定得到重组酶的最适反应温度为60℃。

[0050] 重组酶的最适反应pH

[0051] 将重组酶稀释至合适浓度，在50℃温度下，分别在0.04 M 甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 3.0、3.5），0.04 M柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），0.04 M Tris-盐酸缓冲液（pH 7.0、7.5、8.0）中进行酶活力测定，计算相对酶活力，确定该酶的最适反应pH为4.5-6.5。

[0052] 重组酶热稳定性测定

[0053] 用0.04 M，pH 5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液将重组酶稀释至合适浓度，分别在40、50、55、60、70℃温度下保温0-20分钟，立即取出冰上放置30分钟后测定酶活力，计算相对酶活力确定该酶的热稳定性，发现该酶在55℃以下相对比较稳定。

[0054] 重组酶pH稳定性测定

[0055] 分别使用0.2 M 甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 3.0、3.5），0.2 M柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），0.2 M Tris-盐酸缓冲液（pH 7.0、7.5、8.0）将重组酶稀释至合适浓度，在50℃温度下保温20分钟，立即取出冰上放置30分钟，使用0.2 M柠檬酸-磷酸盐缓冲液稀释10倍后测定酶活力，计算相对酶活力确定该酶的pH稳定性，发现该酶在pH 5.0-6.0之间稳定性较好。

[0056] 实施例7：重组真菌a-淀粉酶RoAmy与商品真菌a-淀粉酶水解淀粉产麦芽糖的比较

[0057] 使用0.04 M，pH 5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制2%玉米淀粉乳，煮沸糊化后冷却至50℃，分别取1 mL糊化淀粉并分别加入0.1 U真菌a-淀粉酶RoAmy及0.1 U商品真菌a-淀粉酶，于50℃温度下保温10-20 h，使用高压液相色谱（HPLC）法测定产物中各组分比例。

[0058] 表1

[0059]

[0060] 如表1所示，当使用真菌a-淀粉酶RoAmy水解时，随着水解时间的延长，反应液中麦芽三糖量逐渐减少至消失，同时麦芽糖量逐渐积累；当使用商品真菌a-淀粉酶水解时，随着水解时间的延长，反应液中麦芽三糖量出现增加趋势，但是麦芽糖量逐渐减少，同时有大量葡萄糖生成。

[0061] 序 列 表

[0062] <110> 江苏锐阳生物科技有限公司

[0063] <120> 一种超高麦芽糖浆的制备方法及其专用酶制剂

[0064] <160> 4

[0065] <170> PatentIn version 3.3

[0066] <210> 1

[0067] <211> 31

[0068] <212> DNA

[0069] <213> 人工序列

[0070] <400> 1

[0071] atcatgaagt ctttcttaag tctcctttgc a 31[0072] <210> 2

[0073] <211> 24

[0074] <212> DNA

[0075] <213> 人工序列

[0076] <400> 2

[0077] ctgcccgggt tatttctttt ggaa 24[0078] <210> 3,SEQ ID NO:1

[0079] <211> 1389

[0080] <212> DNA

[0081] <213> 米根霉

[0082] <220>

[0083] <221> gene

[0084] <222> (1)..(1389)

[0085] <400> 3

[0086] atgaagtctt tcttaagtct cctttgcagc gtcttccttt tacccttagt cgtacaatct 60[0087] gtgcctgtca tcaagcgagc ctcggccagc gactgggaga acagagtcat ttaccaattg 120[0088] ttaactgatc gatttgcaaa atcgactgat gataccaatg gctgctctaa cctgagtgat 180[0089] tactgtggcg gaacatttca aggaatcatt aatcacttgg attacattgc cggaatggga 240[0090] tttgatgcta tctggatatc acctatcccc aaaaatgtga atggaggtta ccatggctat 300[0091] tgggcttctg acttttctca aataaatgag cattttggaa ctgctgatga cttgaaaaag 360[0092] ttggttgcgg ctgctcatgc aaagaacatg tacgttatgc tggacgttgt tgctaatcat 420[0093] gctggcactc cttcatcagg cggcgactat tctggctaca cgttcggtca aagctctgaa 480[0094] taccacagag cctgtgatat caattacaac gaccagaact ctattgaaca gtgctggatt 540[0095] tctggtttgc ctgatatcaa cactgaagac tcggccattg ttagcaaatt gaattcgatt 600[0096] gtttctggtt gggtatctga ctatggcttt gatggtcttc gaatcgatac tgtgaagcac 660[0097] gttcgtaaag atttctggga tggttatgtc tctgctgctg gtgtatttgc taccggagaa 720[0098] gtgcttagcg gcgatgtttc ttatgtctca ccctatcagc agcatgttcc ttctttaatc 780[0099] aactatccat tgtattatcc agtctatgat gtattcacca aatcccgtac catgagccgt 840[0100] ttaagttctg gcttttctga tattaaaaat ggaaacttta aaaacattga tgtcttggtc 900[0101] aactttattg acaatcacga tcaacctcgc ttgttatcca aagctgatca aagtctcgtc 960[0102] aagaatgctc ttgcttattc tttcatggtc caaggtatcc ctgtcttgta ctatggtaca 1020[0103] gagcaatctt tcaagggtgg taacgatcca aacaacagag aggtcttatg gaccactggt 1080[0104] tactcgacca cgtctgatat gtacaagttt gtcactactc ttgtcaaggc acgcaagggc 1140[0105] tcaaactcca cagtaaatat gggaattgct caaaccgata acgtctatgt gttccaaaga 1200[0106] ggcggctctc tggttgttgt caacaactat ggtcaaggat caacaaacac aattactgta 1260[0107] aaggctggct cgttctctaa tggagatact ttgactgatg tgttctccaa caaatctgtt 1320[0108] actgttcaaa ataatcagat cacattccaa ttgcagaatg gaaaccctgc catattccaa 1380[0109] aagaactaa 1389[0110] <210> 4,SEQ ID NO:2

[0111] <211> 462

[0112] <212> PRT

[0113] <213> RoAmy

[0114] <220>

[0115] <221> preprotien

[0116] <222> (1)..(462)

[0117] <400> 4

[0118] Met Lys Ser Phe Leu Ser Leu Leu Cys Ser Val Phe Leu Leu Pro [0119] 1 5 10 15

[0120] Leu Val Val Gln Ser Val Pro Val Ile Lys Arg Ala Ser Ala Ser [0121] 20 25 30[0122] Asp Trp Glu Asn Arg Val Ile Tyr Gln Leu Leu Thr Asp Arg Phe [0123] 35 40 45[0124] Ala Lys Ser Thr Asp Asp Thr Asn Gly Cys Ser Asn Leu Ser Asp [0125] 50 55 60[0126] Tyr Cys Gly Gly Thr Phe Gln Gly Ile Ile Asn His Leu Asp Tyr [0127] 65 70 75[0128] Ile Ala Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro [0129] 80 85 90 [0130] Lys Asn Val Asn Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Ser Asp Phe [0131] 95 100 105[0132] Ser Gln Ile Asn Glu His Phe Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Lys [0133] 110 115 120[0134] Leu Val Ala Ala Ala His Ala Lys Asn Met Tyr Val Met Leu Asp [0135] 125 130 135[0136] Val Val Ala Asn His Ala Gly Thr Pro Ser Ser Gly Gly Asp Tyr [0137] 140 145 150[0138] Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Gln Ser Ser Glu Tyr His Arg Ala Cys [0139] 155 160 165[0140] Asp Ile Asn Tyr Asn Asp Gln Asn Ser Ile Glu Gln Cys Trp Ile[0141] 170 175 180[0142] Ser Gly Leu Pro Asp Ile Asn Thr Glu Asp Ser Ala Ile Val Ser[0143] 185 190 195[0144] Lys Leu Asn Ser Ile Val Ser Gly Trp Val Ser Asp Tyr Gly Phe[0145] 200 205 210[0146] Asp Gly Leu Arg Ile Asp Thr Val Lys His Val Arg Lys Asp Phe[0147] 215 220 225[0148] Trp Asp Gly Tyr Val Ser Ala Ala Gly Val Phe Ala Thr Gly Glu [0149] 230 235 240 [0150] Val Leu Ser Gly Asp Val Ser Tyr Val Ser Pro Tyr Gln Gln His [0151] 245 250 255 [0152] Val Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Leu Tyr Tyr Pro Val Tyr Asp [0153] 260 265 270 [0154] Val Phe Thr Lys Ser Arg Thr Met Ser Arg Leu Ser Ser Gly Phe [0155] 275 280 285 [0156] Ile Ser Asp Lys Asn Gly Asn Phe Lys Asn Ile Asp Val Leu Val [0157] 290 295 300[0158] Asn Phe Ile Asp Asn His Asp Gln Pro Arg Leu Leu Ser Lys Ala [0159] 305 310 315[0160] Asp Gln Ser Leu Val Lys Asn Ala Leu Ala Tyr Ser Phe Met Val [0161] 320 325 330[0162] Gln Gly Ile Pro Val Leu Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Ser Phe Lys [0163] 335 340 345[0164] Gly Gly Asn Asp Pro Asn Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Gly [0165] 350 355 360[0166] Tyr Ser Thr Thr Ser Asp Met Tyr Lys Phe Val Thr Thr Leu Val [0167] 365 370 375[0168] Lys Ala Arg Lys Gly Ser Asn Ser Thr Val Asn Met Gly Ile Ala [0169] 380 385 390[0170] Gln Thr Asp Asn Val Tyr Val Phe Gln Arg Gly Gly Ser Leu Val [0171] 395 400 405[0172] Val Val Asn Asn Tyr Gly Gln Gly Ser Thr Asn Thr Ile Thr Val [0173] 410 415 420[0174] Lys Ala Gly Ser Phe Ser Asn Gly Asp Thr Leu Thr Asp Val Phe[0175] 425 430 435[0176] Ser Asn Lys Ser Val Thr Val Gln Asn Asn Gln Ile Thr Phe Gln[0177] 440 445 450[0178] Leu Gln Asn Gly Asn Pro Ala Ile Phe Gln Lys Asn

[0179] 455 460 462