用于阿胶真伪鉴别的组合物、试剂盒、方法及应用转让专利
申请号 : CN201010526977.9
文献号 : CN101974635B
文献日 : 2012-02-29
发明人 : 陈颖 , 吴亚君 , 王斌 , 韩建勋 , 张海亮
申请人 : 中国检验检疫科学研究院
摘要 :
本发明涉及用于阿胶真伪鉴别的组合物，所述组合物包含寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于阿胶真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用本发明的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于阿胶真伪鉴别的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明还涉及本发明的特异性寡核苷酸引物及探针在鉴别阿胶真伪中的应用。使用本发明的PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地鉴别阿胶的真伪。
权利要求 :
1.用于实时荧光PCR方法鉴别阿胶真伪的组合物，所述组合物包含驴特异性寡核苷酸引物对和探针，其中所述驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2，所述驴探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
2.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含马特异性寡核苷酸引物对和探针，所述马特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.4，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.5，所述马探针的碱基序列为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
3.用于实时荧光PCR方法鉴别阿胶真伪的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的组合物。
4.阿胶真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求1或2所述的组合物或权利要求3所述的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测方法，其中所述实时荧光PCR检测方法为Taqman荧光探针法。
6.权利要求1或2所述的组合物或权利要求3所述的试剂盒在鉴别阿胶真伪中的应用。
说明书 :
用于阿胶真伪鉴别的组合物、试剂盒、方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于阿胶真伪鉴别的包含寡核苷酸引物及探针的组合物，用于鉴别阿胶真伪的实时荧光PCR检测方法，以及阿胶的特异性寡核苷酸引物和探针在鉴别阿胶真伪中的应用。
背景技术
[0002] 阿胶在中国有数千年的食用历史，具有补血止血，滋阴养虚的功效。它是驴皮熬制后形成的一种特殊中药材，主要成分为胶原蛋白。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能保证产品的营养功效。从产品特征上看，阿胶是驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。正品阿胶性状特征呈长方形块、方形块或丁状、块形平整，大小一致，边角整齐，表面为黑褐色，有光泽，质硬而脆、易断，碎片对光照视呈棕色半透明状，断面光亮无油孔、气孔。砸碎后放入杯中，加沸水适量3～5min胶块即可溶化，胶液澄清，无异物。尝之味淡微甘，气清香。除了块状固体阿胶，阿胶产品还包括阿胶口服液、阿胶颗粒及其他含有阿胶的制品。从原料生物分类学上看，驴(Equus asinus)属于奇蹄目马科驴属，包括非洲野驴、藏野驴、中亚野驴、家驴等品种。其中中国饲养的家驴包括华北驴、西南驴、新疆驴、庆阳驴、淮阳驴、泌阳驴、广灵驴、晋南驴、关中驴等众多地方种。
[0003] 目前市场上存在大量通过非法渠道获得的假冒伪劣阿胶产品，其原料主要来自猪、马、牛等动物的皮、骨、结缔组织等。这些伪品的存在严重干扰了市场正常秩序，损害消费者利益，影响正规产品的信誉。为了取缔和预防假冒伪劣阿胶产品，需要质量监管部门加大执法力度，而首要前提是要具备科学可靠的检测方法。
[0004] 目前报道的阿胶鉴别方法主要依靠感官检测，包括阿胶的色泽，切面纹理，水溶性，气味或风味等。但感官指标容易带来判断不准确、缺乏足够说服力等情况。
[0005] 聚合酶链式反应(PCR)是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。PCR方法已用于多种多样的基因检测中。实时荧光PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析，使PCR技术从定性水平发展到定量水平。近几年，在分子生物学研究中，利用定量PCR对基因表达结果进行检测，获得了应用。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性、并能有效地减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应用于各个领域。
[0006] 近年国内有科研机构开展了PCR-RFLP方法的研究，但检测对象无法直接针对阿胶产品。因为阿胶在制作过程中，经过高温煮沸等高强度处理，DNA降解严重，很难扩增出长片段PCR产物。这种情况非常不利于对市场阿胶产品的监管。
[0007] 因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的保健品阿胶的真伪检测方法。
发明内容
[0008] 本发明的一个目的在于，提供快速鉴别阿胶真伪的特异性寡核苷酸引物及探针。
[0009] 本发明的另一个目的在于，提供快速鉴别阿胶真伪的实时荧光PCR检测方法。
[0010] 本发明的再一个目的在于，提供用于快速鉴别阿胶真伪的试剂盒。
[0011] 本发明的再一个目的在于，提供本发明的特异性寡核苷酸引物和探针在鉴别阿胶真伪中的应用。
[0012] 针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0013] 本发明的发明人根据驴细胞色素b基因，设计了能够特异性地鉴别阿胶真伪的驴特异性寡核苷酸引物对和探针，能够从阿胶产品提取的DNA中高效扩增出一
段较短的驴特异性基因片段。根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于鉴别阿
胶真伪的驴特异性寡核苷酸引物对及探针，所述引物对及探针是根据线粒体细胞色
素b序列在驴属与其他属、科、目动物的差异以及我国饲养的家驴不同地方种之间的
基因序列保守性特点而设计的，所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引
物为cytbDON-F：actttggctccctcctagga(SEQ ID No.1)，所述下游引物为cytbDON-R：
gtgtatggctaggaataggc(SEQ ID No.2)；所述探针为cytbDON-Pb：5’atctgcctaatcctccaaatcctaac3’(SEQ ID No.3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方式中，本发明于提供鉴别阿胶真伪的组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物对和探针。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于实时荧光PCR方法鉴别阿胶真伪的组合物，所述组合物包含驴特异性寡核苷酸引物对及探针，其中所述驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
根据本发明的另一个实施方案，本发明的用于阿胶真伪鉴别的组合物还进一步包含马特异性寡核苷酸引物对和探针。优选地，在本发明的组合物中，所使用的马特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为cytbHOR-F：acttcggctccctcctagg(SEQ ID No.4)，所述下游引物为cytbHOR-R：gtgtatggctaggaataggc(SEQ ID No.5)；所述探针为cytbHOR-pb：5’atctgcctaatcctccaaatcttaac3’(SEQ ID No.6)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
段较短的驴特异性基因片段。根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于鉴别阿
胶真伪的驴特异性寡核苷酸引物对及探针，所述引物对及探针是根据线粒体细胞色
素b序列在驴属与其他属、科、目动物的差异以及我国饲养的家驴不同地方种之间的
基因序列保守性特点而设计的，所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引
物为cytbDON-F：actttggctccctcctagga(SEQ ID No.1)，所述下游引物为cytbDON-R：
gtgtatggctaggaataggc(SEQ ID No.2)；所述探针为cytbDON-Pb：5’atctgcctaatcctccaaatcctaac3’(SEQ ID No.3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方式中，本发明于提供鉴别阿胶真伪的组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物对和探针。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于实时荧光PCR方法鉴别阿胶真伪的组合物，所述组合物包含驴特异性寡核苷酸引物对及探针，其中所述驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
根据本发明的另一个实施方案，本发明的用于阿胶真伪鉴别的组合物还进一步包含马特异性寡核苷酸引物对和探针。优选地，在本发明的组合物中，所使用的马特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为cytbHOR-F：acttcggctccctcctagg(SEQ ID No.4)，所述下游引物为cytbHOR-R：gtgtatggctaggaataggc(SEQ ID No.5)；所述探针为cytbHOR-pb：5’atctgcctaatcctccaaatcttaac3’(SEQ ID No.6)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
[0014] 根据本发明的另一个实施方案，本发明提供鉴别阿胶真伪的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用驴特异性寡核苷酸引物对和探针，所述引物对是根据线粒体细胞色素b序列在驴属与其他属、科、目动物的差异以及我国饲养的家驴不同地方种之间的基因序列保守性特点而设计的。在一个实施方案中，在本发明的阿胶真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法中，所使用的驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，所述PCR扩增条件是95℃，10min；95℃15s；60℃，1min，50个循环。优选地，本发明所使用的实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。
[0015] 本发明的实时荧光PCR检测方法进一步包括使用马特异性寡核苷酸引物对和探针。针对马和驴同科，较难区分，目前采用的RFLP方法无法直接检测阿胶产品等问题，本发明根据马细胞色素b基因中与驴靶序列相同的位置，设计了马特异性寡核苷酸引物对和探针，能够通过实时荧光PCR方法高效扩增马特异性基因片段，从而更准确地鉴别阿胶的真伪。在本发明的鉴别阿胶真伪的实时荧光PCR方法中，所使用的马特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为SEQ ID No.4，所述下游引物为SEQ ID No.5，所述探针为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，所述PCR扩增条件是95℃，10min；95℃15s；60℃，1min，50个循环。
[0016] 在一个实施方案中，本发明的阿胶实时荧光PCR检测方法还进一步包括提取样品总DNA和确定特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限的步骤。在一个实施方案中，所述实时荧光PCR检测方法检测出驴成分的检测限为大于0.05pg/μL，优选为0.024pg/μL。
[0017] 根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于快速鉴别阿胶真伪的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于实时荧光PCR方法鉴别阿胶真伪的驴特异性寡核苷酸引物对以及探针和使用说明书。在本发明的试剂盒的优选实施方案中，本发明的驴特异性寡核苷酸引物对是根据线粒体细胞色素b序列在驴属与其他属、科、目动物的差异以及我国饲养的家驴不同地方种之间的基因序列保守性特点而设计的。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中包含的驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ IDNo.2；所述试剂盒中包含的驴探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在驴探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于快速鉴别阿胶真伪的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于实时荧光PCR方法鉴别阿胶真伪的驴特异性寡核苷酸引物对和探针、马特异性寡核苷酸引物对和探针以及使用说明书。在试剂盒的一个优选实施方案中，所述试剂盒中包含驴特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和驴探针SEQ ID No.3，马特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和马探针SEQ ID No.6，在驴探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM，且在马探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速鉴别阿胶真伪的PCR扩增的条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是：95℃，10min；95℃15s；60℃，1min，40个循环。在一个具体的实施方案中，本发明的用于阿胶真伪鉴别的试剂盒还包括标准品和对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。
[0018] 根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的驴特异性寡核苷酸引物对和探针在鉴别阿胶真伪中的应用。在根据本发明的应用的优选实施方案中，所述驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的试剂盒在鉴别阿胶真伪中的应用。优选地，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的驴特异性寡核苷酸引物对和探针。更优选地，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的驴特异性寡核苷酸引物对和探针以及马特异性寡核苷酸引物对和探针。
[0019] 实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此可以实时监控整个PCR反应过程，并最终检测出待测样品的初始拷贝数，从而可检测待测阿胶成分。
[0020] 本发明的实时荧光PCR检测方法采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。本发明的方法巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本发明的实时荧光PCR检测方法，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上阿胶真伪的检测。
附图说明
[0021] 图1显示实时荧光PCR特异性检测驴成分的结果，其中使用驴特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.1和探针SEQ ID No.3检测，荧光曲线编号与样品对应如下：1：驴；3：马；5：牛；7：猪；9：羊；11：鹿；13：鸡；15：鸭；17：鱼；19：大豆；21：玉米；23：空白对照；荧光曲线2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24分别为上述样品依次重复1次，图1中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
[0022] 图2显示实时荧光PCR特异性检测马成分的结果，其中使用马特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5和探针SEQ ID No.6检测，荧光曲线编号与样品对应如下：1：马；3：驴；5：牛；7：猪；9：羊；11：鹿；13：鸡；15：鸭；17：鱼；19：大豆；21：玉米；23：空白对照；荧光曲线2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24分别为上述样品依次重复1次，图2中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
[0023] 图3是检测驴特异性寡核苷酸引物和探针组合的灵敏度的结果，进行实时荧光PCR扩增的DNA溶液的浓度依次为30pg/μL、6pg/μL、1.2pg/μL、0.24pg/μL、0.05pg/μL和0.01pg/μL，各浓度一式三份重复检测，其中荧光曲线编号与浓度对应如下：1、2、3：30pg/μL；4、5、6：6pg/μL；7、8、9：1.2pg/μL；10、11、12：0.24pg/μL；13、14、15：0.05pg/μL；16、17、18：0.01pg/μL；19、20、21：空白对照，图3中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
[0024] 图4是检测马特异性寡核苷酸引物和探针组合的灵敏度的结果，进行实时荧光PCR扩增的DNA溶液的浓度依次为300pg/μL、60pg/μL、12pg/μL、2.4pg/μL、0.5pg/μL、0.1pg/μL，各浓度一式三份重复检测，其中荧光曲线编号与浓度对应如下：1、2、3：300pg/μL；4、5、6：60pg/μL；7、8、9：12pg/μL；10、11、12：2.4pg/μL；13、14、15：0.5pg/μL；16、
17、18：0.1pg/μL；19、20、21：空白对照，图4中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
17、18：0.1pg/μL；19、20、21：空白对照，图4中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
[0025] 图5是以马、驴为例，确定驴特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限，用马DNA将驴DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中驴DNA含量分别为150pg、30ng、6ng、1.2pg、0.25pg、0.05pg，各浓度一式二份重复检测，其中荧光曲线编号与浓度对应如下：1、
2：150pg；3、4：30ng；5、6：6ng；7、8：1.2pg；9、10：0.25pg；11、12：0.05pg；13、14：空白 对照，图5中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
2：150pg；3、4：30ng；5、6：6ng；7、8：1.2pg；9、10：0.25pg；11、12：0.05pg；13、14：空白 对照，图5中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
[0026] 图6是以马、驴为例，确定马特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限，用驴DNA将马DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中马DNA含量分别为1.5ng、300pg、60pg、12pg、2.5pg、1pg，各浓度一式二份重复检测，其中荧光曲线编号与浓度对应如下：1、2：
1.5ng；3、4：300pg；5、6：60pg；7、8：12pg；9、10：2.5pg；11、12：1pg；13、14：空白对照，图6中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
1.5ng；3、4：300pg；5、6：60pg；7、8：12pg；9、10：2.5pg；11、12：1pg；13、14：空白对照，图6中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
[0027] 图7是7份市售阿胶样品(样品1-7)驴成分检测结果，使用驴特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.1和探针SEQ ID No.3检测，其中在每个样品的检测中，均使用驴阳性对照和空白对照；各目标样品一式十份重复检测，在样品1-7的实时荧光PCR图形中荧光曲线1、2、3为驴阳性对照，4-13为重复的测试样品，14-15为空白对照，图7中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
[0028] 图8是对驴成分检测结果呈阴性的市售阿胶样品6、7使用马特异性寡核苷酸引物对和探针进行检测的结果，其中所使用的马特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，所使用的马探针为SEQ ID No.6，在每个样品的检测中，均使用马阳性对照和空白对照；各目标样品一式十份重复检测，在样品6和7的实时荧光PCR图形中荧光曲线1、2、3为马阳性对照，4-13为重复的测试样品，14-15为空白对照，图8中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR基线扣除曲线拟合相对荧光单位值。
具体实施方式
[0029] 通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
[0030] 实施例1
[0031] 本实施例为通过如下试验对阿胶的引物和探针进行了特异性和灵敏度验证。
[0032] 通过检测线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b区序列，可以确定用于阿胶真伪鉴别的特异性寡核苷酸引物和探针组合的特异性和检测灵敏度。反应体系为：Mastermix 12.5μL；探针(10μM)2μL；上、下游引物(10μM)各1μL；模板DNA 5μL；加ddH2O至总体积为
25μL。反应程序为95℃10min；95℃15s；60℃1min，50个循环。
25μL。反应程序为95℃10min；95℃15s；60℃1min，50个循环。
[0033] 所使用的驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ IDNo.2；所使用的探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
[0034] 所使用的马特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.4，所述下游引物的碱基序列为SEQ IDNo.5；所使用的探针的碱基序列为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
[0035] 所使用的检测主要仪器：
[0036] 微量移液器(10μL、100μL、1000μL Eppendorf)、荧光定量PCR仪(IQ5，Biorad，USA))、高速台式离心机(Pico17Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)等。
[0037] 检测主要试剂：
[0038] 氯仿、异丙醇分别购于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris、0.02mol/L Na2-EDTA)、CTAB沉淀液(5g/LCTAB，0.04mol/L NaCl)、1.2mol/L NaCl均为本实验自行配制；Fast Start Universal Probe MasterMix(Rox)购于罗氏公司；引物及探针由上海奥科生物科技有限公司合成等。
[0039] 检测主要步骤：
[0040] 1DNA提取
[0041] 检测样本：(1)11份样品，包括驴、马、牛、猪、羊、鹿、鸡、鸭、鱼、大豆、玉米，用于特异性分析；(2)将提取的驴DNA溶液用无菌水分别稀释为30pg/μL、6pg/μL、1.2pg/μL、0.24pg/μL、0.05pg/μL、0.01pg/μL的浓度，用于分析驴特异性寡核苷酸引物和探针组合的绝对检测限；(2)将提取的马DNA溶液用无菌水分别稀释为300pg/μL、60pg/μL、12pg/μL、2.4pg/μL、0.5pg/μL、0.1pg/μL的浓度，用于分析马特异性寡核苷酸引物和探针组合的绝对检测限；(3)用马DNA将驴DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中驴DNA含量分
别为150pg、30ng、6ng、1.2pg、0.25pg、0.05pg，以确定驴特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限；(4)用驴DNA将马DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中马DNA含量分别为
1.5ng、300pg、60pg、12pg、2.5pg、1pg，以确定马特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限。
别为150pg、30ng、6ng、1.2pg、0.25pg、0.05pg，以确定驴特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限；(4)用驴DNA将马DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中马DNA含量分别为
1.5ng、300pg、60pg、12pg、2.5pg、1pg，以确定马特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限。
[0042] 称取0.1g牛、猪、羊、鹿、鸡、鸭、鱼、大豆、玉米样品粉末和100μL驴、马样品血清至一洁净2.0mL离心管中，加入1.5mLCTAB裂解液，65℃2h，间期不断混匀几次；8000rpm15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中，加入700μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm
10min，分别取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；14500rpm 20min，弃上清液，加入350μL 1.2M NaCl，剧烈振荡30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm 10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，14500rpm 20min，弃上清液，加入500μL 70％乙醇，混匀后，
14500rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入100μL ddH2O溶解，4℃储存备用。
10min，分别取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；14500rpm 20min，弃上清液，加入350μL 1.2M NaCl，剧烈振荡30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm 10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，14500rpm 20min，弃上清液，加入500μL 70％乙醇，混匀后，
14500rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入100μL ddH2O溶解，4℃储存备用。
[0043] 上述测试样品通过以上所述方法提取DNA。阿胶样品粉末使用商业化DNA提取试剂盒提取。
[0044] 2实时荧光PCR检测所用引物和探针
[0045] 所使用的驴特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2和探针为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
[0046] 所使用的马特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5和探针为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。。
[0047] 3实时荧光PCR反应体系：
[0048] TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL
[0049] 探针(10μM)2μL
[0050] 上游引物(10μM)1μL
[0051] 下游引物(10μM)1μL
[0052] 模板DNA 5μL
[0053] 加ddH2O至总体积为25μL
[0054] 注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；
[0055] 4实时荧光PCR反应参数：
[0056] 95℃ 10min
[0057] 95℃ 15s
[0058] 60℃ 1min
[0059] 50个循环。
[0060] 注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。
[0061] 如图1所示，利用实时荧光PCR特异性检测驴线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b区序列时，驴样品出现典型的扩增曲线，而其它样品：马、牛、猪、羊、鹿、鸡、鸭、鱼、大豆、玉米及空白对照(ddH2O)均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的驴特异性寡核苷酸引物和探针对驴样品表现优异的特异性。
[0062] 如图2所示，利用实时荧光PCR特异性检测马线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b区序列时，马样品出现典型的扩增曲线，而其它样品：驴、牛、猪、羊、鹿、鸡、鸭、鱼、大豆、玉米及空白对照(ddH2O)均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的马特异性寡核苷酸引物和探针对马样品表现优异的特异性。
[0063] 为确定驴特异性寡核苷酸引物和探针组合的绝对检测限，将提取的驴样品DNA溶液用无菌水分别稀释为30pg/μL、6pg/μL、1.2pg/μL、0.24pg/μL、0.05pg/μL、0.01pg/μL的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图3所示。驴样品DNA浓度为30pg/μL、6pg/μL、1.2pg/μL、0.24pg/μL时有特异性扩增曲线，而浓度降至0.05pg/μL时，无特异性扩增曲线出现。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出驴成分的含量为0.24pg/μL以上。
[0064] 为确定马特异性寡核苷酸引物和探针组合的绝对检测限，将提取的马样品DNA溶液用无菌水分别稀释为300pg/μL、60pg/μL、12pg/μL、2.4pg/μL、0.5pg/μL、0.1pg/μL的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图4所示。马DNA浓度为300pg/μL、60pg/μL、12pg/μL、2.4pg/μL、0.5pg/μL、0.1pg/μL时有特异性扩增曲线。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出马成分的含量为0.1pg/μL以上。
[0065] 以驴、马为例，用马DNA将驴DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中驴DNA含量分别为150pg、30ng、6ng、1.2pg、0.25pg、0.05pg，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，以确定驴特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限(结果见图5)。实验结果说明该方法检测驴成分的相对检测限为1.2pg。
[0066] 以驴、马为例，用驴DNA将马DNA以10倍稀释，使其PCR反应体系中马DNA含量分别为1.5ng、300pg、60pg、12pg、2.5pg、1pg，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，以确定马特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限(结果见图6)。实验结果说明该方法检测马成分的相对检测限为1pg。
[0067] 实施例2
[0068] 本发明的发明人通过如下试验对市售阿胶样品进行了验证。
[0069] 选取7份市售阿胶样品进行实时荧光PCR反应，以确定所建立的实时荧光PCR方法的可行性、特异性等。
[0070] 在该7份市售样品，已知样品1-5为真阿胶，而样品6和7为假阿胶。
[0071] 在本实施例中，所使用的驴特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2和探针为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。另外，为进一步确认检测的准确性以及鉴定样品的来源，在本实施例中还使用了马特异性寡核苷酸引物对为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5和探针为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
[0072] 在本实施例中，进行实时荧光PCR检测的实验操作条件如实施例1中所述。
[0073] 常规地，扩增待测样品时，重复10次出现1次以上阳性信号即代表检测结果为阳性。
[0074] 如图7所示，利用驴特异性寡核苷酸引物对和探针实时荧光PCR检测线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b区序列时，驴阳性对照、市售阿胶样品1-5获得基线以上典型的荧光扩增曲线，样品1-5的10次重复的扩增阳性率分别为50％、90％、70％、30％和40％，均远远优于目前的其他方法。而市售阿胶样品6-7在基线以上没有出现荧光扩增曲线，表明样品6-7为非阿胶样品。在实施例中，通过本发明的方法进行阿胶真伪鉴别时，鉴别的准确性是为100％。
[0075] 如图8所示，利用马特异性寡核苷酸引物对和探针实时荧光PCR检测线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b区序列时，马阳性对照、未扩增出驴成分的阿胶样品6和7获得基线以上荧光扩增曲线。
[0076] 本实施例的实验结果表明，所检测的7份市售阿胶样品中，有5份来自驴皮，为真正的阿胶样品，而有2份来自马皮，为伪阿胶样品。使用本发明的特异性寡核苷酸引物对和探针进行的实时荧光PCR方法检测阿胶样品的准确率为100％。本发明的实验表明，本发明的实时荧光定量PCR检测方法能有效地进行阿胶真伪的检测。
[0077] 虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。