一种海洋环肽化合物及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN201010512692.X
文献号 : CN101979402B
文献日 : 2013-01-23
发明人 : 林永成 , 裴中 , 许忠良 , 庞冀燕 , 王三永 , 卢锡林 , 黄如训 , 王冠蕾 , 李静
申请人 : 中山大学
摘要 :
本发明公开了一种海洋环肽化合物及其制备方法与应用。本发明的结构的特殊性在于含有N甲基化的环三肽结构。合成路线以L-Lys，D-MeVal，D-MeAla，L-MeAla为原料，经甲胺化，酯化，缩合而成，所用的N端保护基为叔丁氧羰基(BOC)和苄氧羰基(Cbz)，C端保护基为甲酯；经荧光血管标记的转基因斑马鱼模型研究发现，所述海洋环肽化合物具有很强的血管生成活性；显示出该类化合物是一类潜在的血管生成药物，具有很好的应用前景。
权利要求 :
1.海洋环肽化合物在制备血管增生药物中的应用，所述海洋环肽化合物的结构如式(I)所示：
其中：R为叔丁氧羰基、氢。
说明书 :
一种海洋环肽化合物及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种结构新颖的海洋真菌代谢产物海洋环肽，其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物在血管生成方面的应用。
背景技术
[0002] 红树林是热带和亚热带沿海地区特有的植物群落，由于其独特的生存环境，能够产生出许多结构新颖独特的代谢产物(Vera M D，Joullie M M.Med Res Rev，2002，22：102-145)。目前科学家已从其里面的各种内生真菌代谢产物中分离出很多结构新颖、有显著活性的化合物，许多已进入临床试验阶段。多年来，本课题组主要对中国南海红树林内生真菌代谢产物进行研究，从中分离出很多结果新颖的化合物(Lin YC et al J Org.Chem.2001，66，6252-6256.Lin YC et al Phytochemistry 2002，59，469-471.Lin YC et al Tetrahedron 2000，56，9607-9609)，海洋环肽Xyloallenoid A就是本课题组从海洋真菌2508#分离出来的一个有代表性的代谢产物(Lin YC et al Tetrahedron Lett.2001，
42，449-451).结构异常新颖，分子中含有环三肽、连烯基、肉桂酰胺。环三肽及含连烯基化合物在天然产物中很少见，这一物质在真菌生物体内估计会有独特的作用。鉴于其结构珍奇，引起了国内外的关注，2003年国外著名杂志Marine naturalproducts对该化合物进行了报道，2004年国外著名杂志Angew.chem.int.ed再次对该化合物进行了报道。
42，449-451).结构异常新颖，分子中含有环三肽、连烯基、肉桂酰胺。环三肽及含连烯基化合物在天然产物中很少见，这一物质在真菌生物体内估计会有独特的作用。鉴于其结构珍奇，引起了国内外的关注，2003年国外著名杂志Marine naturalproducts对该化合物进行了报道，2004年国外著名杂志Angew.chem.int.ed再次对该化合物进行了报道。
[0003] 新血管的形成，又称血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。是胚胎发育，器官生成，创伤后血管再生及组织修复的基础，对于很多生理和病理过程都是必须的。血管生成还是某些特定的病理状况，如瘤形成(例如，肿瘤和神经胶质瘤)的基本部分。异常的血管生成还与其他疾病，如炎症，风湿性关节炎，牛皮癣，糖尿病视网膜病相关(Folkman，J and Klagsbrun，M，Science，1987，235：442-447；Folkman，J.，Nat.Med.，1995，1，27-31)。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种海洋环肽化合物，其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物在血管增生方面的应用。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供的海洋环肽化合物，其结构通式如下：
[0007]
[0008] X-13a：L-Lys，D-MeVal，D-MeAla
[0009] X-13b：L-Lys，D-MeVal，L-MeAla
[0010] (I)
[0011] 其中：R为叔丁氧羰基、烷基、氢、酰胺或肽类。
[0012] 本发明的海洋环肽化合物中，所述的环肽为一个N甲基化的环三肽，由L-Lys，D-MeVal，D-MeAla和L-Lys，D-MeVal，L-MeAla或其它N甲基化或非N甲基化氨基酸组成。本发明所要保护的海洋环肽化合物，其结构的特殊性在于含有N甲基化的环三肽结构，由L-Lys，D-MeVal，D-MeAla和L-Lys，D-MeVal，L-MeAla组成，是海洋真菌#2508代谢产物Xyloallenoide A的核心部分。合成路线以L-Lys，D-MeVal，D-MeAla，L-MeAla为原料，经甲胺化，酯化，缩合而成，所用的N端保护基为叔丁氧羰基(BOC)和苄氧羰基(Cbz)，C端保护基为甲酯；所用的催化剂为氮正离子或磷正离子缩合剂，所用的溶解为二氯甲烷、乙醚、四氢呋喃、N，N-二甲氧基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇中的一种。
[0013] 在上述制备方法中，所述的氮正离子缩合剂为1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)，磷正离子缩合剂为卡特缩合剂(BOP)或双(2-氧代′-3-恶唑烷基)次磷酰氯(BOP-Cl)。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明以海洋真菌代谢产物XyloallenoideA为先导化合物，对其核心部分环三肽进行了合成，合成了两个异构体，并对其进行血管生成活性研究：荧光血管标记的转基因斑马鱼模型研究发现，所述化合物具有很强的血管生成活性，显示出该类化合物是一类潜在的血管生成药物，具有很好的应用前景。
[0015] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
附图说明
[0016] 图1为X-13对转基因斑马鱼血管生成的作用；
[0017] 图2为X-13促血管生成的量效关系；
[0018] 图3为X-13对血管内皮细胞迁移能力的影响；
[0019] 图4为X-13对血管内皮细胞侵入能力的影响；
[0020] 图5为X-13对血管内皮细胞管形形成能力的影响。
具体实施方式
[0021] 以下通过实施例来进一步阐述本发明，但实施例不对本发明做任何限定。
[0022] 实施例1 MeAla-Me.HCl(10)的合成
[0023] 取68ml THF加入500ml的三颈烧瓶中，搅拌下加入3.5g(18.4mmol)Boc-Ala(9)，10.46ml(184mmol)MeI.后分若干次加入2.2g(184mmol)NaH，室温下搅拌24h，后加入10ml EtOAc，10ml水，停止反应，减压浓缩，后加入200ml H2O，用乙醚(100ml×2)萃取，合并Et2O层，Et2O层用饱和NaHCO3100ml洗涤一次，取无机层.无机层用5％的柠檬酸酸化至pH＝
3.用EtOAc(3×100ml)萃取，合并EtOAc，EtOAc层依次用水、5％Na2S2O4、饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩得N-Boc-MeAal，石油醚重结晶得白色固体3.642g白色固体，产
1
率97.5％，m.p.97.6-98.2℃.H NMR(CDCl3，300MHz)δ：10.54(s，1H)，4.71(dd，1H，J1＝
7.43Hz，J2＝10.6Hz)，2.89(s，3H)，1.49(s，9H)，1.47(d，3H，J＝8.06Hz).
3.用EtOAc(3×100ml)萃取，合并EtOAc，EtOAc层依次用水、5％Na2S2O4、饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩得N-Boc-MeAal，石油醚重结晶得白色固体3.642g白色固体，产
1
率97.5％，m.p.97.6-98.2℃.H NMR(CDCl3，300MHz)δ：10.54(s，1H)，4.71(dd，1H，J1＝
7.43Hz，J2＝10.6Hz)，2.89(s，3H)，1.49(s，9H)，1.47(d，3H，J＝8.06Hz).
[0024] 冰浴下在三颈瓶A中加入3.6g Diazald(16.8mmol)后加入20ml EtOH，搅拌，在另一三颈瓶B中加入2.072g(10.2mmol)N-Boc-MeAal，加入乙醚使之溶解，-10℃下搅拌，保持三颈瓶A在0℃下慢慢滴入KOH的乙醇溶液，用氮气将生产的黄色气体CH2N2吹入三颈瓶B中至反应液变为黄色，继续通入氮气至两瓶黄色消失，停在反应，浓缩得3.689g目标物1
N-Boc-MeAal-OMe，产率100％.H NMR(D2O，300MHz)δ：4.59(m，1H)，3.69(s，3H)，2.81(d，
3H，J＝19.6Hz)，1.44(s，9H)，1.38(d，3H，J＝7.2Hz).
N-Boc-MeAal-OMe，产率100％.H NMR(D2O，300MHz)δ：4.59(m，1H)，3.69(s，3H)，2.81(d，
3H，J＝19.6Hz)，1.44(s，9H)，1.38(d，3H，J＝7.2Hz).
[0025] 将3.258g(15mmol)N-Boc-MeAal-OMe加入250ml的圆底烧瓶中，后加入50ml 4N HCl-Dioxane，室温下搅拌10h，减压浓缩，乙酸乙酯重结晶.得2.361g白色固体10，产率1
100％.H NMR(D2O，300MHz)δ：4.09(m，1H)，3.81(s，3H)，2.71(d，3H，J＝5.76Hz)，0.52(d，
3H，J＝2.48Hz).
100％.H NMR(D2O，300MHz)δ：4.09(m，1H)，3.81(s，3H)，2.71(d，3H，J＝5.76Hz)，0.52(d，
3H，J＝2.48Hz).
[0026] 实施例2 N-Boc-MeVal(11)的合成
[0027] 取68ml THF加入500ml的三颈烧瓶中，搅拌下加入4.0g(18.4mmol)Boc-Val，10.46ml(184mmol)MeI.后分若干次加入2.2g(184mmol)NaH，室温下搅拌24h，后加入10ml EtOAc，10ml水，停止反应，减压浓缩，浓缩物加入200mlH2O，用乙醚(100ml×2)萃取，合并Et2O层，Et2O层用饱和NaHCO3100ml洗涤一次，取无机层.用5％的柠檬酸调节pH＝3，后用EtOAc(3×100ml)萃取，合并EtOAc，依次用水、5％Na2S2O4、饱和食盐水洗涤，无水MgSO4
1
干燥，浓缩，石油醚重结晶得3.706g白色固体11，产率87.2％，m.p.53.5～54.8℃.H NMR(CDCl3，300MHz)δ：8.47(s，1H，COOH)，4.06～4.26(dd，J1＝6.32Hz，J2＝7.85Hz，1H，CH)，2.86(s，3H，CH3)，1.99～2.1(s，1H，CH)，1.45(s，9H，CH3)，1.03(d，J＝6.56Hz，，3H，CH3)，0.91(d，J＝6.7Hz，，3H，CH3).
1
干燥，浓缩，石油醚重结晶得3.706g白色固体11，产率87.2％，m.p.53.5～54.8℃.H NMR(CDCl3，300MHz)δ：8.47(s，1H，COOH)，4.06～4.26(dd，J1＝6.32Hz，J2＝7.85Hz，1H，CH)，2.86(s，3H，CH3)，1.99～2.1(s，1H，CH)，1.45(s，9H，CH3)，1.03(d，J＝6.56Hz，，3H，CH3)，0.91(d，J＝6.7Hz，，3H，CH3).
[0028] 实施例3 二肽N-Boc-MeVal-MeAla-OMe(12)的合成
[0029] 在50ml圆底烧瓶中加入2.063g(8.92mmol)11和2.106g(13.38mmol)10，后加入30ml DMF搅拌使之溶解，加入Bop 6.0g(13.38mmol)和7.0ml(38.94mmol)DIEA，室温下搅拌过夜，在0℃下加入饱和NH4Cl 100ml，停止反应，用EtOAc(3×80ml)萃取，合并有机层，用饱和NH4Cl(1×100ml)、饱和盐水(2×100ml)洗涤，无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析
1
得2.873g黄色浓稠液12，产率97.6％，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：4.82(q，1H，J＝6.8)，
4.40(d，1H，J ＝ 12.8)，3.41(s，3H)，2.76(s，3H)，2.47(s，3H)，2.06(m，1H)，1.18(s，9H)，
13
1.13(d，3H，J＝5.6)，0.59(d，3H，J＝6.4)，0.56(d，3H，J＝6.4)；C NMR(CDCl3)：171.3，
170.3，155.5，79.2，59.1，53.8，51.4，31.5，28.7，27.8，27.6，18.9，17.6，13.7；IR(KBr)-1
vmax(cm )：3530，2967，2934，2874，1748，1701，1680，1657，1645，1479，1456，1393，1306，+ 25
1159，883，769；EIMS m/z 330[M] ；[α] D＝+136.92(c 0.305，CHCl3).
1
得2.873g黄色浓稠液12，产率97.6％，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：4.82(q，1H，J＝6.8)，
4.40(d，1H，J ＝ 12.8)，3.41(s，3H)，2.76(s，3H)，2.47(s，3H)，2.06(m，1H)，1.18(s，9H)，
13
1.13(d，3H，J＝5.6)，0.59(d，3H，J＝6.4)，0.56(d，3H，J＝6.4)；C NMR(CDCl3)：171.3，
170.3，155.5，79.2，59.1，53.8，51.4，31.5，28.7，27.8，27.6，18.9，17.6，13.7；IR(KBr)-1
vmax(cm )：3530，2967，2934，2874，1748，1701，1680，1657，1645，1479，1456，1393，1306，+ 25
1159，883，769；EIMS m/z 330[M] ；[α] D＝+136.92(c 0.305，CHCl3).
[0030] 实施例4 二肽MeVal-MeAla-OMe.HCl(5)的合成
[0031] 将二肽N-Boc-MeVal-MeAla-OMe 1.652g(5.0mmol)加入100ml的圆底烧瓶中，后加入50ml 4N HCl-Dioxane，室温下搅拌10h，减压浓缩，乙酸乙脂重结晶.得1.254g白色固1
体5，产率99.3％.m.p.179-180℃；H NMR(CDCl3，400MHz)δ：4.35(q，1H，J＝9.6)，4.35(m，
1H)，3.59(s，3H)，3.03(s，3H)，2.39(s，3H)，2.32(m，1H)，1.32(d，3H，J＝6.8)，0.98(d，6H，
13
J ＝ 9.2)；C NMR(CDCl3)：171.4，169.9，60.2，58.5，50.8，37.9，30.8，30.5，18.9，18.7，-1
14.1；IR(KBr)vmax(cm )：3580，3397，2961，2940，2872，1688，1622，1520，1398，1296，1086，+ 25
561；FABMS m/z 231[M+1] ；[α] D+61.02(c 0.031，CHCl3).
体5，产率99.3％.m.p.179-180℃；H NMR(CDCl3，400MHz)δ：4.35(q，1H，J＝9.6)，4.35(m，
1H)，3.59(s，3H)，3.03(s，3H)，2.39(s，3H)，2.32(m，1H)，1.32(d，3H，J＝6.8)，0.98(d，6H，
13
J ＝ 9.2)；C NMR(CDCl3)：171.4，169.9，60.2，58.5，50.8，37.9，30.8，30.5，18.9，18.7，-1
14.1；IR(KBr)vmax(cm )：3580，3397，2961，2940，2872，1688，1622，1520，1398，1296，1086，+ 25
561；FABMS m/z 231[M+1] ；[α] D+61.02(c 0.031，CHCl3).
[0032] 实施例5 三肽Boc-Lys(Cbz)-MeVal-MeAla-OMe(3)的合成
[0033] 在 50ml圆 底 烧 瓶 中 加 入 1.74g(6.53mmol)MeVal-MeAla-OMe.HCl(5) 和2.74g(7.18mmol)L-Boc-Lys(Cbz)-OH(4)，后加入25ml DMF搅拌使之溶解，加入Bop
3.17g(7.18mmol)和5.6ml(31.2mmol)DIEA，室温下搅拌过夜，在0℃下加入饱和NH4Cl
100ml，停止反应，用EtOAc(3×100ml)萃取，合并有机层，用饱和NH4Cl(1×100ml)、饱和盐水(2×100ml)洗涤，无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析得0.27g黄色浓稠液3，产率7.0％，
1
H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.24(s，5H)，5.52(s，2H)，4.46(d，1H，J＝8.0Hz)，4.99(s，2H)，
4.89(d，1H，J ＝ 5.6Hz)，4.48(s，1H)，4.02(q，1H，J ＝ 7.2)，3.60(s，3H)，3.08(m，2H)，
2.91(s，3H)，2.82(s，3H)，2.25(m，1H)，1.59(m，2H)，1.45(m，2H)，1.33(s，9H)，1.29(d，3H，J
13
＝9.6Hz)，1.15(m，2H)，0.83(d，3H，J＝6.4)，0.71(d，3H，J＝6.4)；C NMR(CDCl3)：172.6，
171.4，169.7，168.8，156.1，136.3，127.9，127.6，127.5，79.1，65.9，57.9，52.8，51.6，-1
40.2，31.6，29.7，28.9，28.8，27.8，26.9，21.9，19.1，17.8，17.4，13.8；IR(KBr)vmax(cm )：
3339，3327，2965，2940，2872，1744，1709，1632，1524，1456，1250，1171，754，698；EIMS m/z + 25
592[M] ；[α] D+52.24(c 0.495，CHCl3).
3.17g(7.18mmol)和5.6ml(31.2mmol)DIEA，室温下搅拌过夜，在0℃下加入饱和NH4Cl
100ml，停止反应，用EtOAc(3×100ml)萃取，合并有机层，用饱和NH4Cl(1×100ml)、饱和盐水(2×100ml)洗涤，无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析得0.27g黄色浓稠液3，产率7.0％，
1
H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.24(s，5H)，5.52(s，2H)，4.46(d，1H，J＝8.0Hz)，4.99(s，2H)，
4.89(d，1H，J ＝ 5.6Hz)，4.48(s，1H)，4.02(q，1H，J ＝ 7.2)，3.60(s，3H)，3.08(m，2H)，
2.91(s，3H)，2.82(s，3H)，2.25(m，1H)，1.59(m，2H)，1.45(m，2H)，1.33(s，9H)，1.29(d，3H，J
13
＝9.6Hz)，1.15(m，2H)，0.83(d，3H，J＝6.4)，0.71(d，3H，J＝6.4)；C NMR(CDCl3)：172.6，
171.4，169.7，168.8，156.1，136.3，127.9，127.6，127.5，79.1，65.9，57.9，52.8，51.6，-1
40.2，31.6，29.7，28.9，28.8，27.8，26.9，21.9，19.1，17.8，17.4，13.8；IR(KBr)vmax(cm )：
3339，3327，2965，2940，2872，1744，1709，1632，1524，1456，1250，1171，754，698；EIMS m/z + 25
592[M] ；[α] D+52.24(c 0.495，CHCl3).
[0034] 实施例6 MeVal-Me.HCl(14)的合成
[0035] 取68ml THF加入500ml的三颈烧瓶中，搅拌下加入3.5g(18.4mmol)Boc-Ala，10.46ml(184mmol)MeI.后分若干次加入2.2g(184mmol)NaH，室温下搅拌24h，后加入10ml EtOAc，10ml水，停止反应，减压浓缩，后加入200ml H2O，用乙醚(100ml×2)萃取，合并Et2O层，Et2O层用饱和NaHCO3 100ml洗涤一次，取无机层.无机层用5％的柠檬酸酸化至pH＝3.用EtOAc(3×100ml)萃取，合并EtOAc，EtOAc层依次用水、5％Na2S2O4、饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩得N-Boc-MeVal，石油醚重结晶得白色固体3.642g白色
1
固体Boc-MeVal-OH，产率97.5％，m.p.97.6-98.2℃.H NMR(CDCl3，300MHz)δ：10.54(s，
1H)，4.71(dd，1H，J1 ＝7.43Hz，J2＝ 10.6Hz)，2.89(s，3H)，1.49(s，9H)，1.47(d，3H，J ＝
8.06Hz).
1
固体Boc-MeVal-OH，产率97.5％，m.p.97.6-98.2℃.H NMR(CDCl3，300MHz)δ：10.54(s，
1H)，4.71(dd，1H，J1 ＝7.43Hz，J2＝ 10.6Hz)，2.89(s，3H)，1.49(s，9H)，1.47(d，3H，J ＝
8.06Hz).
[0036] 冰浴下在三颈瓶A中加入3.6g Diazald(16.8mmol)后加入20ml EtOH，搅拌，在另一三颈瓶B中加入2.072g(10.2mmol)Boc-MeVal-OH，加入乙醚使之溶解，-10℃下搅拌，保持三颈瓶A在0℃下慢慢滴入KOH的乙醇溶液，用氮气将生产的黄色气体CH2N2吹入三颈瓶B中至反应液变为黄色，继续通入氮气至两瓶黄色消失，停在反应，浓缩得3.689g目标物1
Boc-MeVal-OMe，产率100％.H NMR(D2O，300MHz)δ：4.59(m，1H)，3.69(s，3H)，2.81(d，3H，J＝19.6Hz)，1.44(s，9H)，1.38(d，3H，J＝7.2Hz).
Boc-MeVal-OMe，产率100％.H NMR(D2O，300MHz)δ：4.59(m，1H)，3.69(s，3H)，2.81(d，3H，J＝19.6Hz)，1.44(s，9H)，1.38(d，3H，J＝7.2Hz).
[0037] 将3.258g(15mmol)Boc-MeVal-OMe加入250ml的圆底烧瓶中，后加入50ml 4N HCl-Dioxane，室温下搅拌10h，减压浓缩，乙酸乙酯重结晶.得2.361g白色固体14，产率1
100％.H NMR(D2O，300MHz)δ：4.09(m，1H)，3.81(s，3H)，2.71(d，3H，J＝5.76Hz)，0.52(d，
3H，J＝2.48Hz).
100％.H NMR(D2O，300MHz)δ：4.09(m，1H)，3.81(s，3H)，2.71(d，3H，J＝5.76Hz)，0.52(d，
3H，J＝2.48Hz).
[0038] 实施例7 二肽Boc-Lys(Cbz)-MeVal-OMe(15)的合成
[0039] 在 50ml 圆 底 烧 瓶 中 加 入 0.736g(2.49mmol)14 和 1.044g(2.74mmol)Boc-Lys(Cbz)-OH，后加入20ml DMF搅拌使之溶解，加入Bop 1.21g(2.74mmol)和1.12ml(6.23mmol)DIEA，室温下搅拌过夜，在0℃下加入饱和NH4Cl 100ml，停止反应，用EtOAc(3×80ml)萃取，合并有机层，用饱和NH4Cl(1×100ml)、饱和盐水(2×100ml)洗涤，
1
无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析得1.124g黄色浓稠液15，产率89％，H NMR(CDCl3，
400MHz)δ：7.24(s，5H)，4.98(s，2H)，4.69(d，1H，J ＝ 10.8Hz)，4.01(q，1H，J ＝ 7.2)，
3.59(s，3H)，3.08(m，2H)，2.94(s，3H)，2.13(m，1H)，1.58(m，2H)，1.44(m，2H)，1.32(s，9H)，
13
1.29(m，2H)，0.89(d，3H，J ＝6.4)，0.73(d，3H，J＝ 6.4)；C NMR(CDCl3)：172.9，170.8，
156.3，155.4，136.4，128.2，127.8，127.7，79.3，66.2，61.7，51.8，50.0，40.5，32.7，31.1，-1
28.9，28.1，27.1，21.9，19.5，18.5；IR(KBr)vmax(cm )：3323，2968，2936，2872，1717，1701，+ 25
1647，1526，1250，1169，1015，739，698；EIMS m/z 507[M] ；[α] D+50.32(c 0.186，CHCl3).[0040] 实施例8 二肽Boc-Lys(Cbz)-MeVal-OH(16)的合成
1
无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析得1.124g黄色浓稠液15，产率89％，H NMR(CDCl3，
400MHz)δ：7.24(s，5H)，4.98(s，2H)，4.69(d，1H，J ＝ 10.8Hz)，4.01(q，1H，J ＝ 7.2)，
3.59(s，3H)，3.08(m，2H)，2.94(s，3H)，2.13(m，1H)，1.58(m，2H)，1.44(m，2H)，1.32(s，9H)，
13
1.29(m，2H)，0.89(d，3H，J ＝6.4)，0.73(d，3H，J＝ 6.4)；C NMR(CDCl3)：172.9，170.8，
156.3，155.4，136.4，128.2，127.8，127.7，79.3，66.2，61.7，51.8，50.0，40.5，32.7，31.1，-1
28.9，28.1，27.1，21.9，19.5，18.5；IR(KBr)vmax(cm )：3323，2968，2936，2872，1717，1701，+ 25
1647，1526，1250，1169，1015，739，698；EIMS m/z 507[M] ；[α] D+50.32(c 0.186，CHCl3).[0040] 实施例8 二肽Boc-Lys(Cbz)-MeVal-OH(16)的合成
[0041] 将二肽Boc-Lys(Cbz)-MeVal-OMe 0.72g(1.42mmol)加入100ml的圆底烧瓶中，冰浴下加入的THF/H2O(v/v＝2∶1)45ml，搅拌下加入0.70g(17.07mmol)LiOH，自然升温到室温，搅拌反应10h.后加入饱和NH4Cl溶液终止反应，用EtOAc(2×100ml)萃取。取无机层，用10％的柠檬酸调节pH＝3，后用EtOAc(4×100ml)萃取，合并EtOAc层，后依次用水，饱和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩得0.66g无色粘稠状液
1
Boc-Lys(Cbz)-MeVal-OH(16)，产率94％.H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.32(s，5H)，5.07(s，
2H)，4.71(d，1H，J＝10.4Hz)，4.11(q，1H，J＝7.2)，3.15(m，2H)，3.06(s，3H)，2.25(m，1H)，
1.65(m，2H)，1.53(m，2H)，1.41(s，9H)，1.23(m，2H)，0.87(d，3H，J＝6.4)，0.83(d，3H，J＝
13
6.4)；C NMR(CDCl3)：173.6，172.4，156.4，155.5，136.3，128.1，127.7，127.6，79.4，66.3，-1
60.1，50.1，40.3，32.2，31.7，29.1，27.9，26.9，21.9，19.6，18.6；IR(KBr)vmax(cm )：3331，+
3325，2967，2936，2872，1701，1636，1524，1368，1254，1169，1024，698；EIMS m/z 493[M] ；
25
[α] D+80.59(c0.1685，CHCl3).
1
Boc-Lys(Cbz)-MeVal-OH(16)，产率94％.H NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.32(s，5H)，5.07(s，
2H)，4.71(d，1H，J＝10.4Hz)，4.11(q，1H，J＝7.2)，3.15(m，2H)，3.06(s，3H)，2.25(m，1H)，
1.65(m，2H)，1.53(m，2H)，1.41(s，9H)，1.23(m，2H)，0.87(d，3H，J＝6.4)，0.83(d，3H，J＝
13
6.4)；C NMR(CDCl3)：173.6，172.4，156.4，155.5，136.3，128.1，127.7，127.6，79.4，66.3，-1
60.1，50.1，40.3，32.2，31.7，29.1，27.9，26.9，21.9，19.6，18.6；IR(KBr)vmax(cm )：3331，+
3325，2967，2936，2872，1701，1636，1524，1368，1254，1169，1024，698；EIMS m/z 493[M] ；
25
[α] D+80.59(c0.1685，CHCl3).
[0042] 实施例9 三肽Boc-Lys(Cbz)-MeVal-MeAla-OMe(3)的合成
[0043] 在50ml圆 底烧 瓶 中 加入0.96g(1.95mmol)Boc-Lys(Cbz)-MeVal-OH(16) 和0.40g(2.54mmol)盐酸盐10，后加入20ml DMF搅拌使之溶解，加入Bop1.12g(2.54mmol)和2.24ml(12.46mmol)DIEA，室温下搅拌过夜，在0℃下加入饱和NH4Cl 100ml，停止反应，用EtOAc(3×100ml)萃取，合并有机层，用饱和NH4Cl(1×100ml)、饱和盐水(2×100ml)洗
1
涤，无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析得1.15g黄色浓稠液3，产率94％，H NMR(CDCl3，
400MHz)δ：7.24(s，5H)，5.52(s，2H)，4.46(d，1H，J＝8.0Hz)，4.99(s，2H)，4.89(d，1H，J＝
5.6Hz)，4.48(s，1H)，4.02(q，1H，J＝7.2)，3.60(s，3H)，3.08(m，2H)，2.91(s，3H)，2.82(s，
3H)，2.25(m，1H)，1.59(m，2H)，1.45(m，2H)，1.33(s，9H)，1.29(d，3H，J ＝ 9.6Hz)，1.15(m，
13
2H)，0.83(d，3H，J ＝ 6.4)，0.71(d，3H，J ＝ 6.4)；C NMR(CDCl3)：172.6，171.4，169.7，
168.8，156.1，136.3，127.9，127.6，127.5，79.1，65.9，57.9，52.8，51.6，40.2，31.6，29.7，-1
28.9，28.8，27.8，26.9，21.9，19.1，17.8，17.4，13.8；IR(KBr)vmax(cm )：3339，3327，2965，+
2940，2872，1744，1709，1632，1524，1456，1250，1171，754，698；EIMS m/z 593[M] ；HRMS(m/+ 25
z 592.3444[M]，calcd.Mass 592.3467 for C30H48O8N4)；[α] D+52.24(c 0.495，CHCl3).[0044] 实施例10 三肽Boc-Lys-MeVal-MeAla-OH(17)的合成
1
涤，无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析得1.15g黄色浓稠液3，产率94％，H NMR(CDCl3，
400MHz)δ：7.24(s，5H)，5.52(s，2H)，4.46(d，1H，J＝8.0Hz)，4.99(s，2H)，4.89(d，1H，J＝
5.6Hz)，4.48(s，1H)，4.02(q，1H，J＝7.2)，3.60(s，3H)，3.08(m，2H)，2.91(s，3H)，2.82(s，
3H)，2.25(m，1H)，1.59(m，2H)，1.45(m，2H)，1.33(s，9H)，1.29(d，3H，J ＝ 9.6Hz)，1.15(m，
13
2H)，0.83(d，3H，J ＝ 6.4)，0.71(d，3H，J ＝ 6.4)；C NMR(CDCl3)：172.6，171.4，169.7，
168.8，156.1，136.3，127.9，127.6，127.5，79.1，65.9，57.9，52.8，51.6，40.2，31.6，29.7，-1
28.9，28.8，27.8，26.9，21.9，19.1，17.8，17.4，13.8；IR(KBr)vmax(cm )：3339，3327，2965，+
2940，2872，1744，1709，1632，1524，1456，1250，1171，754，698；EIMS m/z 593[M] ；HRMS(m/+ 25
z 592.3444[M]，calcd.Mass 592.3467 for C30H48O8N4)；[α] D+52.24(c 0.495，CHCl3).[0044] 实施例10 三肽Boc-Lys-MeVal-MeAla-OH(17)的合成
[0045] 将三肽Boc-Lys(Cbz)-MeVal-MeAla-OMe(3)1.15g(1.95mmol)加入100ml的圆底烧瓶中，冰浴下加入的THF/H2O(v/v＝2∶1)30ml，搅拌下加入0.80g(19.40mmol)LiOH，自然升温到室温，搅拌反应10h.后加入饱和NH4Cl溶液终止反应，用EtOAc(2×100ml)萃取。取无机层，用10％的柠檬酸调节pH＝3，后用EtOAc(4×100ml)萃取，合并EtOAc层，后依次用水，饱和盐水洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩得1.12g无色粘稠状液
1
Boc-Lys(Cbz)-MeVal-MeAla-OH，产 率 100 ％ .H NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.07(s，1H)，
7.22(s，5H)，5.54(d，1H，J ＝ 7.6Hz)，5.00(d，1H，J ＝ 5.2Hz)，4.96(s，2H)，4.48(s，1H)，
3.99(q，1H，J ＝ 7.2)，3.04(m，2H)，2.90(s，3H)，2.87(s，3H)，2.25(m，1H)，1.43(m，2H)，
1.38(m，2H)，1.32(m，2H)，1.29(s，9H)，1.25(d，3H，J ＝ 11.2Hz)，0.82(d，3H，J ＝ 6.4)，
13
0.80(d，3H，J ＝ 6.4)；C NMR(CDCl3)：173.9，173.1，171.1，169.9，156.4，136.3，128.2，
127.8，127.7，79.5，66.3，60.2，50.4，40.4，31.6，30.0，29.0，28.1，27.2，26.4，22.2，19.2，-1
18.1，17.6，13.9；IR(KBr)vmax(cm )：3568，3321，2967，2938，1705，1697，1632，1524，1456，+ 25
1250，1169，1022，754；EIMS m/z 578[M] ；[α] D+27.30(c 0.2667，CHCl3).[0046] 将化合物Boc-Lys(Cbz)-MeVal-MeAla-OH溶于60ml乙醇中，后加入0.6g10％Pd-C的催化剂，常温常压下催化氢化3h，过滤，减压浓缩的白色固体0.86g，产率93％.
1
m.p.176-177 ℃，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.01(s，1H)，4.91(d，1H，J＝ 6.0Hz)，4.88(d，
1H，J＝6.0Hz)，4.60(q，1H，J＝7.2)，3.33(s，2H)，2.91(m，2H)，2.81(s，3H)，2.68(s，3H)，
2.23(m，1H)，1.52(m，2H)，1.36(s，9H)，1.27(d，3H，J ＝ 7.2Hz)，1.18(d，2H，J ＝ 6.8Hz)，
13
0.84(d，3H，J ＝6.4)，0.79(d，3H，J ＝ 6.4)；CNMR(CDCl3)：176.9，172.9，170.1，155.3，
79.5，57.9，50.1，39.2，31.1，30.4，29.4，28.2，27.4，26.8，21.8，19.2，18.1，16.7，15.1；
-1 +
IR(KBr)vmax(cm )：3505，2968，2938，1701，1632，1395，1171，754；EIMS m/z 444[M] ；
25
[α] D+19.64(c 0.389，CHCl3，).
1
Boc-Lys(Cbz)-MeVal-MeAla-OH，产 率 100 ％ .H NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.07(s，1H)，
7.22(s，5H)，5.54(d，1H，J ＝ 7.6Hz)，5.00(d，1H，J ＝ 5.2Hz)，4.96(s，2H)，4.48(s，1H)，
3.99(q，1H，J ＝ 7.2)，3.04(m，2H)，2.90(s，3H)，2.87(s，3H)，2.25(m，1H)，1.43(m，2H)，
1.38(m，2H)，1.32(m，2H)，1.29(s，9H)，1.25(d，3H，J ＝ 11.2Hz)，0.82(d，3H，J ＝ 6.4)，
13
0.80(d，3H，J ＝ 6.4)；C NMR(CDCl3)：173.9，173.1，171.1，169.9，156.4，136.3，128.2，
127.8，127.7，79.5，66.3，60.2，50.4，40.4，31.6，30.0，29.0，28.1，27.2，26.4，22.2，19.2，-1
18.1，17.6，13.9；IR(KBr)vmax(cm )：3568，3321，2967，2938，1705，1697，1632，1524，1456，+ 25
1250，1169，1022，754；EIMS m/z 578[M] ；[α] D+27.30(c 0.2667，CHCl3).[0046] 将化合物Boc-Lys(Cbz)-MeVal-MeAla-OH溶于60ml乙醇中，后加入0.6g10％Pd-C的催化剂，常温常压下催化氢化3h，过滤，减压浓缩的白色固体0.86g，产率93％.
1
m.p.176-177 ℃，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.01(s，1H)，4.91(d，1H，J＝ 6.0Hz)，4.88(d，
1H，J＝6.0Hz)，4.60(q，1H，J＝7.2)，3.33(s，2H)，2.91(m，2H)，2.81(s，3H)，2.68(s，3H)，
2.23(m，1H)，1.52(m，2H)，1.36(s，9H)，1.27(d，3H，J ＝ 7.2Hz)，1.18(d，2H，J ＝ 6.8Hz)，
13
0.84(d，3H，J ＝6.4)，0.79(d，3H，J ＝ 6.4)；CNMR(CDCl3)：176.9，172.9，170.1，155.3，
79.5，57.9，50.1，39.2，31.1，30.4，29.4，28.2，27.4，26.8，21.8，19.2，18.1，16.7，15.1；
-1 +
IR(KBr)vmax(cm )：3505，2968，2938，1701，1632，1395，1171，754；EIMS m/z 444[M] ；
25
[α] D+19.64(c 0.389，CHCl3，).
[0047] 实施例11 Cyclo(Boc-L-Lys-D-MeAla-D-MeVal-)(X-13a)的合成
[0048] 法一：在2000ml的圆底烧瓶中加入0.50g(1.13mmol)Boc-Lys-MeVal-OH(17)，后加入1000ml THF-DMF(9∶1，v/v，0.001M).搅拌使之溶解，加入Bop 1.00g(2.26mmol)和1.12ml(6.23mmol)DIEA，室温下搅拌2d，在0℃下加入饱和NH4Cl 100ml，停止反应，浓缩后用EtOAc(3×100ml)萃取，合并有机层，用饱和NH4Cl(1×100ml)、饱和盐水(2×100ml)洗涤，无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析得35mg白色固体X-13a，产率7％。
[0049] 法二：在2000ml的圆底烧瓶中加入0.50g(1.13mmol)Boc-Lys-MeVal-OH(17)，后 加 入 1000ml CH2Cl2-DMF(9∶1，v/v，0.001M).搅 拌 使 之 溶 解，加 入 EDC·HCl1.08g(5.63mmol)和0.77ml(5.63mmol)HOAt，室温下搅拌2d，后加入水100ml，停止反应，浓缩后用EtOAc(3×100ml)萃取，合并有机层，用5％的柠檬酸，饱和NaHCO3(1×100ml)、饱和盐水(2×100ml)洗涤，无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析得270mg白色固体X-13a，产率
56％。
56％。
[0050] 法三：在2000ml的圆底烧瓶中加入0.50g(1.13mmol)Boc-Lys-MeVal-OH(17)，后加入1000ml THF-DMF(9∶1，v/v，0.001M).搅拌使之溶解，加入Bop-Cl0.58g(2.26mmol)和1.12ml(6.23mmol)DIEA，室温下搅拌2d，在0℃下加入饱和NH4Cl 100ml，停止反应，浓缩后用EtOAc(3×100ml)萃取，合并有机层，用饱和NH4Cl(1×100ml)、饱和盐水(2×100ml)洗涤，无水MgSO4干燥，减压浓缩.柱层析得210mg白色固体X-13a，产率1
42 ％。m.p.251-252 ℃，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：6.06(s，1H)，5.42(d，1H，J＝ 8.4Hz)，
5.20(d，1H，J ＝ 10.8Hz)，5.15(d，1H，J ＝ 6.8)，3.55(m，2H)，3.13(s，3H)，3.08(s，3H)，
2.27(m，1H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H)，1.52(m，2H)，1.35(s，9H)，1.25(d，3H，J ＝ 7.2Hz)，
13
0.88(d，3H，J＝4.4)，0.86(d，3H，J＝4.4)；C NMR(CDCl3)：174.1，172.2，170.4，155.4，
58.5，51.1，50.7，38.0，36.8，31.1，30.7，28.5，28.1，26.9，24.9，20.0，19.0，18.9，12.9；
-1
IR(KBr)vmax(cm )：3354，2936，2874，1709，1668，1641，1628，1516，1366，1254，1167，+ +
999；EIMS m/z 426[M] ；HRMS(m/z 426.2841[M]，calcd.Mass 426.2837for C21H38O5N4)；
25
[α] D+42.60(CHCl3，c 0.100).
42 ％。m.p.251-252 ℃，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：6.06(s，1H)，5.42(d，1H，J＝ 8.4Hz)，
5.20(d，1H，J ＝ 10.8Hz)，5.15(d，1H，J ＝ 6.8)，3.55(m，2H)，3.13(s，3H)，3.08(s，3H)，
2.27(m，1H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H)，1.52(m，2H)，1.35(s，9H)，1.25(d，3H，J ＝ 7.2Hz)，
13
0.88(d，3H，J＝4.4)，0.86(d，3H，J＝4.4)；C NMR(CDCl3)：174.1，172.2，170.4，155.4，
58.5，51.1，50.7，38.0，36.8，31.1，30.7，28.5，28.1，26.9，24.9，20.0，19.0，18.9，12.9；
-1
IR(KBr)vmax(cm )：3354，2936，2874，1709，1668，1641，1628，1516，1366，1254，1167，+ +
999；EIMS m/z 426[M] ；HRMS(m/z 426.2841[M]，calcd.Mass 426.2837for C21H38O5N4)；
25
[α] D+42.60(CHCl3，c 0.100).
[0051] 实施例12 Cyclo(L-Lys-MeAla-MeVal-)(1)的合成
[0052] 将三肽Cyclo(Boc-L-Lys-D-MeAla-D-MeVal-)(X-13a)0.2g(0.47mmol)加入50ml的圆底烧瓶中，后加入20ml 4N HCl-Dioxane，室温下搅拌6h，减压浓缩，乙酸乙脂重结1
晶.得0.16g白色固体1，产率96％.m.p.258-260℃，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.42(s，
2H)，6.17(s，1H)，5.25(d，1H，J＝10.8Hz)，5.16(q，1H，J＝6.8Hz)，4.11(q，1H，J＝7.2)，
3.66(m，2H)，3.20(s，3H)，3.11(s，3H)，2.33(m，1H)，1.86(m，2H)，1.61(m，2H)，1.30(d，3H，J
13
＝6.8Hz)，1.19(m，2H)，0.97(d，3H，J＝6.0)，0.94(d，3H，J＝6.0)；C NMR(CDCl3)：171.5，
170.5，170.1，58.6，51.1，50.9，37.9，31.1，30.6，28.1，26.8，19.4，18.9，18.7，14.1，-1
12.7；IR(KBr)vmax(cm )：3397，2961，2940，2642，1688，1622，1520，1399，1398，1296，1101，+ +
1016，561；FABMS m/z 327[M+H]HRFABMS(m/z 327.2367[M+H]，calcd.Mass 327.2391for
25
C16H31O3N4)；[α] D+59.44(c 0.018，CHCl3，)；
晶.得0.16g白色固体1，产率96％.m.p.258-260℃，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.42(s，
2H)，6.17(s，1H)，5.25(d，1H，J＝10.8Hz)，5.16(q，1H，J＝6.8Hz)，4.11(q，1H，J＝7.2)，
3.66(m，2H)，3.20(s，3H)，3.11(s，3H)，2.33(m，1H)，1.86(m，2H)，1.61(m，2H)，1.30(d，3H，J
13
＝6.8Hz)，1.19(m，2H)，0.97(d，3H，J＝6.0)，0.94(d，3H，J＝6.0)；C NMR(CDCl3)：171.5，
170.5，170.1，58.6，51.1，50.9，37.9，31.1，30.6，28.1，26.8，19.4，18.9，18.7，14.1，-1
12.7；IR(KBr)vmax(cm )：3397，2961，2940，2642，1688，1622，1520，1399，1398，1296，1101，+ +
1016，561；FABMS m/z 327[M+H]HRFABMS(m/z 327.2367[M+H]，calcd.Mass 327.2391for
25
C16H31O3N4)；[α] D+59.44(c 0.018，CHCl3，)；
[0053] 实施例13 Cyclo(Boc-L-Lys-D-MeAla-D-MeVal-)(X-13b)的合成
[0054] 以L-Lys，D-MeVal，L-MeAla为初始原料，合成方法同Cyclo(Boc-L-Lys-D-MeAla1
-D-MeVal-)(X-13b)法二，m.p.251-252℃，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：6.06(s，1H)，5.42(d，
1H，J＝8.4Hz)，5.20(d，1H，J＝10.8Hz)，5.15(d，1H，J＝6.8)，3.55(m，2H)，3.13(s，3H)，
3.08(s，3H)，2.27(m，1H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H)，1.52(m，2H)，1.35(s，9H)，1.25(d，3H，
13
J＝7.2Hz)，0.88(d，3H，J＝4.4)，0.86(d，3H，J＝4.4)；C NMR(CDCl3)：174.1，172.2，
170.4，155.4，58.5，51.1，50.7，38.0，36.8，31.1，30.7，28.5，28.1，26.9，24.9，20.0，+ +
19.0，18.9，12.9；EIMS m/z 426[M] ；HRMS(m/z426.2839[M]，calcd.Mass 426.2837for
25
C21H38O5N4)；[α] D-40.35(CHCl3，c0.100).
-D-MeVal-)(X-13b)法二，m.p.251-252℃，H NMR(CDCl3，400MHz)δ：6.06(s，1H)，5.42(d，
1H，J＝8.4Hz)，5.20(d，1H，J＝10.8Hz)，5.15(d，1H，J＝6.8)，3.55(m，2H)，3.13(s，3H)，
3.08(s，3H)，2.27(m，1H)，1.86(m，2H)，1.63(m，2H)，1.52(m，2H)，1.35(s，9H)，1.25(d，3H，
13
J＝7.2Hz)，0.88(d，3H，J＝4.4)，0.86(d，3H，J＝4.4)；C NMR(CDCl3)：174.1，172.2，
170.4，155.4，58.5，51.1，50.7，38.0，36.8，31.1，30.7，28.5，28.1，26.9，24.9，20.0，+ +
19.0，18.9，12.9；EIMS m/z 426[M] ；HRMS(m/z426.2839[M]，calcd.Mass 426.2837for
25
C21H38O5N4)；[α] D-40.35(CHCl3，c0.100).
[0055] 实施例14 X-13对转基因斑马鱼的促血管生成作用
[0056] (一)材料与方法
[0057] 1、药物：X-13，白色粉末。溶于DMSO，贮存浓度200mmol/L，保存于-20℃备用。
[0058] 2、fli 1-EGFP转基因斑马鱼饲养和胚胎的收集。
[0059] 性成熟转基因斑马鱼约3个月大。全自动化控温控光和水处理、循环的斑马鱼专用养殖系统日常维护成鱼，水温度为28.5℃，pH7.0左右，12小时昼夜时间交替，以孵化的盐水虾和热带鱼饲料交叉喂养。配2％琼脂糖制备注射平皿。将一雌一雄的转基因斑马鱼放置到塑料缸中，透明化板障分离雌雄鱼，阻止其交配产卵。让每对鱼均经历明暗交替的光线变换后，清晨9点鱼房亮灯即拔板，20分钟左右将雌鱼产下并体外受精形成的受精卵于一个细胞期用滤网收集。
[0060] 3、药物处理及分组
[0061] 待胚胎分裂至16-256细胞期时，将鱼卵随机置于96孔培养板中。实验组每孔载入3个胚胎及鱼水(速溶海盐40g加蒸镏水1000mL)200ul，于6hpf(hour post fertilized，受精后小时数)时，加样，使加药后终浓度为10、50、100、150、200μM/ml；28℃培养箱中培养至96hpf，于倒置荧光显微镜下，观察flk-GFP转基因斑马鱼的血管生成情况。由于X-13先溶解于DMSO中，使用时用去离子水稀释，最终DMSO的终浓度为0.2％，所以于同一培养板中，留出两列孔，只加养鱼水和0.2％DMSO，作为正常对照组。
[0062] 4、X-13促血管生成作用强度
[0063] 注射之前，以特定参数在高温强力作用下瞬间拉断毛细管玻璃针，分别得到两根一端封闭且细直的注射针，使用锻针仪和磨针仪于光学显微镜下将封闭端切磨形成一小口，尖端粗细适中，保证可以穿破胚胎的膜同时最小限度的损伤胚胎。显微注射前把受精卵整齐地排列在注射盘中的凹槽内，用2.5μl的Eppendorf移液器吸取配制好的VEGF，将注射针插入显微操作持针仪，用钩针调整胚胎位置，用注射针在一个细胞期将1.5ng的VEGF从卵膜注射到细胞质中。注射完毕，立即收集所有注射胚胎，置28℃生化培养箱和养殖水中孵育。
[0064] 5、荧光显微镜观察斑马鱼胚胎的血管生成
[0065] 培养至96hpf，于倒置荧光显微镜下，观察fli 1-EGFP转基因斑马鱼的血管生成情况。胚胎脱膜或剥膜后，用吸管将其转移到凹槽玻片上，滴入0.08％Tricaine将其麻醉，在凹槽玻片上，滴3％甲基纤维素，用吸管吸取鱼胚，竖直放置待鱼胚下沉到管口，轻轻挤压稍许将其滴到甲基纤维素表面。用发针拨动鱼胚，调整其姿势使适合观察，在倒置荧光显微镜下进行绿色荧光血管的观察。计算肠下血管篮里的血管数和/或突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数。观察、拍照完毕后，在甲基纤维素上滴Holt Buffer将其软化，然后温和地吹吸以释放胚胎。将胚胎放回培养液中待其自然苏醒。
[0066] 6、统计分析
[0067] 数据资料以均数±标准差(x±s)表示。统计学处理由计算机运用SPSS 11.0软件进行，组间差异比较用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
[0068] (二)实验结果
[0069] 养鱼水和0.2％DMSO的两组正常对照组fli 1-EGFP转基因斑马鱼的肠下血管篮里的血管数都在4-6条之间，突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率为7±3％、8±2％。VEGF组突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率为86±4％。
X-13作用浓度为10、50、100、150、200μM/ml时突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率分别为15±3％、67±4％、74±5％、80±3％、83±3％，与对照组比较，均P＜0.01(见图1)。
X-13作用浓度为10、50、100、150、200μM/ml时突出到肠下血管篮外到卵黄的垂直分枝血管数频率分别为15±3％、67±4％、74±5％、80±3％、83±3％，与对照组比较，均P＜0.01(见图1)。
[0070] 本实施例结果表明，X-13在新生血管的发生和发展中具有明显作用，且呈现剂量依赖(10-200uM)效应。因此，X-13不仅有可能成为治疗缺血性脑卒中的药物，也可能对其它缺血性相关疾病具有潜在应用价值，且可能成为该类疾病预防和治疗的核心药物。
[0071] 实施例15X-13对人脐静脉内皮细胞的促血管生成作用
[0072] (一)材料与方法
[0073] 1、药物：X-13，白色粉末。溶于DMSO，贮存浓度200mmol/L，保存于-20℃备用。
[0074] 2、人脐静脉内皮细胞的培养和实验分组
[0075] 人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)采用F-12K培养，于37℃5％CO2培养箱中进行培养。细胞培养瓶及实验中采用的24孔板在使用前先覆盖一层含有0.1％的明胶，实验中取2-5代进行实验。实验分为阳性对照组(VEGF)、X-13组及对照组。阳性对照组含浓度为
20ng/ml的VEGF和0.1％DMSO，X-13组设为10、50、100、150、200μM/ml 5个剂量组，对照组只加含有0.5％FBS和0.1％DMSO的培养液。
20ng/ml的VEGF和0.1％DMSO，X-13组设为10、50、100、150、200μM/ml 5个剂量组，对照组只加含有0.5％FBS和0.1％DMSO的培养液。
[0076] 3、细胞迁移实验检测加药后细胞迁移能力
[0077] 取HUVEC按每孔1×105/500μL接种于24孔板。正常培养24小时后弃去培养液，换上只含有0.5％FBS的培养液预处理24小时以达到细胞同步化。然后，用单位为100μl的移液器滴头在每个孔中沿培养板底部呈“一”字形划痕，在50倍倒置荧光显微镜和CCD相机下每孔任意选取3个视野拍照以记录划痕区的相对距离。按500uL/孔加入含药培养液，每个剂量组设3个复孔，继续培养16小时后，参照先前拍照方式记录加药后划痕区的相对距离。
[0078] 4、细胞侵入实验检测X-13对细胞侵入能力的影响
[0079] 本实验采用Transwell chamber进行。利用微孔滤膜(孔径8μm)把小室分隔上、下二层。实验前滤膜的上、下层预先覆盖体积比分别为1∶30和1∶100(用PBS稀释)的4
Matrigel。取HUVEC按每孔5×10/300μL注入chamber上层。chamber下层按500μl/孔注入含药液的培养液，每个剂量组设3个复孔，继续培养7小时后，取出chamber，经PBS蘸洗后，用3.7％多聚甲醛固定，擦净滤膜内表面细胞，采用浓度为20μg/ml的Hoechst 33342染色，撕下微孔滤膜于载玻片上，100倍荧光显微镜下随机选取3个视野拍照，经Metamorph Imaging Series计算侵入下层的细胞数目。
Matrigel。取HUVEC按每孔5×10/300μL注入chamber上层。chamber下层按500μl/孔注入含药液的培养液，每个剂量组设3个复孔，继续培养7小时后，取出chamber，经PBS蘸洗后，用3.7％多聚甲醛固定，擦净滤膜内表面细胞，采用浓度为20μg/ml的Hoechst 33342染色，撕下微孔滤膜于载玻片上，100倍荧光显微镜下随机选取3个视野拍照，经Metamorph Imaging Series计算侵入下层的细胞数目。
[0080] 5、管形形成实验观察加入X-13后细胞分化情况。
[0081] 微量移液枪头和24孔板在冰上预冷，从-20℃冰箱中取出Matrigel放在4℃冰箱中过夜，使之成为液态。在24孔板中每孔注入300μL体积比为1∶1(用PBS稀释)的Matrigel小心摇动使之均匀分布于孔的各个部位，并避免产生气泡。所有操作必须在冰上进行。然后将24孔板放入37℃5％CO2培养箱中30分钟。经过清洗、消化后的用含有0.5％5
PBS的培养液进行收集，按每孔1×10/500uL接种于覆盖Matrigel的24孔板中。每个剂量组设3个复孔，继续培养6小时后，在50倍荧光显微镜下每孔随机选取3个视野进行拍照，通过的图像处理软件计算管道交叉点的数目。
PBS的培养液进行收集，按每孔1×10/500uL接种于覆盖Matrigel的24孔板中。每个剂量组设3个复孔，继续培养6小时后，在50倍荧光显微镜下每孔随机选取3个视野进行拍照，通过的图像处理软件计算管道交叉点的数目。
[0082] 6、统计分析
[0083] 数据资料以均数±标准差(x±s)表示。统计学处理由计算机运用SPSS 11.0软件进行，组间差异比较用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
[0084] (二)实验结果
[0085] 1、细胞迁移实验
[0086] 细胞划痕后16小时，VEGF组划痕区相对距离明显减少，细胞迁移率为60.00％。X-13组浓度在10、50、100、150、200uM/ml时细胞迁移率分别为5.00％、16.67％、38.33％、
48.33％、55.00％(见图2)。与对照组比较，除10μM浓度组外，均P＜0.01，表明X-13能够明显增强HUVEC的迁移能力，且作用呈量-效关系。
48.33％、55.00％(见图2)。与对照组比较，除10μM浓度组外，均P＜0.01，表明X-13能够明显增强HUVEC的迁移能力，且作用呈量-效关系。
[0087] 2、细胞侵入实验
[0088] 通过Transwell chamber检测X-13对细胞侵入能力的影响，VEGF能很大程度地诱导HUVEC由微孔滤膜上层侵入到下层，侵入率为59.26％；X-13组侵入下层的细胞数目也明显增多，浓度为10、50、100、150、200μM/ml时细胞侵入率分别为3.70％、24.07％、35.19％、46.30％、51.85％(见图3)。与对照组比较，除10μM浓度组外，均P＜0.01，表明X-13能够明显增强HUVEC的侵入能力，且作用呈量-效关系。
[0089] 3、管形形成实验
[0090] 与对照组比较，VEGF组形成管状结构的数目明显增多，加入X-13后其管状结构也有所增多，并逐渐交织成网。图像经分析量化后发现：管状分枝点的数目对照组为19/视野，VEGF组为31/视野，X-13组浓度在10、50、100、150、200μM/ml时其数目分别为22、23、25、27、29/视野(见图4)，与对照组比较，均P＜0.01，表明X-13能明显促进管状结构的形成，且作用呈量-效关系。
[0091] 本实施例结果表明，X-13能够明显促进血管内皮细胞侵入、迁移和管状结构的形成，X-13在新生血管的发生和发展中具有明显作用，且呈现剂量依赖(50-200μM)效应。