一种抗重金属锌的单克隆抗体

摘要

本发明公开了一种抗重金属锌的单克隆抗体。该单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Z1A5 CCTCC NO：C200942分泌得到的。本发明的抗重金属锌的单克隆抗体的效价高。利用本发明的抗体可以用于锌离子残留的免疫学检测。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。

权利要求

1.杂交瘤细胞株Z1A5，其保藏编号为CCTCC NO：C200942。

2.由杂交瘤细胞株Z1A5CCTCC NO：C200942分泌得到的单克隆抗体。

3.权利要求2所述单克隆抗体在检测样品中是否含有锌中的应用。

4.权利要求2所述单克隆抗体在检测样品中锌的含量中的应用。

说明书

一种抗重金属锌的单克隆抗体

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗重金属锌的单克隆抗体。

背景技术

[0002] 随着科技的进步和工业的发展，人们的生活水平有了很大的提高。但是在工业高速发展的同时，也带来了一系列环境问题。1931-1972年发生于日本富山县神通川流域的痛痛病和1953年发生于日本熊本县水鱼湾渔村的水俣病都是由食物受到重金属污染引发的，这些悲剧事件引发了人们对环境中重金属污染的关注。

[0003] 什么是重金属呢？重金属系指密度4.0以上约60种元素或密度在5.0以上的45种元素。环境污染方面所指的重金属主要是指生物毒性显著的汞、镉、铅、铬以及类金属砷，也包括具有一定毒性的金属，如锌、铜、镍、锡等元素。重金属不能被微生物降解为无害物，它们在水体中富集起来，造成水体污染，最终危害人类身体健康。目前最引起人们注意的是汞、镉、铬等。砷和锡是非金属，但它们的毒性类似于重金属，一般都算作重金属。有些重金属元素是人体和其它生物体必需的元素，但是其浓度超过一定范围就会引起中毒。

[0004] 许多重金属属于生命体必须的微量元素。一旦缺少某种或某几种，就会使生命体健康受到威胁。但无论必须元素还是有毒元素，人体对它的忍受都要有一定的限度，超过这个限度后便会对生命造成危害。

[0005] 随着现代工业的迅猛发展，重金属在工农业生产中的广泛应用，人们在制造GDP和财富的同时，人为活动引起的环境污染也在加剧。其中铅、汞、镉污染最为剧烈。它通过被浸透的土壤和生长在其上的植物，经过食物链对动物和人体产生毒害作用。

[0006] 对重金属的常规性检测方法已经有很多种，有些也已经是非常成熟的技术，但因为重金属离子存在的范围很广，根据检测精度、方便程度和检测成本，每种技术都有它们的局限性，同时还需合适的场所，因此都不利于在生产中推广应用。建立更快速、更经济的免疫分析法检测汞离子是生产及经济发展的需要。

[0007] 锌参与体内200多种酶的合成和活化，是动物生长发育及维持正常生理机能所必须的微量元素，对动物的生长发育、生产性能、繁殖和免疫功能等方面均有着重要的影响，但摄入过量的锌会导致机体代谢紊乱。肝脏、肾脏、胰脏、骨和心肌贮存锌的能力较强。过量的锌是一种作用迅速的中枢神经毒素，通过对神经细胞的直接损害及对体内各种物质的拮抗而影响脑功能。有报道鹦鹉因啃咬镀锌铁丝制成的鸟笼而普遍出现神经症状。高锌还可明显抑制红细胞的免疫功能，造成雏鸡肝、脾的结构和功能受损(Cui HM，Zhao CY，Li DB，et al.Effect of high Zinc on immune function in chicken.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2005，36(3)：240-245)。日粮锌(ZnSO4)添加为1300mg/kg时，会导致雏鸭患白肌病，肌胃、小肠平滑肌、骨骼肌和心肌受损(Cui HM，Peng X，Fang J，et al.Studies on pathologyof Zinc toxicity in ducklings.Acta Veterinaria etZootechnica Sinica，2004，35(2)：217-221)。

[0008] 总之，重金属是一种很危险的污染物。污染环境中存在的高浓度重金属，对生物的生理活动能产生多种影响，使一些生物发生病害甚至死亡，最终使生态系统平衡被破坏、生态环境恶化。重金属通过食物链可以在人体中积累，引起多种疾病甚至癌症，而且危害还可以遗传到下一代。因此，痕量重金属的定量分析在食品和环境检测等方面都是非常重要的。传统的重金属离子检测方法主要有原子吸收光谱法(AtomicAbsorption Spectroscopy)、紫外分光光度法(Ultra-violet Spectroscopy)、阳极溶出伏安法(Anodic Stripping Voltammeter)、示波极谱法(Oscillopolarography)和各种仪器联用技术，如电感耦合等离子体质谱法(Inductively Coupled Plasma-MassSpectrometry)、电感耦合等离子体原子发射光谱分析(Inductively CoupledPlasma-Atomic Emission Spectrometry)、氢化物发生-原子吸收法(HydrideGeneration-Atomic Absorption Spectrometry)等。检测仪器昂贵，样品要经过湿法消解或微波消解，逐个测定单种重金属浓度，测量精度虽可达到mg/kg或更高，但检测步骤繁琐，检测成本高，需耗时2天左右，难以适应环境及市场产品的现场抽查及产品进出口快速通关的要求。

发明内容

[0009] 本发明的一个目的是提供杂交瘤细胞株及其分泌的抗重金属锌的单克隆抗体。

[0010] 本发明所提供的杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株Z1A5，其保藏编号为CCTCC NO：C200942。

[0011] 由杂交瘤细胞株Z1A5 CCTCC NO：C200942分泌得到的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

[0012] 本发明的另一个目的是提供一种抗原。

[0013] 本发明所提供的抗原是按照包括如下步骤的方法制备得到：

[0014] 1)将可溶性锌盐溶液与螯合剂溶液混合，进行络合反应，得到锌离子与螯合剂的络合物；

[0015] 2)在步骤1)的基础上，再加入载体蛋白和偶联缓冲液，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述络合物的偶联物，即为抗原。

[0016] 所述步骤1)中，所述可溶性锌盐与所述螯合剂的投料比满足如下条件：所述可溶2+
性锌盐中的Zn 与所述螯合剂的投料的物质的量比为1∶1；

[0017] 所述步骤2)中，所述螯合剂与所述载体蛋白的投料比满足如下条件：所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5∶1。

[0018] 所述步骤1)中，所述络合反应在pH值为7.4的条件下进行；

[0019] 所述步骤2)中，所述偶联反应在pH值为9.0的条件下进行。

[0020] 所述步骤1)中，所述络合反应的温度为25℃，所述络合反应的时间为10分钟；

[0021] 所述步骤2)中，所述偶联反应的温度为25℃，所述偶联反应的时间为12小时。

[0022] 所述步骤1)中，所述螯合剂的分子式为C22H28N4O10S·3HCl；

[0023] 所述步骤1)中，所述可溶性锌盐溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将锌粉溶于浓度为68％(体积百分含量)的HNO3水溶液中，且使锌粉完全反应，得到所述可溶性锌盐溶液；

[0024] 所述步骤1)中，所述螯合剂溶液按照包括如下步骤的方法制备得到：将所述螯合剂加入到pH值为9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液中，得到所述螯合剂溶液；

[0025] 所述步骤2)中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白；

[0026] 所述步骤2)中，所述偶联缓冲液为pH9.73、浓度为1.4165g/50mL的HEPES缓冲液。

[0027] 本发明的另一个目的是提供一种不完全包被原。

[0028] 本发明所提供的不完全包被原，按照包括如下步骤的方法制备得到：将螯合剂、载体蛋白和反应缓冲液混合，在pH至9.0、25℃的条件下反应12小时，得到不完全包被原。

[0029] 上述不完全包被原中，所述反应缓冲液为pH值为9.73的HEPES缓冲液；

[0030] 上述不完全包被原中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白；

[0031] 上述不完全包被原中，所述螯合剂的分子式为C22H28N4O10S·3HCl；

[0032] 上述不完全包被原中，所述螯合剂与所述载体蛋白中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5∶1。

[0033] 上述单克隆抗体在检测样品中是否含有锌中的应用也属于本发明的保护范围。

[0034] 上述单克隆抗体在检测样品中锌的含量中的应用也属于本发明的保护范围。

[0035] 本发明的抗重金属锌的单克隆抗体的效价高。利用本发明的抗体可以用于锌离子残留的免疫学检测。并利用其快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，发展便于现场检测的便携方法，从而适用于农畜产品的抽样检测及进出口通关的快速检验。对提高风险评估工作的效率和质量，保障食品安全有重要现实意义。

附图说明

[0036] 图1为Zn螯合剂包被抗原的紫外扫描图谱；

[0037] 图2为Zn螯合剂免疫抗原的紫外扫描图谱；

[0038] 图3为细胞株Z1A5分泌抗体与p-SCN-Bn-DTPA结合系数测定结果；

[0039] 图4为杂交瘤细胞株Z1A5分泌抗体的亚型；

[0040] 图5为单克隆抗体效价的检测；

[0041] 图6为细胞株Z1A5分泌抗体特异性鉴定；

[0042] 图7为Z1A5分泌抗体的稳定性；

[0043] 图8为Zn-DTPA-BSA，DTPA-BSA及载体蛋白BSA的SDS-PAGE电泳图；

[0044] 图9为Zn-DTPA-KLH，载体蛋白KLH的SDS-PAGE电泳图；

具体实施方式

[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0047] 实施例1、抗原和不完全包被原的制备

[0048] 一、制备

[0049] p-SCN-Bn-DTPA购自美国Macrocyclics，货号为B-305。

[0050] 产品名：p-SCN-Bn-DTPA。

[0051] 英文名：2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaaceticacid[0052] 别名：S-2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-Diethylenetriamine Pentaacetic Acid[0053] 分子式：C22H28N4O10S·3HCl。

[0054] pH值为9.73的HEPES缓冲液：1.4165g HEPES，去离子水溶解，用10mol/L的KOH水溶液调pH至9.73，去离子水定容至50mL，过滤除菌，4℃保存。浓度为1.4165g/50mL。

[0055] pH值为7.4的HEPES缓冲液：14.165g HEPES，去离子水溶解，用10mol/L的KOH水溶液调pH至7.4，去离子水定容至500mL。浓度为1.4165g/50mL。

[0056] A液：30mg锌粉溶于200uL 68％(体积百分含量)的浓HNO3水溶液中，得到浓度为150mg/mL的Zn(NO3)2溶液。

[0057] B液：10.668mg p-SCN-Bn-DTPA，加入0.4mL pH9.73的HEPES缓冲液，终浓度为26.67mg/mL。

[0058] C液：20mg BSA溶于0.4mL pH7.4的HEPES缓冲液，得到浓度为50mg/mL的溶液。

[0059] B1液：称取10mg p-SCN-Bn-DTPA溶于0.6mL pH9.73的HEPES缓冲液，得到浓度为16.67mg/mL的溶液。

[0060] C1液：浓度为5.9mg/mL的匙孔血蓝蛋白(KLH)溶液；共1.695mL。

[0061] C1液购自Sigma，货号：H8283。

[0062] 中文名：匙孔血蓝蛋白(KLH)。

[0063] 产品英文名：Hemocyanin from Megathura crenulata(keyhole limpet)。

[0064] 1、Zn-DTPA-BSA和Zn-DTPA-KLH的制备

[0065] Zn-DTPA-BSA的制备：(1)取0.4mL的B液加入反应器，再加入7μLA液，在pH为7.4、室温(25℃)下反应10分钟，得到Zn-DTPA母液；(2)再向其中加入1.2mL pH9.73的HEPES缓冲液、C液0.4mL，调节pH至9.0，室温(25℃)下搅拌，反应12小时，得到
2+
Zn-DTPA-BSA。步骤(1)中，Zn(NO3)2中的Zn 与p-SCN-Bn-DTPA的投料的物质的量比为
1∶1。步骤(2)中，p-SCN-Bn-DTPA与BSA中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5∶1。

[0066] Zn-DTPA-KLH：(1)取0.133mL的B1液加入反应器，再加入A液7.5μL，在pH为7.4、室温(25℃)下反应10分钟，得到Zn-DTPA母液；(2)再向其中加入0.14mL pH9.73的HEPES缓冲液、C1液1.695mL，调节pH至9.0，室温(25℃)下搅拌，反应12小时。步骤
2+
(1)中，Zn(NO3)2中的Zn 与p-SCN-Bn-DTPA的投料的物质的量比为1∶1。步骤(2)中，p-SCN-Bn-DTPA与KLH中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5∶1。

[0067] CentriconYM-30超滤离心管预先用0.1mol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)溶液浸泡过夜，然后用pH9.73的HEPES缓冲液充分冲洗。偶联反应后，用CentriconYM-30超滤离心管对蛋白质复合物进行分离纯化，即用CentriconYM-30过滤除去没有参与反应的过量的2+
金属离子Zn 和螯合剂DTPA及Zn-DTPA，分离纯化时先用pH9.73的HEPES缓冲液洗涤超滤管一次，再用pH7.4的HEPES缓冲液洗涤两次。

[0068] 2、DTPA-BSA的制备

[0069] DTPA-BSA的制备：取0.4mL的B液加入反应器，再向其中加入1.2mL pH9.73的HEPES缓冲液、C液0.4mL，再加pH9.73的HEPES缓冲液将调节pH至9.0，室温(25℃)下搅拌，反应12小时，得到DTPA-BSA。反应中p-SCN-Bn-DTPA与BSA中的赖氨酸的投料的物质的量的比为5∶1。

[0070] 分离纯化步骤同步骤1。

[0071] 纯化后所得的抗原分装于-20℃保存，长期保存存于-80℃。

[0072] 二、抗原的鉴定

[0073] 1、抗原的浓度测定

[0074] 参照BCA试剂盒步骤，用BCA法构建浓度检测标准曲线。蛋白浓度测定标准曲线的绘制：在聚苯乙烯微孔板上，分别将2mg/mL的BSA标准蛋白稀释至浓度为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL，0μg/mL。用BCA蛋白定量试剂盒测定570nm的光吸收值。以吸收值减去空白值得到的数值对BSA含量作图，绘出标准曲线。KLH的标准曲线绘制原理同BSA。抗原浓度的测定：将分离纯化后的抗原样品适当稀释，用BCA蛋白定量试剂盒测定570nm的光吸收值，通过标准曲线计算样品溶液中抗原浓度。

[0075] 结果表明，利用BCA法检测分离纯化后的的Zn-DTPA-BSA、Zn-DTPA-KLH、DTPA-BSA中蛋白的实际浓度依次为25.155±0.038mg/mL，4.195±0.014mg/mL，9.242±0.015mg/mL(见表1)。

[0076] 表1.BCA法检测抗原中蛋白浓度

[0077]

[0078] 2、抗原与载体蛋白的紫外扫描图谱

[0079] 用pH 7.4的HEPES缓冲液作空白，取10μL C液，88μL C1液及其相应的抗原及不完全包被原，用pH 7.4的HEPES缓冲液稀释至蛋白浓度为0.5mg/mL，在波长228-320nm范围内进行紫外扫描。

[0080] 如图1所示，BSA在235nm，278nm各有一个吸收波峰，不完全包被原DTPA-BSA在231nm，278nm也各属于吸收值，完全抗原Zn-DTPA-BSA与其相应的载体蛋白和不完全包被原相比，在229nm-278nm之间属于高吸收值的区域，载体蛋白和抗原的紫外扫描曲线在
229nm-278nm之间完全没有重叠之处。完全抗原Zn-DTPA-BSA紫外扫描的特征既具有BSA的特征，还具有DTPA-BSA的特征。这证明了抗原合成成功。

[0081] 如图2所示，KLH在238nm，282nm各有一个吸收波峰，完全抗原Zn-DTPA-KLH与其相应的载体蛋白相比，在238nm，282nm也各有一个吸收波峰，载体蛋白和抗原的紫外扫描曲线在228nm-320nm之间完全没有重叠之处。完全抗原Zn-DTPA-KLH紫外扫描的特征具有KLH的特征。这证明了抗原合成成功。

[0082] 3、抗原中全Zn的含量

[0083] 用pH 7.4的HEPES缓冲液作空白做空白，将离心纯化后的抗原用pH 7.4的HEPES缓冲液稀释适当倍数后，参照国标GB/T 17141-1997，用石墨炉原子吸收光谱法检测抗原中的Zn2+浓度(Khosraviani M，Pavlov A R，Flowers G C，et al.Detection of heavymetals by immunoassay：optimization and validation of a rapid，portable assay for ioniccadmium.Environmental science&technology，1998，32：137-142)。

[0084] 石墨炉原子吸收光谱法检测抗原中全Zn的含量结果如表2所示，通过石墨炉原子吸收光谱法检测Zn-DTPA-BSA、Zn-DTPA-KLH、DTPA-BSA、DTPA-KLH、HEPES中的含量依次为：295±0.3μg/mL，49.5±0.5μg/mL，0μg/mL，0μg/mL，0μg/mL(表2)。说明金属离子通过螯合剂连到蛋白质上，进一步证明抗原合成成功。

[0085] 表2.人工抗原中Zn的含量

[0086]

[0087] 4、抗原SDS-PAGE电泳

[0088] 用5％浓缩胶，6％分离胶，点样量20μL/孔，对BSA、DTPA-BSA、Zn-DTPA-BSA进行垂直SDS-PAGE电泳。用3％浓缩胶，5％分离胶，点样量15μL/孔，对KLH、Zn-DTPA-KLH进行垂直SDS-PAGE电泳。步骤如下：

[0089] 取各样品做好稀释，分别与载样缓冲液等体积混合在99℃预热8min，然后加入凝胶样品孔中，记录样品序号。

[0090] 电泳时在浓缩胶中电流用10mA，进入分离胶时用20mA，当溴酚蓝到达底部时关闭电源。

[0091] 电泳结束后，用考马斯亮蓝G-250染色、脱色。

[0092] 扫描仪扫描并保存图片。

[0093] 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH 8.8，5.45g Tris，加5mL蒸馏水预溶，用2MHCl调pH至8.8，定容至30mL，4℃保存。

[0094] 浓缩胶缓冲液：0.494mol/L Tris-HCl，pH6.8，0.598g Tris，加5mL蒸馏水预溶，用2MHCl调pH至6.8，定容至10mL，4℃保存。

[0095] 丙稀酰胺贮备液：8.73g Acr，0.27g Bis，加蒸馏水至30mL，不溶物用过滤法除去，棕色瓶4℃避光保存。

[0096] 10％SDS(十二烷基磺酸钠)：1.0g SDS在68℃加热条件下溶于一定量蒸馏水，用浓HCl调溶液pH值至7.2，再加蒸馏水至10mL，室温保存。

[0097] 10％过硫酸铵：1.0gAP，加蒸馏水至10mL，4℃避光保存。

[0098] Tris-Gly电极缓冲液：Tris 3.0g，Gly 14.4g，SDS 1.0g，调pH至8.3，定容至1000mL，4℃保存。

[0099] 样品缓冲液：SDS 1.6g，4％巯基乙醇0.80mL，10％甘油2.0mL，0.01％溴酚蓝1.0mg，用10mM磷酸钠/钾(pH7.0)定容至20mL，4℃保存。

[0100] 5％浓缩胶：H2O 2.7mL，Acr/Bis 0.67mL，浓缩胶缓冲液0.5mL，10％SDS 0.04mL，10％过硫酸铵0.04mL，TEMED 0.004mL。

[0101] 6％分离胶：H2O5.32mL，Acr/Bis 1.98mL，分离胶缓冲液2.5mL，10％SDS 0.04mL，10％过硫酸铵0.1mL，TEMED 0.004mL。

[0102] 3％浓缩胶：H2O 2.968mL，Acr/Bis 0.402mL，浓缩胶缓冲液0.5mL，10％SDS0.04mL，10％过硫酸铵0.04mL，TEMED 0.004mL。

[0103] 5％分离胶：H2O 5.65mL，Acr/Bis 1.65mL，分离胶缓冲液2.5mL，10％SDS 0.04mL，10％过硫酸铵0.1mL，TEMED 0.004mL。

[0104] 结果如图8所示(M：Marker，1：BSA，2：DTPA-BSA，3：Zn-DTPA-BSA)。显示，由于DTPA-BSA上交联有螯合剂，与BSA相比，分子量变大，DTPA-BSA电泳图带滞后且较模糊。同2+
理Zn-DTPA-BSA与DTPA-BSA及BSA相比，分子量变大，且由于Zn 带正电，所以电泳图带滞后且模糊。

[0105] 由于KLH分子量大(大于2000kDa)，实验中使用还原SDS-PAGE。结果如图9所示(M：Marker，1：KLH，2：Zn-DTPA-KLH)。图9中3条带是KLH使用二巯基乙醇切后的亚基条带，分子量虽然无法确定，但可以看出，二巯基乙醇切后的Zn-DTPA-KLH与KLH的各亚基相2+
比，分子量变大，且由于Zn 带正电，所以电泳图带滞后且较模糊，可判断亚基上已交联上不完全包被原，由此可定性判断抗原合成成功。

[0106] 实施例2、单克隆抗体的制备及功能验证

[0107] 一、单克隆抗体的制备

[0108] (一)杂交瘤细胞株Z1A5的制备

[0109] 1、小鼠的免疫及融合小鼠的选择

[0110] 1)基础免疫：首免时，选择8周龄的BABL/c小鼠体重约23-25g)取蛋白浓度为4.195mg/mL的免疫抗原液Zn-DTPA-KLH与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀后乳化1小时～
2小时直到滴入水中不扩散，每只BABL/c腹腔注射200μg Zn-DTPA-KLH抗原。三周后第二次免疫，相同剂量抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫，以后每隔两周免疫一次，方法同第二次免疫。第三次免疫及以后每次免疫后7天，尾静脉采血，分离血清，测定血清的效价和产生抗体的特异性。

[0111] 2)加强免疫：融合前3天加强免疫小鼠，加强免疫无需乳化，所用抗原Zn-DTPA-KLH剂量为600ug/只。

[0112] 3)融合小鼠的选择：用间接ELISA法选择融合小鼠，方法如下：

[0113] ①包被：用HBS(10mmol/L，pH7.4)稀释Zn-DTPA-BSA和DTPA-BSA，并以相同的浓度2.5mg/L分别包被到96孔酶标板上，50μL/孔，4℃过夜或37℃孵化2小时；②封闭：PBST洗涤5次，拍干，按100μL/孔加3％BSA，37℃封闭1小时；③一抗：洗涤同上，加入相同的待检血清，以未免疫小鼠的血清作阴性对照，50μL/孔，37℃孵化1小时；④酶标二抗：
洗涤同上，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG/IgM(混合物)1∶5000稀释后，50μL/孔，
37℃孵育1小时；⑤显色：洗涤同上，加入显色液TMB，50μL/孔，37℃孵育15min；⑥终止反应：按50μL/孔加1N盐酸终止反应；⑦酶标仪上测OD450值，以空白孔调零。

[0114] 2.骨髓瘤细胞(SP2/0)的培养

[0115] 融合前36-48h将SP2/0细胞分瓶扩大培养于75cm2细胞瓶内。融合当天，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50mL离心管内，1000rpm离心5min，然后用DMEM营养液(GIBCO公司，目录号为12800-017)重新悬浮，取少量台盼蓝染色计数，保证细胞成活率大于90％以上，用于细胞融合。

[0116] 3、免疫脾细胞的制备

[0117] 在加强免疫后第三天取免疫小鼠，摘除眼球放血并分离血清作为抗体检测时阳性对照；将颈椎脱臼处死的小鼠置75％酒精中浸泡5min，置超净工作台蜡盘内；无菌取出小鼠脾脏，放入盛有10mL DMEM营养液的平皿中，轻轻漂洗，除去附着的结缔组织与脂肪；用剪刀剪碎脾脏，置于200目铜网上，用注射器内芯研磨脾脏，并用DMEM营养液冲洗使脾细胞全部通过网孔进入溶液中；将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM营养液至30mL，混匀，1000rpm离心8min，弃上清液；同法离心、洗涤细胞一次，然后将细胞悬于10mL DMEM营养液中混匀；取上述细胞混悬液进行计数备用。

[0118] 4、饲养细胞的制备

[0119] 细胞融合的前一日，将未经免疫的BALB/c小鼠(8-12周龄)眼球采血，颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精5min，置超净工作台蜡盘内，腹部向上固定；将BALB/c小鼠皮肤用消毒镊子提起，小心剪开腹部皮肤，分离皮肤与腹膜，充分暴露腹膜；用无菌注射器吸取适量DMEM营养液注入腹腔，按摩腹部，待腹腔细胞与注入的营养液充分混合后，轻轻吸回营养液加入无菌离心管内，重复冲洗2-3次；所得液体1000rpm离心5min，弃上清液。向沉淀中加入10mL DMEM营养液，重新吹散细胞，取上述细胞混悬液进行台盼蓝染色计数；用含5
HAT(Sigma公司，目录号H0262)的培养液悬浮细胞，调整细胞浓度为1-2×10 个/mL，加入
96孔细胞培养板中(100μL/孔)，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养备用。

[0120] 5、细胞融合

[0121] 将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按5-10∶1比例混合于离心管内，1000rpm离心8min，弃上清液，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状；用1mL移液管吸取预热至37℃的50％PEG(WT 1450 Sigma公司，目录号P5402)(PH8.0)溶液1mL，沿转动的管壁缓缓滴入，控制在60s加完，然后将细胞悬液吸入移液管(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其吹入离心管内(时间也控制在30s左右)；在5min内向离心管内加入25mL DMEM营养液终止融合作用；将融合后的细胞液1000rpm离心5min，弃上清液，用37℃水浴预热的含HAT培养液重悬；加入有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔，置37℃、5％CO2的培养箱中培养。每天记录细胞生长情况，融合后第四天，用1％HAT选择培养液半量换液，约7-10天，改用1％HT(Sigma公司，目录号H0137)选择培养液半量换液继续培养。

[0122] 6、阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆化

[0123] 每天观察细胞的生长情况，融合后3-5天，可见有克隆细胞生长，待细胞集落生长至孔底的1/3-1/2时，对其上清液用间接ELISA方法进行检测，对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，以有限稀释法克隆三次，使阳性率达100％，注意及时冻存细胞，然后扩大培养以制备腹水，并将一部分细胞连续传代、冻存、复苏，观察细胞分泌单克隆抗体的稳定性。

[0124] 得到稳定分泌抗锌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Z1A5，该细胞株已于2009年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编
430072)，保藏号为CCTCC NO：C200942。

[0125] (二)单克隆抗体的大量制备

[0126] 在获得分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆后，通常以两种方法大量生产单克隆抗体：一种是体外培养法，不含其他免疫球蛋白，易于纯化。另一种是动物体内诱生法制备单克隆抗体，利用纯系小鼠诱发腹水，该法产量和效价多很高，是目前大量获得单抗的主要途径。

[0127] 体外法培养法：将对数生长期的杂交瘤细胞Z1A5 CCTCC NO：C200942在CELLine CL1000膜支持的细胞培养系统中用含10％FBS的DMEM中培养，37℃，5％CO2培养箱中培养7天收集上清即获得单克隆抗体。

[0128] 体内培养法：采用小鼠体内诱生法，取8周龄健康BALB/c雌性小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.5mL/只，10-15天后使用。将细胞瓶中培养的杂交瘤细胞Z1A5吹下来，1000rpm离心10min弃上清液，收集细胞沉淀。用DMEM基础培养液将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞6
数调至10/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。密切观察动物的健康状况与腹水征象，接种细胞7-10天后产生腹水，待腹水尽可能多，处死小鼠，用滴管将腹水收集到离心管中。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/mL，此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。将腹水
12000rpm离心10min，弃去上层的脂肪、石蜡油和下层的沉淀，小心抽去中层的淡黄色清凉液体，即获得单克隆抗体，-20℃冷冻保存。

[0129] 二、抗体的功能

[0130] 1、DTPA浓度对抗体的影响

[0131] ①包被：用HBS(10mmol/L，pH7.4)稀释Zn-DTPA-BSA，并以浓度2.5mg/L包被到96孔酶标板上，50μL/孔，4℃过夜或37℃孵化2小时；②封闭：PBST洗涤5次，拍干，按
100μL/孔加3％BSA，37℃封闭1小时；③一抗：洗涤同上，加入细胞株Z1A5分泌的抗体
25uL与不同浓度的p-SCN-Bn-DTPA 25uL混合后静置1小时，以SP2/0上清代替细胞株Z1A5分泌的抗体作阴性对照，50μL/孔，37℃孵化1小时；④酶标二抗：洗涤同上，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgM1∶10000稀释后，50μL/孔，37℃孵育1小时；⑤显色：洗涤同上，加入显色液TMB，50μL/孔，37℃孵育15min；⑥终止反应：按50μL/孔加1N盐酸终止反应；
⑦酶标仪上测OD450值，以空白孔调零。从图3可见，抗体与浓度低于20mMp-SCN-Bn-DTPA结合较小，而20mM p-SCN-Bn-DTPA远远高于锌的浓度，结果说明细胞株Z1A5分泌的抗体不与
2+
p-SCN-Bn-DTPA反应，而是针对金属Zn 或Zn-DTPA。

[0132] 2、单克隆抗体类型及亚型鉴定

[0133] 利用鼠单抗亚型鉴定试剂盒ISOStripTMMonoclonal Antibody Isotyping Kit对杂交瘤细胞株所分泌的抗体进行亚类鉴定。取稀释液0.15mL加入试剂盒小管中，室温放置1min。待其自然溶解后，轻轻混匀。然后将试剂条插到小管底部，大约5min后，当最前端条带在两对“+”中间出现时，即可见与杂交瘤细胞株所分泌的抗体亚类和轻链类型对应的指示条带所在位置，从而确定抗体亚型，结果杂交瘤细胞Z1A5所分泌的抗体为IgM亚类，轻链为κ型(图4)。

[0134] 3、抗体效价测定

[0135] 检测体外培养杂交瘤细胞Z1A5得到的抗体的效价。

[0136] 间接ELISA方法如下：①包被：用HBS(10mmol/L，pH7.4)稀释Zn-DTPA-BSA至BSA蛋白浓度为2.5mg/L，包被到96孔酶标板上，50μL/孔，4℃过夜或37℃孵化2小时；②封闭：PBST洗涤5次，拍干，按100μL/孔加3％BSA，37℃封闭1小时；③一抗：洗涤同上，不同稀释度的体外培养得到的抗体，以SP2/0上清作阴性对照，50μL/孔，37℃孵化1小时；④酶标二抗：洗涤同上，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgM1∶10000稀释后，50μL/孔，
37℃孵育1小时；⑤显色：洗涤同上，加入显色液TMB，50μL/孔，37℃孵育15min；⑥终止反应：按50μL/孔加1N盐酸终止反应；⑦酶标仪上测OD450值，以空白孔调零。

[0137] 实验设3次重复，结果取平均数。结果如表3和图5所示。结果显示，间接ELISA方法杂交瘤细胞株Z1A5细胞培养上清液效价达1∶51200。

[0138] 表3、抗体的效价

[0139]稀释度 平均值 STDEV
1∶200 1.028 0.033941
1∶400 0.877 0.046669
1∶800 0.772 0.025456
1∶1600 0.632 0.001414
1∶3200 0.364 0.001414
1∶6400 0.213 0
1∶12800 0.1325 0.000707
1∶25600 0.074 0
1∶51200 0.0565 0.00495
SP2/0 0.034 0.002

[0140] 4、细胞株Z1A5分泌抗体特异性鉴定

[0141] 用间接ELISA法①包被：用HBS(10mmol/L，pH7.4)分别稀释Zn-DTPA-BSA和DTPA-BSA至BSA蛋白浓度为2.5mg/L，分别包被到96孔酶标板上，50μL/孔，4℃过夜或37℃孵化2小时；②封闭：PBST洗涤5次，拍干，按100μL/孔加3％BSA，37℃封闭1小时；
③一抗：洗涤同上，加入细胞株Z1A5培养上清，SP2/0细胞上清做阴性对照，50μL/孔，37℃孵化1小时；④酶标二抗：洗涤同上，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgM 1∶10000稀释后，50μL/孔，37℃孵育1小时；⑤显色：洗涤同上，加入显色液TMB，50μL/孔，37℃孵育
15min；⑥终止反应：按50μL/孔加1N盐酸终止反应；⑦酶标仪上测OD450值，以空白孔调零。

[0142] 实验设3次重复，结果取平均数。结果如图6所示。结果显示细胞株Z1A5分泌的抗体与Zn-DTPA-BSA反应的OD450高于与DTPA-BSA反应的OD450，阴性对照的OD450低于0.05，2+
说明此株细胞分泌的抗体针对Zn 特异性高。

[0143] 5、杂交瘤分泌抗体稳定性的测定

[0144] 将杂交瘤细胞株冻存后，过一段时间再复苏并且连续培养后测抗体效价。检测方法同抗体效价测定所用间接ELISA方法。

[0145] 经检测显示细胞株Z1A5分泌抗金属Zn2+单克隆抗体的水平未见明显下降(图7)，表明细胞株分泌抗体的稳定性较好。