玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子克隆和应用

摘要

本发明公开玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子克隆和应用，其方法是，将从玉米中克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子，与目标基因编码区或其RNAi结构融合，构建植物表达结构，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，产生转基因植株；通过对转基因植株目标性状的选择，获得抗逆性或经济性状明显提高的转基因植株及其后代，创造出在植物育种中具有应用前景的新种质和新品种。

权利要求

1.一种玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK 基因启动子序列在单子叶植物中构建融合基因改变植物性状的应用，其特征是，所述玉米PEPCK基因启动子序列如SEQ ID NO.1所示，其与Bt毒蛋白基因或与磷酸丙糖／磷酸转运体基因TPT融合构建植物表达载体，采用转基因技术将融合基因导入植物细胞，产生转基因植株。

2.如权利要求1所述玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK 基因启动子序列在单子叶植物中构建融合基因改变植物性状的应用，其特征是，将玉米PEPCK基因启动子序列与Bt毒蛋白基因融合构建植物表达载体，遗传转化产生转基因抗虫玉米。

3.如权利要求1所述玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK 基因启动子序列在单子叶植物中构建融合基因改变植物性状的应用，其特征是，将玉米PEPCK基因启动子序列与磷酸丙糖/磷酸转运体基因TPT融合构建植物表达载体，通过遗传转化获得高光效转基因玉米。

说明书

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子克隆和应用

技术领域

[0001] 本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过构建融合基因及转基因改变植物性状的方案及用途。

背景技术

[0002] 植物基因工程的发展依赖于具有不同特性的启动子应用。目前植物基因工程中常用的启动子主要有组成型启动子和诱导型启动子，如双子叶转基因植物中常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂碱合酶基因Nos启动子、拟南芥Rd29A启动子，单子叶转基因植物中常使用的玉米Ubi1启动子和水稻肌动蛋白基因Act1启动子。组成型启动子具有驱动基因在各种组织持续、恒定表达的特点，可产生大量的异源蛋白质，这在培育抗虫抗除草剂基因工程中有重要意义。诱导型启动子可是目标基因在特定条件下表达，有利于植株正常生长和发育。在转基因生物研究中，经常需要在特定组织中高强度表达目标基因，现有启动子在许多情况下很难满足需要。另外，有报道表明，重复使用同一种启动子启动两个或者两个以上外源基因在细胞内同时表达会导致基因沉默现象发生。因此，开发新的启动子在转基因生物研究中意义重大。

[0003] 植物基因启动子克隆及应用的工作已有大量报道。如Pierre等(2003)从咖啡中克隆了1，5-二磷酸核酮糖梭化酶/加氧酶小亚基基因-RBCS1的启动子区域，分析表明该启动子含有调控植物发育和光诱导的顺式作用元件，用该启动子构建的融合基因转化烟草，得出该启动子具有叶片特异性和光诱导性。Singh等(2003)从百合中克隆了一个LGC1基因的启动子，该启动子驱动的基因只在花粉中雄配子细胞中表达。在LGCI启动子的-242～-183bp之间可能包含某一特异表达的顺式作用元件，它的缺失会导致细胞特异性表达特性丧失。Gu等(2006)克隆得到玉米β-葡萄糖苷酶基因(ZmGLU1)的启动子，用该启动子启动gus基因表达，在转基因烟草中GUS蛋白在根中表达水平很高。Luo等(2006)从水稻的圆锥花序中分离出了绒毡层特异性RTS基因，此基因的启动子含有一些与其他花药特异性启动子相同的顺式作用元件，并能够驱动目的基因在转基因植物中组织特异性表达，使转基因植物产生雄性不育。Tittarelli等(2007)从小麦中一个可能的高亲和力磷转运体-TaPT2基因ATG上游分离到一个579bp的片段，在低磷条件下该片段可在转基因小麦根系中特异地启动gus报告基因的表达。Gutha等(2008)将水稻OsDREBlB抗逆基因745bp的启动子区域与gus融合后转化拟南芥和烟草，组织化学分析结果显示报告基因的表达受甘露醇、NaCl、PEG、冷、ABA和水杨酸多种胁迫的诱导。

[0004] 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK，phosphoenolpyruvate carboxykinase)2+
(EC4.1.1.49)普遍存在于动植物和微生物细胞中，催化腺苷酸和Mn -依赖性的草酰乙酸和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的相互转化，即催化草酰乙酸+ATP←→PEP+ADP+CO2。虽然在体外这个反应是可逆的，但在高等生物体内，由于在生理条件下对CO2的低亲和力致使该酶催化的羧化反应可以忽略(Ray and Black 1976；Urbina and Avilan 1989)。在不同物种中PEPCK在细胞内分布和特性会有明显不同，编码基因序列和结构有很长差异。在细菌、酵母和植物中，ATP依赖性PEPCK的一级结构是同样的，但与动物细胞中GTP依赖性PEPCK的一级结构相似度很低(Utter and Kolenbrander，1972；Kim and Smith，1994)。来自于高等植物的该酶序列与动物的PEPCK序列呈现很大差异，但它们的催化性质相似，酶的活性位点相同或相似，在进化上关联。与动物PEPCK序列相比较，黄瓜和C4禾草类的PEPCK序列与酵母、大肠杆菌等微生物的该酶序列相似度高，但高等植物的酶较大，具有N-端延伸(Kim and Smith 1994；Finnegan and Burnell 1995；Walker and Leegood 1995，1996)。

[0005] 在非光合作用细胞中，PEPCK在糖异生代谢中是一个关键酶，催化三羧酸循环中间物进入糖异生途径中的第一步反应。在动物细胞中，PEPCK(GTP-dependent)不仅在细胞糖异生代谢中扮演重要角色，而且其活性与细胞分裂生长和肌体代谢疾病密切相关，已有大量的工作。在萌发种子中该酶催化糖异生(Leegood and ap Rees 1978)，在一些藻类中该酶参与CO2富集(Reiskind and Bowes 1991)。PEPCK也存在于一些植物如黄瓜的韧皮部和生毛体中(R.P.Walker，L.I.Técsi and R.C.Leegood，未发表资料)。在C4植物中PEPCK参与苹果酸或天门冬氨酸的脱羧作用，即叶肉细胞产生的产生苹果酸或门冬氨酸进入维管束鞘细胞后，它们被转变为草酰乙酸，后者在PEPCK作用下脱去羧基，释放CO2，CO2又被Rubisco固定产生磷酸糖。

[0006] 植物的光合作用分为光反应和暗反应两个阶段，光反应的实质是在光下产生同化力ATP和NADPH去推动暗反应的进行；而暗反应的实质是用同化力将CO2转化成稳定的碳水化合物。在C4植物中，固定CO2的酶为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxlase，PEPC)，它对底物CO2有较高的亲和力，且不受O2的竞争抑制，形成的初产物为草酰乙酸(oxaloacetic acid，OAA)，OAA再被还原为苹果酸或进一步转化为天冬氨酸，然后苹果酸或天冬氨酸通过胞间连丝转移到维管束鞘细胞中，再迅速在脱羧酶的催化下重新释放CO2，参与Calvin循环，形成糖类。根据植物所形成的C4二羧酸的种类以及脱羧反应参与的酶类，C4植物分为3个亚型：叶绿体NADP-苹果酸酶(NADP-ME)催化脱羧反应的NADP-ME型，如玉米、甘蔗、高粱等；线粒体NAD-ME催化的NAD-ME型，如马齿苋；以及胞质磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化的PCK型，如鼠尾草(Wyrich等1998)。PEPCK活性在NAD-ME型C4单子叶植物中很低或可忽略，而在NADP-ME型C4单子叶植物中活性可差异很大。一些NADP-ME型单子叶植物缺乏PEPCK活性，如高粱；而玉米等C4单子叶植物PEPCK活性较高(Gutierrez et al.，1974a；Prendergast et al.，1987；Dengler and Nelson，1999；Kanai and Edwards，1999)。在玉米等C4植物中，PEPCK如同在C3植物中一样是胞质酶(Ku et al.1980；Chapman and Hatch 1983；Watanabe et al.1984)。在维管束鞘细胞中，CO2释放方式取决于脱羧酶的类型，或是由PEPCK催化或是由NADP-苹果酸酶催化，其中以PEPCK催化产生OAA脱羧为最简单的方式。在释放CO2的同时产生的丙酮酸又由维管束鞘细胞转移到叶肉细胞的叶绿体中，在丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)的催化下生成无机碳的受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，使光合反应循环进行。一些学者提出，PEPCK-型的C4植物不仅有高的PEPCK活性，而且有可观的NAD-苹果酸酶活性，而该型苹果酸酶存在于线粒体中，推测PEPCK-型的C4植物在维管束鞘细胞中同时采用PEPCK和NAD-苹果酸酶(Burnell and Hatch 1988a，1988b)进行脱羧反应，PEPCK活性所需的ATP来自于由NAD-苹果酸酶催化的苹果酸脱羧产生的NADH(Burnell and Hatch 1988b；Carnal et al.1993；Agostino et al.1996)。

[0007] 在一些NADP-ME型物种中PEPCK活性和调节性质已有详细的研究，并利用PEPCK抗体检测了维管束鞘细胞的蛋白质量(Walker et al.，1997；Wingler et al.，1999)。在玉米维管束鞘细胞中NADP-ME催化苹果酸释放CO2，PEPCK催化天门冬氨酸释放CO2，NADP-ME14 14
和PEPCK联合提供了磷酸核酮糖羧化所需的CO2。玉米 CO2标记试验得出，CO2最初出现在苹果酸和天门冬氨酸的C-4位置上(分别为75％和25％)，其后标记碳出现在其它代谢物中。而且，苹果酸脱羧速率可受天门冬氨酸和3-磷酸甘油酸刺激而提高数倍，是光依赖性的；PEPCK催化天门冬氨酸脱羧受ATP刺激，依赖于草酰乙酸和锰离子，不依赖于光照，主要产物是PEP，有少量丙酮酸产生(Wingler et al.，1999)。然而，关于不同C4植物中PEPCK和它在光合作用中的作用仍待研究。

[0008] C3和C4植物的PEPCK的活性因不同的发育过程和不同的细胞类型往往会出现较大的差异。在一些类型的C3植物中可检测到高水平的PEPCK活性。在C4禾草Urochloapanicoides中，4个PEPCK基因差异表达，PEPCK1和PEPCK2在叶片中表达强度高，推测在光合作用和CO2富集中起作用。PEPCK3和PEPCK4主要在正发育的根中表达(Finnegan et al.，1999)，可能在糖异生中起重要作用。

[0009] 植物PEPCK基因克隆的工作已有报道，其中代表性的工作有Furumoto等(1999)克隆玉米PEPCKcDNA并进行功能分析的工作和Kim等(2003)克隆黄瓜PEPCK基因并进行序列分析工作。在Furumoto等工作中，从玉米叶中分离了一个全长的ATP依赖性的PEPCK(EC4.1.1.49)cDNA，发现该基因RNA特异而高丰度的在维管束鞘细胞中表达，利用黄瓜PEPCK抗体进行的玉米PEPCK组织学定位也获得了相同结果。由该cDNA推译的蛋白质序列表明，在多肽链N端有一延伸，后者是植物PEPCK的特征。在14天的玉米小苗中，该基因的转录本水平是白天大幅度高于夜间，然而在42天的植株中，这种昼夜巨变程度下降。在大肠杆菌中表达玉米PEPCK，纯化后用肠激酶(enterokinase)处理，蛋白被分解为二部分，一部分有完整的N端，另一部分由于过度消化缺少N端的77个氨基酸。截头蛋白表现的酶活性比完整蛋白高2倍，可以被3-磷酸甘油酸(3-PGA)抑制(I0:5＝17.5mM)。而完整的酶蛋白对3-磷酸甘油酸抑制不敏感。这些结果表明，完整的N端延伸在植株体内可能通过可逆磷酸化参与PEPCK活性的调节。

[0010] 拟南芥基因组含有2个PEPCK基因(PCK1 and PCK2)，分别位于4号和5号染色体上，推测它们编码的蛋白分别为73,404和72,891Da，拟南芥中这2个PEPCK基因在大多数组织中均有转录，转录本存在于叶、根、花、果实、正发育和正萌发种子的中。然而PCK1mRNA呈现出丰度更高，存在于较多组织中。PEPCK在萌发后生长的子叶中PEPCK含量丰富，一致于它在糖异生中的作用。PEPCK在库组织如幼叶、发育中的花中也含量丰富。拟南芥5号染色体上的PEPCK基因含有9个外显子和8个内含子。从油菜冷驯化的黄化苗的cDNA文库中，Sáez-Vásquez等(1995)分离出一个ATP依赖性的PEPCK基因。该基因为冷诱导型的，cDNA长1508核苷酸，编码412个氨基酸，推导的氨基酸序列与酵母ATP依赖性PEPCK2+
的相似性为53％，与大肠杆菌的为47％，有相似的ATP结合结构域、Ca 结合位点和催化位点。Finnegan等(1999)从C4单子叶植物Urochloapanicoides的cDNA文库中筛选出4个PEPCK基因，PEPCK1编码一个68kD蛋白，PEPCK2编码626个氨基酸，推测分子量约68.7kD，与PEPCK1相似性高达96％。基因组片段分析表明，PEPCK1和PEPCK2是彼此紧密连锁的PEPCK基因，二者转录方向相同，PEPCK2位于PEPCK1上游。另有2个PEPCK基因被分别命名为PEPCK3和PEPCK4，PEPCK4位于PEPCK3上游，二者转录方向相同。

[0011] Kim等(1994)建立了正处衰老阶段的黄瓜子叶的cDNA文库，从中筛选出一个编码ATP依赖性的PEPCK(EC 4.1.1.49)cDNA克隆。该全长cDNA编码约74.4KD多肽，与细菌和酵母的PEPCK相似性分别为43％和57％。该cDNA在大肠杆菌中表达，产生约74KD多肽。利用该多肽制备抗体检测黄瓜子叶、叶片和根的提取物，肯定了其特异性结合PEPCK。在黄瓜种子吸涨后7天期，PEPCK mRNA和蛋白质水平在子叶中增加，峰值分别在吸涨后的第2和第3天。在衰老子叶中，PEPCK mRNA和蛋白质又降低到低水平。这提示PEPCK在子叶糖异生中起重要作用。以黄瓜PEPCKcDNA为探针，克隆基因组基因。经过限制酶消化、Southern杂交和核苷酸测序，确定了该基因长达9kb，由13个外显子和12个内含子组成。该基因的外显子数目和基因结构相似于拟南芥4号染色体上的PEPCK基因和水稻基因组中的PEPCK基因，后二者分别含有13个和12个外显子。在黄瓜基因组中，只检测出一拷贝的PEPCK基因。

[0012] 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子的研究较少，中国医学科学院中国协和医科大学冯凯等(中国医学科学院学报，26(5)：562-565)在2004年报道构建磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子调控的报告基因表达质粒，为评价PEPCK启动子转录调控特性创造条件。他们从载体质粒pPEPCK-int中截取大小为550bp的大鼠PEPCK启动子片段，借助过渡载体质粒PBR-PEPCK将PEPCK启动子片段插入pGL2-basic-Luc报告质粒。通过酶切鉴定及基因测序证明，pGL2-PEPCK::Luc荧光素酶表达质粒构建成功，并能够在体外体系中表达荧光素酶。pGL2-PEPCK::Luc质粒可作为体外研究大鼠PEPCK启动子转录调节特性的新手段。

[0013] 黄瓜PEPCK基因(CsPEPCK)启动子在开放读码框5’上游的2kb区域中存在保守的植物特异顺反式元件，几个异柠檬酸裂解酶基因和苹果酸合酶基因的启动子区域存在的普通异顺反式元件也存在于黄瓜PEPCK基因启动子区，这些元件在植物发育过程中，特别是种子萌发过程中对糖发生反应起作用。CsPEPCK、异柠檬酸裂解酶基因和苹果酸合酶基因的启动子区域存在的保守元件有：TATA signal(5’-TATAAAT)(在CsPEPCK翻译起始位点-216bp处)、2个CAAT框(分别在5’TATA box上游的10bp(-226bp)和下游的24bp处(-188bp)、一个富含AT的回文序列(与-1131bp～-1092bp序列有90％相似性)、一对反向重复序列(92％相似性，分别位于-1200bp～-1173bp和-998bp～-971bp)。在这3个启动子近开放读码框区1kb区段内反式作用因子可结合的位点有：GATA-motif(糖抑制反应元件)、水稻α-淀粉酶基因(Ramy3D)特异的顺式作用元件、植物特异的Dof转录因子结合的3个嘧啶框(5’-CCTT-I-D，存在于CsPEPCK启动子-412bp、-390bp和-301bp处)、蔗糖诱导元件SURE(SURE2存在于CsPEPCK启动子-547bp处、SURE1存在于-541bp和-492bp处，二者部分重叠；另有4个SURE2元件分别位于-939bp、-794bp、-755bp和-712bp处)(Crierson et al.，1994)、2个可对光和钙/钙调素反应的GT-1框(5’-C；GTI-AA，处于2个嘧啶框之间)、一个5’-CAACA序列(存在于CsPEPCK启动子-826bp(可被DNA结合蛋白RAV1识别，Kagaya et al.，1999)、一个ACCT框(存在于CsPEPCK启动子-576bp处，bZIP蛋白识别序列)、2个IMH相关序列(IMH2同源于Myb结合序列ACCA/TACC，IMHI可能同源于萌发反应核心序列TCTrCT，分别位于CsPEPCK启动子-124bp和-180bp处)、糖反应相关顺式作用序列AMY-boxI、I-Box和SP8(结合WRKY家族中SPFl-型蛋白)。

[0014] 从已有资料看来，玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子的克隆、分析和利用研究未见报道，该启动子启动的基因表达可高确定出现在玉米维管束鞘细胞内。

发明内容

[0015] 针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一个高效表达的启动子玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子(PZmPEPCK)并将其应用于植物转基因，产生性状改变的工程植物。

[0016] 本发明所述的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子的克隆及应用方法是，将从玉米中克隆PZmPEPCK序列，以全长(1500bp)或部分序列为启动子重组到目标基因编码框(以正义形式或反义形式)或RNAi结构之前，构建融合基因，然后将融合基因插入到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行性状鉴定，从中筛选出目标性状明显改变的转基因植株及其后代，创造出在植物育种中具有应用前景的新种质和新品种。

[0017] 其中，所述的PZmPEPCK序列来自普通栽培玉米和玉蜀黍属的玉米近缘种或亚种，也可是人工合成的序列一致和相近DNA片段。

[0018] 其中，所述用于构建融合基因的PZmPEPCK序列可为全长序列，也可以为部分序列，也可以为根据部分序列人工合成的脱氧多核苷酸链。

[0019] 其中，所述应用方法是通过融合基因及植物表达载体的构建应用PZmPEPCK序列，通过转基因技术获得性状发生变化的转基因植株及后代。

[0020] 本发明所说的植物为高等植物，包括被子植物和裸子植物；包括单子叶植物和双子叶植物；包括草本植物和木本植物。

[0021] 本发明所说的融合基因由PZmPEPCK序列和目标基因编码序列(以正义形式或反义形式)或RNAi结构及植物基因的3′尾巴区构成。融合基因能在植物细胞中有效表达。

[0022] 本发明克隆出玉米PEPCK基因启动子并进行了序列，检测了PEPCK基因在根系和叶片中的表达强度；将该启动子和蔗糖转运体基因或Bt毒蛋白基因分别融合，构建植物表达结构；再将后者重组到植物表达载体中，转入玉米骨干自交系，获得了抗虫玉米。

[0023] 玉米PEPCK基因表达强度的检测

[0024] 采用实时定量RT-PCR检测玉米PEPCK基因在玉米根和叶片中的表达强度，以Actin 1为内参。在玉米根中，该基因表达强度约为Actin 1的70倍，在玉米幼叶和老叶中的表达强度分别约为Actin 1的76倍和60倍，即在玉米植株营养器官中玉米PEPCK基因表现出很高的表达强度。

[0025] 玉米PEPCK基因启动子(PZmPEPCK)的克隆

[0026] 以玉米PEPCK基因编码区序列为探针，筛选玉米基因组文库，获得了一个带有开放读码框5`上游1500bp的克隆，采用PCR方法克隆出该启动子区段。该区段对应于玉米自交系B73染色体1的BAC克隆ZMMBBb-342D19和ZMMBBb0342D19(GeneBank数据库，登陆号AC190759.3)中的一段序列。全长序列如下(SEQ ID No.1)：

[0027] CCATATGGCATTAGGGGCCCTAGGGATCCAGATCGTTGATCAATGCTACGGGGTACAAGGCTCCTCGAGGACCTGGATGATTTAATCTTAGGTGTCTCGGAGTGCTAGGAGCATCAGGTTTAGAGCGCCATAGGGCATTAAGGTCCATGGGGACCAAGATCATTGAT℃ACTGCTATGGGGTAAAATGCTCCTCAAGAACTTACCTGATTTTATCCTAGGTTGTCCCGAAGTGTTAGTAGCACTAGGCCTTAGAGCGTCGTGAGGCCCAAAGGGCCCCCGGGGGCTTGTAACATGTCCATATAAGACTTAGTAGTTTGTATTACATTATTATGTTAACTGATGTTAAACCTCTCTCTAGCCGAGACCAAGAGAGATTTTCGAGGCATGAGGCCTCGAGAGCACAGCATGGTGTATGTGTATCGTTATCCTTGAATACATCTTGCTCCTTGTTTTGAAAACCAATAGTGGTGTCGGCGCAGTCTGGCAACTGACATACCTTAAGTTTTAAAACCTTCGTATCTTTCTTTGTAATTACTAAGCTATGTGTGCAGCGGCCACACTTTACCACTTGAATCTGTAGGTTGCGTGTTCTATTTCTGCCATCCATACCTTATTTTCTTTCTTTTGTTCTCCGCCACTGGAACCATGAAATCTCCATCGTTTTCATTCTTTCCCAAGGGGCCGCGACACCAAAATGACCGAACATCAGTCGAAACCACTGCAACCTGACCAATGTACCCTATTTCTACTTGCAATTCACTTCTCCAGGTAATAACACGTGAGTAGGGTAGTACAATTCAGGGCGTGTAGACAAATCAGTGGAGCCGATAAGTTTATGCATAAGAAAAGTCAGTGATTTTATTAACTACTTTCTCTCCCAGAACAAACTTCGCAAGGCACAGCTGTCGCAGTCACACCGATTTGGCTAGCCTCCCTCCGGTTAGCAACTTTGGAGTATTAGCAAGCATACAGGAGTAAACAAGTAGCTAAGCAAATGCAGATTCAGAATAATGCAAATATTGTGTTAAGCCGGAACGAAAGAATAAGCTCCACTGCTGCTCCTGCAGAGTGCAAAAACCCAAACCCAACCCGGAACGAAAGCGCCGCCGCCGTTGAATGGTCGGGTAGAGGACGTAACCATGGTTCACTGCCGGGCCCTTTAAAAGCCGAGCCGGGCTCGTCCCATCCGCCCCACGACCGCTTGGCGCTTCATCACTCGTTCCCTTTCGAAAGCCCGCGCACGCACGTCGGTCGTCCCGTACGTGTGCCCGTCTATCTATCCTCCTCGACTCCGTCGTGTCTCTTCAACTCCGTCGTGTCGTGTGCAATCGTTGCATGCGGCGAACGCTATACATGGTGCTCCGAGAGTGTCCGGGAGCAGAGAGCATCGATCAATGGCGGGGTTTGGTCTGGTCTGGTCTGGTCCCATCCCAGCAGGGTCGCTAATGCGCGCTCGCTGCTGCTTCTCTCTCTGCAGGAGCAGGACCTCGATCGGCCGAGATGGCGACGCCGAACGGGCT[0028] 玉米PEPCK基因启动子(PZmPEPCK)序列的基本特征

[0029] 在该启动子区域中，存在多个转录调控元件，有15个CAAT-box，分别位于-1456(P，即正义链)、-1037(P)、-766(P)、-171(P)、-104(P)、-1335(N，即反义链)、-478(N)、-685(P)、-505(P)、-482(P)、-576(N)、-1037(P)、-766(P)、-743(P)和-703(P)；
9个G-Box，分别位于-719(P)、-235(N)、-235(P)、-236(P)、-302(P)、-1239(N)、-201(N)、-182(N)和-177(N)；3个AAGAA基序，分别位于-457(P)、-827(N)、-878(N)；3个MBS(MYBbinding site)元件，分别位于-1161(P)、-1010(P)和-799(N)；2个ABRE元件，分别位于-235(P)、-719(P)；ARE元件2个，分别位于-782(N)、-1039(N)；2个Sp1元件，分别位于-308(N)、-565(P)；2个GC-基序，分别位于-1217(N)、-1221(P)；3-AF1结合位点、AuxRR-core、CAT-box、CCAAT-box、CG-基序、MNF1、chs-Unitlm 1、Skn-1基序、GATA基序和Box I元件各1个，分别位于-1123(P)、-1352(P)、-861(P)、-1012(N)、-1221(P)、-230(P)、-
407(P)、-801(N)、-1070(N)和-1043(N)。

[0030] 玉米PEPCK基因启动子(PZmPEPCK)与目标基因的重组

[0031] 采用常规的分子克隆技术将玉米PEPCK基因启动子全长或部分序列连接到目标基因编码框(以正义形式或反义形式)或RNAi结构之前，构建融合基因，然后将融合基因重组到与pROK2或pCam系列等植物表达载体中获得重组质粒；也可将玉米PEPCK基因启动子全长或部分序列直接插入到植物表达载体中的目标基因的编码框之前，形成完整的可在植物细胞中有效表达的融合基因。可根据受体植物和所需基因的表达强度及可调控程度，融合基因中可加入分别适合于单、双子叶植物或其它植物的增强子或抑制子或对特点信号发生反应的序列(顺式作用元件)。融合基因的3`端可选用不同基因的3′尾巴区，也可插入增强子序列。在融合基因中，也可在编码区插入不同内含子。重组质粒可导入大肠杆菌和农杆菌中增殖或/和保存。

[0032] 用含有玉米PEPCK基因启动子(PZmPEPCK)的植物表达载体转化植物[0033] 根据转基因受体材料的特定选用不同的转基因方法获得转基因植物。

[0034] 常用的转化方法有3类：1)直接转化法，即提取重组质粒DNA，采用基因枪轰击法、聚乙二醇诱导法、电融合法、硅碳纤维法等将质粒DNA导入细胞。2)农杆菌介导的遗传化方法。3)种系转化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，还有将不同类方法组合使用的转化程序，如将基因枪轰击法和农杆菌结合使用以提高转化效率。以下以玉米自交系胚性愈伤组织为材料采用基因枪轰击法进行遗传转化。

[0035] 玉米(Zea mays L.)自交系植株在自交授粉后9-15天，取果穗剥去苞叶后于70％酒精中浸泡5min，无菌条件下挑取约1.0-1.5mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养基每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织作为遗传转化的受体材料。

[0036] 采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取1.0μm大小的金粉，经70％乙醇洗涤后静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水彻底清洗3次，然后50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl2、20μl 0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。离心弃上清液后，加70％乙醇静置。然后离心弃上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。

[0037] 在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养皿中每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。将材料转入加有选择剂(如1-5ppm除草剂绿黄隆)的培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继代时淘汰变褐死亡的组织块。经过筛选的抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约10cm高时栽到大田中，自交结实。转基因植株采用PCR检测法筛选，Southern blotting验证。通过数代分子检测和自交结实产生纯系，在通过抗性鉴定和田间选择获得转基因优异材料。

[0038] 转基因玉米植株的性状检测及利用

[0039] 将转有玉米PEPCK基因启动子启动的融合基因的玉米和未转基因的对照自交系种子播在的花盆和大田，分别在苗期(3～7叶期)、雌雄穗发育期(9～13叶期)、开花授粉期和成熟期进行转基因性状和植株生理指标的检测。综合多方面的测试结果，选出优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。

具体实施方式

[0040] 实施例1：转PZmPEPCK::Bt毒蛋白基因创造玉米抗虫自交系及应用[0041] 1)受体系统的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、昌7-2、DH4866等的自交种子。离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基有：

[0042] 种 子 萌 发 培 养 基：KNO31900mg/l，NH4NO31650mg/l，CaCl2·2H2O 440mg/l，MgSO4·7H2O 370mg/l，KH2PO4·H2O 170mg/l，FeSO4·7H2O 27.8mg/l，ZnSO4·7H2O10mg/l，MnSO4·4H2O 22.3mg/l，H3BO310mg/l，KI0.83mg/l，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/l，CuSO4·5H2O0.025mg/l，CoCl2·6H2O 0.025mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，烟酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30g/l，琼脂粉7g/l，pH 5.8～6.0。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。

[0043] A培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5～9.0μmol/l和2，4-D 1.0～3.0μmol/l，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。

[0044] B培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于丛生芽组织块分化小苗。

[0045] 成苗培养基：种子萌发培养基附加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l，用于丛生小芽发育成小苗。

[0046] 生根培养基：种子萌发培养基附加IBA 2.8～3.6μmol/l，用于无根小苗生根。

[0047] 基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。

[0048] 种子灭菌和萌发：玉米种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10--15分钟，然后用无菌水洗涤3--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30---40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23---30℃)下1--2天。萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。

[0049] 茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化：萌发种子的胚芽伸长止3---5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下(24--27℃)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6--10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4-D浓度取3.0μmol/l；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为1.0μmol/l，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2--3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5--6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。

[0050] 2)以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生

[0051] 将带有双元载体(Mini--Ti质粒带有选择剂抗性基因和PZmPEPCK::Bt毒蛋白基因)的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol/l的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5--20倍用于转化。

[0052] 取继代后培养13--20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的培养基上于黑暗中培养7--12天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4-D的A培养基上恢复培养后产生小芽。

[0053] 将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-3000lx，光照14-15小时/天。小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40％的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温
22--28℃，夜温15--21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。

[0054] 3)转基因植株的抗性检测和选择利用

[0055] 取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。而后将转基因植株(T0)套袋自交结实。将来自不同T0植株的T1种子播在温室或具有防护设施的田间，出苗后取叶片采用酶联免疫检测方法测定Bt毒蛋白表达量，然后人工接种亚洲玉米螟卵块，观测植株抗虫性。Bt毒蛋白检测和人工接虫试验采用本领域所用的常规技术和试剂盒。T1代筛选出的抗虫植株继续套袋自交，对其子代继续进行分子生物学鉴定和抗虫性检测。通过数代自交纯合和抗性检测及选择，最终获得抗虫玉米自交系。该自交系可用于配制玉米抗虫杂交种。

[0056] 实施例2：转PZmPEPCK::TPT1基因创造玉米高光效育种材料

[0057] 植物细胞质与叶绿体基质间的糖/磷转运主要是由磷酸丙糖/磷酸转运体(Triose-phosphate/phosphate translocator，TPT)来负责，该转运体可以将磷由细胞质转运到叶绿体中，同时，等摩尔的磷酸丙糖3-PGA从叶绿体基质转运到细胞质中。而当细胞质的磷浓度降低时，TPT转运体的活性受到抑制，从而导致代谢物在叶绿体中的积累，影响叶片光合速率。ZmTPT1是从玉米中克隆的一个磷酸丙糖/磷酸转运体基因，对底物亲和力高，通过构建融合基因实现该基因在玉米维管束鞘细胞中高强度表达，有利于玉米叶片保持高的光合速率。该实例通过PZmPEPCK::TPT1基因构建和该基因转入玉米骨干自交系来实现这一目标。

[0058] 1.玉米无菌苗获得

[0059] 玉米优良自交系的种子，用70％乙醇浸泡8分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件(25-28℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。

[0060] 2.农杆菌培养及活化

[0061] 将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因bar和PZmPEPCK::TPT1融合基因)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100μmol/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

[0062] 3.玉米无菌苗转化

[0063] (1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌5
苗浸泡在菌液中，在0.5×10Pa大气压下处理8-12分钟。

[0064] (2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。

[0065] (3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

[0066] 4.转化植株筛选与定植

[0067] 转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂 (Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9.6ml-10.8ml ，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。

[0068] 5.转基因植株子代分析

[0069] T1代植株长到3叶期用10.8ml 水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交结籽外，采用PCR技术检测外源基因进行Southern blotting验证，并采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系测定植株在不同光强和温度下净光合速率的变化，测定3-7叶期小苗生长速率，测定单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状的观测和比较，选择高光效高产株系进入生物安全性试验和玉米育种实验。