一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法。本发明提供的菌或菌的提取物在制备亚硝基血红蛋白中的应用；还提供一种酶制剂为将所述的菌提取物、苯甲酸钠溶液、壳聚糖溶液混合得到的酶制剂；还提供一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法。本发明的实验证明，通过亚硝酸还原酶及辅酶生物合成亚硝基血红蛋白，具有反应条件温和、反应过程容易控制、酶制剂来源产业化可操作性强、亚硝基血红蛋白生产率高等优点，利用该技术可直接生产用于肉制品加中过程中的着色剂——亚硝基血红蛋白，显著降低肉制品中亚硝酸盐的添加量，具有广阔的市场前景。

权利要求

1.一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法，包括如下步骤：

将血红蛋白溶液、酶制剂、亚硝酸钠溶液、抗坏血酸溶液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混合，反应，得到亚硝基血红蛋白；

所述酶制剂为将菌提取物、苯甲酸钠溶液、壳聚糖溶液混合得到的酶制剂；

所述菌的提取物按照如下方法制备得到：发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCC No.1627，破碎菌体，离心，收集上清液，即为含有亚硝酸还原酶的菌的提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述血红蛋白、酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合得到的混合液中的配比为(1-2)mg∶(200-500)U∶(0.0625-0.225)mg∶(1.5-5)mg∶(2.145-3.74)mg∶(0.654-1.475)mg。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述反应的pH值为5.8-6.6，反应的温度为60℃-80℃，反应时间为5min-20min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述反应的pH值为5.8、6或6.6，反应的温度为60℃、70℃或80℃，反应时间为5min、10min或20min。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述酶制剂中，所述的菌提取物、苯甲酸钠、壳聚糖的配比为2200U-6200U∶0.5mg-1.5mg∶0.5mg-1.5mg。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发酵温度为30℃-35℃，所述发酵的时间为20h-30h。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：每1L发酵所用培养基按照如下方法配制：将10g-15g葡萄糖，1.0g-1.5g牛肉膏，1.0g-2.0g蛋白胨，1.35g-2g磷酸氢二钾，

0.5g-0.7g磷酸二氢钾，1g-2g氯化钠，0.138g-0.15g亚硝酸钠，0.1g-0.2gMgSO4·7H2O，

0.01g-0.02g MnSO4·H2O，0.01g-0.02g CaCl2·2H2O和水组成，用水补至1L，调pH为7.0；

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述破碎菌体的方式为超声破碎，所述超声的功率为200w；所述超声的次数为90次；所述超声的方式为：间歇10s，超声5s；所述离心力为26000g，离心时间为15min。

说明书

一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种酶法合成亚硝基血红蛋白色素的方法。

背景技术

[0002] 为了使产品具有理想的色泽、增强抑菌性及延长保存期、赋予产品独特的风味，国内外均一直采用硝酸盐或亚硝酸盐作为肉制品的腌制剂。但是亚硝酸盐的过多摄入将对人体产生危害，甚至具有致癌作用，因此，过去数十年来各国研究机构都在积极寻找一种能在肉类生产中替代亚硝酸盐的化合物。亚硝基血红蛋白(HbNO)即是一种替代亚硝酸盐的无硝着色剂。

[0003] HbNO是血红蛋白在一定条件下与来源于亚硝酸盐(或一氧化氮)的亚硝基进行合成反应的产物，由于亚硝基更易于与肌红蛋白(Mb)生成亚硝基肌红蛋白(MbNO)，故将HbNO-添加到肉制品中，HbNO在一定的条件下分解，迅速释放NO，与肌红蛋白结合，生成鲜艳的红色，起发色作用。

[0004] 近年来，国内外学者相继开展了利用动物血液中所含有的血红蛋白合成亚硝基血红蛋白(HbNO)等新型腌肉色素的研究，并将制得的HbNO作为一种着色剂加入到肉制品中，从而使肉制品呈现鲜亮的玫瑰红色，有效地降低肉制品中亚硝酸盐残留量，也保持了肉制品所具有的色泽、风味、防腐抗菌等特性。由此可见，以HbNO作为发色剂代替亚硝酸盐发色，不仅发色效果同亚硝酸盐相同，而且大大降低了亚硝酸盐的残留。

[0005] 利用天然畜禽血液中的血红蛋白为原料制成色泽鲜红、对热和氧稳定的发色剂，2-
所应具备的条件为：(1)含有只将NO 只还原至NO，且不再继续还原的能力；(2)阻止亚铁氧化为高铁，提供稳定性高的配位体；(3)应用安全无毒、符合中华人民共和国国家标准(食品卷)的试剂。

[0006] 目前国内外众多学者对亚硝基血红蛋白的合成进行了深入研究，但是合成亚硝基血红蛋白主要是以化学法为主，加入抗坏血酸等还原性物质使得生成的亚硝基血红蛋白很不稳定，反应参数不能有效控制，反应产物的着色稳定性不尽人意。酶法生产HbNO的研究至今还未见报道。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的是提供一种菌或菌的提取物在制备亚硝基血红蛋白中的应用。

[0008] 本发明提供了菌或菌的提取物在制备亚硝基血红蛋白中的应用；

[0009] 所述菌的提取物按照如下方法制备得到：

[0010] 发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627，破碎菌体，离心，收集上清，即为含有亚硝酸还原酶的菌的提取物。

[0011] 1-10％(体积百分含量)的接种量接种于液体发酵培养基中，初始pH为5.0-7.5。所述发酵温度为30℃-35℃，所述发酵的时间为20h-30h，摇床转速为100-240r/min，得到菌悬液。

[0012] 所述发酵温度具体为30℃、32℃或35℃；所述发酵时间具体为20h、25h或30h；

[0013] 每1L发酵所用培养基按照如下方法配制：将10g-15g葡萄糖，1.0g-1.5g牛肉膏，1.0g-2.0g蛋白胨，1.35g-2g磷酸氢二钾，0.5g-0.7g磷酸二氢钾，1g-2g氯化钠，0.138g-0.15g亚硝酸钠，0.1g-0.2g MgSO4·7H2O，0.01g-0.02g MnSO4·H2O，0.01g-0.02g CaCl2·2H2O和水组成，用水补至1L，调pH为7.0；

[0014] 每1L发酵所用培养基具体按照如下方法配制：将10g、12g或15g葡萄糖，1.0g、1.2g或1.5g牛肉膏，1.0g、1.5g或2.0g蛋白胨，1.35g、1.5g或2g磷酸氢二钾，0.5g、0.6g或0.7g磷酸二氢钾，1g、1.5g或2g氯化钠，0.138g、0.14g或0.15g亚硝酸钠，0.1g、0.15g或
0.2g MgSO4·7H2O，0.01g、0.015g或0.02g MnSO4·H2O，0.01g、0.015g或0.02g CaCl2·2H2O和水组成，用水补至1L，调pH为7.0；

[0015] 所述破碎菌体的方式为超声破碎，所述超声的功率为200w；所述超声的次数为90次；所述超声的方式为：间歇10s，超声5s；

[0016] 所述离心力为26000g，离心时间为15min。

[0017] 本发明的另一个目的是提供一种酶制剂。

[0018] 本发明提供的酶制剂为将所述的菌提取物、苯甲酸钠溶液、壳聚糖溶液混合得到的酶制剂；

[0019] 所述酶制剂中，所述的菌提取物、苯甲酸钠、壳聚糖的配比为2200U-6200U∶0.5mg-1.5mg∶0.5mg-1.5mg；所述的菌提取物、苯甲酸钠、壳聚糖的配比具体为2200U、3700U或6200U∶0.5mg、1mg或1.5mg∶0.5mg、1mg或1.5mg；

[0020] 所述苯甲酸钠溶液按照如下方法制备：将苯甲酸钠溶解在浓度为50mM、pH值为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得到苯甲酸钠溶液，所述苯甲酸钠在所述苯甲酸钠溶液中的浓度为1g/L-3g/L，所述苯甲酸钠在所述苯甲酸钠溶液中的浓度具体为1g/L、
2g/L或3g/L；

[0021] 所述壳聚糖溶液按照如下方法制备：将壳聚糖溶解在浓度为50mM、pH值为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得到壳聚糖溶液，所述壳聚糖在所述壳聚糖溶液中的浓度为1g/L-3g/L，所述壳聚糖在所述壳聚糖溶液中的浓度具体为1g/L、2g/L或3g/L。

[0022] 本发明的第三个目的是提供一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法。

[0023] 本发明提供的方法包括如下步骤：

[0024] 将血红蛋白溶液、酶制剂、亚硝酸钠溶液、抗坏血酸溶液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混合，反应，得到亚硝基血红蛋白。

[0025] 所述血红蛋白、酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合得到的混合液中的配比为(1-2)mg∶(200-500)U∶(0.0625-0.225)mg∶(1.5-5)mg∶(2.145-3.74)mg∶(0.654-1.475)mg；

[0026] 所述血红蛋白、酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合液中的配比具体为1mg或2mg∶208U、500U或200U∶0.0625mg、0.075mg或0.225mg∶5mg、1.5mg或3.75mg∶3.74mg、2.145mg或2.58mg∶1.475mg、0.95mg或0.654mg；

[0027] 所述血红蛋白溶液按照如下方法制备：将血红蛋白或血红蛋白提取液与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混合得到血红蛋白溶液，所述血红蛋白在所述血红蛋白溶液中的浓度为6g/l-20g/l，所述血红蛋白在所述血红蛋白溶液中的浓度具体为6g/l、10g/l或20g/l；

[0028] 所述亚硝酸钠溶液按照如下方法制备：将亚硝酸钠溶解在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中得到亚硝酸钠溶液，所述亚硝酸钠在所述亚硝酸钠溶液中的浓度为1.5g/l-9g/l，所述亚硝酸钠溶液的浓度具体为1.5g/l、3g/l或9g/l；

[0029] 所述抗坏血酸溶液按照如下方法制备：将抗坏血酸溶解在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中得到抗坏血酸溶液，所述抗坏血酸在所述抗坏血酸溶液中浓度为60g/l-150g/l，所述抗坏血酸在所述抗坏血酸溶液中的浓度具体为60g/l、120g/l或150g/l；

[0030] 所述酶制剂的浓度为500U/ml-2000U/ml，具体为500U/ml、800U/ml或2000U/ml；

[0031] 所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为0.1M磷酸氢二钠-0.05M柠檬酸缓冲液，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的PH值为5.8-6.6，所述PH值具体为5.8或6.6。

[0032] 所述反应的pH值为5.8-6.6，反应的温度为60℃-80℃，反应时间为5min-20min；

[0033] 所述反应的pH值具体为5.8、6或6.6，反应的温度为60℃、70℃或80℃，反应时间为5min、10min或20min。

[0034] 所述血红蛋白提取液按照如下方法制备：将离体的动物血细胞加入2-3倍体积的水，破碎细胞，抽滤，收集滤液，即为血红蛋白提取液。

[0035] 所述将离体的动物血细胞加入2-3倍体积的水具体为述将离体的动物血细胞加入2或3倍体积的水。

[0036] 所述破碎细胞的方法为磁力搅拌30min-40min，具体为30min或40min。

[0037] 所述抽滤采用布氏漏斗；

[0038] 所述动物为猪或者鸭。

[0039] 所述血红蛋白购自Sigma公司，批号为H3760。

[0040] 所述方法制备的亚硝基血红蛋白也是本发明保护的范围。

[0041] 所述的亚硝基血红蛋白在制备着色剂中的应用也是本发明保护的范围。

[0042] 本发明的实验证明，通过亚硝酸还原酶及辅酶生物合成亚硝基血红蛋白，具有反应条件温和、反应过程容易控制、酶制剂来源产业化可操作性强、亚硝基血红蛋白生产率高等优点，利用该技术可直接生产用于肉制品加中过程中的着色剂----亚硝基血红蛋白，显著降低肉制品中亚硝酸盐的添加量，具有广阔的市场前景。

附图说明

[0043] 图1为猪血红蛋白标准曲线

[0044] 图2为亚硝基血红蛋白的紫外可见光谱扫描

具体实施方式

[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0047] 下述无特殊说明，百分比均为质量百分含量。

[0048] 实施例1、利用新鲜猪血制取亚硝基血红蛋白

[0049] 一、制备亚硝酸还原酶(NiR)酶制剂

[0050] 1、培养基制备

[0051] (1)斜面种子培养基配方：营养肉汤粉1.8％，琼脂2％，亚硝酸钠0.0138％，pH7.0。

[0052] (2)液体种子培养基配方：葡萄糖1.5％，蛋白胨0.2％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，MgSO4·7H2O浓度为0.01％、MnSO4·H2O浓度为0.001％、CaCl2·2H2O浓度为0.002％，调pH为7.0。

[0053] (3)1L发酵培养基：10g葡萄糖，1.0g牛肉膏，1.0g蛋白胨，1.35g磷酸氢二钾，0.5g磷酸二氢钾，1g氯化钠，0.138g亚硝酸钠，0.1g MgSO4·7H2O，0.01g MnSO4·H2O，0.01g CaCl2·2H2O和水组成，用水补至1L，调pH为7.0。

[0054] 2.种子培养：将保存于沙土管中的巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627(本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号CGMCC No.1627，可商购获得。活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。专利公开号为CN101050433。)接种到斜面培养基上，30℃培养24h，获得活化菌种；再将该活化菌种接种于种子培养基中，30℃培养20h，获得种子培养液。

[0055] 3.将种子培养液以4％(V/V)的接种量转接到装有100mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中得到发酵混合物，将发酵混合物在30℃、转速160r/min持续振荡培养20h，获得发酵液(将发酵容器中所有的产物记作发酵液)。

[0056] 4.菌体细胞的收集，将上述发酵液在4℃冷冻离心15min(26000×g)，沉淀菌体用磷酸缓冲液重新悬浮，然后再次离心得到菌体。

[0057] 5.将步骤4提取的菌体细胞，按1000mL发酵物的菌体细胞加50mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH6.5)，超声波破碎，超声波条件为200w，超声5s，间歇10s，90次。4℃冷冻离心15min(26000×g)，上清液即为菌提取物，即为亚硝酸还原酶的粗酶液。

[0058] 所述亚硝酸盐还原酶活性的测定：

[0059] (1)亚硝酸盐标准曲线的建立

[0060] 按照GB/T 5009.33-2003测定。用北京普析仪器厂生产的UV-1900型号双光束紫外分光光度计测定。以亚硝酸盐的浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。

[0061] (2)亚硝酸盐还原酶活性的测定

[0062] 参照Rosa(Rosa M，et al，2001)的方法，构建亚硝酸盐还原酶的活性测定方法。测定酶活反应体系共250μL:0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，0.1M NaCl，0.1M NO2-，0.1M MV(甲基紫晶)，0.1M Na2S2O4，以及一定量酶液。20-36℃水浴中反应10min，剧烈振荡终止反应。取10μL加格利斯试剂显色，在480-620nm比色法测定亚硝酸盐的变化。

[0063] 根据标准曲线，可以得出亚硝酸还原酶的酶活。

[0064] 酶活定义：每分钟所还原1nmoL亚硝酸盐所需要的酶量定义为一个酶活力单位。酶活单位：U/mL酶液(或酶制剂)。

[0065] 测得亚硝酸还原酶粗酶液的酶活力为7240U/ml粗酶液。

[0066] 6.分别用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH6.5)配制浓度为2g/L的苯甲酸钠溶液和1g/L壳聚糖溶液，然后与步骤5中所得的菌提取物等体积混合，制成亚硝酸还原酶液体酶制剂；

[0067] 所 述酶 制 剂 中，所述 的 菌 提 取 物、苯 甲 酸 钠、壳 聚糖 的 配 比 为3700U∶1mg∶0.5mg。

[0068] 采用上述方法检测亚硝酸还原酶液体酶制剂中的酶活力，酶制剂的酶活为3538U/ml酶制剂。

[0069] 二、血红蛋白的制备

[0070] 用棕色瓶采集猪新鲜血液，将8g柠檬酸三钠加入1L新鲜猪血液(顺鑫农业发展集团公司)，混合得到抗凝血；抗凝血在3000r/min离心15min，收集下层细胞，对下层血细胞加入等体积的生理盐水(0.95％NaCl)洗涤，在3000r/min离心15min，如此反复两到三次，至离心上清液清澈无淡黄色，收集沉淀即为血细胞。

[0071] 向沉淀(即血细胞)中加入3倍体积的水，、磁力搅拌40min，破碎血细胞然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液即为血红蛋白提取液，检测血红蛋白含量，方法采用碱性羟基高铁血红素法(ALKALINE HAEMATIND-575，简称AHD-575)(碱性羟基高铁血红素法测定原理是：将血红蛋白及其衍生物，在碱性环境下

[0072] 与试剂中的非离子型表面活性物质发生反应，迅速形成稳定的碱性高铁非离子型表面活性剂复合物，该复合物在波长575nm处有一吸收峰。此法应用的试剂稳定、无毒，对各种血红蛋白及其衍生物的转化能力一致。

[0073] 测定血红蛋白的浓度具体如下：

[0074] (1)AHD-575试剂的配制

[0075] 准确称取聚乙二醇辛基苯基醚25.0g，加入0.1mol/L NaOH溶液至1L，过滤，室温下保存备用。

[0076] (2)标准曲线的制作

[0077] 将猪血红蛋白标准品(Sigma公司，批号为H3760)配制成不同浓度的溶液，分别吸取0.2ml加入到30mlAHD-575试剂中，静置反应1～3min，于575m波长下，以AHD-575试剂为空白，测定吸光度。以猪血红蛋白标准品的浓度(g/L)为横坐标，以吸光度为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得出血红蛋白溶液浓度X与吸光度值Y的关系的标准线及回归方程(见图1)。

[0078] (3)于洁净的烧杯中，吸取血红蛋白提取液样品0.2ml，以AHD-575法测定吸光度，A575＝0.151。剩余的血红蛋白提取液放入冰箱贮存。查猪血红蛋白标准曲线得血红蛋白浓度C＝52.64g/L。

[0079] 用浓度为磷酸氢二钠(0.1M)-柠檬酸(0.05M)，pH6.6的缓冲液稀释血红蛋白提取液得到血红蛋白的含量为6g/L的血红蛋白溶液。

[0080] 三、酶法合成亚硝基血红蛋白反应

[0081] 首先，用浓度为磷酸氢二钠(0.1M)-柠檬酸(0.05M)，pH6.6的缓冲液配制以下浓度的溶液：1.5g/L亚硝酸钠溶液，120g/L抗坏血酸溶液；其次，按照以下体积比例将各反应物添加到共5ml的反应体系中，2ml上述获得的6g/L的血红蛋白溶液，0.5ml亚硝酸钠溶液，0.5ml抗坏血酸溶液，0.707ml上述获得的亚硝酸盐还原酶酶制剂(3538U/ml，相当于500U/ml反应液)，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液补足体积至5ml；

[0082] 所述血红蛋白、亚硝酸盐还原酶酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合液中的配比为1mg∶208U∶0.0625mg∶5mg∶3.74mg∶1.475mg。

[0083] 最后，将反应各物质充分混匀，用1M的柠檬酸调节反应体系pH为6.6，80℃反应10min后，冰水浴中迅速冷却，4000r/min离心15min，弃去上请，沉淀即为亚硝基血红蛋白(酶法)。

[0084] 采用上述合成亚硝基血红蛋白反应的体系和方法，不同的是不加入亚硝酸盐还原酶酶制剂，仅将2ml血红蛋白溶液、0.5ml亚硝酸钠溶液、0.5ml抗坏血酸溶液，浓度为0.1M磷酸氢二钠-0.05M柠檬酸缓冲液(pH6.0)补足体积至5ml，混合、反应、离心收集对照沉淀，得到对照亚硝基血红蛋白(化学法)。

[0085] 用80％的丙酮溶液溶解上述所得沉淀(亚硝基血红蛋白(酶法))，于450nm-650nm之间作紫外可见光谱扫描，结果如图2A所示，从图中可以看出，(亚硝基血红蛋白(酶法))在475nm、539nm和563nm附近有较强的吸收峰(亚硝基血红蛋白的特征吸收峰)，这与文献报道的亚硝基血红蛋白的紫外可见光谱扫描特征图谱基本一致(黄群，马美湖，麻成金，欧阳玉祝.亚硝基血红蛋白合成研究.肉类工业，2007(1)：28-31)。

[0086] 检测上述得到的亚硝基血红蛋白和对照亚硝基血红蛋白的含量，OD540(OD540可用于表征亚硝基血红蛋白)亚硝基血红蛋白(酶法)的吸光值为0.967，OD540对照亚硝基血红蛋白(化学法)的吸光值为0.4658，亚硝基血红蛋白(酶法)比对照亚硝基血红蛋白(化学法)的吸光值提高了108％。

[0087] 实施例2、利用新鲜鸭血制取亚硝基血红蛋白

[0088] 一、制备亚硝酸还原酶(NiR)酶制剂

[0089] 1.培养基制备

[0090] (1)斜面种子培养基配方：营养肉汤粉1.8％，琼脂2％，亚硝酸钠0.0138％，pH7.0。

[0091] (2)液体种子培养基配方：葡萄糖1.5％，蛋白胨0.2％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，MgSO4·7H2O浓度为0.01％、MnSO4·H2O浓度为0.001％、CaCl2·2H2O浓度为0.002％，调pH为7.0。

[0092] (3)1L发酵培养基：12g葡萄糖，1.2g牛肉膏，1.5g蛋白胨，1.5g磷酸氢二钾，0.6g磷酸二氢钾，1.5g氯化钠，0.14g亚硝酸钠，0.15g MgSO4·7H2O，0.015g MnSO4·H2O，0.015g CaCl2·2H2O和水组成，用水补至1L，调pH为7.0。

[0093] 2.种子培养：将保存于沙土管中的巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627(本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号CGMCC No.1627，可商购获得。活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。)接种到斜面培养基上，30℃培养24h，获得活化菌种；再将该活化菌种接种于种子培养基中，30℃培养20h，获得种子培养液。

[0094] 3.将步骤2获得的种子培养液以5％的接种量接种于液体发酵培养基中，初始pH为7.5，在35℃、转速140r/min下恒温培养25h，得到菌悬液；

[0095] 4.菌体细胞的收集，将上述发酵液在4℃冷冻离心15min(20000×g)，沉淀菌体用磷酸缓冲液重新悬浮，然后再次离心得到菌体。

[0096] 5.将步骤4提取的菌体细胞，按1000mL发酵物的菌体细胞加25mL磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH6.5)，超声波破碎，超声波条件为300w，超声5s，间歇10s，60次。4℃冷冻离心15min(26000×g)，上清液即为菌提取物，即为(亚硝酸还原酶)的粗酶液。按照实施例1的方法测得亚硝酸还原酶粗酶液的酶活力为12436U/ml粗酶液。

[0097] 6.分别用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH6.5)配制浓度为1g/L的苯甲酸钠溶液和2g/L壳聚糖溶液，然后与步骤5中所得的菌提取物等体积混合，制成亚硝酸还原酶液体酶制剂。

[0098] 所 述酶 制 剂 中，所述 的 菌 提 取 物、苯 甲 酸 钠、壳 聚糖 的 配 比 为6200U∶0.5mg∶lmg。

[0099] 按照实施例1的方法测得酶制剂的酶活为6051U/ml酶制剂。

[0100] 二、血红蛋白的制备：用棕色瓶采集新鲜鸭血液，向新鲜的鸭血液中加入将5g柠檬酸三钠加入1L鸭血中，得到抗凝血，在4000r/min离心20min，对下层血细胞加入等体积的生理盐水(0.95％NaCl)洗涤，如此反复两到三次，至离心上清液清澈无淡黄色，分离血细胞。加入2倍体积的水、磁力搅拌30min，破碎血细胞然后用布氏漏斗抽滤，滤液即为血红蛋白提取液。

[0101] 按照实施例1的方法检测血红蛋白含量，结果与实施例1无显著差异。

[0102] 用浓度为磷酸氢二钠(0.1M)-柠檬酸(0.05M)，pH6.6的缓冲液稀释血红蛋白提取液得到血红蛋白的含量为10g/L的血红蛋白溶液。

[0103] 三、酶法合成亚硝基血红蛋白反应

[0104] 首先，用浓度为磷酸氢二钠(0.1M)-柠檬酸(0.05M)，pH6.0的缓冲液配制以下浓度的溶液：3g/L亚硝酸钠溶液，60g/L抗坏血酸溶液；其次，按照以下体积比例将各反应物添加到共5ml的反应体系中，2ml上述获得10g/L的血红蛋白溶液，0.5ml亚硝酸钠溶液，0.5ml抗坏血酸溶液，1.653ml上述获得的亚硝酸盐还原酶酶制剂(6051U/ml，相当于2000U/ml反应液)，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液0.347ml补足体积；

[0105] 所述血红蛋白、亚硝酸盐还原酶酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合液中的配比为1mg∶500U∶0.075mg∶1.5mg∶2.145mg∶0.95mg。

[0106] 最后，将反应各物质充分混匀，用1M的柠檬酸调节反应体系pH为6.0，70℃反应5min后，冰水浴中迅速冷却，4000r/min离心15min，弃去上请，沉淀即为亚硝基血红蛋白。

[0107] 按照实施例1的方法检测，结果与实施例1无显著差异。

[0108] 实施例3、利用血红蛋白纯品制取亚硝基血红蛋白

[0109] 一、制备亚硝酸还原酶(NiR)酶制剂

[0110] 1.培养基制备

[0111] (1)斜面种子培养基配方：营养肉汤粉1.8％，琼脂2％，亚硝酸钠0.0138％，pH7.0。

[0112] (2)液体种子培养基配方：葡萄糖1.5％，蛋白胨0.2％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，MgSO4·7H2O浓度为0.01％、MnSO4·H2O浓度为0.001％、CaCl2·2H2O浓度为0.002％，调pH为7.0。

[0113] (3)1L发酵培养基：15g葡萄糖，1.5g牛肉膏，2.0g蛋白胨，2.0g磷酸氢二钾，0.7g磷酸二氢钾，2g氯化钠，0.15g亚硝酸钠，0.2g MgSO4·7H2O，0.02g MnSO4·H2O，0.02g CaCl2·2H2O和水组成，用水补至1L，调pH为7.0。

[0114] 2.种子培养：将保存于沙土管中的巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No.1627(本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号CGMCC No.1627，可商购获得。活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。)接种到斜面培养基上，30℃培养24h，获得活化菌种；再将该活化菌种接种于种子培养基中，30℃培养20h，获得种子培养液。

[0115] 3.将步骤2获得的种子培养液以6％的接种量接种于液体发酵培养基中，初始pH为6.5，在32℃、转速200r/min下恒温培养30h，得到菌悬液；

[0116] 4.菌体细胞的收集，将上述发酵液在4℃冷冻离心15min(30000×g)，沉淀菌体用磷酸缓冲液重新悬浮，然后再次离心得到菌体。

[0117] 5.将步骤4提取的菌体细胞，按1000mL发酵物的菌体细胞加75mL磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH6.5)，超声波破碎，超声波条件为250w，超声6s，间歇10s，80次。4℃冷冻离心15min(26000×g)，上清液即为菌提取物，即为(亚硝酸还原酶)的粗酶液。按照实施例1的方法测得亚硝酸还原酶粗酶液的酶活力为4874U/ml粗酶液。

[0118] 6.分别用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH6.5)配制浓度为3g/L的苯甲酸钠溶液和3g/L壳聚糖溶液，然后与步骤5中所得的菌提取物等体积混合，制成亚硝酸还原酶液体酶制剂，

[0119] 所 述酶 制 剂 中，所述 的 菌 提 取 物、苯 甲 酸 钠、壳 聚糖 的 配 比 为2200U∶1.5mg∶1.5mg。

[0120] 按照实施例1的方法测定酶制剂的酶活为：2162U/ml酶制剂。

[0121] 二、制备亚硝基血红蛋白

[0122] 称取2g血红蛋白纯品(Sigma公司，批号为H3760)，充分溶解于1000ml pH 5.8磷酸氢二钠(0.1M)-柠檬酸(0.05M)缓冲液中配成20g/L的血红蛋白溶液。

[0123] 三、酶法合成亚硝基血红蛋白反应

[0124] 首先，用浓度为磷酸氢二钠(0.1M)-柠檬酸(0.05M)，pH 5.8的缓冲液配制以下浓度的溶液：9g/L亚硝酸钠溶液，150g/L抗坏血酸溶液；其次，按照以下体积将各反应物添加到共5ml的反应体系中，2ml上述获得的20g/L血红蛋白溶液，0.5ml亚硝酸钠溶液，0.5ml抗坏血酸溶液，1.850ml上述获得的亚硝酸盐还原酶酶制剂(2162U/ml，相当于800U/ml反应液)，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液0.150ml补足体积；

[0125] 血红蛋白、亚硝酸盐还原酶酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合液中的配比为2mg∶200U∶0.225mg∶3.75mg∶2.58mg∶0.654mg。

[0126] 最后，将反应各物质充分混匀，用1M的柠檬酸调节反应体系pH为6.6，60℃反应20min后，冰水浴中迅速冷却，4000r/min离心15min，弃去上请，沉淀即为亚硝基血红蛋白。

[0127] 按照实施例1的方法检测，结果与实施例1无显著差异。