长期贮藏梨花粉种质的方法

摘要

本发明提供了一种梨花粉长期可靠的贮藏方法，属于植物发育生物学领域。将梨花粉经干燥后装于变色硅胶盒内，外用锡纸包扎密封，进行液氮冻存超低温贮藏，待来年需要用时将贮藏的花粉依次在-73℃、-20℃、4℃中分别放置24小时进行逐步苏醒，最后于黑暗环境中恢复至室温，备用。该方法保险可靠，可有效维持梨花粉的活力，操作简单易行，节省空间，且可借鉴用于其他种质资源的保存，具有广泛的应用价值。

权利要求

长期贮藏梨花粉的方法，包含：1)花粉采集：采含苞待放的大蕾期花苞，带回室内，揉搓花朵，使花药与花丝分离，用孔径1.43mm细孔筛筛下花药，雨后采花或花瓣沾有露时，先晾干再揉搓花朵，花药在温度20～25℃、相对湿度体积比70％～80％、无阳光直射的室内单层摊匀，经1～2天后散出花粉，爆出的花粉用石蜡纸分小包包好，每包5cm×5cm×0.5cm大小，埋入放有变色硅胶的干燥容器中，盒用锡纸包扎整齐，以达到干燥遮光的目的；2)液氮冻存花粉：将包扎好的花粉置于液氮罐内，淹没于液氮，为防止液氮挥发殆尽，贮藏期间内每隔两个月补充一次液氮；3)花粉复苏：待需要使用花粉时，打开罐口，倾倒出罐内的液氮，将贮藏的花粉依次在‑73℃、‑20℃、4℃中分别放置24小时进行逐步苏醒，最后于黑暗环境中恢复至室温，备用。

说明书

长期贮藏梨花粉种质的方法

一、技术领域

[0001] 本发明是长期贮藏梨花粉种质的方法，属于植物发育生物学领域。二、背景技术

[0002] 梨（Pyrus)属于配子体型自交不亲和性果树，绝大多数品种自花授粉不结实，在 生产上必须配置授粉树，或者进行人工授粉才能获得预期的产量和品质。但在生产上由 于花期不遇或者天气原因，常常需要从外地采集、调用花粉，甚至需要用到前一年贮藏的花 粉；在梨育种工作中，根据育种目标的不同，育种者也常常要从各地调用具特殊或优异性状 的梨种质花粉以丰富遗传多样性；此外，由于梨是典型的配子体型自交不亲和性果树，梨花 粉在自交不亲和性机理的研究中常常作为重要的研究试材，但梨花粉一年只能采一次，这 必然涉及到在一年的研究周期中花粉的贮藏问题。不论从梨树栽培、育种还是科学研究方 面来说，其工作基础是花粉须具有较高的活力，具有较高活力的花粉是上述工作取得成功 的关键性前提条件。因此，怎样在贮藏、运输过程中延长花粉寿命，最大限度地维持花粉活 力对梨树生产、种质保存、科研具有重要意义。相关研究报道，花粉的活力受温度和湿度的 影响，但尚未形成能够较好维持梨花粉活力的有效贮藏方法。一般常温下贮藏的梨花粉活 力迅速下降，失去应用价值。本发明通过比较研究不同贮藏方法对梨花粉萌发和花粉管生 长的影响，形成包含三个关键技术步骤的梨花粉长期贮藏技术。该技术操作简单易行，节省 空间，有效维持了长期贮藏后梨花粉的活力，在梨树生产、育种、种质保存、科学研究等方面 具有重要的应用价值。三、发明内容

[0003] 技术要求

[0004] 本发明的目的在于解决梨花粉在常规贮藏过程中花粉活力急速降低，以致不能满 足生产、科研需要的问题。

[0005] 技术方案

[0006] 本发明要解决上述问题所采用的新技术方案如下：

[0007] 1、花粉采集方法：采含苞待放的大蕾期花苞，带回室内，揉搓花朵，使花药与花丝 分离，用细孔筛筛下花药。雨后采花或花瓣沾有露时，先晾干再揉搓花朵。花药在温度20〜 25°C、相对湿度70%〜80%、无阳光直射的室内单层摊勻，经1〜2天后即可散出花粉。爆 出的花粉用石蜡纸分小包包好，每包5cmX5cmX0. 5cm大小，埋入放有变色硅胶的干燥容 器中，外用锡纸包扎整齐，以达到干燥遮光的目的；

[0008] 2、液氮冻存花粉：根据所藏花粉量的多少来选择大小合适的液氮罐，将包扎好的 花粉置于液氮罐内，淹没于液氮。为防止液氮挥发殆尽，贮藏期间内每隔两个月补充一次液 氮；

[0009] 3、花粉复苏：待需要使用花粉时，打开罐口，倾倒出罐内的液氮，此时切忌立即将 包扎的花粉直接暴露于常温环境中。因为升温太快会导致花粉褐变，使得花粉蛋白酶性失活，大大降低花粉活力。应将贮藏的花粉依次在-73°C、-20°C、4°C中分别放置24小时进行 逐步苏醒，最后于黑暗环境中恢复至室温，备用。

[0010] 有益效果

[0011] 本发明的贮藏方法有效地维持了经长期贮藏的梨花粉活力，对于梨树的生产、育 种、种质保存、科学研究等方面具有重要的有益效果，具体表现如下：

[0012] (1)保障了人工授粉时采集、调运花粉过程中花粉的安全性，使生产中保存花粉以 备来年使用，保障花粉充足供应成为可能；

[0013] (2)为育种工作中所需的不同地域来源花粉的高活力保存提供技术支撑，同时为 通过花粉进行梨种质保存提供了一条新的途径；

[0014] (3)可以周年为梨自交不亲和性机理科学研究提供具高活力的梨花粉，克服了相 关研究的季节局限性；

[0015] (4)本贮藏方法投资小，操作简单，能在很小的空间里贮藏大量的花粉，并可借鉴 用于保存种子等其他种质资源，有着广泛的实用价值。四、附图说明：

[0016] 图1 ‘丰水，梨花粉在_20°C、_73°C、_196°C三种贮藏环境下花粉活力的变化；

[0017] 图2长期贮藏梨花粉的流程示意图；五、具体实施方式：

[0018](一）实验方法

[0019] 1、花粉采集：本专利以‘丰水’梨为研究试材，采集含苞待放的大蕾期花苞，收集花 药，室温下干燥爆粉，待花粉散出后用石蜡纸包好，按不同的方法保存花粉，并定期进行检 测；

[0020] 2、花粉保存方法：

[0021] (1)花粉贮藏温度的梯度处理：将同一包花粉分成五份，每份约5cmX5cmX0. 5cm 大小，埋入放有变色硅胶（一种颗粒状干燥剂，蓝色，吸水后变白）的干燥容器中，分别在室 温、4°C、-20-73_196°C条件下贮藏。其中室温下每隔5天，按上述花粉培养法测量 一次花粉萌发率和花粉管长度。4°C每隔10天测量一次，而-20°C、-73°C、-196°C条件下贮 藏的花粉将于贮藏之日起第30天、60天、90天、180天、270天、360天进行测定；

[0022] (2)花粉贮藏湿度的梯度处理：将采集的花粉用石蜡纸包好后置于空气湿度 15 %、32 %、52 %、66 %、81 %的密闭盒子中，并将盒子置于黑暗、室温条件下，分别贮存1、6、 12、18天后，按上述花粉培养与测量方法测定花粉萌发率和花粉管长度；

[0023] 3、花粉活力测定：本研究采用固体培养基培养花粉。培养基的组分为10%蔗糖、 0.01%硼酸和的琼脂。将花粉均勻地点播在培养基上，在黑暗、25°C条件下培养24h。 在培养基上滴数滴甲基蓝染色液，在显微镜下观察花粉的萌发和生长情况。在统计花粉萌 发率时，以萌出的花粉管长度超过花粉粒直径的为已发芽，否则为未发芽花粉，统计100粒 以上；花粉萌发率为已萌发的花粉数除以总观测的花粉数乘以100%;花粉管生长长度测量 20条，计算其平均值。每个处理重复3次。

[0024] ( 二）结果与分析[0025] 1、不同贮藏温度对花粉萌发和花粉管生长的影响

[0026] 通过数据分析发现，在不同贮藏温度下贮藏的花粉萌发率和花粉管生长长度差异 显著。室温条件下，花粉活力下降很快，贮藏20天后萌发率从0天的98. 7%下降到4.3%， 贮藏30天后，花粉完全失去活力。但随着贮藏温度的降低，花粉保持活力的时间越来越长， 液氮冻存（_196°C )条件下，花粉贮藏360天后花粉的萌发率依然可达68. 9%且花粉管长 度仍较长，说明活力强（图1)。

[0027] 2、贮藏湿度对花粉萌发和花粉管生长的影响

[0028] 在不同贮藏湿度下花粉萌发和花粉管生长存在很大差异（表1)，在高湿度条件下 花粉迅速失去活力，随着湿度的降低，花粉维持活力的时间也越长，如相对湿度15%时，室 温贮藏18天后，划分萌发率仍然达到58. 2%，花粉管长度也较高适度条件下花粉管长。

[0029] 贮藏温度和湿度和花粉活力保持时间呈负相关关系，说明低温、低湿度有利于梨 花粉的长期保存，利于梨花粉活力的维持。

[0030] 根据以上结论提出本发明内容（图2)：将梨花粉经干燥后装于变色硅胶盒内，外 用锡纸包扎密封，进行液氮超低温贮藏，待需要用时将贮藏的花粉依次在-73°C、-20°C、4°C 中分别放置24小时进行逐步苏醒，最后于黑暗环境中恢复至室温，备用。该贮藏方法保险 可靠，操作简单易行且节省空间，解决了梨花粉在常规贮藏过程中花粉活力急速降低，以致 不能满足生产、科研需要的问题。

[0031] 表1 ‘丰水’花粉在不同湿度贮藏后的萌发率和花粉管长度

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