一种节水型的稚鲍养殖方法

摘要

本发明公开了一种节水型稚鲍养殖方法，养殖过程如下：(1)在养殖池内铺砖，然后注入海水；(2)稚鲍下池，同时开始曝气；(3)定期投喂饵料，并在养殖水体中和/或投喂的饵料中添加蛭弧菌蛭质体菌液；且每5-30天换水一次，每次换水量为一个量程；(4)当稚鲍体长达到1.0-1.6cm时，即可采收稚鲍；所述菌株为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M209172，保藏日期为2009年8月7日。本发明的优点有：(1)能节能减排，更环保；(2)蛭质体制备、保存更方便，耐受力强，杀菌作用时间更久；(3)能够明显改善稚鲍体质，增强免疫力。

权利要求

一种节水型稚鲍养殖方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在养殖池内铺砖，然后注入海水；(2)稚鲍下池，同时开始曝气；(3)定期投喂饵料，并在养殖水体中和/或投喂的饵料中添加蛭弧菌蛭质体菌液；且每5‑30天换水一次，每次为全池换水；(4)当稚鲍体长到1.0‑1.6cm时，即可采收稚鲍；所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中国典型培养物保藏中心保藏，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M209172，保藏日期为2009年8月7日。

2.根据权利要求1所述的养殖方法，其特征在于，所述铺砖是先将砖洗刷干净并用高 锰酸钾溶液消毒，消毒后再采取骑叠式摆砖。

3.根据权利要求1所述的养殖方法，其特征在于，所述海水在注入前经过砂滤和沉淀 处理。

4.根据权利要求1所述的养殖方法，其特征在于，所述投喂饵料时要先停止曝气，投饵 0. 5-lh后再开始曝气。

5.根据权利要求1所述的养殖方法，其特征在于，所述稚鲍下池后，曝气量控制在 10-100L/h/m3，光照控制在 50-2001ux，水温控制在 15_28°C。

6.根据权利要求1所述的养殖方法，其特征在于，所述在投喂的饵料中添加蛭弧菌蛭 质体菌液是指用浓度为10-107pfU/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡饵料20〜40分钟。

7.根据权利要求1所述的养殖方法，其特征在于，所述在养殖水体中添加的蛭弧菌蛭 质体菌液，使蛭弧菌蛭质体在水体中的浓度至少达到10pfu/mL。

8.根据权利要求7所述的养殖方法，其特征在于，所述每次换水后都立即添加蛭弧菌 蛭质体菌液，并使蛭弧菌蛭质体在水体中的浓度至少达到10pfu/mL。

9.根据权利要求7或8所述的养殖方法，其特征在于，所述蛭弧菌蛭质体在水体中的浓 度为 10-107pfu/mL。

10.根据权利要求1〜8任意一项所述的养殖方法，其特征在于，所述蛭弧菌蛭质体菌 液的制备方法为：在含副溶血弧菌的DNB液体培养基中接入蛭弧菌BDFM05，恒温摇床150rpm〜300rpm、 20〜35°C培养24〜48h ；培养液于4°C 6000〜8000rpm离心15〜20min，取沉淀，向沉淀 中加入DNB液体培养基重新悬浮蛭弧菌沉淀物，即制得蛭弧菌蛭质体菌液。

说明书

一种节水型的稚鲍养殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及海水贝类养殖技术领域，特别涉及一种提高稚鲍养殖成活率、节水节 能、绿色环保的养殖方法。

背景技术

[0002] 我国的鲍养殖研究从20世纪70年代开始起步，经过近三十年的发展，取得了巨大 的成绩和显著的经济效益。近年来，随着稚鲍人工养殖规模的扩大，技术上的缺陷也逐渐凸 显出来，在养殖过程中，特别是在稚鲍剥离后，容易引发一些稚鲍疾病，随着养殖规模迅速 的发展，其养殖工作普遍存在着稚鲍于剥离后数天内出现不同程度大量死亡的现象，死亡 率高达80%以上，保苗率一般维持在3-20%之间，多数养殖场的保苗率低于10%，目前此 种情况一直未能得以解决。由于鲍苗、稚鲍大量死亡导致生产成本增加，许多场家不能维持 正常生产，部分场家停产、转产，致使供给的稚鲍量锐减。给养殖户带来了巨大的经济损失。 病原体感染是引起稚鲍死亡的主要原因，人工养殖主要是细菌性疾病和病毒性疾病。常见 的潜在致病菌有副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等。

[0003] 目前常规的防治稚鲍掉板的方法主要是定期施用抗生素，抗生素虽然具有药物直 接入水、浓度高、吸收快、疗效好的优点，但缺点是可能对稚鲍产生刺激性、引发新病症。如 果长期大量使用抗生素，不仅会使潜在致病菌耐药菌株增加，也会使一些鲍病例变得难以 治愈。此外鲍体内抗生素残留会影响稚鲍品质，不利于销售，进而造成养殖者的经济损失。 中草药防治稚鲍掉板也是一种常见的办法，具有无药物残留、经济效益高的优点，但也有见 效慢的缺点，因而寻求一种更高效、经济的办法显得极为迫切。

[0004] 蛭弧菌蛭质体是指蛭弧菌侵入宿主细菌前的生长形式。蛭弧菌的生活史可分为脱 离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体状态和在宿主细菌内生长发育的蛭质体状态。游 泳体蛭弧菌侵入宿主的周质空间的同时失去鞭毛，宿主细胞也开始膨胀，变为一个对渗透 压并不敏感的球形体（即"蛭质体"）。与游泳体相比，蛭质体具有制备、保存更为方便，环 境耐受力强，杀菌作用时间虽略慢但更久等特点，同时还具有潜在的灭活疫苗功能。当游泳 体蛭弧菌入侵宿主细胞后，宿主细胞的呼吸作用（respiration)很快被停止。蛭弧菌也进 入蛭质体状态，开始分泌多种酶，消解宿主细胞的大分子为小分子物质，进而整合为自身的 营养物质，使自身生长，变长。最终，长条状的蛭质体分成很多短的节段，长出鞭毛，重新成 为游泳体。之后它们分泌必需的酶类，破壁而出，再次成为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游 泳的游泳体。在此蛭质体发育期间，蛭弧菌并不改变宿主细胞的表面结构，使原宿主仍具有 抗原作用，可刺激生物体，产生免疫应答反应。

[0005] “绿色养殖”成为近年来国家的重大需求，引起水产界的广泛关注。目前，用蛭弧菌 蛭质体来进行稚鲍养殖在国内外尚未报道。

[0006] 已有的研究表明，作为一种有益微生物制剂，无论是在食品工业还是在（海洋） 水产养殖等领域，蛭弧菌的应用均是安全的。例如：在国外，Lenz and Hespell (1978) 研究发现，蛭弧菌及对动物及人的细胞不具侵染性[Lenz R. W.，HespellR. B. Attemptsto grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells. Archives of Microbiology, 1978,119(3) =245-248] „在国内，林茂等(2006)研究了蛭弧菌对鱼类细 胞的作用，发现它对鱼类细菌没有侵染作用[林茂，杨先乐，薛晖，曹海鹏，邱军强。蛭弧菌 BDH2102对鱼类细胞及病原菌的作用。微生物学通报，2006，33(1) :7_11]。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种提高稚鲍免疫力，促进稚 鲍生长，提高稚鲍成活率的节水型养殖方法。

[0008] 本发明的目的通过下述方案实现：

[0009] 一种节水型稚鲍养殖方法，其特征在于，养殖过程如下：

[0010] (1)在养殖池内铺砖，然后注入海水；

[0011] (2)稚鲍下池，同时开始曝气；

[0012] (3)定期投喂饵料，并在养殖水体中和/或投喂的饵料中添加蛭弧菌蛭质体菌液； 且每5-30天换水一次，每次为全池换水；

[0013] (4)当稚鲍体长到1. 0-1. 6cm时，即可收稚鲍；

[0014] 所述蛭弧菌为蛭弧菌（Bdellovibrio sp. )BDFM05，由中国典型培养物保藏中心保 藏，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO :M209172，保藏日期为2009年8月7日。BDFM05 呈单细胞，椭圆形，大小为1. 43X0. 53 μ m,端生鞭毛，鞭毛长度至少2μ m ；所述蛭弧菌 (Bdellovibrio sp. )BDFM05以双层平板法于28°C培养三天可形成直径2〜3mm的透明圆 形噬菌斑，采用蛭质体高密度发酵方法发酵，得到一定浓度的蛭弧菌蛭质体。

[0015] 优选地，所述铺砖是先将砖洗刷干净并用高锰酸钾溶液消毒，消毒后再采取骑叠 式摆砖。

[0016] 优选地，所述海水在注入前经过砂滤和沉淀处理。

[0017] 所投喂的饵料为人工合成饵料，优选地，所述投喂饵料时要先停止曝气，投饵 0. 5-lh后再开始曝气。

[0018] 优选地，所述稚鲍下池后，曝气量控制在10-100L/h/m3，光照控制在50-2001ux，水 温控制在15-28°C。

[0019] 优选地，所述在投喂的饵料中添加蛭弧菌蛭质体菌液是指用浓度为10-107pfU/mL 的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡饵料20〜40分钟。

[0020] 优选地，所述在养殖水体中添加的蛭弧菌蛭质体菌液，使蛭弧菌蛭质体在水体中 的浓度至少达到10pfu/mL。

[0021] 优选地，所述每次换水后都立即添加蛭弧菌蛭质体菌液，并使蛭弧菌蛭质体在水 体中的浓度至少达到10pfu/mL。

[0022] 优选地，所述蛭弧菌蛭质体在水体中的浓度为10_107pfu/mL。

[0023] 优选地，所述蛭弧菌蛭质体菌液的制备方法为：

[0024] 在含副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)的DNB液体培养基中接入蛭弧菌 BDFM05 (CCTCC M209172)，恒温摇床 150rpm 〜300rpm、20 〜35°C培养 24 〜48h ；培养液于 40C 6000〜8000rpm离心15〜20min，取沉淀，向沉淀中加入DNB液体培养基重新悬浮蛭弧 菌沉淀物，即制得蛭弧菌蛭质体菌液。[0025] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

[0026] 1、本发明所述的蛭弧菌蛭质体菌液能显著提高稚鲍体质，增强免疫力。

[0027] 本发明中所述的蛭弧菌蛭质体菌液在控制稚鲍养殖环境、饵料、水体中细菌的效 果显著，能够明显改善稚鲍体质，增强免疫力。

[0028] 2、本发明所述的蛭弧菌蛭质体菌液在控制和消除稚鲍潜在致病菌应用中安全性 好。

[0029] 蛭弧菌蛭质体菌液通过裂解潜在致病菌的方法是生物方法。蛭弧菌蛭质体可侵 染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑止或清除生物体及其环境中潜在致病菌的生物净 化因子，且其在裂解完宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，从而克服了抗生素滥用带来的副 作用和常规消毒剂对稚鲍的不利影响，同时已有研究已证明蛭弧菌对人等无毒。

[0030] 3、所述的蛭弧菌蛭质体菌液能净化水质并促进稚鲍生长。

[0031] 蛭弧菌蛭质体对水质有净化作用，能改善动物胃肠道环境，促进生长。

[0032] 4、含有本发明所述的蛭弧菌蛭质体菌液适合推广应用于鲍鱼养殖过程。

[0033] 蛭弧菌蛭质体对人和鲍鱼无毒副作用。适合于鲍鱼大规模工厂化养殖，可以为鲍 鱼的绿色加工生产提供保障并且为控制和消除鲍鱼潜在致病菌提供了一种新方法。

具体实施方式

[0034] 下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限 于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本发明的实施地位山东某养殖 场，本发明的稚鲍为皱纹盘鲍，由该养殖场提供。

[0035] 实施例1

[0036] 蛭弧菌蛭质体的制备

[0037] 所述蛭弧菌（Bdellovibrio sp.)BDFM05以双层平板法于28°C培养三天可形成直 径2〜3mm的透明圆形噬菌斑，所用的蛭弧菌蛭质体通过高密度蛭弧菌蛭质体的发酵方法 进行发酵：在装有IOOmL营养肉汤（蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，pH 7. 4士0. 2)的 锥形瓶中接种0. 5mL 107cfu/mL副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，购于美国典型微 生物菌种保藏中心 AmericanType Culture Collection，编号：ATCC 17802)，200rpm、28°C 摇床培养18小时，培养液分别于4°C、5000rpm离心15min，弃上清。用5mL生理盐水悬浮 沉淀菌体，之后加入到一个装有IOOmL DNB (dilute nutrient broth)液体培养基（营养肉 汤0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，海水晶28g，溶于IOOOmL蒸馏水，pH值为 7. 2〜7. 6)的锥形瓶中，再加入ImL含103pfu/mL的蛭弧菌BDFM05 (CCTCC M209172)。恒温 摇床250rpm、28°C培养36h。培养液于4°C 6000rpm离心20min，取沉淀，加入IOmL DNB液体 培养基（营养肉汤0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，海水晶28g，溶于IOOOmL 蒸馏水中，pH值为7. 2〜7. 6)悬浮沉淀菌体，得到浓度为107-109pfU/mL的蛭弧菌蛭质体 菌液。

[0038] 实施例2

[0039] 蛭弧菌蛭质体菌液在养殖中应用

[0040] 本发明实施地的养殖池建在养殖大棚内，每个水池规格为2X2X0. 75m，水深为 0.45m。每池放置曝气管8条。水池上方盖上遮光度为60%的遮光布，避免光照过强。光照强度一般控制在（50-200) lux。

[0041] 实施地海域的具体水质条件为：水温15-28°C，盐度27-33%。，pH为6. 8-7. 2，海水 经过砂滤、沉淀处理，并在进入养殖池前，在池进水管口包扎一个200目的网袋，防止细砂 入池。水源水质符合中华人民共和国国家标准渔业水质标准（GB11607-89)要求，符合农业 部《无公害食品海水养殖用水水质》（NY5052-2001)要求。

[0042] 铺砖前，将四角水泥方砖洗刷干净并用高锰酸钾溶液消毒，消毒后再放入池底，池 底共放60块四脚水泥砖，两侧对称、骑叠式放置，每列6块，每侧5列。放砖后各池均用高 锰酸钾溶液消毒，反复冲洗干净，然后注入经过砂滤和沉淀处理的海水。稚鲍下池，所选取 的附苗波纹板附稚鲍量在30-2000粒/板，稚鲍体长在2. 0-4. 5mm，稚鲍健康、活力好，每池 稚鲍剥离量为10000粒，投鲍后即开始曝气，曝气量为50L/h/m3。

[0043] 本发明设置一个生产对照组-正常流水，日换水量为池水量的2倍，每天早上6 ： 00 用高压水冲洗池子，晚上18:00正常投饵，期间不加蛭弧菌蛭质体菌液，完全的工厂养殖方 式，将其编为A组。其他具体编排方案如下：（1)在养殖水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，但 饵料中不加。

[0044] 每次换水后立即在养殖水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，所需48个水池分为B-1、 B-2、B-3、B-4, C-I、C_2、C_3、C_4，D_l、D_2、D_3、D_4，E_l、E_2、E_3、E—4，F_l、F_2、F—3、 F-4，G-l、G-2、G-3、G-4，每组2个重复。各组的换水周期及加菌液浓度如下：

[0045] B 组（Β-1、Β-2、Β-3、Β-4) :5天换（全池）水一 -次；[0046] C 组（C-l、C-2、C-3、C-4) :10天换（全池）水- 一次；[0047] D 组（D-l、D-2、D-3、D-4) :15天换（全池）水- 一次；[0048] E 组（Ε-1、Ε-2、Ε-3、Ε-4) ：20天换（全池）水- 一次；[0049] F 组（F-l、F-2、F-3、F-4) ：25天换（全池）水- 一次；[0050] G 组（G-l、G-2、G-3、G-4) ：30天换（全池）水- 一次；[0051] B-I、C-1、D-1、E-1、F-I、G- -1组每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭弧菌蛭质体菌体浓度达到IO1PfuAiL ；

[0052] B-2、C-2、D-2、E_2、F_2、G-2组每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液， 使水体中蛭弧菌蛭质体菌体浓度达到103pfu/mL ；

[0053] B-3、C-3、D-3、E_3、F_3、G-3组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌蛭质体菌 液，使水体中蛭弧菌蛭质体菌体浓度达到105pfU/mL ；

[0054] B-4、C-4、D-4，E_4、F_4、G-4组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌蛭质体菌 液，使水体中蛭弧菌蛭质体菌体浓度达到107pfu/mL。

[0055] (2)在饵料中加蛭弧菌蛭质体菌液，但在养殖水体中不加。

[0056] 每天投饵前用蛭弧菌蛭质体菌液浸泡饵料半小时，而每次换水后养殖水体都不加 蛭弧菌蛭质体菌液。所需48个水池分为b-1、b-2、b-3、b-4 ；c-1、c-2、c-3、c-4 ；d-l、d_2、 d-3、d-4 ；e-1、e-2、e_3、e_4 ；f_l、f_2、f_3、f-4 ；g-l, g_2、g-3、g-4 每组 2 个重复。各组 的换水周期及加菌液浓度如下：

[0057] b 组（b-1、b-2、b-3、b-4) ：5 天换(全池)水一次；

[0058] c 组（c-1、c-2、c-3、c-4) ：10 天换（全池)水一次；

[0059] d 组（d-1、d-2、d-3、d-4) ：15 天换(全池)水一次；[0060] e 组（e-1、e-2、e_3、e_4) ：20 天换（全池）水一次；

[0061] f 组（f-1、f-2、f-3、f-4) ：25 天换(全池)水一次；

[0062] g 组（g-1、g_2、g_3、g-4) ：30 天换（全池）水一次；

[0063] b-l、c-l、d-l、e-l、f-l、g-l组投的饵料经过浓度为IO1PfuAiL的蛭弧菌蛭质体菌 液菌液浸泡过的饵料；每次换水不在水体加蛭弧菌蛭质体菌液。

[0064] b-2、c-2、d-2、e-2、f-2、g-2组投的饵料经过浓度为103pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌 液菌液浸泡过的饵料；每次换水不在水体加蛭弧菌蛭质体菌液。

[0065] b-3、c-3、d-3、e-3、f-3、g-3组投的饵料经过浓度为105pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌 液菌液浸泡过的饵料；每次换水不在水体加蛭弧菌蛭质体菌液。

[0066] b-4、c-4、d-4、e-4、f-4、g-4组投的饵料经过浓度为107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌 液菌液浸泡过的饵料；每次换水不在水体加蛭弧菌蛭质体菌液。

[0067] (3)在养殖水体和饵料中均添加蛭弧菌蛭质体菌液。

[0068] 每天投饵前用蛭弧菌蛭质体菌液浸泡饵料半小时，每次换水后养殖水体也加蛭弧 菌蛭质体菌液。所需 48 个水池分为 Bb-l、Bb-2、Bb-3、Bb-4 ;Cc-l、Cc-2、Cc-3、Cc_4 ；Dd-U Dd-2、Dd-3、Dd-4 ；Ee_l、Ee_2、Ee_3、Ee_4 ；

[0069] Ff-1、Ff-2、Ff-3、Ff-4 ；Gg_l、Gg_2、Gg_3、Gg-4 每组 2 个重复。各组的换水周期 及加菌液浓度如下：

[0070] Bb 组（Bb-I、 Bb- -2、 Bb- -3、 Bb- -4) :5天换（全池）水一 -次；[0071] Cc 组（Cc-I、 Cc- -2、 Cc- -3、 Cc- -4) :10天换（全池）水- 一次；[0072] Dd 组（Dd-I、 Dd- -2、 Dd- -3、 Dd- -4) :15天换（全池）水- 一次；[0073] Ee 组（Ee-I、 Ee- -2、 Ee- -3、 Ee- -4) ：20天换（全池）水- 一次；[0074] Ff 组(Ff-U Ff- -2、 Ff- -3、 Ff- -4) ：25天换（全池）水- 一次；[0075] Gg 组（Gg-I、 Gg- -2、 Gg- -3、 Gg- -4) ：30天换（全池）水- 一次；[0076] Bb-I、Cc-I、 Dd- -1、 Ee- -1、 Ff -1、 Gg-I组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭弧菌蛭质体菌体浓度达到IO1PfuAiL ；每次投饵的饵料用浓度为 IO1PfuAiL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡半小时；

[0077] Bb-2、Cc-2、Dd_2、Ee_2、Ff-2, Gg-2组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌 蛭质体菌液，使水体中蛭弧菌蛭质体菌体浓度达到103pfU/mL ；每次投饵的饵料用浓度为 103pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡半小时。

[0078] Bb-3、Cc-3、Dd_3、Ee_3、Ff-3, Gg-3组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌 蛭质体菌液，使水体中蛭弧菌蛭质体菌体浓度达到105pfU/mL ；每次投饵的饵料用浓度为 105pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡半小时；

[0079] Bb-4、Cc-4、Dd_4、Ee_4、Ff-4, Gg-4组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌 蛭质体菌液，使水体中蛭弧菌蛭质体菌体浓度达到107pfU/mL ；每次投饵的饵料用浓度为 107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡半小时。

[0080] 本发明的各组池中，所投喂的饵料为人工合成饵料，饵料量随稚鲍大小而变化，当 要投喂饵料时，要先停止曝气，投饵Ih后再开始曝气。为了减少残饵对水质的破坏，需要每 天对除A组外各组池底和四角方砖上的残饵进行虹吸，也可间隔5天对残饵进行虹吸。除 此之外，每晚需要观察稚鲍活动情况，吃食状况等。[0081] 从剥离下板到最后统计稚鲍，时间为60天，为了 了解蛭弧菌蛭质体对稚鲍的成活 率的影响促进生长能力，需要最后对活稚鲍进行计数，并按一定指标统计稚鲍。

[0082] (4)养殖指标与测量

[0083] ①稚鲍初始量，每池1万稚鲍。

[0084] ②收稚鲍平均壳长，随机抽取50粒稚鲍，测量壳长，取平均值。

[0085] ③稚鲍平均重量，随机抽取50粒稚鲍，称其总重后取平均

[0086] ④收鲍总量，称取IOg稚鲍，计算其粒数，将稚鲍称总重估算粒数。

[0087] ⑤成活率，某阶段结束时稚鲍量占该阶段投稚鲍量的百分率。

[0088] (5)稚鲍免疫指标测定

[0089] 试验结束每组取样18个去壳，3个/管放于6个分别盛有ImL Hank’ s缓冲液（pH 值7-8)的2ml-Eppendorf管中，贮于-80°C以备抗免疫指标的测定。测定时取出样品，使其 在冰上融化。进行勻浆，然后6000r/min，-4°C离心5min.取上清用于免疫指标的测定。

[0090] ①酚氧化物酶的测定

[0091] 酚氧化物酶的活性测定是通过测定和L-DOPA (左旋多巴）反应生成的多巴胺的吸 光值来计算的。把每个样品100 μ L到1. 5mL的Eppendorf管中，每个样品重复三次。再加 入用PBS液配制的0. 5mg/mL海藻酸钠在26-27°C下反应30min。加入50 μ L的用PBS液配 制的3mg/mL的L-DOPA(左旋多巴），IOmin后，在490nm处读取吸光值。对照液用相应的 PBS液代替海藻酸钠。

[0092] ②溶菌酶活力测定

[0093] 以溶壁微球菌冻干粉为底物。用0. lmol/L,pH = 6.4的磷酸盐缓冲液配成底物悬 液（0D570nm〜0. 3)，取3. OmL该悬液于试管内置冰浴中，再加入50 μ L待测血清，混合，测 AO值。然后将试液移入37°C温浴中置30min，取出后再置于冰浴中lOmin，以终止反应，测 其A值。溶菌活力UL按（AO-A)/A式计算。

[0094] ③感染实验

[0095] 感染试验于预先消毒的盛有15L砂滤海水（盐度29〜30%。)的透明水族箱中进行，从A，B-U B-2.....Gg-4各个组随机取稚鲍200颗，设两个重复。向各组水体中添加副
溶血弧菌液，使水体中副溶血弧菌菌体浓度达到108cfu/mL。实验期间不流水养殖，正常投 饵，以5L/h/m3连续曝气，水温为22°C，pH控制在7. 2。人工感染后，连续观察5天，最终计 算成活率，采用相对存活率（Relative Percentage Survival, RPS)计算式：

[0096] RPS (% ) = (1-免疫组死亡率/对照组死亡率）X 100%

[0097] 此种方法对稚鲍养殖的各项指标影响具体见下表：

[0098] 表1 5天换水对稚鲍生长情况和免疫力的影响

[0099]组别 稚鲍初始 壳长 (mm) 收稚鲍平 均壳长 (mm) 收稚鲍 平均重 量(mg) 收稚鲍 总里 (只） 存活率 (%) 酚氧化 酶活性 (U/mL) 溶菌酶 活性 (U/mL) RPS(%)A 3.54 10.58 165.80 6245 62.45 0.766 0.463 0B-I 3.53 11.84 232.37 8582 85.82 1.345 0.609 88..2B-2 3.54 12.65 283.40 8656 86.56 1.456 0.707 89.5B-3 3.53 13.06 311.86 8774 87.74 1.665 0.796 95.4B-4 3.52 13.42 338.37 8996 89.96 1.732 0.918 100b-1 3.52 10.87 179.81 8564 85.64 1.434 0.606 86.9b-2 3.51 11.54 215.15 8685 86.85 1.483 0.704 89.6b-3 3.53 12.43 268.87 8787 87.87 1.671 0.798 94.7b-4 3.55 13.05 311.14 8992 89.92 1.759 0.909 100Bb-I 3.54 12.37 264.99 8577 85.77 1.378 0.599 89.2Bb-2 3.53 12.83 295.67 8660 86.60 1.501 0.704 93.5Bb-3 3.55 13.61 352.94 8863 88.63 1.673 0.799 98.1Bb-4 3.52 13.82 369.53 8997 89.97 1.808 0.926 100

[0100] 表2 10天换水对稚鲍生长情况和免疫力的影响

[0101]酚氧化 RPS(%；)
收稚鲍平 收稚鲍平收稚鲍 溶菌酶
稚鲍初始 存活率酶(PO)
组别 均壳长 均重量 总量 活性
壳长(mm) (%) 活性
(mm) (mg) (只） （U/mL)
(U/mL)
A 3.54 10.58 165.80 6245 62.45 0.766 0.463 0C-I 3.54 11.94 238.31 8467 84.67 1.332 0.614 88.7C-2 3.54 12.66 284.07 8645 86.45 1.501 0.706 89.5C-3 3.54 13.07 312.58 8796 87.96 1.685 0.798 94.2C-4 3.51 13.34 332.35 8962 89.62 1.776 0.915 100.c-1 3.54 10.86 179.32 8485 84.85 1.442 0.616 85.6c-2 3.52 11.62 219.66 8677 86.77 1.495 0.705 88.4c-3 3.55 12.47 271.47 8786 87.86 1.662 0.804 93.6c-4 [0102] 3.51 13.08 313.29 8986 89.86 1.782 0.908 100Cc-I 3.55 12.36 264.35 8446 84.46 1.351 0.609 89.2Cc-2 3.51 12.89 299.84 8647 86.47 1.532 0.707 93.5Cc-3 3.54 13.67 357.63 8796 87.96 1.680 0.799 96.6Cc-4 3.54 13.85 371.94 8978 89.78 1.793 0.924 100[0103] 表3 15天换水对稚Ii ■生长情况和免疫力的影响 [0104] 组别 稚鲍初 始壳长 (mm) 收稚鲍平 均壳& (mm) 收稚鲍平 均重量 (mg) 收稚鲍 总量 (只） 存活率 (%) 酚氧化 酶(PO) 活性 (U/mL) 溶菌酶 活性 (U/mL) RPS(%)A 3.54 10.58 165.80 6245 62.45 0.766 0.463 0D-I 3.55 11.76 227.69 8544 85.44 1.371 0.614 88.4D-2 3.55 12.65 283.40 8638 86.38 1.492 0.708 88.8D-3 3.54 13.14 317.62 8756 87.56 1.694 0.803 93.6D-4 3.55 13.36 333.85 8956 89.56 1.766 0.916 100d-1 3.54 10.85 178.82 8534 85.34 1.468 0.616 85.2d-2 3.55 11.46 210.71 8649 86.49 1.452 0.706 88.5d-3 3.54 12.36 264.35 8767 87.67 1.674 0.805 93.4d-4 3.53 13.03 309.71 8949 89.49 1.762 0.914 100Dd-I 3.54 12.35 263.71 8544 85.44 1.398 0.608 89.5Dd-2 3.53 12.79 292.91 8653 86.53 1.549 0.707 93.5Dd-3 3.54 13.55 348.29 8858 88.58 1.676 0.797 96.8Dd-4 3.55 13.24 324.93 8998 89.98 1.794 0.928 100[0105] 表4 20天换水对稚Ιί ■生长情况和免疫力的影响 [0106] 组别 稚鲍初始 壳长(mm) 收稚鲍平 均壳长 (mm) 收稚鲍平 均重量 (mg) 收稚鲍 总量 (只） 存活率 (%) 酚氧化 酶(PO) 活性 (U/mL) 溶菌酶 活性 (U/mL) RPS(%)A 3.54 10.58 165.80 6245 62.45 0.766 0.463 0E-I 3.51 11.66 221.93 8458 84.58 1.392 0.614 88.5[0107]E-2 3, .52 12.55 276.73 8641 86.41 1.502 0.708 88.9E-3 3 .54 13.07 312.58 8785 87.85 1.680 0.803 93.6E-4 3, .54 13.22 323.46 8956 89.56 1.791 0.916 100e-1 3, .53 10.63 168.16 8475 84.75 1.465 0.616 85.4e-2 3. .52 11.42 208.51 8674 86.74 1.483 0.706 88.3e-3 3. .55 12.36 264.35 8789 87.89 1.676 0.805 92.4e-4 3, .53 13.04 310.43 8985 89.85 1.788 0.914 100Ee-I 3. .53 12.25 257.36 8436 84.36 1.345 0.608 89.2Ee-2 3. ,54 12.78 292.23 8663 86.63 1.567 0.707 93.4Ee-3 3. ,54 13.46 341.40 8728 87.28 1.676 0.797 96.7Ee-4 [0108] [0109] 3. 表 .53 13.19 5 25天换水对稚舍 321.26 8958 89.58 包生长情况和免疫力的影响 1.793 0.928 100
收稚鲍平收稚鲍平收稚鲍
组稚鲍初始売 存活率
均壳长 均重量 总量
别 长（mm) (%)
(mm) (mg) (只）
酚氧化 酶(PO)
活性
溶菌酶 活性 (U/mL)
RPS(%)
(U/mL) A 3.54 10.58 165.80 6245 62.45 0.766 0.463 0F-I 3.51 11.66 221.93 8451 84.51 1.405 2.464 87.5F-2 3.52 12.55 276.73 8645 86.45 1.501 2.558 88.6F-3 3.54 13.07 312.58 8787 87.87 1.696 2.653 92.3F-4 3.54 13.22 323.46 8956 89.56 1.843 2.766 100f-1 3.53 10.63 168.16 8477 84.77 1.508 2.466 84.5f-2 3.52 11.42 208.51 8672 86.72 1.539 2.556 87.6f-3 3.55 12.36 264.35 8785 87.85 1.696 2.655 92.8f-4 3.53 13.04 310.43 8976 89.76 1.784 2.764 100Ff-I 3.53 12.25 257.36 8515 85.15 1.452 2.458 88.4Ff-2 3.54 12.78 292.23 8657 86.57 1.591 2.557 92.5Ff-3 3.54 13.46 341.40 8736 87.36 1.702 2.647 95.7Ff-4 [0110] [0111] 3.53 13.19 表6 30天换水对稚舍 321.26 8946 89.46 包生长情况和免疫力的影响 1.748 2.778 100
11组别 稚鲍初始 壳长（mm) 收稚鲍平 均壳长 (mm) 收稚鲍平 均重量 (mg) 收稚鲍 总量 (只） 存活 率 (%) 酚氧化酶 (PO) 活性 (U/rnL) 溶菌酶 活性 (U/mL) RPS (%)A 3.54 10.58 165.80 6245 62.45 0.766 0.463 0G-I 3.51 11.58 217.40 8438 84.38 1.405 0.618 87.6G-2 3.53 12.47 271.47 8635 86.35 1.526 0.715 88.4G-3 3.51 13.24 324.93 8764 87.64 1.682 0.807 92.4G-4 3.52 13.19 321.26 8949 89.49 1.861 0.917 100g-i 3.52 10.44 159.31 8477 84.77 1.492 0.617 84.8g-2 3.52 11.27 200.40 8663 86.63 1.593 0.706 87.6g-3 3.54 12.18 252.97 8778 87.78 1.708 0.804 91.5g-4 3.52 12.88 299.14 8971 89.71 1.799 0.917 100Gg-I 3.54 12.14 250.49 8504 85.04 1.455 0.605 88.4Gg-2 3.51 12.65 283.40 8635 86.35 1.592 0.703 92.3Gg-3 3.53 13.38 335.35 8738 87.38 1.734 0.806 95.6Gg-4 3.51 13.17 319.81 8953 89.53 1.826 0.927 100

[0112] 从表1-6可以看出，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭质体的浓度升高，成活率 都有一定升高，且都明显高于A组，说明采用新型的添加蛭弧菌蛭质体的方法，明显节约养 殖成本，以2 X 2 X 0. 75m的水池为例，按每天两个交换量的流水方式，水深0. 45m来计算，每 天需要3. 6吨海水，以海水的成本0. 264元/吨（养殖场提供的数据），这样一口水池每天 的耗水费用达到0. 95元，而应用蛭弧菌蛭质体的日耗水费用只有0. 047元，两者相差0. 9 元。因此这种新方法不仅大大节约了用水量，还节省了大量的人力，物力资源，节约了养殖 成本，提高了成活率。

[0113] 从不同换水周期来看，相同浓度下的各组稚鲍成活率，体长等都没有太大的变化， 说明采用新型养殖方法，5-30天不换水蛭弧菌蛭质体仍能促进稚鲍的生长。综合来看，在 lOpfu/mL浓度下，30天不换水是比较经济的方式，采用这样的方法，效果较佳。

[0114] 免疫力方面，添加蛭弧菌蛭质体的各组免疫指标明显高于A组；感染实验结果表 明，A组的存活率为0%，其他所有添加过蛭弧菌蛭质体的各组相对存活率为84. 5-100%o 说明蛭弧菌蛭质体能够显著提高稚鲍的免疫力。

[0115] 水质方面，氨态氮用次溴酸纳氧化法测定（GB12763.4-91)；亚硝酸盐氮用重 氮-偶氮光度法测定（GB12763.4-91)。应用试验结束时，对各组的水质进行了测定。结果 表明，A组水池中的各项水质测定值均高于试验组B、C、D. . . G组。其中，A组氨态氮的检测 结果为0. 0356mg/L, B-I与Gg-4之间最低为0. 0258mg/L、最高为0. 0354mg/L ；A组检测亚 硝酸盐氮结果为0. 051mg/L, B-I与Gg_4之间最低为0. 043mg/L、最高为0. 051mg/L。

[0116] 由以上结果分析可知，应用浓度为IO1-IO7PfVmL蛭弧菌蛭质体菌液可有效改善养殖水体环境，调节水中氨态氮、亚硝酸盐氮的含量，从而提供有利于稚鲍生存的水体环 境。弧菌数方面，采用涂布TCBS平板法检测，对照组A水体弧菌数在2. 67 X 102cfu/mL左 右，然而添加蛭弧菌蛭质体菌液的各组弧菌总数一般在2. 35-3. 82X IO1CfuAiL,说明蛭弧 菌蛭质体能有效控制水体的弧菌数，并达到改善水质的目的细菌数方面，综合来看，无论是 在水体，还是在饵料，抑或两者中都添加蛭弧菌蛭质体菌液，都能明显的提高稚鲍的体质， 增强稚鲍的免疫力，而且能够改善水质，达到节水节能、提高成活率的良好效果。

[0117] 从蛭弧菌蛭质体添加方式来看，不论在水体、饵料，或者是两者均使用蛭弧菌蛭质 体，三种方法都能大大提高稚鲍的成活率、促进稚鲍的生长。但在养殖水体和饵料中均添加 蛭弧菌蛭质体的方法效果最佳。

[0118] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例限 制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理所作的改变、修饰、替代、均应为等效的置换， 都在本发明的保护范围之内。