一种核桃壳提取物及其抗艾滋病毒的药物用途

摘要

本发明“一种核桃壳提取物及其抗艾滋病毒的药物用途”涉及一种核桃壳有效部位的提取分离方法及其医药用途。本发明的核桃壳提取物由经粉碎的核桃壳以碱溶液浸泡提取、醇沉、溶剂回收、干燥而成。本发明得到的核桃壳提取物能有效抑制艾滋病毒(HIV)，可以预期发展成为防治艾滋病的药物。药效学试验结果显示：核桃壳具有体外抗HIV-1活性，治疗指数大于400。

权利要求

1.一种具有抗艾滋病毒功能的核桃壳提取物，其由包含下列步骤的方法制备得到：a)粉碎粗品，加氢氧化钠溶液至刚好浸没样品，常温浸泡10-24小时，过滤得滤液A；

b)再加入500-1000毫升碱液，放置1-3小时，过滤，合并滤液，得滤液B；

c)在滤液B中加入冰醋酸，放置0.5-2小时，过滤得沉淀C，滤液加入1倍量乙醇，放置

0.5-2小时，过滤得沉淀D，滤液再加入1倍量乙醇，放置0.5-2小时，过滤得沉淀E，滤液继续加入3倍量乙醇，放置0.5-2小时，过滤得沉淀F；

d)将沉淀C、D、E、F中的一个或多个部分置30-50℃减压烘干1-3小时，得干品即为产品。

2.根据权利要求1的核桃壳提取物，其制备方法的步骤a)中的氢氧化钠溶液是指浓度为1摩尔/升的氢氧化钠溶液。

3.根据权利要求1的核桃壳提取物，其制备方法的步骤b)中的碱液是指浓度为1摩尔/升的氢氧化钠溶液。

4.根据权利要求1的核桃壳提取物，其制备方法的步骤c)中的乙醇的浓度为

20-100％。

5.权利要求1-4之一的核桃壳提取物用于制备防治艾滋病的药物的用途。

6.一种具有抑制艾滋病毒功能的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的权利要求1-4之一的核桃壳提取物和可药用载体。

7.根据权利要求6的药物组合物，其是片剂、胶囊剂、控释剂或缓释剂。

说明书

一种核桃壳提取物及其抗艾滋病毒的药物用途

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域。具体而言，本发明涉及一种核桃壳提取物及其医药用途。该提取物表现出有效的体外抑制艾滋病毒功能，治疗指数较高，可以预期发展成为防治艾滋病的药物。

背景技术

[0002] 艾滋病的医学全名为“获得性免疫缺陷综合征”(AcquiredImmune Deficiency Syndrome，即AIDS)，由人类免疫缺陷病毒(HIV，又称艾滋病病毒)引起。HIV病毒是一种能攻击人体免疫系统的病毒，它把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而破坏人的免疫系统，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵抗能力而发病，从而发生多种感染或肿瘤，最后导致死亡。当HIV感染者的免疫功能受到病毒的严重破坏、以至不能维持最低的抗病能力时，感染者便发展为艾滋病病人。

[0003] HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(lentivirus)，目前已发现两种HIV病毒株系，分别为HIV-1和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到。其毒力和传播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。

[0004] 艾滋病的危害席卷全球，蔓延之势十分迅猛。1984年，全世界报告的艾滋病患者不足3000人。联合国艾滋病规划署发布的《2008艾滋病流行状况报告》指出：截至2007年底，艾滋病已经导致2500万人死亡，另有3300万人受感染，其中我国有70万人。我国自1985年首次发现HIV病毒感染者，至今已有60～80万人发生了感染，专家估计，如果不迅速采取有效的预防措施，按目前的年平均30％的增长速度，到2010年，我国的HIV感染者将超过1000万。在非洲的有些国家，HIV的感染率达总人口30％以上。因此，预防和治疗艾滋病，已不仅仅是挽救个人生命的问题，而是关系到民族存亡的大事。

[0005] 艾滋病目前仍是不治之症。历史上许多曾严重威胁人类健康的疾病，都因开发出有效的疫苗而被控制甚至消灭，例如天花、小儿麻痹、麻疹等。但目前人类还没有研制成功艾滋病疫苗，科学家们仍在努力。因此，研制抗HIV药物迫在眉睫。目前，艾滋病的治疗一方面是抑制病毒，增强免疫功能，另一方面是防治机会性感染，缓解症状、延长生命。经过几年的实践证明，最行之有效的治疗措施是增加使用有效的抗HIV药物，通常使用联合疗法，包括核苷类(如美国FDA推荐应用的AZT(重氮脱氧胸苷))、非核苷类及蛋白酶抑制剂在内的两种或多种药物。这样的联合疗法被认为是高效的抗逆转录病毒治疗(HAART，或称“鸡尾酒疗法”)。但HAART并不能根除体内的病毒，而长期的药物治疗也会带来一些副作用，且价格较高(每人每年高达15000美金)。国内的专家正将目光瞄准中药领域，发掘中国医药学宝库，力图找到能有效抑制病毒、修复人体免疫力、低毒、廉价的抗HIV药物，而我们的前期研究已看到了希望。

[0006] 核桃壳为胡桃科植物泡核桃Juglans sigillata、胡桃Juglans reglia、核桃楸Juglans mandshurica、野核桃Juglans cathayensis等的成熟果实硬壳。核桃又名胡桃、羌桃，是世界四大干果之一，食用具有丰富的营养价值。核桃入药，通常用其种仁。《本草纲目》记述，核桃仁有“补气养血，润燥化痰，益命门，处三焦，温肺润肠，治虚寒喘咳，腰脚重疼，心腹疝痛，血痢肠风”等功效。据现有报道，核桃仁具有防治心脑血管疾病、改善消化系统功能、治疗胆石症、清除自由基、消炎杀菌、防癌抗癌等功效。随着科学技术的发展和人类生活水平的提高，人们对核桃资源的开发研究已不仅是以核桃仁为主，在核桃的树皮、果(青)皮、枝条、叶、花、坚果壳的应用研究上也取得了新的进展。然而，关于核桃的树皮等部位的应用研究还局限于工艺品制作、饲料、活性炭原料等方面。关于核桃的坚果壳在制备药物方面的应用研究除中国发明专利申请(申请号：200710056996.8)表明核桃壳的醇提取物具有一定的强心及改善心肌供血的活性外，其余方面的应用尚未见报道；且该技术方案仅涉及核桃壳的乙醇提取部位，对于核桃壳的其他提取物的制药用途也未见报道。

[0007] 世界上出产核桃的国家很多，除我国外，还有美国、法国、意大利、印度、土耳其等。核桃在我国具有2000多年的栽培历史，栽培面积为世界最大。2008年我国的核桃总产量达到83万吨，居世界前列。核桃在我国绝大部分省区均有栽培分布，其中云南是著名核桃产区，年产量居全国之首。

[0008] 随着近年来核桃加工工业的发展，大量的核桃壳下脚料得以收集利用。核桃加工出仁率按45-50％计算，核桃出壳率达50-55％，折算起来现在每年可有41-45万吨的核桃壳资源可以利用。现在核桃壳主要直接作为生产活性炭的原料、制造环保滤料进行污水处理、以及在油田中应用、研磨材料制造等。核桃壳作为药物的应用研发还很少。现代研究表明核桃壳具有抗氧化活性，能有效地清除羟基自由基，而对超氧阴离子无清除作用，可与同浓度的茶多酚相媲美。但单纯抗氧化活性，很难确定其在哪一类疾病中应用能有较好的防治效价。

[0009] 因核桃壳的药理活性、功能主治的研究在国内外开展尚少，影响了这一丰富天然资源的有效开发和利用，长期以来造成这一药用资源的巨大浪费。以云南省为例，云南大理漾濞县为核桃之乡，大量种植泡核桃Juglans sigillata。大理漾濞核桃有限责任公司对核桃的深加工、精加工已取得良好的社会效益和经济效益，成为省、州、县的龙头企业，被誉为云南省的“企业之星”，为漾濞县的“富民强县”做出了积极贡献。然而，被废弃的核桃壳在当地只用做燃料，并未再利用。因此，将核桃壳按现代工艺进行提取分离并寻找其有效抑制艾滋病毒的有效部位既有巨大的社会效益又有显著的经济效益。在作了一系列相关研究后我们发现了一种十分经济有效的核桃壳抗HIV病毒有效部位的制备方法，并据此完成了本发明。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种具有抗HIV功能的核桃壳提取物，并公开了该提取物用于制备防治艾滋病的药物的用途。

[0011] 具体而言，本发明中核桃壳具抗艾滋病毒活性的有效部位提取物的制备方法如下：用碱溶液浸泡提取经粉碎的核桃壳、醇沉、浓缩提取回收溶剂得到的抑制HIV病毒生长活性有效部位经减压浓缩至无醇味、干燥得产品。

[0012] 本发明中的核桃壳可以是泡核桃Juglans sigillata、胡桃Juglansreglia、核桃楸Juglans mandshurica、野核桃Juglans cathayensis或胡桃科胡桃属其他植物中的一种或多种。

[0013] 本发明所述的核桃壳提取物药物组合物是由核桃壳碱溶液提取物和药学上应用的各种制剂辅料，通过合理组合制成的用于医疗目的的制剂。

[0014] 本发明具有抗HIV病毒功能的核桃壳提取物可以与现已上市的抗艾滋病药物如重氮脱氧胸苷(AZT)、齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、地拉韦定(delavirdine)、沙喹那韦、奈韦拉平(nevirapine)、利托那韦(ritonavir)和吲哚那韦等联合使用，制备得到具有艾滋病毒抑制活性的组合物，可用于治疗艾滋病。该类药物组合物可以采用片剂、胶囊剂等剂型药物，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型。这些药物组合物可以用于治疗艾滋病、延长艾滋病人生存时间和/或质量等用途。

[0015] 本发明的有益之处是：核桃树自然资源丰富，本发明提取物原料核桃壳资源丰富易得，提取工艺简单、成分及药效稳定，容易实现产业化。此外，该项研究完全有希望研发出一种对核桃种植业，尤其是边疆经济发展有重大推动作用的抗艾滋新药。

具体实施方式

[0016] 为了更好地理解本发明的实质，下面通过实施例进一步说明本发明。实施例给出了代表性的部分核桃壳提取物的制备方法和抗HIV病毒活性数据的药理实验结果，说明其在抗艾滋病药物研究领域中的用途。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。

[0017] 实施例1：核桃壳提取物A的制备

[0018] 核桃壳粗品1千克，粉碎，加800毫升的氢氧化钠溶液(1摩尔/升)，常温浸泡过夜，过滤。再加入700毫升的氢氧化钠溶液(1摩尔/升)，放置2小时，过滤，合并滤液。在滤液中加入冰醋酸至pH＝5，放置1小时，过滤。滤液加入1倍量乙醇(95％)，放置1小时，过滤。滤液再加入1倍量乙醇(95％)，放置1小时，过滤，得沉淀a。将a置40℃减压，烘干2小时，得干品1.8克即得产品A。提取率：0.18％。

[0019] 实施例2：核桃壳提取物B的制备

[0020] 核桃壳粗品1千克，粉碎，加800毫升的氢氧化钠溶液(1摩尔/升)，常温浸泡过夜，过滤。再加入700毫升的氢氧化钠溶液(1摩尔/升)，放置2小时，过滤，合并滤液。在滤液中加入冰醋酸至pH＝5，放置1小时，过滤。滤液加入1倍量乙醇(95％)，放置1小时，过滤。滤液再加入1倍量乙醇(95％)，放置1小时，过滤。滤液继续加入3倍量乙醇(95％)，放置1小时，过滤，得沉淀b。将b置40℃减压，烘干2小时，得干品1.0克即得产品B。提取率：0.1％。

[0021] 实施例3：核桃壳提取物A抑制HIV病毒的活性试验

[0022] 3.1实验原理与依据：根据国家食品药品监督管理局(SFDA)发布的“抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则(2006)”，采用国际通用实验方法对药物的抗HIV-1活性进行检测。

[0023] 3.2材料与方法

[0024] 3.2.1测定药物和化合物：待测样品为根据实施例1制备得到的核桃壳提取物A(以下简称“样品1”)。待测样品溶解于DMSO中，4℃保存，贮存浓度为25.0毫克/毫升。

[0025] 3.2.2试剂和溶液：生物缓冲剂HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)、噻唑蓝 MTT(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)、DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、青霉素(Penicillin)、硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)、谷氨酰胺(Glutamine)均购自Sigma公司；2-巯基乙醇(2-ME，2-Mercaptoethanol)为Bio-Rad公司产品。RPMI-1640和胎牛血清为Gibco公司产品。

[0026] 3.2.3细胞和病毒：人T淋巴细胞系C8166细胞、MT-4细胞以及HIV-1实验株HIV-1IIIB均由英国Medical Research Council，AIDS ReagentProject惠赠。所有细胞和病毒均以含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-1IIIB，滴定并计算出病毒的TCID50。病毒贮存液分装后，置-70℃保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。

[0027] 3.2.4HIV-1感染性滴定：HIV-1IIIB按Johnson&Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将HIV-1IIIB贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。

[0028] 每孔加入C8166细胞50微升，每孔终体积为200微升。37℃，5％CO2培养。第3天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100微升，第7天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1IIIB诱导的细胞病变效应(CytopathicEffect，CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定；按Reed&Muench方法计算病毒的TCID50(50％组织培养染毒浓度)。

[0029] 3.2.5对C8166细胞的毒性实验：4×105/毫升C8166细胞悬液100微升与不同的待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含药物的对照孔，37℃，5％CO2培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。

[0030] ELx800酶标仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC50值(50％抑制细胞生长浓度)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166细胞产生毒性时的药物浓度。

[0031] 3.2.6对HIV-1IIIB致细胞病变(CPE)的抑制实验：将8×105/毫升C8166细胞50微升/孔接种到含有100微升/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50微升的HIV-1IIIB稀释上清，1300TCID50/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。AZT为阳性药物对照。37℃，5％CO2培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC50(50％有效浓度)为抑制合胞体形成50％时的药物浓度。

[0032] 3.2.7计算公式：根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed&Muench法计算出化合物抑制病毒的50％有效浓度(EC50)，50％抑制细胞生长浓度(CC50)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeuticindex)。

[0033] 1、细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100

[0034] 2、HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100

[0035] 3、TI＝CC50/EC50

[0036] 3.3结果：样品1的细胞毒性作用、对HIV-1IIIB诱导C8166细胞病变的抑制作用，以及样品1抗HIV-1病毒的治疗指数如表1～表3所示。

[0037] 表1MTT法测试样品对人T淋巴细胞系C8166细胞的毒性作用