磁性纳米颗粒溶液、其制备方法及用途

摘要

本发明公开了一种分散在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中的磁性纳米颗粒溶液。制备磁性纳米颗粒溶液的方法，包括下列步骤：利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；其特征在于所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。本发明也公开了利用该磁性纳米颗粒溶液制备磁性生物传感器的方法及在制备磁性生物传感器的应用。本发明磁性纳米颗粒溶液制备的磁性生物传感器，保持该生物传感器活性达到99.95％-99.97％，可保留原生物传感器对特定底物的定量响应强度和检测灵敏度，同时可以通过磁体回收将生物传感器从水体或土壤样品中分离，为生物传感器在环境检测与医药领域的应用提供了技术支持。

权利要求

一种磁性纳米颗粒溶液，该磁性纳米颗粒分散在溶剂中，其特征在于：所述的溶剂是聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。

2.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒溶液，其特征在于：所述的磁性纳米颗粒是直 径为15-2 Inm的氧化铁。

3. 一种制备磁性纳米颗粒溶液的方法，该方法包括下列步骤：a.利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；b.利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；其特征在于：所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。

4.根据权利要求3所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于：所述的磁性纳 米颗粒是直径为15-21nm的氧化铁。

5.根据权利要求4所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于：步骤b的超声 分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤a中制得的磁性纳米颗粒中加纯 水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清 液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

6.根据权利要求5所述的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其特征在于：步骤b的超声 分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤a中制得的磁性纳米颗粒中加纯 水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 20KHz至120KHz超声条件下震荡5_20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5_20分钟，弃去上 清液，加入等体积纯水，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5_20分钟，2000rpm至6000rpm 下离心5-20分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

7. —种磁性生物传感器的构建方法，该方法包括下列步骤：a.接种生物传感器的单菌落于液体培养基中，获得细胞悬浮液。b.利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；c.利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；d.将步骤a制得的细胞悬浮液与步骤c制得的磁性纳米颗粒溶液共培养，磁体回收已 经结合磁性纳米颗粒的生物传感器，得到磁性生物传感器；其特征在于：步骤c中所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。

8.根据权利要求7所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：所述的磁性纳米 颗粒是直径为15-21nm的氧化铁。

9.根据权利要求8所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤c的超声分 散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤b中制得的磁性纳米颗粒中加纯 水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清 液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

10.根据权利要求9所述的磁性生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤c的超声 分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤b中制得的磁性纳米颗粒中加纯 水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 20KHz至120KHz超声条件下震荡5_20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5_20分钟，弃去上清液，加入等体积纯水，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5_20分钟，2000rpm至6000rpm 下离心5-20分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

11.根据权利要求7至10中任一权利要求所述的磁性生物传感器的构建方法，其特 征在于：所述的生物传感器选自：不动杆菌（Acinetobacter sp.) ADPWH_lux、不动杆菌 (Acinetobacter sp.) ADPWH_Tol 和不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_alk012.权利要求1或2所述的磁性纳米颗粒溶液用于制备磁性生物传感器的应用。

说明书

磁性纳米颗粒溶液、其制备方法及用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种磁性纳米颗粒溶液，以及该磁性纳米颗粒溶液的制备方法，磁性 生物传感器的构建方法，及该磁性纳米颗粒溶液的用途。

背景技术

[0002] 社会各行业在生产、运输、使用和处置过程中，往往伴随着大量具有环境风险的污 染物残留、泄露和排放。近年来，随着我国工业、农业和市政建设的快速发展，由上述污染 物所导致的环境污染事故层出不穷，受污染场地的数目与面积逐年扩大，对人民生活健康 造成了重大威胁。在这些污染物中，以农药和石油化工产品为代表的复杂持久性有机污染 物具有痕量、广泛存在和种类繁多等特点，给环境监测与风险评价提出了巨大的挑战。现 有的传统化学分析方法面对复杂持久性有机污染物，具有操作繁琐（复杂的预处理过程）、 耗时较长（几小时至几天时间）、设备昂贵和成本较高等缺点，并且无法有效评价复合污 染条件下的生物毒性与环境生态风险。这些问题严重制约了相关污染场地的环境评估和 风险评价，限制了突发性环境应急事故的快速评估，为新型检测技术，特别是以生物传感器 (biosensor)为代表的生物快速检测技术的发展提供了良好的契机。

[0003] 据相关行业报告表明，英国环境监测市场目前已达到5. 9亿英镑（60亿人民币） 的规模（Environmental KTN report, 2008) 0其中，快速检测技术所涵盖的市场份额达到 2亿英镑（20亿人民币）。而从全球范围来看，最新的全球市场分析报告（GlobalIndustry Analysts, Inc.)预测生物传感器市场价值在2012年之前可以达到61亿美元（400亿人民 币）。现有中国经济的高速发展已经付出了高昂的环境代价，这主要体现在污染场地带来的 生态修复与人体健康问题、工业搬迁场地引发的二次开发问题和突发性环境事故导致的预 警应急问题等。这些问题都伴随着对环境监测与风险评价的更高要求，表明中国政府对新 型环境检测技术具有迫切的需求，预示着生物快速检测技术在中国具有广阔的市场。

[0004] 生物细胞传感器以活体微生物细胞作为宿主，可以真实的评价环境中目标物质的 生物效应（生物可利用性），检测方法简单易行，可直接应用于水样，具有稳定性和可靠性， 与传统分析方法相比具有高度的准确性。而其低成本和快速响应的特点，可以满足此领域 市场的需要，兼备操作简单和可实现定量测定等优点。但与此同时，生物细胞传感器由于受 到自身特点的限制，具有难回收和难操控等问题。首先，由于活体生物细胞传感器本身具备 生物活性，可以在自然环境中增殖与运动，因此一旦投入被检测或应用环境中，难以同土著 微生物进行区别，更难以回收，其自身携带的目标基因、调控基因或报道基因存在巨大的环 境风险。其次，对于土壤等复杂环境样品的分析，往往需要在检测过程中将样品与生物传感 器分离，以避免复杂介质对检测信号的影响。

[0005] 磁性纳米颗粒是一种有效的远距离操纵工具，通过将磁性纳米颗粒与有机或无机 材料结合，可以实现通过磁场对相应材料的运动进行远距离控制，已在微晶体和碳纳米管 研究领域受到了广泛关注。在微生物学领域，已有研究成功将磁性纳米颗粒固定在活体酵 母细胞，但应用于活体细菌细胞的研究尚未见报道，其面临的技术问题主要包括如何在固定化过程中保持细胞活性。 发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种可以与生物传感器结合，同时保持该生物传感器活性， 并使生物传感器具有磁性，便于检测回收的磁性纳米颗粒溶液，其制备方法及应用。

[0007] 为了达到上述目的，本发明提供了一种磁性纳米颗粒溶液，该磁性纳米颗粒分散 在溶剂中，其特征在于所述的溶剂是聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。

[0008] 本发明的磁性纳米颗粒溶液，其特征在于所述的磁性纳米颗粒是直径为15-21nm 的氧化铁。

[0009] 本发明还提供了一种制备磁性纳米颗粒溶液的方法，该方法包括下列步骤：

[0010] a.利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；

[0011] b.利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，得到磁性纳米颗粒溶液；

[0012] 其特征在于：所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。

[0013] 本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于：所述的磁性纳米颗 粒是直径为15-2 Inm的氧化铁。

[0014] 本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于：步骤b所述的超声 分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤a所制得的磁性纳米颗粒中加纯 水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清 液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

[0015] 本发明的制备磁性纳米颗粒溶液的方法，其进一步特征在于：步骤b所述的超声 分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤a所制得的磁性纳米颗粒中加纯 水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 20KHz至120KHz超声条件下震荡5_20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5_20分钟，弃去上 清液，加入等体积纯水，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5_20分钟，2000rpm至6000rpm 下离心5-20分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

[0016] 本发明还提供了一种磁性生物传感器的构建方法，该方法包括下列步骤：

[0017] a.接种生物传感器的单菌落于液体培养基中，获得细胞悬浮液；

[0018] b.利用共沉积法合成磁性纳米颗粒；

[0019] c.利用超声分散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒，获得磁性纳米颗粒溶液；

[0020] d.将步骤a制得的细胞悬浮液与步骤c制得的磁性纳米颗粒溶液共培养，磁体回 收已经结合磁性纳米颗粒的生物传感器，制得磁性生物传感器；

[0021] 其特征在于：步骤c中所述的溶剂为聚丙烯胺的盐酸盐水溶液。

[0022] 本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：所述的磁性纳米颗粒 是直径为15-21nm的氧化铁。

[0023] 本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：步骤c所述的超声分 散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤b中所制得的磁性纳米颗粒中加纯 水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 超声条件下震荡，离心，弃去上清液，加入等体积纯水，在超声条件下震荡，离心，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

[0024] 本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：步骤c所述的超声分 散法在溶剂中分散磁性纳米颗粒包括下列步骤：向步骤b中所制得的磁性纳米颗粒中加纯 水，制得磁性纳米颗粒水溶液，在聚丙烯胺的盐酸盐水溶液中加入磁性纳米颗粒水溶液，在 20KHz至120KHz超声条件下震荡5_20分钟，2000rpm至6000rpm下离心5_20分钟，弃去上 清液，加入等体积纯水，在20KHz至120KHz超声条件下震荡5_20分钟，2000rpm至6000rpm 下离心5-20分钟，弃去上清液，再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

[0025] 本发明的磁性生物传感器的构建方法，其进一步特征在于：所述的的生物传感器 ϋ 自云力ff® (Acinetobacter sp,)ADPWH_lux>^sj]ff (Acinetobacter sp. )ADPWH_ Tol 和不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_alk。

[0026] 进一步，本发明还提供了磁性纳米颗粒溶液用于制备磁性生物传感器的应用。本 发明的磁性生物传感器检测水体或土壤样品中污染物的应用，是将所述的磁性生物传感器 与水体或土壤样品混合，培养所述磁性生物传感器，通过检测报道基因表达产物的发光强 度来直接定量检测土壤样品污染物含量。其中使用多功能酶标仪作为检测仪器，使用磁体 回收磁性生物传感器，所述培养温度为30°C。

[0027] 本发明的磁性纳米颗粒溶液与生物传感器结合，制备磁性生物传感器，可以同时 保持该生物传感器活性达到99. 95% -99. 97%，可保留原生物传感器对特定底物的定量响 应强度和检测灵敏度，同时可以通过磁体回收的方法将磁性生物传感器从水体或土壤样品 中分离，有效增强了生物传感器的使用范围，为生物传感器在环境检测与医药领域的应用 提供了技术支持。

[0028] 为了更好地理解本发明，现在结合附图及具体实施例对本发明进行详细地说明。

[0029] 在此需要说明的是本发明所用的生物材料、试剂、仪器如无特别说明均属于本领 域常规的生物材料、试剂、仪器，均可以通过商业途径购得。本发明中所使用的培养基及方 法如无特别说明，均为本领域常规的培养基及方法。

附图说明

[0030] 图1是本发明制得的磁性纳米颗粒溶液的透射电子显微镜（TEM)照片。

[0031] 图2是悬浮状态（左图）与磁体吸附状态（右图）的本发明制得的磁性生物传感 器不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_lux。

[0032] 图3是本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp)ADPWH_lux薄 片法的透射电子显微镜（TEM)照片。

[0033] 图4是图3部分区域的放大图像。

[0034] 图5是本发明制得的磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux 的表面电子能谱（EDX)。

[0035] 图6是在琼脂糖板上菌落计数磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp.) ADPWH_lux数量的图示。

[0036] 图7是磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. ) ADPWH_lux细胞的生长和 分裂的图示。

[0037] 图8是磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. ) ADPWH_lux对水中不同浓度水杨酸的响应。

[0038] 图9A和9B是磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_alk对海水 中不同浓度石油的响应。

[0039] 图10是磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_Tol对水中不同浓 度甲苯的响应。

[0040] 图11是磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux对土壤不同水 杨酸含量的响应。

具体实施方式

[0041] 实施1 ：磁性纳米颗粒溶液的制备

[0042] 将2. OmL浓度为1. OM的FeCl3溶液加入到试管中，缓慢加入0. 5mL浓度为2. OM的 FeCl2溶液，搅拌均勻。逐滴缓慢加入25mL浓度为1. OM的氯化铵溶液，同时IOOOrpm转速 快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复 重复磁体回收过程，直至上清液PH值为7. 0，获得含有磁性纳米颗粒水溶液。

[0043]取 IOOmg 聚烯丙基胺盐酸盐（Poly (allylamine)Hydrochloride，PAH )，加入至 10. OmL纯水中，配置浓度为10. 0g/L的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取IOmL该聚烯丙基胺盐 酸盐水溶液，加入1. OmL上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液，40KHz超声波条件下 振荡10分钟，3000rpm条件下离心10分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、 离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

[0044] 实施2 ：磁性纳米颗粒溶液的制备

[0045] 将2. OmL浓度为1. OM的FeCl3溶液加入到试管中，缓慢加入0. 5mL浓度为2. OM的 FeCl2溶液，搅拌均勻。逐滴缓慢加入25mL浓度为1. OM的氯化铵溶液，同时IOOOrpm转速 快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复 重复磁体回收过程，直至上清液PH值为7. 0，获得含有磁性纳米颗粒的水溶液。

[0046]取 IOOmg 聚烯丙基胺盐酸盐（Poly (allylamine)Hydrochloride，PAH)，加入至 10. OmL纯水中，配置浓度为10. 0g/L的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取IOmL该聚烯丙基胺盐 酸盐水溶液，加入1. OmL上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液，20KHz超声波条件下 振荡5分钟，2000rpm条件下离心5分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离 心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。

[0047] 实施3 ：磁性纳米颗粒溶液的制备

[0048] 将2. OmL浓度为1. OM的FeCl3溶液加入到试管中，缓慢加入0. 5mL浓度为2. OM的 FeCl2溶液，搅拌均勻。逐滴缓慢加入25mL浓度为1. OM的氯化铵溶液，同时IOOOrpm转速 快速搅拌，直至出现黑色沉淀。使用磁体回收该沉淀，弃去上清液，加入等体积纯水。反复 重复磁体回收过程，直至上清液PH值为7. 0，获得含有磁性纳米颗粒的水溶液。

[0049]取 IOOmg 聚烯丙基胺盐酸盐（Poly (allylamine)Hydrochloride，PAH)，加入至 10. OmL纯水中，配置浓度为10. 0g/L的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液。取IOmL该聚烯丙基胺盐 酸盐水溶液，加入1. OmL上述步骤中制备得到的磁性纳米颗粒水溶液，120KHz超声波条件 下振荡20分钟，6000rpm条件下离心20分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超 声、离心、弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得磁性纳米颗粒溶液。[0050] 参考图1，实施例1-3中所制得的磁性纳米颗粒溶液的透射电子显微镜（TEM)照片 显示该磁性纳米颗粒几乎都是球形形状并且氧化铁颗粒的大小分布是15-21nm之间，包括端值。

[0051] 实施4 ：磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux的制备

[0052] 1)细胞培养

[0053] 生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux(购自惟馨雨生物技术有限 公司或根据现有技术公开的文献 Huang W. E. et al. Chromosomally located genefusions constructed in Acinetobacter sp.ADPl for the environmental detection of salicylate. Environ. Microbiol. 7，1339-1348，2005 所述方法构建）单菌落接种至 LB 液体 培养基（LB)，30°C培养过夜后，取 IOmL 菌液(CFU = 5 X 108cells/mL), 3000rpm 离心 10 分 钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均勻，再次3000rpm离心10 分钟，弃去上清液，加入ImL纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5X109cells/mL。

[0054] 2)磁性纳米颗粒溶液制备

[0055] 如实施例1所述。

[0056] 另取IOmL聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，加入1. OmL纯水，40KHz超声波条件下振荡 10分钟，3000rpm条件下离心10分钟，弃去上清液。加入等体积纯水，重复上述超声、离心、 弃去上清液过程。再次加入等体积纯水，获得聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。

[0057] 3)磁性生物传感器构建

[0058] 取500 μ L步骤1)中制备的细胞悬浮液，加入4. 5mL步骤2)中制备的磁性纳米颗 粒溶液。30°C条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性 纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均勻。 上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基（1升 液体矿物质培养基含有 2. 5g Na2HPO4,2. 5g KH2PO4U. OgNH4CUO. IgMgSO4 ·7Η20、10 μ L 饱和 CaCl2溶液、10 μ L饱和FeSO4溶液和ImL Bauchop & Elsden溶液）中，获得磁性生物传感 器不动杆菌(Acinetobacter sp.) ADPWH_lux。

[0059] 另取500 μ L步骤1)中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入4. 5mL步骤2)中制备 的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30°C条件下震荡培养30分钟。使用3000rpm离心 10分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均勻。上述离心回收步骤重复三次， 最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不 动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux 阴性对照。

[0060] 实施5 ：磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_alk的制备

[0061] 1)细胞培养

[0062] 生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_alk(购自惟馨雨生物技术有 限公司)单菌落接种至含有10mg/L卡那霉素的LB液体培养基（LBK)，30°C培养过夜后，取 IOmL菌液(CFU = 5 X 108cells/mL)，3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。 使用涡旋振荡器使细胞混合均勻，再次3000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入ImL纯水浓 缩，该细胞悬浮液浓度约为5X109cellS/mL。

[0063] 2)磁性纳米颗粒溶液制备

[0064] 如实施例2所述。8[0065] 3)磁性生物传感器构建

[0066] 取500 μ L步骤1)中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入4. 5mL步骤2)制备的磁 性纳米颗粒溶液。30°C条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结 合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合 均勻。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基 (1 升液体矿物质培养基含有 2. 5g Na2HPO4,2. 5gKH2P04、l. OgNH4CUO. IgMgSO4 · 7Η20、10 μ L 饱和CaCl2溶液、10 μ L饱和FeSO4溶液和ImL Bauchop & Elsden溶液)中，获得磁性生物 传感器不动杆菌（Acinetobacter sp.) ADPffH alk。

[0067] 另取500 μ L步骤1)中获得的生物传感器细胞悬浮液，加入4. 5mL实施例4步 骤2)中制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30°C条件下震荡培养30分钟。使用 3000rpm离心10分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均勻。上述离心回收步 骤重复三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基（1升液体矿物质培养基含 有 2. 5g Na2HPO4,2. 5g KH2PO4U. Og NH4Cl、0. Ig MgSO4 · 7H20、10 μ L 饱和 CaCl2 溶液、10 μ L 饱和FeSO4溶液和lmLBauchop&Elsden溶液）中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动 杆菌（Acinetobacter sp.) ADPWH_alk 阴性对照。

[0068] 实施例6 ：磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_Tol的制备

[0069] 1)细胞培养

[0070] 磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. ) ADPWH_Tol (购自惟馨雨 生物技术有限公司或根据现有技术公开的文献Huang W. Ε. et al. Characterizing the regulationof the Pu promoter in Acinetobacter baylyi ADP1. Environ. Microbiol. 10，1668-1680,2008所述方法构建)单菌落接种至含有10mg/L卡那霉素的LB 液体培养基(LBK)，30°C培养过夜后，取IOmL菌液(CFU = 5 X 108cells/mL)，3000rpm离心 10分钟，弃去上清液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均勻，再次3000rpm离 心10分钟，弃去上清液，加入ImL纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5X 109cells/mL。

[0071] 2)磁性纳米颗粒溶液制备

[0072] 如实施例3所述。

[0073] 3)磁性生物传感器构建

[0074] 取500 yL步骤1)中获得的生物传感器悬浮液，加入4. 5mL步骤2)中制备的磁性 纳米颗粒溶液。30°C条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结 合磁性纳米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合 均勻。上述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于等体积液体矿质培养基 中，获得磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_Tol。

[0075] 另取500 μ L步骤1)中获得的生物传感器悬浮液，加入4. 5mL实施例4步骤2)中 制备的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液阴性对照。30°C条件下震荡培养30分钟。使用3000rpm 离心10分钟，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均勻。上述离心回收步骤重复 三次，最后将所获得沉淀溶解于等体积液体矿质培养基（1升液体矿物质培养基含有2. 5g Na2HPO4,2. 5g KH2PO4,1. Og NH4CUO. Ig MgSO4 · 7H20、10 μ L 饱和 CaCl2 溶液、10 μ L 饱和 FeSO4溶液和lmLBauchop&Elsden溶液）中，获得无磁性纳米颗粒的生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp. )ADPWH_Tol 阴性对照。[0076] 实施例7 ：磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux的特性

[0077] 对实施例4的磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux做如下 实验，实验过程及结果如下：

[0078] 磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux悬浮状态（图2左图） 与普通细胞悬浊液无显著差异，在磁体吸附状态（图2右图）下，磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp.) ADPWH_lux可被有效富集和回收。证明了磁性纳米颗粒溶液使得生物 传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. ) ADPWH_lux具有了磁性。

[0079] 如图3所示，薄片法的磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp)ADPWH_lux 的透射电子显微镜照片显示：磁性纳米颗粒粘附于细胞表面。如图4所示，图3中部分放大 的图像显示：磁性纳米颗粒都粘附于细胞外壁上，在胞质中没有发现磁性纳米颗粒。此外， 如图5所示，磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux的表面电子能谱 (EDX)证实了细胞壁上氧化铁纳米颗粒的存在。

[0080] 然后用磁性和非磁性的生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux的 平板计数来估测该磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux的效率。

[0081] 计数结果是磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. ) ADPWH_lux的数量是 2. 22士0. 10X 108CUF/ml，非磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux 细 胞数量是8. 00士0. 51X104CUF/ml (图6)，表明磁性化生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux的效率是99. 96士0. 01%。因为，通过在琼脂糖板上菌落计数来计数磁性生 物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux的数量，因此，该实验也表明磁性化的 细菌细胞还是活的，因此该磁性生物传感器是生物相容性的。在PAH中分散的磁性纳米颗 粒不能进入胞质解释了高水平存活率的原因。并且我们也检查了磁性化细胞的生长和分 裂，图7表明在30°C温育120分钟期间，非磁性化的细胞数量从0增加到12%，这证明了磁 性化的细胞能够正常分裂和生长。

[0082] 对实施例5和6中制得的磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_ alk和不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_Tol做了相同的实验，实验过程及结果相同。

[0083] 实施例8 ：磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux对水中水杨 酸含量的检测

[0084] 1)样品准备

[0085] 称取160. Img水杨酸钠，加入到IOOmL纯水中，得到浓度为IOmM的水杨酸钠储备 溶液。分别上述获得的水杨酸钠溶液按比例用纯水稀释，配置浓度为50nM、IOOnMU μ M、 10 μ M和100 μ M的水杨酸钠溶液。

[0086] 称取27. 02g六水合丁 二酸钠，加入到IOOmL纯水中，使用0. 22 μ m滤膜 (Millipore)过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为1M。

[0087] 2)样品测试

[0088] 取176 μ L实施例4中获得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照的生物传感器，加 入黑色底透的96孔酶标板（美国Corning Costar公司）孔内。每孔内分别加入4 μ L 丁 二酸那储备溶液和20 μ L上述系列水杨酸钠溶液，使用纯水作为阴性对照（control)，每组 测试包括三个平行样。

[0089] 使用多功能酶标仪（型号Synergy 2，美国BioTek公司）对96孔酶标板内生物发光强度进行测量。培养温度为30°C，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保 证细胞混合均勻。

[0090] 3)数据处理

[0091] 计算步骤2)中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生 物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物 发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生 物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各2 个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。

[0092] 磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux对水中不同浓度水 杨酸的响应如图8所示。测试结果表明，磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobactersp.) ADPWH_lux与原生物传感器均对水杨酸有显著响应，生物发光响应倍数随水杨酸浓度增加 而增强。两种生物传感器对相同浓度水杨酸溶液的响应无显著差异，表明磁性生物传感器 不动杆菌（Acinetobacter sp.) ADPWH_lux可以有效识别并对水溶液中水杨酸产生定量响 应。

[0093] 实施例8 ：磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. ) ADP_alk对海水中石油 含量的检测。

[0094] 1)样品准备

[0095] 分别12. 5 μ L英国北海布伦特原油和伊朗锡里岛原油，溶解于IOOmL海水中，使用 40Κ-Ηζ超声波振荡30秒，摇勻，该乳浊液含有石油浓度为100mg/L。将该乳浊液按不同比 例使用海水稀释，配制浓度为0. 1,0. 2、l、2、10、20、100mg/L的系列石油海水溶液。

[0096] 称取27. 02g六水合丁 二酸钠，加入到IOOmL纯水中，使用0. 22 μ m滤膜 (Millipore)过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为1M。

[0097] 2)样品测试

[0098] 取20 μ L实施例5中制得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照生物传感器的悬浮 液，加入黑色底透的96孔酶标板（美国Corning Costar公司）孔内。每孔内分别加入4 μ L 丁二酸那储备溶液和176 μ L上述系列石油水溶液，使用纯水作为阴性对照（control)，每 组测试包括三个平行样。

[0099] 使用多功能酶标仪（型号Synergy 2，美国BioTek公司)对96孔酶标板内生物发 光强度进行测量。培养温度为30°C，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保 证细胞混合均勻。

[0100] 3)数据处理

[0101] 计算步骤2)中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生 物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物 发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生 物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各2 个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。

[0102] 磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. ) ADPWH_alk对海水中不同浓度石 油的响应如图9A、9B所示。测试结果表明，磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp.) ADPWH_alk与原生物传感器均对海水中不同浓度的原油有显著响应，生物发光响应倍数随原油浓度增加而增强。相同石油浓度条件下，磁性生物传感器生物发光响应倍数显著低于 原生物传感器，这可能是由于磁性生物传感器表面聚丙烯基胺高分子膜对非极性分子传质 的阳碍作用，但两种生物传感器对原油的检测限相同，表明磁性生物传感器Acinetobacter sp. ADPWH_alk可以有效识别并对海水中原油产生定量响应。

[0103] 实施例9:磁性生物传感器（Acinetobacter sp) ADPWH_Tol对水中甲苯含量的检 测

[0104] 1)样品准备

[0105] 取甲苯20 μ L加入到IOOmL纯水中，40Κ-Ηζ超声波30秒，得到甲苯饱和储备溶液， 浓度为600 μ Μ。将该乳浊液按不同比例使用纯水稀释，配制浓度为6、60和600 μ M的系列甲苯溶液。

[0106] 称取27. 02g六水合丁 二酸钠，加入到IOOmL纯水中，使用0. 22 μ m滤膜 (Millipore)过滤，得到无菌丁二酸钠储备溶液，该溶液丁二酸钠浓度为1M。

[0107] 2)样品测试

[0108] 取20 μ L实施例6中获得的磁性生物传感器和无磁性阴性对照生物传感器悬浮 液，加入黑色底透的96孔酶标板（美国Corning Costar公司）孔内。每孔内分别加入4 μ L 丁二酸那储备溶液和176 μ L上述系列甲苯水溶液，使用纯水作为阴性对照（control)，每 组测试包括三个平行样。

[0109] 使用多功能酶标仪（型号Synergy 2，美国BioTek公司)对96孔酶标板内生物发 光强度进行测量。培养温度为30°C，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保 证细胞混合均勻。

[0110] 3)数据处理

[0111] 计算步骤2)中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生 物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物 发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生 物发光相对倍数。取每种生物传感器诱导组不同时刻生物发光相对倍数峰值及其前后各2 个时间点生物发光相对倍数，计算平均值，获得该生物传感器生物发光响应倍数。

[0112] 磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_Tol对水中不同浓度甲苯 的响应如图10所示。测试结果表明，磁性生物传感器Acinetobacter sp. ADPWH_Tol与原生 物传感器均对甲苯有显著响应，生物发光响应倍数随甲苯浓度增加而增强。两种生物传感 器对相同浓度甲苯溶液的响应无显著差异，表明磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux可以有效识别并对水溶液中甲苯产生定量相应。

[0113] 实施例10 ：磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. )ADPWH_lux对土壤水 杨酸含量的检测

[0114] 1)细胞培养

[0115] 不动杆菌（Acinetobacter sp.)ADPWH_lux单菌落接种至LB液体培养基（LB)， 30°C培养过夜后，取IOmL菌液(CFU = 5 X 108cells/mL)，3000rpm离心10分钟，弃去上清 液，加入等体积纯水。使用涡旋振荡器使细胞混合均勻，再次3000rpm离心10分钟，弃去上 清液，加入ImL纯水浓缩，该细胞悬浮液浓度约为5X109cells/mL。

[0116] 2)磁性生物传感器构建[0117] 取500 μ L步骤1)中获得的细胞悬浮液，加入4. 5mL实施例1中制备的磁性纳米颗 粒溶液。30°C条件下震荡培养30分钟。使用磁体置于试管侧壁10分钟，回收已结合磁性纳 米颗粒的生物传感器，弃去上清液，加入等体积纯水，使用漩涡振荡器是细胞混合均勻。上 述磁体回收步骤重复三次，最后将所获得磁性物质溶解于1/10体积纯水中，获得磁性生物 传感器不动杆菌（Acinetobacter sp.) ADPWH_lux。

[0118] 3)样品准备

[0119] 称取160. Img水杨酸钠，加入到IOOmL纯水中，得到浓度为IOmM的水杨酸钠储备 溶液。分别上述获得的水杨酸钠溶液按比例用纯水稀释，配置浓度为0、0. 1、1、10和ΙΟΟμΜ 的水杨酸钠溶液。分别取上述水杨酸钠溶液2. OmL加入到2. Og干净土壤中，室温条件下震 动搅拌24小时以保证水杨酸与土壤混合均勻，该土壤水杨酸含量分别为0. 0,0. 14,1. 4,14 和140mg/g。上述土壤分别加入8mL纯水，40K_Hz超声波300秒后，加入ImL步骤2)中获得 的磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp.) ADPWH_lux和ImL液体LB培养基。该土 壤/生物传感器混合液30°C条件下培养20分钟，静置2分钟后取2mL上清液。使用磁体置 于含上述上清液的试管侧壁10分钟，回收磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp.) ADPWH_lux,小心移去上清液和土壤颗粒沉淀，加入1. 8mL纯水和200 μ L新鲜液体LB培养 基，振荡摇勻。

[0120] 4)样品测试

[0121] 取200 μ L步骤2)中获得的磁性生物传感器Acinetobacter sp. ADPWH_lux悬浮 液，加入黑色底透的96孔酶标板（美国Corning Costar公司）孔内，每组测试包括三个平 行样。

[0122] 使用多功能酶标仪（型号Synergy 2，美国BioTek公司）对96孔酶标板内生物发 光强度进行测量。培养温度为30°C，每10分钟进行一次测量，每次测量前振荡1分钟以保 证细胞混合均勻。

[0123] 5)数据处理

[0124] 计算步骤4)中测试过程所获得的每种生物传感器三组平行样均值，获得每种生 物传感器阴性对照与诱导组不同时刻生物发光强度。每种生物传感器诱导组不同时刻生物 发光强度除以对应时刻阴性对照组生物发光强度，获得每种生物传感器诱导组不同时刻生 物发光响应倍数。

[0125] 磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp. ) ADPWH_lux对土壤不同水杨 酸含量的响应如图11所示。测试结果表明，经磁体回收的磁性生物传感器不动杆菌 (Acinetobacter sp. )ADPWH_lux对土壤中水杨酸有显著响应，生物发光响应倍数随水杨酸 含量增加而增强。磁性生物传感器不动杆菌（Acinetobacter sp.)ADPWH_lux对土壤不同 水杨酸含量的响应峰值出现在120分钟左右，但与土壤混合培养后已对水杨酸产生响应， 表现为多功能酶标仪0分钟时刻不同水杨酸含量土壤对应生物发光响应倍数不同。