从甘草中提取的黄酮类化合物、其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201010284030.1
文献号 : CN101982465A
文献日 : 2011-03-02
发明人 : 李巍 , 王英华 , 小池一男 , 詹晓平 , 李松沛
申请人 : 宁夏回族自治区药品检验所
摘要 :
本发明涉及通过提取分离从甘草中获得的黄酮类化合物及其作为蛋白酪氨酸磷酸1B的应用。所述化合物的结构式如图所示，包括2个新化合物和10个已知化合物。该类化合物可作为蛋白酪氨酸磷酸1B抑制剂用于预防和治疗糖尿病和肥胖症。
权利要求 :
1.一种从甘草中提取的黄酮类化合物，其结构式如下：
2.一种从甘草中提取的黄酮类化合物，其结构式如下：
3.一种从甘草中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于其步骤为：将甘草用95％乙醇提取，提取物上HP-20大孔树脂柱，分别用70％甲醇、90％甲醇洗脱，取90％甲醇洗脱部分上silica柱层析，利用制备高效液相色谱仪分离纯化，得到12种黄酮类化合物，其名称和结构式如下：
4.按照权利要求3方法制成的黄酮类化合物作为蛋白酪氨酸磷酸1B抑制剂在预防或治疗糖尿病方面的应用。
5.按照权利要求3方法制成的黄酮类化合物作为蛋白酪氨酸磷酸1B抑制剂在预防或治疗肥胖症方面的应用。
说明书 :
从甘草中提取的黄酮类化合物、其制备方法和应用
技术领域：
[0001] 本发明涉及化学领域，特别是一种从甘草中提取的黄酮类化合物、其制备方法和应用背景技术：
[0002] 生活习惯病和代谢综合症已经成为全球性的健康问题，其中2型糖尿病和肥胖症引起广泛关注(Saltiel R.A.，Ronald Kahn C.Nature 2001，414，799)。2型糖尿病的发病机制是多方面的，普遍特征是胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗(Hull R.L.，Andrikopoulos S.，Bruce Verchere C.，Vidal J.，WangF.，Cnop M.，Prigeon L.R.，Kahn E.S.Diabetes 2008，52，372)。肥胖症能引起胰岛素抵抗而成为主要的引起2型糖尿病的因素(Gallagher J.E.，LeRoith D.，Karnieli E.Endocrinol.Metab.Clin.N.Am.2008，37，559；Hays P.N.，Galassetti R.P.，Coker H.R.Pharmacol.Ther.2008，118，181)。
[0003] 蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP1B)是一种存在于细胞内的酶，它在肝脏、肌肉、和脂肪组织等胰岛素标的器官中普遍表达。PTP1B通过催化活性化的胰岛素受体、胰岛素受体底物蛋白，以及两面神激酶2脱磷酸化，而成为重要的胰岛素和瘦素的负调节因子(Byon C.H.J.，Kusaril B.A.，Kusari J.Mol.Cell.Biochem.1998，182，101；Zabolotny M.J.，Bence-Hanulec K.K.，Stricker-Krongrad A.，Haj F.，Wang Y.，Minokosh Y.，Kim Y.B.，ElmquistK.J.，Tartaglia A.L.，Kahn B.B.，Neel G.B.Dev.Cell 2002，2，489)。许多生化学、基因学、药理学研究证明抑制PTP1B的活性是一种有效治疗的2型糖尿病和肥胖症的治疗手段(Zhang S.；Zhang Z.Y.Drug Discov.Today 2007，12，373)。
[0004] 甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)植物的根和根状茎，在《神农本草经》中作为上品收载，其主要功效是和中缓急、润肺、解毒、调和诸药等，是临床应用最为广泛的传统中药。许多研究表明甘草黄酮具有多种生物活性(Marjan N.A.；Hossein H.Phytother.Res.2008，22，709)，并且最近又被报道有治疗糖尿病的作用(Nakagawa K.；Kishida H.；Arai N.；NishiyamaT.；Mae T.Biol.Pharm.Bull.2004，27，1775)。
发明内容：
发明内容：
[0005] 本发明的目的是从甘草中提取出一种黄酮类化合物，该化合物可以作为PTP1B抑制剂，用于糖尿病和肥胖症的预防和治疗。
[0006] 本发明按照下述方案实现：
[0007] 一种从甘草中提取的黄酮类化合物，其结构式如下：
[0008]
[0009] 另一种从甘草中提取的黄酮类化合物，其结构式如下：
[0010]
[0011] 从甘草中提取黄酮类化合物的方法，其步骤为：将甘草用95％乙醇提取，提取物上HP-20大孔树脂柱，分别用70％甲醇、90％甲醇洗脱，取90％甲醇洗脱部分上silica柱层析，利用制备高效液相色谱仪分离纯化，得到12种黄酮类化合物，其名称和结构式如附图1所示。
[0012] 按照上述方法制成的黄酮类化合物作为蛋白酪氨酸磷酸1B抑制剂在预防或治疗糖尿病方面的应用；
[0013] 按照上述方法制成的黄酮类化合物作为蛋白酪氨酸磷酸1B抑制剂在预防或治疗肥胖症方面的应用。
[0014] PTP1B抑制活性测定
[0015] 本发明以p-Npp作为PTP1B酶反应的底物，具体的反应体系为2mM p-NPP，PTP1B(0.05μg)，一定浓度的样品，在缓冲液(pH 6.0的60mM柠檬酸盐缓冲液，0.1M NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)中反应.然后在37℃反应30分钟，加入20μL 10M的NaOH停止反应，测定405nm下的吸光度。通过不加样品而来测定样品空白，不加PTP1B来测定阴性对照。样品的抑制率通过以下公式计算：
[0016] 抑制率(％)＝[(OD阴性对照-OD空白)-(OD样品-OD样品空白]/(OD阴性对照-OD空白)。
[0017] 当样品在100μM浓度下测得抑制率大于30％时，通过在3种适宜的浓度下测得抑制率计算IC50值。用同样的方法测定已知的PTP1B抑制剂RK682的IC50值作为阳性对照。测定三次求平均值和标准偏差，IC50值表示为平均值±标准偏差。
[0018]附图说明：
[0019] 图1是本发明从甘草中提取得12种黄酮类化合物的名称及结构式示意图。
[0020] 图中化合物1和2为新化合物，化合物2，6、12是制备高效液相分离时加入TFA后所产生的人工产物。其余化合物为已知化合物licocoumarone，isoliquiritigenin，licoflavone A，apigenin，isokaempferide，glycycoumarin，cycloglycyrrhisoflavone，isoglycycoumarin。具体实施方式：
[0021] 下面通过具体实施例对本发明进行描述，但是本发明的范围并不仅限于此。
[0022] 甘草(1Kg)用95％乙醇提取，得到甘草95％乙醇提取物(200g)，该提取物上HP-20大孔树脂柱(1000mm×90mm i.d.)，分别用70％甲醇(18L)、90％甲醇(18L)洗脱。取90％甲醇部分(33.4g)上silica柱层析(205mm×60mm i.d.)依次用氯仿(3L)，氯仿-甲醇(95∶5)(3L)，氯仿-甲醇(9∶1)(3L)，氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)(3L)洗脱。氯仿-甲醇(95∶5)部分(4.5g)继续上silica柱层析(290mm×32mm)，用氯仿-甲醇(95∶5)分离，每50mL为一个溶出部位。第6-18个溶出部位，利用制备高效液相色谱仪，进一步分离纯化，色谱条件为：高效液相色谱仪(JASCO PU-2086，JASCO RI-2031，JASCO UV-2075)，色谱柱(Waters XBridge C18 ODS柱)，流动相(70％甲醇-0.06％TFA)，流速为5mL/min。得到的分离部位再用silica柱层析精制，得到化合物1-12，经NMR、IR、MS分析证明结构如附图1所示。其中化合物1、2为新化合物，化合物2、6、12是用制备高效液相分离时加入TFA后，所产生的人工产物。化合物3-12为已知化合物licocoumarone，isoliquiritigenin，licoflavone A，apigenin，isokaempferide，glycycoumarin，cycloglycyrrhisoflavone，isoglycycoumarin。
[0023] 化合物1：淡褐色固体，通过高分辨ESIMS(m/z 377.1362，[M+Na]+)结合DEPT图谱-1 -1 1确定其分子式为C21H22O5。红外光谱显示在3434cm 和1628cm 有强的吸收峰。H NMR图谱显示一个ABX系统[δ7.29(1H，d，J＝8.2Hz)，δ6.73(1H，dd，J＝8.1，1.8Hz)，δ6.84(1H，d，J＝1.8Hz)]，一个异戊二烯基[δ3.27(2H，d，J＝6.4Hz)，δ5.21(1H，t)，δ1.67(3H，s)，δ1.75(3H，s)]，一个甲氧基[δ3.36(3H，s)]，一个甲基[δ2.05(3H，s)]，一个芳香质子信号[δ6.23(1H，s)]。根据HMBC图谱中的相关，确定异戊二烯基，甲氧基和芳香质子信号[δ6.23(1H，s)]存在与一个苯环中。
[0024]
[0025] 将化合物1甲基化后，甲基化产物的NOESY图谱中显示该芳香质子信号[6.23(1H，s)]与反应生成的两个甲氧基相关，因此取代在B环。同时，ABX系统归在A环。未归属的13 2
结构单元包括一个甲基[δ2.05(3H，s)]，和 C NMR图谱上所显示的两个SP 杂化的C原子。HMBC图谱显示甲基的H同时和这两个C相关，因此推测结构中存在3-oxy-propene的结构单元。因此化合物的结构被确定为
结构单元包括一个甲基[δ2.05(3H，s)]，和 C NMR图谱上所显示的两个SP 杂化的C原子。HMBC图谱显示甲基的H同时和这两个C相关，因此推测结构中存在3-oxy-propene的结构单元。因此化合物的结构被确定为
[0026] 2-[4，6-dihydroxy-3-(γ，γ-dimethylallyl)-2-methoxyphenyl]-6-hydroxy-3-methyl-benzofuran(英文名)，2-[4，6-二羟基-3-(γ，γ-二甲基烯丙基)-2-甲氧基苯基]-6-羟基-3-甲基-苯并呋喃(中文名)。同时NOESY图谱中显示的相关也与此结构相符。
[0027]
[0028] 化合物1：淡褐色固体；UV(MeOH)λmax(logε)205(4.52)，262(3.96)，302(4.01)；IR(KBr)vmax3435，1629，1459，1384，1146，1120，1070cm-1；HRESIMS(positive)m/z
377.1362[M+1]+(calcd for C21H22O5Na，377.3862)；1H NMR(CD3OD，500Hz)：δ1.75(3H，s，H3-4”)，1.67(3H，s，H3-5”)，2.05(3H，s，H-10)，3.27(2H，d，J＝6.4Hz，H2-1”)，3.36(3H，s，OCH3)，5.21(1H，m，H-2”)，6.23(1H，s，H-5’)，6.73(1H，dd，J ＝ 8.2，1.8Hz，H-5)，
6.84(1H，d，J ＝ 1.8Hz，H-7)，7.29(1H，d，J ＝ 8.2Hz，H-4)；13C NMR(CD3OD，125MHz)：
8.9(C-10)，18.0(C-4”)，26.0(C-5”)，23.5(C-1”)，61.3(2’-OCH3)，98.6(C-7)，
99.6(C-5’)104.6(C-1’)，112.1(C-5)，114.6(C-3’)，115.1(C-3)，120.0(C-4)，
124.5(C-9)，125.4(C-2”)，131.0(C-3”)，146.7(C-2)，156.1(C-6)，156.7(C-6’)，
157.1(C-8)，159.1(C-4’)，160.5(C-2’).
377.1362[M+1]+(calcd for C21H22O5Na，377.3862)；1H NMR(CD3OD，500Hz)：δ1.75(3H，s，H3-4”)，1.67(3H，s，H3-5”)，2.05(3H，s，H-10)，3.27(2H，d，J＝6.4Hz，H2-1”)，3.36(3H，s，OCH3)，5.21(1H，m，H-2”)，6.23(1H，s，H-5’)，6.73(1H，dd，J ＝ 8.2，1.8Hz，H-5)，
6.84(1H，d，J ＝ 1.8Hz，H-7)，7.29(1H，d，J ＝ 8.2Hz，H-4)；13C NMR(CD3OD，125MHz)：
8.9(C-10)，18.0(C-4”)，26.0(C-5”)，23.5(C-1”)，61.3(2’-OCH3)，98.6(C-7)，
99.6(C-5’)104.6(C-1’)，112.1(C-5)，114.6(C-3’)，115.1(C-3)，120.0(C-4)，
124.5(C-9)，125.4(C-2”)，131.0(C-3”)，146.7(C-2)，156.1(C-6)，156.7(C-6’)，
157.1(C-8)，159.1(C-4’)，160.5(C-2’).
[0029] 化合物2：淡黄色固体，紫外图谱上显示在320nm和334nm有最大吸收峰，与2-arylbenzofuran类化合物非常相似。1H NMR图谱显示一个ABX系统[δ7.63(1H，d，J＝
8.5Hz)，δ6.40(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz)，δ6.41(1H，d，J＝2.4Hz)]，一个2位二甲基取代的二氢呋喃环[δ2.76(2H，m)，δ1.71(2H，m)，δ1.27(6H，s)]，一个甲氧基[δ4.03(3H，s)]，还有两个芳香质子的双峰[δ6.66(1H，d，J＝1.0Hz，H-7)，δ7.21(1H，d，J＝1.0Hz，H-3)]。除了二氢呋喃环以外，有已知化合物licocoumarone(3)的结构相同。因此，化合物
2的被确定为licocoumarone(3)的异戊二烯基与临位的羟基在TFA的催化下合环之后的产物。
8.5Hz)，δ6.40(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz)，δ6.41(1H，d，J＝2.4Hz)]，一个2位二甲基取代的二氢呋喃环[δ2.76(2H，m)，δ1.71(2H，m)，δ1.27(6H，s)]，一个甲氧基[δ4.03(3H，s)]，还有两个芳香质子的双峰[δ6.66(1H，d，J＝1.0Hz，H-7)，δ7.21(1H，d，J＝1.0Hz，H-3)]。除了二氢呋喃环以外，有已知化合物licocoumarone(3)的结构相同。因此，化合物
2的被确定为licocoumarone(3)的异戊二烯基与临位的羟基在TFA的催化下合环之后的产物。
[0030] 化 合 物 2：UV(MeOH)λmax(logε)204(4.53)，294(sh)(4.06)，320(4.26)，334(sh)(4.19)；IR(KBr)vmax3433，1623，1509，1459，1385，1312，1255，1212，1111cm-1；
ESIMS(positive)m/z 341[M+1]+.1H NMR(CD3OD，500Hz)：δ1.27(6H，s，H3-4”，H3-5”)，
1.71(2H2，m，H2-2”)，2.76(2H，m，H2-1”)，4.03(3H，each，s，OCH3)，6.40(1H，dd，J＝2.4，
8.5Hz，H-5’)，6.41(1H，d，J＝2.4Hz，H-3’)，6.66(1H，d，J＝1.0Hz，H-7)，7.21(1H，d，J＝1.0Hz，H-3)，7.63(1H，d，J＝8.5Hz，H-6’)；13C NMR(CD3OD，125MHz)：δ19.9(C-1”)，
29.1(C-4”，5”)，44.8(C-2”)，60.8(4-OCH3)，71.9(C-3”)，93.5(C-7)101.9(C-3)，
103.9(C-3’)，108.1(C-5)，111.6(C-1’)，115.0(C-9)，117.0(C-5)，128.1(C-6’)，
152.0(C-4)，152.1(C-2)，154.6(C-6)，155.3(C-8)，156.8(C-2’)，159.3(C-4’).[0031] 上述两种新化合物以及图1中所示的其余10种化合物glycyrrhisoflavone，glisoflavone，licocoumarone，isoliquiritigenin，licoflavone A，apigenin，isokaempferide，glycycoumarin，cycloglycyrrhisoflavone，isoglycycoumarin，具有蛋白酪氨酸磷酸1B抑制活性，可以应用于预防或治疗糖尿病或者肥胖症。
ESIMS(positive)m/z 341[M+1]+.1H NMR(CD3OD，500Hz)：δ1.27(6H，s，H3-4”，H3-5”)，
1.71(2H2，m，H2-2”)，2.76(2H，m，H2-1”)，4.03(3H，each，s，OCH3)，6.40(1H，dd，J＝2.4，
8.5Hz，H-5’)，6.41(1H，d，J＝2.4Hz，H-3’)，6.66(1H，d，J＝1.0Hz，H-7)，7.21(1H，d，J＝1.0Hz，H-3)，7.63(1H，d，J＝8.5Hz，H-6’)；13C NMR(CD3OD，125MHz)：δ19.9(C-1”)，
29.1(C-4”，5”)，44.8(C-2”)，60.8(4-OCH3)，71.9(C-3”)，93.5(C-7)101.9(C-3)，
103.9(C-3’)，108.1(C-5)，111.6(C-1’)，115.0(C-9)，117.0(C-5)，128.1(C-6’)，
152.0(C-4)，152.1(C-2)，154.6(C-6)，155.3(C-8)，156.8(C-2’)，159.3(C-4’).[0031] 上述两种新化合物以及图1中所示的其余10种化合物glycyrrhisoflavone，glisoflavone，licocoumarone，isoliquiritigenin，licoflavone A，apigenin，isokaempferide，glycycoumarin，cycloglycyrrhisoflavone，isoglycycoumarin，具有蛋白酪氨酸磷酸1B抑制活性，可以应用于预防或治疗糖尿病或者肥胖症。