PEG化的IGF-I变体在神经肌肉病治疗中的应用

摘要

本发明涉及聚乙二醇(PEG)化的IGF-I变体在治疗、预防神经肌肉病和/或延缓神经肌肉病的疾病进程中的药学用途，所述神经肌肉病优选肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)。本发明更特别涉及聚乙二醇化的IGF-I变体在制备用于神经肌肉病尤其是肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)的治疗、预防和/或延缓疾病进展的药物中的应用，其中该聚乙二醇化的IGF-I变体的特征在于其来源于野生型人IGF-I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)并且第27、65和68位氨基酸有1或2个氨基酸改变，以使得在第27、65和68位的1或2个氨基酸是极性氨基酸但不是赖氨酸而且PEG被连接到至少一个赖氨酸残基上。

权利要求

1.聚乙二醇(PEG)化的IGF-I变体在制备用于治疗、预防和/或延缓神经肌肉病的药物组合物中的应用，其中所述聚乙二醇化的IGF-I变体特征在于其来源于野生型人IGF-I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，并在第27、65和68位氨基酸处带有一个或两个氨基酸改变，以使得第27、65和68位氨基酸中的一个或两个是极性氨基酸但不是赖氨酸，而且PEG被连接到至少一个赖氨酸残基上。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述PEG化的IGF-I变体特征在于野生型人IGF-I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的下列氨基酸改变：(a)K65R和K68R(SEQ ID NO：2)；

(b)K27R和K68R(SEQ ID NO：3)，或

(c)K27R和K65R(SEQ ID NO：4)。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述PEG化的IGF-I变体在K68被单PEG化，而且其特征在于野生型人IGF-I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的下列氨基酸改变：K27R和K65R(SEQ ID NO：4)。

4.如权利要求1至3中任一项所述的应用，其中所述PEG具有20至100KDa的总分子量。

5.如权利要求1至4中任一项所述的应用，其中所述PEG化的IGF-I变体在N-末端氨基酸被进一步PEG化。

6.如权利要求1至5中任一项所述的应用，其中所述PEG化的IGF-I变体在K65或K68被单PEG化，或者在K65和K68被二PEG化。

7.如权利要求1至6至任一项所述的应用，其中所述PEG化的IGF-I变体特征在于N末端的最多三个氨基酸被平截。

8.如权利要求1至7中任一项所述的应用，其中所述PEG化的IGF-I变体特征在于聚乙二醇基团是分枝的聚乙二醇基团。

9.如权利要求1至8中任一项所述的应用，其中所述神经肌肉病是运动神经元病(MND)。

10.如权利要求9所述的应用，其中所述MND是肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)。

11.如权利要求10所述的应用，其中所述PEG化的IGF-I变体单独使用、在与第二药学活性化合物结合的组合中与第二药学活性化合物依次使用或同时使用。

12.如权利要求11所述的应用，其中所述组合中的所述第二药学活性化合物是至少一种神经保护剂，所述神经保护剂具有对谷氨酸释放的抑制作用、或对电压依赖钠通道的灭活作用、或干扰兴奋性氨基酸受体结合递质之后的胞内事件的能力。

13.如权利要求12所述的应用，其中所述第二药学活性化合物是利鲁唑。

14.一种对需要治疗的受试者进行神经肌肉病的治疗、预防和/或延缓疾病进程的方法，包括对所述受试者给予治疗有效量的可药用形式的如权利要求1至8中任一项所述PEG化的IGF-I。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述神经肌肉病是MND，优选ALS。

16.用于治疗、预防神经肌肉病和/或延缓神经肌肉病进程的药物组合物，其包含可药用形式的根据权利要求1至8中任一项所述的PEG化的IGF-I变体。

17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述神经肌肉病是MND，优选ALS。

18.如上所述的本发明。

说明书

PEG化的IGF-I变体在神经肌肉病治疗中的应用

发明领域

[0001] 本发明涉及聚乙二醇(PEG)化的IGF-I变体在神经肌肉病尤其是肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)的治疗、预防和/或延缓疾病进展中的药物应用。本发明更具体涉及聚乙二醇化的IGF-I变体在制备用于神经肌肉病尤其是肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)的治疗、预防和/或延缓该疾病进展的药物组合物中的应用，其中该聚乙二醇化的IGF-I变体的特征在于其来源于野生型人IGF-I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)并且第27、65和68位氨基酸有1或2个氨基酸改变，以使得在第27、65和68位的1或2个氨基酸是极性氨基酸而不是赖氨酸而且PEG被连接到至少一个赖氨酸残基上。

背景技术

[0002] 神经肌肉病涵盖一系列的疾病，包括神经病(遗传的或是后天获得的)、肌营养不良、ALS、脊髓性肌萎缩(SMA)以及一系列少见肌肉病。神经肌肉病影响到控制随意肌的神经。当神经元变得不正常或死亡时，神经系统和肌肉之间的联系就会中断。结果肌肉会变得无力和消瘦。肌肉无力会导致颤搐、痉挛、疼痛和关节活动障碍。有时候也会影响心脏功能和呼吸功能。进行性肌肉无力有很多原因，可以发生在从婴儿到成人的任何年龄段。

[0003] 肌营养不良(MD)是神经肌肉病中的一个亚类。MD代表了一个遗传性肌肉病家族。有些类型影响儿童(如迪谢纳肌营养不良)而且在20-30年内是致命的。其他类型出现在成年而且是逐渐进展的。一些肌营养不良的基因已经被鉴定，包括迪谢纳肌营养不良(肌营养不良蛋白基因突变造成)和青少年和成人起病的Miyoshi肌营养不良或是其变异型、肢带肌营养不良2B型或LGMD-2B型(dysferlin基因突变引起)。这些“功能缺失”的基因突变导致肌肉中相关蛋白不能表达从而引起肌肉功能障碍。这些基因突变的小鼠模型是存在的，来源于大自然的自发变异或是相关基因的失活或缺失产生。这些模型有助于检测可能替代肌肉中缺失蛋白质而恢复正常肌肉功能的治疗方法。

[0004] 神经肌肉病也包括运动神经元病(MND)，其属于归因于中枢神经系统运动神经元破坏和运动神经元通路的退行性改变的一组神经病，而且其不同于其他的由神经元而不是运动神经元破坏引起的神经退行性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病、橄榄桥小脑萎缩等。美国国立神经病与卒中研究所(NINDS)认为运动神经元病(MND)是影响身体上部分或下部分神经的进行性、退行性疾病。根据NINDS的观点，有些是遗传的。一般来讲，MND发生在中年。症状可能包括吞咽困难、肢体无力、言语不清、步态异常、面部无力和肌肉痉挛。在这些疾病晚期，呼吸也可能受累。大部分MND的病因是未知的，但是环境、中毒、病毒或遗传等因素均是可疑的病因。MND的分型包括成人脊髓性肌萎缩(SMA)、也称为Lou Gehrig氏病的肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、也称为SMA1型或称为韦-霍二氏病的婴儿进行性脊髓性肌萎缩(SMA)、也称为SMA2型的中间型脊髓性肌萎缩(SMA2)、也称为SMA3型或Kugelberg-Welander的青少年脊髓性肌萎缩(SMA3)、也称为肯迪尼病或X连锁SBMA的延髓肌萎缩(SBMA)。运动神经元病是一类运动神经元退变和死亡的疾病。运动神经元包括上运动神经元和下运动神经元，其支配随意肌，刺激它们收缩。上运动神经元起自大脑皮层，发出神经纤维穿过脑干和脊髓，而控制着下运动神经元。下运动神经元位于脑干和脊髓，发出神经纤维至肌肉。下运动神经元疾病是指下运动神经元退变性疾病。当下运动神经元退变时，它正常激动的肌纤维变得失去联系而且不能收缩，从而引起肌肉无力和反射减弱。任一类型神经元缺失造成的无力、肌肉萎缩(消瘦)和无痛性肌无力是MND的临床标志。

[0005] ALS是一种以脊髓、脑干、大脑皮层中的运动神经元选择性和进展性缺失为特征的致命性运动神经元病。其典型地导致进行性肌无力和神经肌肉性呼吸衰竭。大约10％的ALS与编码Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因点突变有关。导致ALS的主要遗传原因的发现为检测各种治疗方法奠定了基础。神经营养因子(NTF)可能有潜在的防止神经元萎缩、轴索变性和细胞死亡等神经保护作用，这在90年代早期引起了ALS治疗的极大希望。已经在ALS病人身上评价了纤毛神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-I)。在ALS病人中检测这些因子的理论是基于它们在发育中细胞自然死亡模式、创伤性神经损伤或模拟ALS的例如pmn或wobbler小鼠之动物模型中的营养作用。除了IGF-1(Lai EC等人，Neurology 1997，49：1621-1630)这些重组蛋白质的全身给药并没有给ALS病人带来临床益处(Turner MR等人，Semin.Neurol.2001；21：167-175)。不良副反应和有限的生物利用度使它们的可能临床受益评估复杂化。应用神经营养蛋白的实际困难是这些蛋白的半衰期相对较短而神经变性病是慢性病而且需要长期治疗。

[0006] 同时，已经生产了一些过度表达不同ALS连锁的SOD1突变的转基因小鼠品系(Newbery HJ等人，Trends Genet.2001；17：S2-S6)。通过贴切模拟很多ALS的临床与神经病理特点，这些小鼠已经为探讨临床前期应用神经营养因子提供了更多的相关动物模型。重组营养蛋白直接给药令人失望。对运动神经元神经病理有很微小的或没有有益作用(Azari MF等人BrainRes.2003；982：92-97；Feeney SJ等人Cytokine 2003；23：108-118；Dreibelbis JE等人Muscle Nerve 2002；25：122-123)。然而，病毒载体介导的神经营养因子如神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、IGF-I或心肌营养因子-I(CT-I)的递送显示出行为或神经病理上的改善(Wang LJ等人，J.Neurosci.2002；22：6920-6928；Bordet T等人，Hum.Mol.Genet.2001；10：1925-1933和Kaspar BK等人，Science 2003，301：839-842)，这提示采用适当的施用方案，效果是能够达到的。

[0007] 胰岛素样生长因子(IGF-I)是结构上与胰岛素相关的环化的合成代谢性激素。在循环系统中，大于99％的IGF-I被结合到对IGF有高亲和力并能调节IGF-I功能的IGF-I结合蛋白(IGFBP)上。该因子可以通过特异蛋白酶的蛋白水解作用从IGFBP局部性释放。尽管身体的每个细胞都能产生IGF-I，但血清中的IGF-I大部分(75％)来源于肝脏( K.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.94(1999)7088-7092；Yakar，S.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.96(1999)7324-7329)。IGF-I除了有内分泌作用外，其在脑发育与成熟方面起到旁分泌角色(Werther，G.A.，等人，Mol.Endocrinol.4(1990)773-778)。通过体外研究表明IGF-I是一个强有力的非选择性中枢神经系统几种类型神经元的营养因子(Knusel，B.，等 人，J.Neurosci.10(1990)558-570；Svrzic，D.，和Schubert，D.，Biochem.Biophys.Res.Commun.172(1990)54-60)，包括多巴胺能神经元(Knusel，B.等人，J.Neurosci.10(1990)558-570)，少突胶质细胞(McMorris，F.A.和Dubois-Dalcq，M.，J.Neurosci.Res.21(1988)199-209；McMorris，F.A. 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
83(1986)822-826；Mozell，R.L. 和 McMorris，F.A.，J.Neurosci.Res.30(1991)382-390)和脊髓运动神经元(Hughes，R.A.，等人，J.Neurosci.Res.36(1993)663-671；Neff，N.T.等人，J.Neurobiol.24(1993)1578-1588；Li，L.等人，J.Neurobiol.25(1994)759-766)。周围IGF-I通过受体调节转运方式透过血脑屏障(BBB)进入大脑已经被阐释(Rosenfeld，R.G. 等 人，Biochem.Biophys.Res.Commun.149(1987)159-166；Duffy，K.R. 等 人，Metab.Clin.Exp.37(1988)136-140；Pan，W. 和 Kastin，A.J..Neuroendocrinology
72(2000)171-178)。主要产生于SOD1转基因小鼠的临床前数据提供了通过鞘内或缓慢释放装置或基因治疗方式给药时IGF-I均显示出对ALS相关参数的有效性的强有力证据(Kaspar等人，Science 301：839，2003；Boillee和Cleveland，Trends Neurosci 27：235，
2004；Dobrowolny等人，J Cell Biol168：193，2005；Nagano等人，J Neurol Sci 235：61，
2005；Narai等人，JNeurosci Res 82：452，2005)。这表明IGF-I需要持续性给药，因为没有公开数据表明在ALS模型上的胃肠外IGF-I应用剂量的疗效适用于人类。

[0008] 美国专利No.5,093,317提及给予IGF-I能增强胆碱能神经元存活能力。进一步的了解是IGF-I能刺激外周神经再生(Kanje，M.等人，BrainRes.486(1989)396-398)并能加强鸟氨酸脱羧酶的活性(美国专利No.5,093,317)。美国专利No.5,861,373和WO93/02695A1提到了一种治疗中枢神经系统损伤或疾病的方法，其主要通过增加病人中枢神经系统内的IGF-I和/或其类似物活性浓度来影响神经胶质和/或非胆碱能神经细胞。WO
02/32449A1指出一种通过哺乳动物鼻腔给予包含治疗有效量的IGF-I或其生物活性变体的药物组合物来减少或预防哺乳动物中枢神经系统缺血性损伤的方法。IGF-I或其变体通过鼻腔吸收并以有效剂量转运至哺乳动物中枢神经系统中，从而减少或预防缺血性事件造成的缺血性损伤。EP 0874641A1要求保护IGF-I或IGF-II在制备用于治疗或预防中枢神经系统神经损伤的药物中的应用，所述神经损伤的原因包括：AIDS相关的痴呆、AD、帕金森氏症、Pick氏病、亨廷顿氏病、肝性脑病、皮层基底节综合征、进行性痴呆、家族性痉挛性轻截瘫和痴呆、进行性核上性麻痹、多发性硬化、弥漫性硬化症或急性坏死出血性脑炎，其中所述药物为以血脑屏障或血脊髓屏障之外的IGF有效剂量的胃肠外给药形式。

[0009] 但是对于临床应用，外源性应用后周围IGF-I的短半衰期是个明显的缺陷，而且需要高剂量频繁给药，这就产生了严重问题。由于急性超负荷IGF-I给药造成的副作用(如低血糖，在IGE-I的临床实验中频繁发生，也可在NDA报告21-839中看到)(http://www.fda.gov/cder/foi/nda/2005/021839_S000_Increlex_Pharm.pdf)限制了最大耐受剂量，而在其最大耐受剂量也没有达到能持续的效果。为了克服这种缺点且能达到有较好作用的较高剂量水平，需要有较慢的吸收率、较长和较稳定的血液保留但是仍保持生物活性的修饰的IGF-I。为了确保这种修饰的IGF-I仍能发挥其神经保护作用，也需要血脑屏障转运系统能充分地工作。

[0010] 在临床前期的应用中，已经努力解决了至少一些前面提到的困难，方法是通过把IGF-I装进如微泵和微球体的缓慢释放装置中，从而使其能持续释放而没有大的血药浓度的波动(Carrascosa C等人Biomaterials 25；707-714；WO 03/077940A1)。但是，观察到应用此方法IGF-I初始血药浓度急剧上升，从而会产生和在人类皮下注射IGF-I相同的急性副作用。

[0011] 令人惊奇的是，已经发现特别是PEG化IGF-I(PEG-IGF-I)变体当胃肠外注射时具有所需要的药代动力学特点。这种PEG化IGF-I变体即使达到高于非PEG化IGF-I十倍的剂量和/或血浆浓度也没有急性低血糖反应。可清楚预计到PEG化会损害IGF-I的结合和受体介导的血脑屏障穿透性。下文中具体描述的PEG化IGF-I变体在动物(即小鼠神经肌肉病模型)中以比非PEG化IGF-I低很多的剂量就能显示出令人惊奇的神经保护功能，这表明：1)：血脑屏障转运系统能充分工作，2)：在体内该分子能充分保持其生物活性，3)：低血糖只有在PEG化IGF-I的剂量高于IGF-I十倍剂量时才会出现，这就允许为获得更好效能而在人类中应用更高的剂量。

发明内容

[0012] 本发明的第一实施方式涉及一种通过对有需要的病人施用药学有效量的下述PEG化的IGF-I变体来治疗神经肌肉病的方法。

[0013] 在优选的实施方式中，本发明涉及一种通过对有需要的病人施用药学有效量的下述PEG化的IGF-I变体来治疗MND，特别是ALS的方法。

[0014] 在另一个实施方式中，本发明进一步涉及一种药物组合物，包括下述PEG化的IGF-I变体和可药用载体，其中该药物组合物可用于治疗、预防神经肌肉病和/或延迟神经肌肉病的发展，该神经肌肉病优选MND，更优选ALS。

[0015] 本发明进一步的方面涉及下述PEG化的IGF-I变体在生产用于治疗神经肌肉病的药物中的应用，该神经肌肉病优选MND，更优选ALS。

[0016] 本发明的详细说明

[0017] 除非另外定义，此处使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文中记载的方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于实施或实验本发明，下文中还是描述了其优选的方法和材料。

[0018] 定义

[0019] 术语“神经肌肉病”包括直接(通过肌肉本身内在的病理改变)或间接(通过神经病理改变)损害肌肉功能的疾病或病症。神经肌肉病的例子包括但不限于：

[0020] 运动神经元病，如肌萎缩性脊髓侧索硬化症ALS(也称为Lou Gehrig病)、1型脊髓性肌萎缩(SMA1，韦-霍二氏病)、2型脊髓性肌萎缩(SMA2)、3型脊髓性肌萎缩(SMA3，库-韦病)、延髓肌萎缩症(SBMA，也称为肯迪尼病和X-连锁的SBMA)，

[0021] 肌营养不良，如迪谢内肌营养不良(DMD也称为假性肥大型肌营养不良)、贝克肌营养不良(良性假性肥大型肌营养不良)(BMD)、埃-德肌营养不良(EDMD)、肢带型肌营养不良(LGMD)、面-肩-肱型肌营养不良(FSH或FSHD，也称为郎-德营养不良)、强直性肌营养不良(MMD，也称为斯坦纳特病)、眼咽型肌营养不良(OPMD)、远端型肌营养不良(DD，Miyoshi)、先天性肌营养不良症(CMD)，

[0022] 肌肉代谢病，如磷酸化酶缺乏症(MPD或PYGM，也称为麦卡德尔病)、酸性麦芽糖酶缺乏症(AMD，也称为庞皮病)、磷酸果糖激酶缺乏症(也称为塔瑞病)、脱支酶缺乏症(DBD，也称为科里病或福布斯病)、线粒体肌病(MITO)、肉毒碱缺乏病(CD)、肉毒碱棕榈酰基转移酶缺乏症(CPT)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、肉毒碱棕榈酰基转移酶缺乏症(CPT)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症；

[0023] 外周神经疾病，如，沙-马-图病(CMT，也称为遗传性运动和感觉神经病(HMSN)或腓肌型肌萎缩(PMA)、弗里德赖希共济失调(FA)、德-索病(DS)，

[0024] 炎性肌病，如，皮肌炎(DM)、多发性肌炎(PM)、包涵体肌炎(IBM)，[0025] 神经肌肉接头病，如重症肌无力(MG)、兰-伊综合征(LES)、先天性肌无力综合征(CMS)，

[0026] 源于内分泌异常的肌病，如，甲亢性肌病(HYPTM)、甲状腺功能减退性肌病(HYPOTM)，

[0027] 其他肌病，如，先天性肌强直(MC，也叫汤姆森和贝克尔病)、先天性肌强直病(PC)、中央轴空病(CCD)、线状体肌病(NM)

[0028] 肌管性肌病/中央核性肌病(MTM或CNM)、周期性麻痹(PP，两种形式：低血钾性和高血钾性)。

[0029] “MND”是指影响具有运动功能的神经元(即传导运动冲动的神经元)的疾病。这类神经元也被称为“运动神经元”。这些神经元非限制性包括：发出α神经纤维支配骨骼肌纤维的脊髓前角α神经元；发出β神经纤维支配肌梭内和肌梭外肌纤维的脊髓前角β神经元；发出γ神经纤维(肌梭运动纤维)支配肌梭的梭内肌纤维的脊髓前角γ神经元；供应除了发出传入冲动的肌肉的异侧神经元；供应发出传入冲动的肌肉的同侧神经元；细胞胞体位于脊髓腹侧灰柱而其终末端在骨骼肌的下周围神经元；接受来自中间神经元发出冲动的周围神经元；以及从运动皮层传送冲动到脑神经运动核或脊髓腹侧灰柱的位于大脑皮层的上位神经元。

[0030] 运动神经元病的非限制性实例包括各种肌萎缩，如，遗传性肌萎缩，包括遗传性脊髓性肌萎缩；急性婴儿脊髓性肌萎缩如韦-霍二式病；进行性儿童肌萎缩如近端型、远端型及延髓型肌萎缩；青少年或成年起病的脊髓性肌萎缩，包括近端型，肩胛腓型，面肩胛肱型及远端型脊髓性肌萎缩；肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)和原发性侧索硬化(PLS)。该术语还包括运动神经元损伤。

[0031] 术语肌萎缩性脊髓侧索硬化(或“ALS”)，也被称为Lou Gehrig氏病，其是一种影响到大脑皮层、脑干和脊髓运动神经元的致命性疾病(Hirano，(1996)Neurology，47(4Suppl.2)：S63-6)。虽然该病的病因不明，但是有一个理论认为ALS中神经细胞的死亡是细胞外谷氨酸过剩导致神经细胞过度兴奋所造成的。谷氨酸是谷氨酸能神经元释放的神经递质，被摄入胶质细胞中，在那里被谷氨酰胺合成酶转化成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺再次进入该神经元并被谷氨酰胺酶水解形成谷氨酸，以补充神经递质池。在正常的脊髓和脑干中，胞外液中的细胞外谷氨酸水平保持在较低的微摩尔水平，因为部分功能是对神经元起支持作用的胶质细胞立即利用2型兴奋性氨基酸转运蛋白(EAAT2)吸收了谷氨酸。
已鉴定出患有ALS的病人中正常EAAT2蛋白质的缺失对于该疾病的病理改变很重要{参见，例如Meyer等人，(1998)J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry，65：594-596；Aoki等人，(1998)Ann.Neurol.43：645-653；Bristol等人，(1996)Ann Neurol.39：676-679)。EAAT2水平降低的一个解释是EAAT2被异常剪接(Lin等人，(1998)Neuron，20：589-602)。这种异常剪接产生了在EAAT2蛋白质的C末端区域45至107个氨基酸缺失的剪接变体(Meyer等人，(1998)Neurosci Lett.241：68-70)。由于EAAT2的这种缺失或缺陷，导致了胞外谷氨酸的积聚，引起神经元持续活动。谷氨酸的积聚对神经元细胞具有毒性效应，因为神经元的持续活动导致了细胞提早死亡。虽然关于ALS的病理已经了解了很多，但是对散发病例的发病机理和家族性ALS中突变SOD蛋白质的成因性质还是知之甚少(Bruijn等人，(1996)Neuropathol.Appl.Neurobiol，22：373-87；Bruijn等人，(1998)Science 281：
1851-54)。已经推测过许多模型，包括谷氨酸毒性、缺氧、氧应激、蛋白质聚集、神经丝和线粒体异常(Cleveland等人，(1995)Nature 378：342-43；Cleveland等人，Neurology，
47(4 Suppl.2)：S54-61，discussion S61-20996)；Cleveland，(1999)Neuron，24：515-20；
Cleveland等人，(2001)Nat.Rev.Neurosci.，2：806-19；Couillard-Despres等人，(1998)Proc.Natl.Acad.ScL USA，95：9626-30；Mitsumoto，(1997)Ann.Pharmacother.，31：
779-81；Skene等人，(2001)Nat.Gen et.28：107-8；Williamson等人(2000)Science，288：
399)。

[0032] 目前，对于ALS没有治疗方法，也没有已证明可有效预防或逆转疾病进程的疗法。最近食品药品管理局(FDA)批准了几种药物。迄今为止，治疗ALS的尝试包括：用具有细胞保护效果的长链脂肪醇(参见美国专利No.5,135,956)或用丙酮酸盐(参见美国专利No.5,395,822)治疗神经元退化；和用谷氨酰胺合成酶阻断谷氨酸级联(参见美国专利
5,906,976)治疗。例如，利鲁唑，一种谷氨酸释放抑制剂，在美国已经批准用于治疗ALS，并且延长了至少一些ALS患者的生命达三个月。但是，有一些报道指出即使利鲁唑治疗有限地延长了存活时间，但是看起来还是没有提供患者肌肉强度的任何改善。所以，利鲁唑的效果限于治疗不改变患者生命质量的情况(Borras-Blasco等人(1998)Rev.Neurol，27：
1021-1027)。

[0033] 下文中使用的“分子量”是指PEG的平均分子量。

[0034] 本发明的“PEG或PEG基团”是指含有聚乙二醇作为主要部分的残基。这样的PEG可以进一步含有下述化学基团：结合反应所必需的化学基团；从该分子的化学合成中产生的化学基团；或作为将该分子的各个部分隔开理想距离的间隔段的化学基团。并且，这样的PEG可以由互相链接的一个或多个PEG侧链组成。具有多于1个PEG链的PEG基团称作多臂化或分枝化PEG。可制备分枝化PEG，例如，通过将聚环氧乙烷加入到多种多元醇中，多元醇包括甘油、季戊四醇和山梨醇。例如，可以从季戊四醇和环氧乙烷制备四臂的分枝化PEG。分枝化的PEG通常具有2至8个臂，记载于例如EP-A 0473084和美国专利No.5,932,462。
特别优选的是具有通过赖氨酸的一级氨基连接的两个PEG侧链(PEG2)的PEG(Monfardini，C等人，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。

[0035] 本文中使用的“基本均质”意思是，制备、包含或使用的仅仅PEG化IGF-I变体是具有一个或两个PEG基团连接的IGF-I变体。其制剂可含有小量的未反应(即缺少PEG基团)蛋白质。通过肽谱和N-末端测序确定的下面一个例子提供了为至少90％PEG-IGF-I变体缀合物和最多5％未反应蛋白质的制剂。这种PEG化的IGF-I变体均质制剂的分离和纯化可以通过常规纯化方法进行，优选分子排阻色谱。

[0036] 本文中使用的“单PEG化的”是指每个IGF-I变体分子中仅仅一个赖氨酸被PEG化的IGF-I变体，因此在该位点仅有一个PEG基团共价连接。纯的单PEG化的IGF-I变体(没有N-末端PEG化)占所述制剂的至少80％、优选90％，最优选单PEG化的IGF-I变体占所述制剂的92％或更多，余量为例如未反应(未PEG化)的IGF-I和/或N-末端PEG化的IGF-I变体。因此根据本发明的单PEG化IGF-I变体制剂足够均质，以至于可呈现均质制剂的优势，例如在药物应用中的优势。上述限定同样适用于二PEG化的物质。

[0037] 本文中使用的“PEG化的IGF-I变体”或“氨基反应性PEG化”是指通过IGF-I变体分子的一个或两个赖氨酸与聚乙二醇基团的氨基反应性偶联将IGF-I变体共价结合到一个或两个聚乙二醇基团上。PEG基团连接到IGF-I变体分子中赖氨酸侧链的一级氨基(ε-氨基)处。PEG化还可能进一步发生在N末端的α-氨基上。由于所使用的合成方法和变体，PEG化的IGF-I变体可包括在K65、K68和/或K27处PEG化、带有或没有N末端PEG化的IGF-I变体的混合物，从而在不同的分子中PEG化的位点可以不同，或者PEG化的IGF-I变体在每分子中聚乙二醇侧链数量方面和/或该分子中PEG化位点方面可以基本均质。优选该IGF-I变体是单PEG化和/或二PEG化、而且尤其是不含N-末端PEG化的IGF-I变体。

[0038] 本文中使用的“PEG或聚乙二醇”是指可商业获得，或可以根据本领域公知方法通过乙二醇的开环聚合制备(Kodera，Y.等人，Progress inPolymer Science23(1998)1233-1271；Francis，G.E.等人，Int.J.Hematol.68(1998)1-18)的水溶性的聚合物。术语“PEG”用来广泛包含任何聚乙二醇分子，其中乙二醇(EG)单元的数量是至少460、优选460至2300，特别优选460-1840(230个EG单元为大约10kDa的分子量)。EG单元数量的上限仅仅由PEG化的IGF-I变体的溶解度限制。通常不使用大于含有2300个EG单元的PEG。优选地，本发明中使用的PEG的一端具有羟基或甲氧基(甲氧基PEG，mPEG)，并在另一端通过醚氧键共价连接到接头部分。该聚合物或者是线性的或者是支链的。支链PEG例如记载于Veronese，F.M.等人，Journal of Bioactive and Compatible Polymers
12(1997)196-207的PEG。

[0039] 本发明的一方面涉及通过对有需要的患者给予药学有效量的PEG化的IGF-I变体来治疗神经肌肉病的方法，所述神经肌肉病优选运动神经元病，最优选ALS。在一个更优选的实施方式中，要治疗的疾病是由导致超氧化物歧化酶1突变的遗传缺陷引起的ALS。

[0040] 该PEG化的IGF-I变体特征在于PEG连接到重组人IGF-I突变蛋白的赖氨酸残基上，该突变蛋白在野生型人IGF-I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的第27、65和68位氨基酸位点处具有一个或两个氨基酸改变，以使得第27、65和68位氨基酸位点的一个或两个氨基酸是极性氨基酸但不是赖氨酸。

[0041] 本文中使用的“极性氨基酸”选自半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。赖氨酸也是极性氨基酸，但是被排除在外，因为根据本发明赖氨酸被取代。优选精氨酸用作极性氨基酸。

[0042] 优选重组人IGF-I突变蛋白质的PEG化形式，其特征在于：野生型IGF-I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的下列氨基酸的改变：

[0043] (a)K65R和K68R(SEQ ID NO：2)；

[0044] (b)K27R和K68R(SEQ ID NO：3)；

[0045] (c)K27R和K65R(SEQ ID NO：4)。

[0046] 特别优选具有K27R和K65R氨基酸改变的重组人IGF-I突变蛋白(SEQ ID NO：4)的PEG化形式，其特征是在K68处的单PEG化。

[0047] 还优选如上所述的赖氨酸PEG化的IGF-I变体和N-末端PEG化的IGF-I变体的组合物，其中所述IGF-I变体的一级氨基酸序列相同，而且都在野生型人IGF-I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的第27、65和68位置上具有一个或两个氨基酸改变，以使得27、65和68位置的一个或两个氨基酸是极性氨基酸但不是赖氨酸。优选分子比例是9∶1至1∶9(该比例指赖氨酸PEG化的IGF-I变体/N-末端PEG化的IGF-I)。进一步优选的是其中摩尔比为至少1∶1(至少一份赖氨酸PEG化的IGF-I变体对应每一份N-末端PEG化的IGF-I变体)，优选至少6∶4(至少六份赖氨酸PEG化的IGF-I变体对应每四份N-末端PEG化的IGF-I变体)的组合物。优选该赖氨酸PEG化的IGF-I变体和N-末端PEG化的IGF-I变体都是单PEG化的。在该组合物中，优选在赖氨酸PEG-化的IGF-I变体和N-末端PEG化的IGF-I变体中的变体都相同。IGF-I变体优选选自具有野生型人IGF-I氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的下列氨基酸改变的IGF-I突变蛋白：

[0048] (a)K65R和K68R(SEQ ID NO：2)；

[0049] (b)K27R和K68R(SEQ ID NO：3)；

[0050] (c)K27R和K65R(SEQ ID NO：4)。

[0051] 根据SEQ ID NOS 2至4的重组人IGF-I突变蛋白的优选PEG化形式可用下列制备赖氨酸PEG化的IGF-I或赖氨酸PEG化的IGF-I变体的方法得到，该变体包含一个或两个氨基酸，其选自如WO 2008/025528A1所述的用另一种极性氨基酸独立取代赖氨酸27、65和/或68，WO 2008/025528A1通过完整引入本申请作为参考。WO 2008/025528A1中记载的方法可制备SEQ ID Nos 2至4所示的重组人IGF-I突变蛋白，其没有被N-末端PEG化。

[0052] 进一步优选的是，该PEG化的IGF-I变体是其N-末端至多三个氨基酸被平截(优选三个氨基酸都被平截)的变体。其对应的野生型突变体记为Des(1-3)-IGF-I，在N-末端缺失了甘氨酸、脯氨酸和谷氨酸残基(Kummer，A.等人，Int.J.Exp.Diabesity Res.4(2003)45-57)。

[0053] 优选该聚乙二醇基团具有至少20kDa的总分子量，更优选为约20至100kDa，特别优选20至80kDa。聚乙二醇基团是线性的或分枝的。

[0054] 本文中所述氨基反应性PEG化指代一种随机连接聚乙二醇链至IGF-I变体的一级赖氨酸氨基上的方法，该方法利用反应性(活化的)聚乙二醇，优选利用优选甲氧基聚乙二醇的N-羟基琥珀酰亚胺酯。偶联反应将聚乙二醇连接到赖氨酸残基的反应性一级(ε)氨基，和任选的IGF-I的N末端氨基酸α-氨基上。PEG与蛋白质这样的氨基结合是本领域公知的。例如，Veronese，F.M.，Biomaterials 22(2001)405-417给出了这类方法的综述。依据Veronese的综述，PEG与蛋白质一级氨基的结合可以利用活化的PEG进行，活化的PEG对所述一级氨基进行烷基化。对于该反应，可以使用活化的烷基化PEG，例如PEG-乙醛、PEG-三氟代乙基磺酰氯(PEG-tresylchloride)或环氧PEG。此外可用的试剂是酰化PEG，例如羧化PEG或PEG的羟基琥珀酰亚胺酯，其末端羟基被氯甲酸酯或羰基咪唑活化。此外可以使用的PEG试剂是具有氨基酸臂的PEG。这样的试剂可包含所谓的分枝PEG，其中两个相同或不同的PEG分子被肽间隔序列(优选赖氨酸)连接，并且，例如作为赖氨酸间隔序列的活化羧化物结合到IGF-I变体上。单N末端偶联还在Kinstler，O.等人，Adv.Drug Deliv.Rev.54(2002)477-485中有记载。

[0055] 可用的PEG试剂可购自例如Nektar Therapeutics有限公司。

[0056] 根据实施的需要，可以使用任何分子量的PEG，例如从约20kDa到100kDa(n为460至2300)。PEG中重复单元的数量“n”对以道尔顿计的分子量是近似的。例如，如果两个PEG分子连接到一个连接物上，其中每个PEG分子具有相同的分子量10kDa(各个n为约230)，那么在该连接物上的PEG的总分子量为约20kDa。连接到该连接物上的PEG的分子量也可以是不同的，例如在一个连接物上的两个分子中，一个PEG分子可以是5kDa，而一个PEG分子可以是15kDa。分子量总是指平均分子量。

[0057] 制备氨基-反应性PEG化的IGF-I变体的适宜方法和优选试剂记载于WO2006/066891中。可以理解的是，可以对方法进行改变，只要该方法得到如上所述的PEG化的IGF-I变体，例如基于Veronese，F.M.，Biomaterials 22(2001)405-417中记载的方法进行改变。制备本发明的PEG化的IGF-I变体特别优选的方法记载于WO 2008/025528A1中，其通过完全引入本申请作为参考。

[0058] 靶蛋白中至多三个潜在反应性一级氨基基团(至多两个赖氨酸和一个末端氨基酸)的出现导致在聚乙二醇链连接点不同的一系列PEG化的IGF-I变体异构体的产生。

[0059] PEG化的IGF-I变体包含一个或两个PEG基团，PEG基团为线性或分枝的，而且随机连接到EGF-I变体上，其中该PEG化的IGF-I变体中所有PEG基团的总分子量优选为20至80kDa。该分子量范围有小的偏差也是可能的。但是，由于降低的IGF-I受体活化和血脑屏障输送，预期当分子量升高时活性下降。因此，PEG分子量20至100kDa的范围应理解为用于有效治疗MND特别是ALS的IGF-I变体缀合的PEG之最佳范围。

[0060] 药物制剂

[0061] 上述PEG化的IGF-I变体特征在于其在循环中改善的稳定性，这种稳定性使其能够以低施用间隔(即延长的间隔)持续地到达全身的IGF-I受体。

[0062] PEG化的IGF-I变体能够用本领域技术人员已知的制备药物组合物的方法进行制剂。对于这种组合的制备，本发明PEG化的IGF-I变体与可药用载体结合成混合物，优选通过对含有该药物组合物所需成分的水性溶液进行透析。

[0063] 这类可药用载体记载于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，Mack出版公司，Oslo等编辑(例如第1435-1712页)。典型的组合物包含有效量的本发明物质，例如约0.1至100mg/ml，和适宜量的载体。该组合物可以胃肠外给药。优选本发明的PEG化的IGF-I通过腹膜内给药、皮下给药、静脉给药或经鼻给药。

[0064] 本发明的药物制剂可以用本领域已知的方法制备。通常，PEG化的IGF-I变体的溶液对要用于药物组合物中的缓冲液进行透析，通过浓缩或稀释来调节所需蛋白质最终浓度。

[0065] 这样的药物组合物可用于注射或输注给药，优选腹膜内给药、皮下、静脉注射或鼻腔给药，并含有有效量的PEG化的IGF-I变体和可药用的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅料和/或载体。这种组合物包括各种缓冲成分的稀释剂(例如精氨酸、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度、添加剂(例如去污剂和增溶剂(例如Tween(TM)80/聚山梨酯，普卢兰尼克(TM)F68))、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(Timersol(TM)，苯甲基醇)和增量物质(例如蔗糖、甘露醇)，将这些材料加入到聚合化合物的颗粒制剂中，聚合化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸等或将这些材料加入到脂质体中。这样的组合物可影响释放的PEG化的IGF-I变体的物理状态稳定率和清除率。

[0066] 剂量和药物浓度

[0067] 通常，在标准治疗方法中，用每周每千克0.001至20mg，优选0.01至8mg范围内的PEG化的IGF-I变体剂量治疗患者一定阶段，持续一周至约3个月或更长的时间。每周通过皮下、静脉、腹膜推注或输注每毫升含有0.1至100mg上述PEG化的IGF-I变体的药物制剂施药一次。该治疗可以与任何标准治疗(例如化疗)联合使用，通过在标准治疗之前、当中或之后使用PEG化的IGF-I。这种联合治疗得到比单独标准治疗更好的结果。

[0068] 已发现上述PEG化的IGF-I变体可以每周给药一次或两次就能成功治疗。因此治疗神经肌肉病，优选MND，更优选ALS的方法应包括对有需要的患者每3至8天优选每7天给予治疗有效量的上述PEG化的IGF-I变体一个剂量，每次的剂量范围为每千克给予0.001至3mg，优选0.01至3mg的PEG化IGF-I变体。PEG化的IGF-I变体优选使用单PEG化的IGF-I变体。

[0069] 上述PEG化的IGF-I变体可用于制备治疗神经肌肉病、优选MND、更优选ALS的药物，该PEG化的IGF-I变体以治疗有效量对有需要的患者给药，给药剂量为每6至8天优选每7天每千克给予0.001至3mg，优选0.01至3mg范围的PEG化IGF-I变体的一个或两个剂量。PEG化的IGF-I变体优选使用单PEG化的IGF-I变体。

[0070] 上述PEG化的IGF-I变体还可以单独使用、在与第二药学活性化合物结合的组合中依次使用或与该第二药学活性化合物同时使用，以治疗神经肌肉病，优选MND，更优选ALS。优选该组合中的第二药学活性化合物是至少一种神经保护剂，该神经保护剂具有对谷氨酸释放的抑制作用、或电压依赖的钠通道的失活作用、或干扰兴奋性氨基酸受体结合递质之后的胞内事件的能力。

[0071] 第二药学活性化合物优选利鲁唑。利鲁唑阻断TTX-S钠通道，该钠通道与损坏的神经元相关(Song JH，Huang CS，Nagata K，Yeh JZ，Narahashi T.Differential action of riluzole on tetrodotoxin-sensitive andtetrodotoxin-resistant sodium channels J.Pharmacol.Exp.Ther.1997；282：707-14)。其降低了钙离子内流并间接阻碍了谷氨酸受体的刺激。与直接谷氨酸受体阻断一起降低了神经递质谷氨酸对运动神经元的作用。

[0072] 本发明中使用的术语“利鲁唑”是指2-氨基-6-(三氟甲氧基)苯并噻唑，6-(三氟甲氧基)苯并噻唑-2-胺或CAS-1744-22-5。该实施方式的广义含义中，术语“利鲁唑”也包含具有至少一种也在利鲁唑中观察到的药学性质的活性成分，该药学性质选自对谷氨酸释放的抑制作用、电压依赖钠通道的灭活和干扰兴奋性氨基酸受体结合递质之后的胞内事件的能力。利鲁唑在ALS中的应用记载于US 5,527,814，该化合物及其制备记载于EP050551。其他神经保护剂化合物可以如Yagupolskii等在Zhurnal Obschei Khimii 33(7)，
2301-7(1963)中所述制备。

[0073] 提供下列实施例、参考文献和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围由所附权利要求书设定。应理解可以对所设定的过程进行修改而不背离本发明的精神。

[0074] 序列表

[0075] SEQ ID NO：1

[0076] 野生型人IGF-I的氨基酸序列(根据SwissProt P01343，IGF-I前体蛋白的氨基酸1-70)。

[0077] SEQ ID NO：2

[0078] 携带K65R和K68R氨基酸置换的人IGF-I突变蛋白的氨基酸序列。

[0079] SEQ ID NO：3

[0080] 携带K27R和K68R氨基酸置换的人IGF-I突变蛋白的氨基酸序列。

[0081] SEQ ID NO：4

[0082] 携带K27R和K65R氨基酸置换的人IGF-I突变蛋白的氨基酸序列。

附图说明

[0083] 图1示出了小鼠皮下注射100μg/kg rhIGF-I或PEG-IGF-I之后的血清检测。用ELISA技术在标明的时间点检测PEG-IGF-I或rhIGF-I的血清水平。

[0084] 图2示出了在小鼠中皮下注射了rhIGF-I或PEG-IGF-I(100μg/kg)之后，IGF-I在海马CA1神经元中的免疫反应性。在所标明的时间点，将大脑取出并对hIGF-I免疫染色。分析海马CA1区域的数字图像，以获得神经元内的染色强度。

[0085] 图3示出了在比格犬中皮下注射PEG-IGF-I(200-5000μg/kg)后的血糖水平。用Roche AkkuCheck装置在各个时间点从血滴中评估葡萄糖水平。箭头指示在5000μg/kg剂量下，仅在雄性犬中显著发生严重低血糖症。

[0086] 图4示出了用rhIGF-I或PEG-IGF-I治疗5天后小鼠初级运动神经元(primary motoneuron)的体外存活。在PEG-IGF-I或rhIGF-I以不同浓度存在或不存在下培养来自C57Bl/6小鼠的初级运动神经元，并用相差显微镜在第5天体外评估其存活。

[0087] 图5示出了用赋形剂或150μg/kg PEG-IGF-I s.c.q2d治疗的pmn小鼠的握力强度。每周检测动物前肢的肌力，数字表示每个时间点分析的动物数量(＊＊，p＜0.01)。

[0088] 图6示出了用赋形剂或150μg/kgPEG-IGF-I s.c.q2d治疗的pmn小鼠的转杆行为(rotarod performance)。每周检测动物的运动协调性，数字表示每个时间点的动物数量(＊，p＜0.05)。

[0089] 图7示出了在用赋形剂或PEG-IGF-I(150μg/kg s.c.q2d)处理的pmn小鼠的面神经核中运动神经元存活。动物出生后34天处死，并对组织加工用于组织学检测。双盲法进行运动神经元数量的体视学检测，数值表示每只小鼠中运动神经元的总数(＊＊，p＜0.01)。

[0090] 图8示出了在用赋形剂或PEG-IGF-I(150μg/kg s.c.q2d)处理的pmn小鼠的腰脊髓中的运动神经元存活。动物出生后34天处死，并对组织加工用于组织学检测。双盲法进行运动神经元数量的体视学检测，数值表示每只小鼠中运动神经元的总数(＊＊＊，p＜0.001)。

[0091] 图9示出了用赋形剂或PEG-IGF-I(150μg/kg s.c.q2d)处理的pmn小鼠的近端膈神经中的有髓轴突数量。动物出生后34天处死，并对组织加工用于组织学检测。双盲法进行有髓轴突数量的体视学检测，数值表示每个膈神经中有髓轴突的总数(＊，p＜0.05)。

[0092] 图10示出了用赋形剂或PEG-IGF-I(150μg/kg s.c.q2d)处理的pmn小鼠的远端膈神经中的有髓轴突数量。动物出生后34天处死，并对组织加工用于组织学检测。双盲法进行有髓轴突数量的体视学检测，数值表示每个膈神经中有髓轴突的总数(＊＊，p＜0.01)。

[0093] 图11示出了用赋形剂或PEG-IGF-I(150μg/kg s.c.q3.5d)处理的SOD1(G93A)小鼠的体重分析。每周检测体重，并且其数值以设为100％的第一次检测的体重来进行归一化(＊，p＜0.05)。

[0094] 图12示出了在用赋形剂或PEG-IGF-I(150μg/kg s.c.q3.5d)处理的SOD1(G93A)小鼠中的疾病发作。每周检测动物，疾病发作定义为后肢无力、异常步态和抓握倒置金属网困难。Kaplan-Meier曲线示出了从出生后34周开始处理的各个小鼠中的疾病发作。棒状图示出了两个组疾病发作时的平均年龄(p＜0.05)。

[0095] 图13示出了用赋形剂或PEG-IGF-I(150μg/kg s.c.q3.5d)处理的SOD1(G93A)小鼠的握力强度。每周检测动物的前肢肌力。通过将最后一次测量值算入后续数据，在该时间阶段内进行动物濒死的LOCF分析(＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01)。

[0096] 图14示出了用赋形剂或PEG-IGF-I(150μg/kg s.c.q3.5d)处理的SOD1(G93A)小鼠的转杆行为。每周检测动物的运动协调性。通过将最后一次测量值算入后续数据，在该时间阶段内进行动物濒死的LOCF分析(＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01)。

[0097] 图15示出了与ALS小鼠模型中说明的神经肌肉单位相关的PEG-IGF-I的体内作用。表明PEG-IGF-I改善了神经肌肉功能，并保护了脑干和脊髓中运动轴突和运动神经元，因此就意味着PEG-IGF-I对所有负责保持神经肌肉连接的部分都起作用。

具体实施方式

[0098] 方法：

[0099] 小鼠胚胎运动神经元培养

[0100] 用单克隆大鼠抗p75抗体(Chemicon，Hofheim，德国)通过淘选技术从胎龄12.5天的小鼠中制备脊椎运动神经元的培养物。对个体腰脊髓的腹侧部分切片，并转移至含有10μM 2-巯基乙醇的HBSS中。用胰酶处理(0.05％，10分钟)后，研磨制得单细胞悬浮液。
将细胞铺在大鼠抗p75抗体包被的培养板(Greiner，Nürtingen，德国)上，室温放置30分钟。然后用Hank’s平衡盐溶液(HBSS；3次)洗涤各个孔，然后用去极化盐水(0.8％NaCl，
35mM KCl和1μM 2-巯基乙醇)将贴壁细胞从平板上分离。以3000细胞/孔的密度将细胞铺到如(Miller，T.M.等人，J.Biol.Chem.272，9847-9853，1997)所述预包被了多鸟苷酸和层粘连蛋白的4孔培养板(Greiner)中。细胞在神经基础培养基(Life Technologies，Karlsruhe，德国)、B27补充剂、10％马血清、500μM glutamax和50μg/ml脱铁运铁蛋白中，在37℃、5％CO2气氛中培养。第一天置换50％的培养基，然后每隔一天置换50％的培养基。当所有细胞都贴壁到培养板上之后4小时，进行铺板细胞的初次计数。在第5天另
2
外对相明亮的细胞计数。每个时间点每个孔对十个视野进行计数(1.16mm/视野)。

[0101] 血清rhIGF-I或PEG-IGF-I水平和CA1神经元中的神经元内IGF-I染色[0102] 为了评价血清rhIGF-I或PEG-IGF-I水平，在100μg/kg rhIGF-I或PEG-IGF-I单次皮下注射之后，在不同的时间点(每个时间点n＝4只小鼠)从C57Bl/6小鼠取血液样本。制备血清，进行ELISA检测。对于rhIGF-I的测定，使用商品化的rhIGF-I检测(DSL)。对于PEG-IGF-I的测定，将链霉抗生物素包被的检测微孔板用生物素化的抗PEG(IgM)捕获抗体包被。将血清样本与地高辛化的(digoxygenated)IGFBP-4孵育15个小时，以用IGFBP-4置换内源性IGFBP结合的任何IGF-I。洗涤之后，将平板与抗-Dig-POD(Fab)孵育，e
并用ABTS颜色反应检测。吸光度信号用SpectraMax M2 读数器在405nm和490nm定量。

[0103] 单次皮下注射100μg/kg rhIGF-I或PEG-IGF-I之后的不同时间点，在异氟醚麻醉下断头处死C57Bl/6小鼠，取出大脑。在干冰中骤冻脑半球，然后在多聚甲醛(磷酸盐缓冲液PBS中，4％)中固定。然后，用振动切片机(蔡司)切成40μm矢状切片。对于免疫反应性的半定量分析，从离侧面边缘2mm处开始切片，切24片。每隔三片取1片(每个第四片)用于计数，每只小鼠总共取6片。用山羊抗hIGF-I抗体(R&D系统)对切片进行免疫染色，用核染料进行复染。用驴抗山羊Cy3(Jackson)标记进行第二次检测。用PixelFly相机(Klughammer)在相同亮度和穿过CA1细胞层的相同的染色强度下，对CA1神经元的数字图像进行全盲评价，穿过CA1细胞层的染色强度用ImagePro 4.5软件(Media Cybernetics)半自动获得。平均每只小鼠的6个切片的强度值。

[0104] 血糖估测

[0105] 用PEG-IGF-I(200-5000μg/kg s.c.)处理比格犬，在至多6天(144h)的不同时间间隔后取血液样本。用AkkuCheck装置(Roche)从血滴评价血糖。

[0106] 功能评价

[0107] 有规律地监控小鼠，以评估其疾病发作，疾病发作定义为当小鼠呈现后肢无力、异常步态和抓握倒转金属网困难。SOD1(G93A)转基因小鼠的疾病发作是不定的(Gurney等人，Science 264(5166)：1772-1775，1994)，但是其在pmn小鼠出生后第三周发生(Schmalbruch等人，J NeuropatholExD Neurol 50(3)：192-204，1991)。为了评估产生的后肢无力的程度，在出生后第24天(pmn突变小鼠)和出生后第34周(SOD G93A突变小鼠)对突变小鼠每周进行功能性运动测试。平均五次在电子握力计(俄亥俄州哥伦布市哥伦布仪器公司，Columbus Instruments，Columbus，Ohio)上的实验以记录前肢握力(以牛顿计)。此外，检测小鼠在杆以4-40rpm(每分钟转数)的线性加速度下转动的转杆装置(Hugo Basile Bio.Res.App.)上保持平衡的能力。每个检测记录每只小鼠在该转杆上保持的时间(秒)(等待时间(latency))三次。出生后第24天(pmn小鼠)或出生后第34周(SOD1小鼠)的平均值记作100％，针对该数值对后续的分析结果进行归一化。

[0108] 组织学分析

[0109] 在出生后第34天测定PEG IGF-I和赋形剂(即不合PEG IGF-I的对应的缓冲液)处理过的pmn小鼠的面神经核和腰脊髓中的运动神经元胞体数量。此外，在这些小鼠突变体中对膈神经的近端和远端中有髓轴突的数量进行计数。用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中的4％多聚甲醛(PFA)对动物进行穿心灌注，取脑干和腰脊髓(L1-L6)。从包括面神经核的脑干区域开始系列切片(7μm)，从腰脊髓开始系列切片(12.5μm)。在尼斯尔染色之后，每5个(面神经核)或每10个(脊髓)切片对运动神经元进行计数，原始数据针对裂开的核(split nuclei)校正(Masu等人，Nature 365：27-32，1993)。膈神经在含有4％多聚甲醛和2％戊二醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲液中后固定过夜。锇处理和脱水之后，所有的样本在Spurr氏介质中包埋。用玻璃刀切半薄(0.5μm)横切片，azur-甲基蓝(azur-methylen blue)染色，以进行光学显微镜检查。从神经横切片在配备有数码相机(ActionCam；Agfa，Mortsel，比利时)的徕卡(德国Nussloch)光学显微镜拍摄的照片中测定完整的有髓神经纤维的数量。

[0110] 实施例

[0111] 实施例1：

[0112] 为了评价rhIGF-I和PEG-IGF-I的全身性暴露情况，在C57Bl/6小鼠上利用特定检测方法评价单次皮下注射100μg/kg rhIGF-I或PEG-IGF-I后药物水平。因此，PEG-IGF-I与rhIGF-I相比显示出大大延长的半衰期和较高的血清暴露(图1)。为了更深入研究是否这种增加的外周暴露转移至大脑，用识别人IGF-I的抗体对这些小鼠脑切片进行了免疫染色并评价CA1区神经元内染色。在皮下注射rhIGF-I后2小时和6小时CA1神经元的IGF-I染色增强，但是24小时后褪回至基线水平(图2)。相反，在注射PEG-IGF-I后24小时和48小时仍能观察到IGF-I的染色增强并且在48小时达到更高水平。这些数据显示rhIGF-I和PEG-IGF-I的脑进入情况与外周暴露情况具有相似的动力学表现，而且也表明与rhIGF-I相比PEG-IGF-I外周暴露越高，向脑内转运的越好而且在脑内保持的时间越长。

[0113] 实施例2：

[0114] 在比格犬的毒理学检测中，在皮下注射150μg/kg这样相对较低剂量rhIGF-I仍显示出有急性诱发低血糖的较大可能(NDA报告21-839)。为了分析PEG-IGF-I低血糖的可能性，雌雄比格犬被单次皮下注射200-5000μg/kg剂量范围的PEG-IGF-I。如图3所示，多达2000μg/kg时也没观察到持续性低血糖。但是，在5000μg/kg剂量时，两只狗中的一只患有严重的低血糖(如图2箭头示)并且不得不通过输注葡萄糖使其清醒。结果，在这个时间点，葡萄糖试验被停止。总之，这些数据显示皮下注射高达2000μg/kg PEG-IGF-I也没有出现与皮下注射150μg/kg rhIGF-I相似的低血糖(NDA报告21-839)的可能性。

[0115] 实施例3：

[0116] 为研究PEG-IGF-I和rhIGF-I的体外活性，比较了两种化合物使运动神经元存活方面的作用。把来源于胎龄12.5的C57B1/6小鼠胚胎的初级运动神经元在存在或不存在不同浓度的rhIGF-I或PEG-IGF-I的溶液中培养，5天后通过相差显微技术进行存活神经元计数。如图4所示，两种化合物显示出相同的运动神经元保护作用。该数据表明rhIGF-I和PEG-IGF-I有相同的生物活性。

[0117] 实施例4：

[0118] 对于rhIGF-I，在SOD1(G93A)小鼠这一广泛应用的ALS动物模型中，一些局部或持续性给药方案都显示出有效性(Kaspar等人，Science 301：839，2003；Dobrowolny等人，J Cell Biol 168：193，2005；Nagano等人，J NeurolSci 235：61，2005；Narai等人，J Neurosci Res 82：452，2005)。因此，我们研究了在两个独立的ALS模型-pmn小鼠和SOD1(G93A)小鼠中临床发病前皮下注射150μg/kg PEG-IGF-I的体内疗效。

[0119] 为在散发ALS模型中试验PEG-IGF-I，使用了pmn小鼠(Bommel等人，J Cell Biol159：563，2002)。这种ALS模型在出生后2周出现第一个功能损害症状，在出生后5-6周死亡。因此从发病开始的出生后第13天，即疾病刚刚开始的时间，每2天(q2d)用赋形剂(n＝12)或150μg/kgPEG-IGF-I(n＝13)皮下注射Pmn小鼠。每周通过握力分析评定前肢肌力，在生后第45天明显地观察到PEG-IGF-I的效果，用PEG-IGF-I处理的存活pmn小鼠与赋型剂处理的动物相比获得显著较高的效果(p＜0.05，n＝4-5，图5)。通过测定转杆上花费的时间来分析运动协调能力揭示出PEG-IGF-I-处理的pmn小鼠比赋形剂处理的小鼠表现得更好，在出生后第38天更为显著(p＜0.05，n＝8-12，图6)。而且，从pmn小鼠出生后的第13天开始用赋形剂和PEG-IGF-I(150μg/kg皮下注射)处理并且在出生后第34天处理完，然后进行组织学分析。立体计数面运动神经元显示在PEG-IGF-I处理组有明显更高的运动神经元存活数(p＜0.01，n＝6-12，图7)。相似地，腰髓运动神经元存活数也明显增高(p＜0.001，n＝5-6，图8)。最后，膈神经有髓轴突数的分析揭示出当比较赋形剂处理的pmn小鼠和PEG-IGF-I处理的pmn小鼠时，在近端有髓轴突数的显著增高(p＜0.05，n＝4-5，图9)，远端膈神经也是如此(p＜0.01，n＝5-6，图10)。

[0120] 为在广泛应用的家族性ALS模型中试验PEG-IGF-I，SOD1(G93A)小鼠(低拷贝)被应用。这些小鼠在出生后第34-35周出现第一个症状，此后的4-5周死亡。因此从发病开始的出生后第34周，即疾病刚刚开始的时间，每周2次(q3.5d)用赋形剂(n＝6)或150μg/kg PEG-IGF-I(n＝7)皮下注射SOD1(G93A)小鼠。为保证整个实验过程中的统计效能，应用了LOCF(末次观察值结转法)分析法。这种方法(也被应用在临床试验中)能保留动物死之前的最后测量值用于所有后续时间点。体重变化的分析显示在疾病早期(大约37周)PEG-IGF-I处理的小鼠体重下降显著延迟(37、38和39周p＜0.05，n＝6-7LOCF，图11)。监测作为疾病起病的第一组症状如：后肢无力、步态失调和抓握倒转金属网困难等，这些症状平均延后了4周，从生后第38.5周到生后第42.5周(p＜0.05，n＝6-7，图12)。每周通过握力分析评定前肢肌力观察到了从生后第35周持续至所有动物死亡PEG-IGF-I的显著保护作用(35、38、42和43周p＜0.05，36、39、40和41周p＜0.01，n＝6-7LOCF，图13)。
通过测定转杆上花费的时间来分析运动协调能力揭示出PEG-IGF-I-处理的SOD1(G93A)小鼠比赋形剂处理的小鼠表现得更好(37，38，39和41周p＜0.05，40，42和43周p＜0.01，n＝6-7LOCF，图14)。

[0121] 总结pmn和SOD1(G93A)小鼠的所有体内数据，研究显示PEG-IGF-I在ALS模型中所有有关目标中介入了神经肌肉功能而且有可能在疾病的每个时期均起作用。大部分可能通过保护神经肌肉接头和联结，PEG-IGF-I显示出的肌力和功能的保护作用预示其有肌肉合成代谢作用。除此之外，PEG-IGF-I显示出的挽救脊髓和面神经核运动轴索和运动神经元胞体的作用提示其对运动神经元有直接保护作用(图15)。这些退行性发生在ALS晚期，在早期和晚期PEG-IGF-I都可能影响疾病的进程。