DNER介导的胰腺内分泌前祖细胞及其子代的细胞纯化

摘要

本发明涉及鉴定和获得培养细胞的方法，所述培养细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞。还设想了扩增这样的细胞的数量以及分拣这样的细胞的方法。在某些方面，本发明进一步涉及选择性细胞表面标记DNER，其允许选择具有内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞表型的独特细胞亚类。在某些方面，选择性细胞表面标记选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8。而且，本发明涉及选自这样细胞的分离细胞及其组合物。

权利要求

1.一种鉴定胰腺细胞的方法，所述胰腺细胞包括选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的细胞，所述方法包括使含有胰腺细胞的细胞群与DNER结合试剂接触。

2.一种获得胰腺细胞培养物的方法，所述胰腺细胞培养物包括选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的细胞，所述方法包括：使包含胰腺细胞的细胞群接触DNER结合试剂，然后分离结合DNER结合试剂的细胞与不结合DNER结合试剂的细胞从而获得DNER阳性细胞。

3.一种获得胰腺细胞培养物的方法，所述胰腺细胞培养物包括选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的细胞，所述方法包括：获得按照权利要求2的方法纯化的细胞，随后将所获得细胞在有利于所述细胞分化为包括选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的细胞的胰腺细胞的条件下培养。

4.一种扩增胰腺细胞数量的方法，所述胰腺细胞包括选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的细胞，所述方法包括：获得按照权利要求2的方法纯化的细胞，随后将所获得细胞在有利于所获得细胞类型扩增的条件下培养。

5.一种扩增胰腺细胞数量的方法，所述胰腺细胞包括选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的细胞，所述方法包括：获得按照权利要求4纯化并扩增的细胞，随后将所获得细胞在有利于所述细胞分化为胰腺细胞的条件下培养，所述胰腺细胞选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞。

6.一种为不能生产至少一种胰腺激素的哺乳动物提供胰腺内分泌功能的方法，其中按照权利要求1-5中的任一项的方法获得细胞，所述方法还包括以下步骤：将所获得细胞以足以在哺乳动物中产生可检测量的至少一种胰腺激素的量植入哺乳动物体内。

7.一种定量包含胰腺细胞的DNER阳性细胞的方法，所述方法包括：a)使所述细胞与DNER结合试剂接触；和b)测定具有DNER细胞表面标记的细胞(DNER阳性细胞)的量。

8.一种优化体外方案的方法，其中定期监测表达DNER的细胞(DNER阳性细胞)的数量。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中将一种或多种其它结合试剂与DNER结合试剂同时或序贯地组合使用。

10.权利要求9的方法，其中其它结合试剂选自DDR1、prominin1(也称为CD133)、CD49f、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述DNER阳性细胞进一步分化为产胰岛素细胞，任选还进一步分化为以下细胞：胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和/或生长激素释放激素生产细胞。

12.一种通过权利要求1-11中任一项定义的方法获得的、选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化内分泌细胞的分离细胞。

13.一种包含分离细胞的组合物，所述分离细胞选自以下的一种或多种通过权利要求

1-11中任一项定义的方法获得的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化内分泌细胞。

14.DNER结合试剂用于鉴定或选择表达DNER蛋白作为细胞表面标记的细胞的用途。

15.DNER蛋白作为细胞表面标记用于获得胰腺内分泌细胞的培养物的用途。

说明书

DNER介导的胰腺内分泌前祖细胞及其子代的细胞纯化

发明领域

[0001] 在某些方面，本发明涉及选择性细胞表面标记DNER，其能够鉴定、选择和/或定量具有胰腺内分泌前祖细胞表型的独特细胞亚类及其子代。在某些方面，选择性细胞表面标记选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8。

[0002] 还设想了包含胰腺细胞的组合物、细胞培养物和细胞群，所述胰腺细胞选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，以及生产完全分化的内分泌细胞和检测内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的方法。

[0003] 发明背景

[0004] β细胞移植极有可能改善1型糖尿病的治疗，但首先需要克服众多障碍。其中一个障碍是缺乏可用的供体胰岛。胚胎干(ES)细胞来源的β细胞原则上可以提供无限数量的移植用β细胞，但迄今没有找到产生完整功能β细胞的可靠方案。已针对小鼠ES细胞和人ES细胞这二者报告了由胚胎干细胞形成定形内胚层(DE)细胞，载于例如WO2005/116073、WO 2005/063971和US 2006/0148081。由例如DE细胞有效产生胰腺内胚层(PE)细胞，有利于产生用于治疗糖尿病的产胰岛素β细胞。

[0005] 在尝试培养完全分化的胰岛细胞中，其目标一直是分离胰腺细胞，包括能够分化为胰腺β细胞或胰岛的胰腺内分泌前祖细胞。由外分泌谱系分离胰腺内分泌谱系的一个重要步骤应是鉴定可识别的细胞标记，其对胰腺内分泌前祖细胞和/或其子代是特异性的。为此，已对胞内标记和胞外标记进行了研究。胞内标记，尤其是在发展为完全分化的胰岛细胞的胚胎胰腺细胞中检测到的转录因子，已作为祖细胞标记进行了透彻研究。在某些方面，这些胞内标记是在发展为成熟胰岛细胞的胚胎胰腺细胞中检测到的转录因子。例如已研究了诸如Pdx1、Ngn3、Pax6和Isl1的转录因子。它们在按程序于胚胎发育过程中变为胰腺内分泌细胞的细胞中表达。然而，这些胞内标记提供的实际价值比胞外标记低，因为分析这些标记的表达要求杀死细胞或将报告基因遗传工程入细胞中永久修饰细胞。

[0006] 具体地说，包含早期胰腺芽结构(存在于小鼠胎儿发育的9.5-10.5天)的最早的多能干细胞或祖细胞共表达3种转录因子：Pdx1、Nkx6.1和Ptf1a。然后Ptf1a和Nkx6.1的表达分别被隔离在外周腺泡定向区和中央导管/内分泌定向区。参见Hald等人，J Histochem Cytochem(2008)；56(6)：587-95。因此，应该高度优先考虑鉴定在胰腺组织亚类中选择性表达的有用表面标记，所述亚类例如已被定向为选择内分泌谱系的早期“导管/内分泌”祖细胞的特定亚群。我们已将这些细胞命名为“内分泌前祖细胞”。在该阶段，DNER在内分泌前祖细胞的表面上选择性表达。这样的细胞以后将表达Ngn3，并向内分泌成熟发展。

[0007] 一经鉴定，胞外标记就将提供以下优势：表达所述标记的细胞可在无菌条件下被分拣且保持存活。已将上皮细胞粘附分子如Ep-CAM和整联蛋白作为胰腺胰岛祖细胞标记进行了研究。参见例如Cirulli等人，J.Cell Biol.140：1519-1534(1998)；和Cirulli等人，J.Cell Biol.150：1445-1460(2000)。

[0008] 附图描述

[0009] 图1：图1A示意显示了典型的8μm小鼠e15.5胰腺组织切片。小鼠胰腺中的细胞不同时分化。因此，可于给定时间观测不同发育期的细胞。于e15.5观察到两个主要结构区：中央结构区和外周结构区。中央结构区包含已发育为早期内分泌细胞、内分泌祖细胞、内分泌前祖细胞和导管/内分泌祖细胞的细胞。该中央结构区不含腺泡谱系的细胞。腺泡+ + -谱系的细胞存在于外周结构区中。外周结构区中的细胞为Ptf1a 和Pdx1，但也为Nk6.1、- - + 低
Ddr1 和Dner。在中央结构区中，细胞也为Pdx1。β细胞谱系的细胞为Dner ，这些细胞+ +
中的一些为胰岛素阳性。与Dner 细胞数相比，中央结构区中的大部分细胞为Ddr1。人胰腺中存在相应的细胞及其定位。图1B示意显示了细胞经过的不同阶段。在胰腺中，细胞开+ + +
始为多能胰腺祖细胞群，即Pdx1/Nkx6.1/Ptf1a。细胞的第一个命运选择是进入腺泡谱系+ - + + + + +
(Ptf1a)或导管/内分泌谱系(Ptf1a 以及Pdx1 和Nkx6.1，或Pdx1、Nkx6.1 和Ddr1)。
这些细胞中的一些细胞命运为导管谱系，一些细胞将通过打开Dner变成内分泌前祖细胞。
+
当胰腺细胞为Dner 时，其具有选择内分泌细胞命运的潜力，并因此将在随后打开Ngn3。一旦细胞打开Ngn3，其就是内分泌祖细胞。Dner与Ngn3共表达，但发现一些Ngn3阳性细胞为+ +
Dner阴性。Ngn3 细胞也是Pdx1。Ngn3表达在祖细胞中仅是短暂的，并通过特定阶段触发内分泌分化程序，在所述特定阶段中，包括NeuroD、Pax6、Arx(在α细胞中)，且Pax4(在β细胞中)在内的其它转录因子被活化。这些转录因子在某种程度上起活化激素基因的作用，且在早期内分泌细胞变成激素阳性时，它们几乎总是已经Ngn3阴性，但随后为例如Pax6+。由该时间点开始，细胞将根据之前和未来的命运决定输入信息，发育为完全分化的内分泌细胞类型之一(α-、β-、δ-、PP-和生长激素释放激素-细胞)。

[0010] 图2：小鼠和人Dner的ClustalW。比对同一性为90％。跨膜结构域加下划线：氨基酸639-661。胞外部分为氨基酸1-638。这包括可被切除的N-末端信号序列(即前30-35个氨基酸)。比对默认显示表示每列中观测到的保守程度的以下符号：“＊”表示该列中所有比对序列的残基或核苷酸相同。“：”表示观测到保守取代。“.”表示观测到半保守取代。

[0011] 图3：小鼠(A)和人(B)Dner的GlcNAc O-糖基化。预测GlcNAc O-糖基化存在于小鼠和人的胞外侧，并以“G”表示。

[0012] 图4：小鼠(A)和人(B)Dner的赖氨酸的ε氨基的糖化(Glycation)。预测糖化存在于小鼠和人Dner的胞外侧，并以“G”表示。

[0013] 图5：小鼠(A)和人(B)Dner的天冬酰胺的N-糖基化。预测N-糖基化存在于小鼠和人Dner的胞外侧，并以“N”表示。

[0014] 图6：小鼠(A)和人(B)Dner的粘蛋白型GalNAc O-糖基化。预测糖基化存在于小鼠和人Dner的胞外侧，并以“T”表示。下划线，即“______”，表示被切除的信号肽。

[0015] 图7：用Dner抗体进行的αTC的FACS。对既没有与山羊抗-Dner一抗温育也没有与驴抗山羊Cy2二抗温育的αTC进行FACS，产生Cy2荧光非常弱的细胞群(即背景)。加入驴抗山羊Cy2二抗导致荧光显著增加，这缘于二抗与细胞的非特异性结合(即背景)。
加入第一山羊IgG同种型对照，产生与单独的二抗几乎相同的荧光(即背景)。然而，加入山羊抗Dner导致荧光显著增加，表明Dner蛋白可以在FACS中用作标签。

[0016] 图8：用Dner抗体(A)和同种型对照(B)进行的e15.5小鼠胰腺细胞的FACS。

[0017] 发明概述

[0018] 在某些方面，本发明公开了胞外标记DNER用于鉴定和选择特定胰腺细胞的用途。在某些方面，本发明公开了选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8的胞外标记用于鉴定和选择特定胰腺细胞的用途。

[0019] 在某些方面，本发明涉及鉴定细胞的方法，所述细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括使包含胰腺细胞的细胞群与DNER结合试剂接触。在某些方面，本发明涉及鉴定细胞的方法，所述细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括使包含胰腺细胞的细胞群与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8的结合试剂接触。

[0020] 在某些方面，本发明涉及获得细胞培养物的方法，所述培养物包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括：使包含胰腺细胞的细胞群与DNER结合试剂接触，然后分离结合DNER结合试剂的细胞与不结合DNER结合试剂的细胞获得DNER阳性细胞。

[0021] 在某些方面，本发明涉及获得细胞培养物的方法，所述细胞培养物包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括：获得按照上述或本文所述方法纯化的细胞，随后在有利于细胞分化为胰腺细胞的条件下培养所获得的细胞，所述胰腺细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞。

[0022] 在某些方面，本发明涉及扩增细胞数量的方法，所述细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括：获得按照上述或本文所述方法纯化的细胞，随后在有利于所获得的细胞类型扩增的条件下培养所获得细胞。

[0023] 在某些方面，本发明涉及扩增细胞数量的方法，所述细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括：获得按照上述或本文所述方法纯化并扩增的细胞，随后在有利于所述细胞分化为胰腺细胞的条件下培养所获得的细胞，所述胰腺细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞。

[0024] 在某些方面，本发明涉及给不能生产至少一种胰腺激素的哺乳动物提供胰腺内分泌功能的方法，其中细胞通过任一种上述或本文所述方法获得，所述方法还包括以下步骤：将所获得的细胞植入哺乳动物中，植入的细胞量足以在哺乳动物中产生可检测量的至少一种胰腺激素。

[0025] 在某些方面，本发明涉及通过以下步骤定量包含胰腺细胞的DNER阳性细胞的方法：a)使所述细胞与DNER结合试剂接触；和b)测定具有DNER作为细胞表面标记的细胞(DNER阳性细胞)的量。

[0026] 在某些方面，本发明涉及用于优化体外方案的方法，其中定期监测表达DNER的细胞(DNER阳性细胞)的数量。

[0027] 在某些方面，本发明涉及通过本文所述的任一种方法获得的分离细胞，所述分离细胞选自：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞。

[0028] 在某些方面，本发明涉及包含通过本文限定的任一种方法所定义的方法获得的分离细胞的组合物，所述分离细胞选自以下的一种或多种细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞。

[0029] 在某些方面，本发明涉及使用DNER结合试剂鉴定或选择表达DNER蛋白作为细胞表面标记的细胞。

[0030] 在某些方面，本发明涉及使用DNER蛋白作为细胞表面标记获得胰腺内分泌细胞培养物。

[0031] 以本发明的方法鉴定、富集和/或分离的DNER阳性细胞具有分化为胰腺谱系的多种细胞类型的潜力。在某些方面，DNER阳性细胞进一步分化为产胰岛素细胞，其可以获得单独的产胰岛素细胞，或者获得还包括以下细胞的细胞培养物：生产胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和/或生长激素释放激素的细胞。以本发明的方法鉴定、富集和/或分离的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞具有分化为胰腺谱系的多种细胞类型的潜力。在某些方面，DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP 11和/或SLC30A8阳性细胞进一步分化为产胰岛素细胞，其可以获得单独的产胰岛素细胞，或者获得还包括以下细胞的细胞培养物：生产胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和/或生长激素释放激素的细胞。

[0032] 发明详述

[0033] DNER存在于由内分泌前祖细胞至完全分化的胰腺细胞的分化阶段的胰腺细胞上。相比之下，DDR1存在于由导管/内分泌祖细胞至早期内分泌细胞的分化阶段的胰腺细胞上。因此，与DDR1相比，DNER出现在胰腺细胞发育过程中的晚期，且也在晚期表达。因此，DNER提供处于其中细胞定向为内分泌谱系的分化阶段的胰腺细胞的胞外标记。使用胞外标记DNER鉴定、富集和/或分离胰腺细胞，其提供这样的细胞具有变成完全分化的内分泌细胞的潜力，但却失去了变成导管细胞或腺泡细胞的潜力。

[0034] DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8为内分泌谱系的胞外标记，其出现在这样的分化期：Ngn3表达出现并且仍然是完全成熟的内分泌细胞、包括β细胞的附近或之后。因此，DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8提供了其它胰腺细胞胞外标记，所述胰腺细胞处于这样的分化期：其中所述细胞定向为内分泌谱系，并已失去了变成导管细胞或腺泡细胞的潜力。

[0035] 胰腺内分泌细胞及其祖细胞

[0036] 在胰腺中可发现几种不同类型的胰腺细胞。这些细胞包括例如多能胰腺祖细胞、导管/内分泌祖细胞、内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞。这些细胞类型的示意图参见图1。

[0037] “胰腺内分泌细胞”或“表达胰腺激素的细胞”在本文可互换使用，是指能够表达至少一种以下激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和生长激素释放激素。

[0038] 本文使用的“分泌胰腺激素的细胞”是指能够分泌至少一种以下激素的胰腺内分泌细胞：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和生长激素释放激素。

[0039] 本文使用的“胰腺内分泌前祖细胞”(也称为“胰腺内分泌前祖细胞”和“内分泌前祖细胞”)是这样的细胞：其已失去了发育成胰腺导管和腺泡细胞的潜力，但还没有表达Ngn3蛋白，且不表达激素，但其有潜力分化为胰腺内分泌细胞或分泌胰腺激素的细胞，且+其一般还具有至少部分这些细胞特有的表型特征。在某些方面，内分泌前祖细胞为Pdx1、+ + +
Nkx6.1、Ddr1 和Dner。

[0040] 本文使用的“胰腺内分泌祖细胞”(也称为“胰腺内分泌祖细胞”和“内分泌祖细胞”)是这样的细胞：其为表达Ngn3蛋白的细胞，但不表达激素，但其有潜力分化为胰腺内分泌细胞或分泌胰腺激素的细胞，且其一般还具有至少部分这些细胞特有的表型特征。在+ + + + +/-某些方面，内分泌祖细胞为Pdx1、Nkx6.1、Ngn3、Ddr1 和Dner 。在某些方面，内分泌祖+ + + +/低/- +/低/- +
细胞为Pdx1、Nkx6.1、Ddr1、Ngn3 和Dner 。在某些方面，内分泌祖细胞为Pdx1、+ +/低/- +
Nkx6.1、Ddr1 和Ngn3。

[0041] 本文使用的“早期内分泌细胞”(也称为“胰腺早期内分泌细胞”)为内分泌细胞，其已关闭了Ngn3，但不共有在成熟胰腺的胰岛中存在的完全分化的胰腺内分泌细胞的全部特征，例如对葡萄糖的响应性。早期内分泌细胞对一种或多种胰腺内分泌激素(胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和生长激素释放激素)可为阴性或阳性。在某些方+/- +/- + +/- +/-面，早期内分泌细胞为Pdx1 、Nkx6.1 、激素 、Ddr1 和Dner 。在某些方面，早期内分高/+ + +/- +/低/- +/低/-
泌细胞为Pdx1 、Nkx6.1、激素 、Ddr1 和Dner 。

[0042] 本文使用的“完全分化(的)内分泌细胞”(也称为“胰腺成熟内分泌细胞”)是这样的细胞：其共有在成熟胰腺的胰岛中存在的完全分化的胰腺内分泌细胞的全部特征。“表达胰腺激素的细胞”和“分泌胰腺激素的细胞”是从早期至完全分化表型的“胰腺内分泌细+/- +/- + - 低胞”。在某些方面，完全分化的内分泌细胞为Pdx1 、Nkx6.1 、激素 、Ddrl 和Dner 。在+ +/- + 低/-
某些方面，完全分化的内分泌细胞为Pdx1、Nkx6.1 、激素 和Dner 。

[0043] 本文使用的“β细胞谱系”是指转录因子Pdx1和至少一种以下转录因子的阳性基因表达的细胞：Ngn3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl1、Hnf3β、MafA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系的特征性标记的细胞包括β细胞。

[0044] 本文使用的“导管/内分泌祖细胞”为在早期胰腺发育过程中驻留在中心部分并保留变成成熟导管细胞或完全分化的内分泌细胞的双能的细胞。而且，这些细胞表达转录因子Pdx1和Nkx6.1，但不表达Ptf1a。导管/内分泌祖细胞的实例可见于小鼠e12.0左右+ + +/-的发育期。在某些方面，导管/内分泌祖细胞、内分泌前祖细胞为Pdx1、Nkx6.1、Ddr1 。

[0045] 本文使用的“多能胰腺祖细胞”是代表胰腺最早细胞的细胞。这些细胞的独特表+ + +征为以下3种关键转录因子的三阳性细胞：Pdx1/Nkx6.1/Ptf1a。

[0046] 本文使用的“标记”为核酸或多肽分子，其在目标细胞中差异表达。在该方面，差异表达是指阳性标记表达水平增高而阴性标记表达水平降低。与其它细胞相比，可检测水平的标记核酸或多肽在目标细胞中足够高或足够低，这样就可以使用本领域已知的众多方法中的任一种方法，来鉴别和区分目标细胞和其它细胞。

[0047] 在某些方面，通过本发明方法获得的胰腺内分泌细胞为产胰岛素的细胞，还任选分化为产胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和/或生长激素释放激素的细胞。本文使用的“(生)产胰岛素的细胞”是指生产并储存或分泌可检测量的胰岛素的细胞。“(生)产胰岛素的细胞”可以为单个细胞或细胞聚集物。

[0048] 在某些方面，通过本发明方法获得的胰腺DNER+细胞包含早期内分泌细胞。在某些方面，通过本发明方法获得的胰腺DNER+细胞包含内分泌祖细胞。在某些方面，通过本发明方法获得的胰腺DNER+细胞可为：1)能够成熟为内分泌细胞的非分裂细胞；2)能够在成熟前扩增有限次数的分裂细胞；3)能够经历细胞分裂并随着时间推移由一个培养容器传代至另一个容器的分裂细胞。在某些方面，具有DNER作为细胞表面标记的胰腺细胞培养物是指富集胰腺细胞的培养物，所述胰腺细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，它们除了可检测的DNER细胞表面表达之外，还能够分化为完全分化的胰腺内分泌细胞，包括生产胰岛素的胰腺β细胞。

[0049] 在某些方面，通过本发明方法获得的胰腺DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞包含早期内分泌细胞。在某些方面，通过本发明方法获得的胰腺DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞包含内分泌祖细胞。在某些方面，通过本发明方法获得的胰腺DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞可为：1)能够成熟为内分泌细胞的非分裂细胞；2)能够在成熟前扩增有限次数的分裂细胞；3)能够经历细胞分裂并随着时间推移由一个培养容器传代至另一个容器的分裂细胞。在某些方面，具有DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8作为细胞表面标记的胰腺细胞培养物是指富集胰腺细胞的培养物，所述胰腺细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，它们除了可检测的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8细胞表面表达之外，还能够分化为完全分化的胰腺内分泌细胞，包括生产胰岛素的胰腺β细胞。

[0050] 细胞的“传代”通常是指接种的培养容器由部分汇合状态过渡至汇合状态，此时，将它们由培养容器中取出，并以较低密度再接种在培养容器中。然而，细胞可能在达到汇合之前传代。传代通常导致细胞群在其生长达到汇合时扩增。细胞群的扩增取决于初始接种密度，但通常为1-10、1-5、1-3或1-2倍扩增。因此，传代通常要求细胞能够在培养中进行多次细胞分裂。

[0051] 包含胰腺细胞的细胞群

[0052] 本文使用的术语“包含胰腺细胞的细胞群”是指包含一种或多种选自以下的细胞类型的细胞群：腺泡和导管细胞、多能胰腺祖细胞、导管/内分泌祖细胞、胰腺内分泌前祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、早期胰腺内分泌细胞、胰腺内分泌细胞、胰腺激素分泌细胞、胎儿胰腺细胞、成人胰腺细胞和其它非胰腺细胞。细胞“群”是指通过特定的起始细胞分离或培养程序获得的大量细胞。细胞群的特性一般由具有具体特性的个体细胞百分率(例如对特定标记染色阳性的细胞百分率)或针对整个群体检测时特性的群体平均值(例如由细胞群制备的裂解物中的mRNA量，或组织化学可检测的标记如Ngn3、Pax6、胰岛素或胰高血糖素阳性的细胞百分率)定义。

[0053] 在某些方面，包含胰腺细胞的细胞群得自胰腺。在某些方面，包含胰腺细胞的细胞群得自胎儿胰腺或成人胰腺。在某些方面，胰腺来自哺乳动物，例如人。

[0054] 在某些方面，包含胰腺细胞的细胞群得自体细胞群。在某些方面，体细胞群已被诱导去分化为胚胎样干(ES，例如多能)细胞。这样的去分化细胞也被称为诱导(型)多能干细胞(IPS)。

[0055] 在某些方面，包含胰腺细胞的细胞群得自胚胎干(ES，例如多能)细胞。在某些方面，包含胰腺细胞的细胞群为多能细胞，例如ES样细胞。

[0056] 在某些方面，包含胰腺细胞的细胞群为胚胎分化干(ES或多能)细胞。分化发生在胚状体和/或单层细胞培养物或其组合。

[0057] 在某些方面，包含胰腺细胞的细胞群为哺乳动物来源的细胞群。在某些方面，包含胰腺细胞的细胞群为人类来源的细胞群。在某些方面，细胞群已分化为胰腺内分泌谱系。

[0058] 在某些方面，包含胰腺细胞的细胞群得自一个或多个捐赠的胰腺。本文所述方法不受捐赠胰腺的年龄限制。因此，可以使用由胚胎至成年的供体分离的胰腺材料。

[0059] 由供体收获胰腺后，通常立即对其加工处理获得单个细胞或小细胞群，然后使用多种方法培养。一种方法要求清洗所收获的胰腺组织，备用于酶促消化。然后使用酶处理消化结缔组织，使所收获组织的实质解离为较小的胰腺细胞物质单元。所收获的胰腺组织用一种或多种酶处理，使胰腺细胞、亚结构和单个胰腺细胞与所收获器官的总体结构分离。设想将胶原酶、DNAse、Liberase制品(参见美国专利号5,830,741和5,753,485)和其它酶用于本文公开的方法。

[0060] 可以对所分离的源材料进一步加工，以富集一种或多种所需的细胞群。然而，解离用于培养的胰腺组织可以不进行进一步的分离直接用于本发明的培养方法。在某些方面，所分离的胰腺细胞物质或材料通过密度梯度离心(例如Nycodenz、Ficoll或Percoll)纯化。例如，美国专利号5,739,033描述的梯度方法可以用作富集处理的胰腺胰岛细胞的手段。由供体源收集的细胞混合物通常是异质性的，因此包含α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、导管细胞、腺泡细胞、兼性祖细胞和其它胰腺细胞类型。

[0061] 典型的纯化方法使得分离的细胞物质分离为多层或多界面。通常，形成两个界面。上层是胰岛富集层，通常含有10％-100％悬浮胰岛细胞。第二个界面通常为混合细胞群，其包含胰岛、腺泡和导管细胞。底层为沉淀物，其在梯度底部形成。该层通常主要包含腺泡细胞、部分残留胰岛和部分导管细胞。导管树组分可以单独收集，以便进一步操作。选定用于进一步操作细胞级分将随选定的梯度级分和每次分离的最终结果而不同。

[0062] 当胰岛细胞为所需的细胞类型时，在分离级分中适当富集的胰岛细胞群将包含至少10％-100％的胰岛细胞。其它胰腺细胞类型和浓度也可以在富集后收集。例如，本文描述的培养方法可以用于分离自第二个界面、沉淀或其它级分的细胞，这取决于所用的纯化梯度。

[0063] 在某些方面，中间胰腺细胞培养物由富集胰岛(上层)的级分产生。另外，然而，更异质的第二个界面和通常包含胰岛、腺泡和导管细胞或导管树组分、腺泡细胞和某些残留胰岛细胞的混合细胞群的底层级分，各自也可以用于培养。在某些方面，尽管两层均包含能够产生本文所述的DNER和/或DDR1阳性群的细胞，但每层均可具有用于所公开方法的特定优势。在某些方面，尽管两层均含有能够产生本文所述的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1阳性群的细胞，但每层均可具有用于所公开方法的特定优势。

[0064] 在某些方面，所述细胞群为干细胞群。在某些方面，所述细胞群为分化为胰腺内分泌谱系的干细胞群。

[0065] 干细胞是未分化的细胞，其定义是在单细胞水平上既能够自我更新，也能够分化产生子代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的另一特征是能够在体外分化为多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的不同细胞系的功能细胞，以及在移植后产生多个胚层组织的能力，以及在注射入胚泡中后能够显著形成大部分(如果不是全部)组织。

[0066] 干细胞根据其发育潜力分类为：(1)全能干细胞，意指能够产生所有的胚胎和胚外细胞类型；(2)多能干细胞，意指能够产生所有的胚细胞类型；(3)多能干细胞，意指能够产生一部分细胞谱系，但全部都在特定的组织、器官或生理系统中(例如，造血干细胞(HSC)可以产生的子代包括HSC(自我更新)、限于血细胞的寡能祖细胞以及为血液正常组分的所有细胞类型和元件(例如血小板))；(4)寡能干细胞，意指能够产生的细胞谱系部分比多能干细胞更有限；和(5)单能干细胞，意指能够产生单个细胞谱系(例如生精干细胞)。

[0067] 由干细胞获得胰腺细胞的方案例如但不限于下述方案：D′Amour，K.A.等人(2006)，Nat Biotechnol 24，1392-401；Jiang，J.等人(2007)，StemCells 25，1940-53；和Kroon，E.等人(2008)，Nat Biotechnol 26，443-452。

[0068] 由体细胞或被诱导去分化为多能细胞的体细胞(如ES样细胞)获得胰腺细胞的方案例如但不限于下述方案：Aoi，T.等人(2008)，Science321(第5889)，699-702；D′Amour，K.A.等人(2006)，Nat Biotechnol 24，1392-401；Jiang，J.等人(2007)，Stem Cells 25，1940-53；Kroon，E.等人(2008)，Nat Biotechnol 26，443-452；Takahashi，K.等人(2007)，Cell 131，861-72；Takahashi，K.和Yamanaka，S.(2006)，Cell 126，663-76；和Wernig，M.等人(2007)，Nature 448，318-24。

[0069] 分化是未特化的(“未定向的”)或低特化的细胞获得特化细胞(例如神经细胞或肌细胞)特征的过程。分化或分化诱导细胞是在细胞谱系中已占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向(的)”在应用于分化过程时，是指在分化途径中已前进至某个点的细胞，其在该点，在正常环境下，将继续分化为特定细胞类型或细胞类型亚类，但在正常环境下，其不能分化为不同的细胞类型或逆转为低分化细胞类型。去分化是指在细胞谱系中细胞逆转回更未特化的(或定向的)位置的过程。本文使用的细胞谱系限定了细胞的遗传性，即其来自哪种细胞以及其可产生什么细胞。细胞谱系使细胞处于发育和分化的遗传流程中。谱系特异性标记是指与目标谱系的细胞表型特异性相关的特征，可用于评价未定向细胞向目标谱系的分化。

[0070] 本文使用的“分化”是指其中细胞由未分化状态发展为分化状态、由不成熟状态发展为更不成熟状态或由不成熟状态发展为成熟状态的过程。例如，早期未分化的胚胎胰腺细胞能够增殖并表达特征性标记，如Pdx1、Nkx6.1和Ptf1a。成熟或分化的胰腺细胞不增殖，且不分泌高水平的胰腺内分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β细胞响应于葡萄糖以高水平分泌胰岛素。细胞相互作用和成熟的变化表现为细胞失去未分化细胞标记或获得分化细胞标记。失去或获得单个标记可以表明细胞已“成熟或完全分化”。术语“分化因子”是指加入胰腺细胞以增强其向成熟内分泌细胞(还包含产生胰岛素的β细胞)分化的化合物。示例性的分化因子包括肝细胞生长因子、角化细胞生长因子、毒蜥外泌肽-4、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子、表皮生长因子血小板衍生生长因子和胰高血糖素样肽1。在某些方面，细胞的分化包括在含有一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。

[0071] 胰腺内分泌谱系的特征性标记选自：Ngn3、NeuroD、Islet-1、Pdx1、Nkx6.1、Nkx2.2、MafA、MafB、Arx、Brn4、Pax4、Pax6、Glut2、胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽(PP)和生长激素释放激素。在某些方面，胰腺内分泌细胞能够表达至少一种以下激素：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、PP和生长激素释放激素。适用于本发明的是表达胰腺内分泌谱系的至少一种特征性标记的细胞。在本发明的某些方面，表达胰腺内分泌谱系的特征性标记的细胞为胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以为表达胰腺激素的细胞。或者，胰腺内分泌细胞可以为分泌胰腺激素的细胞。

[0072] 在本发明的某些方面，胰腺内分泌细胞为表达β细胞谱系的特征性标记的细胞。表达β细胞谱系的特征性标记的细胞表达Pdx1和至少一种以下转录因子：Ngn3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl1、Hnf3β、MafA、Pax4和Pax6。在本发明的某些方面，表达β细胞谱系的特征性标记的细胞是β细胞。在某些方面，所述胰腺内分泌细胞为表达标记Nkx6.1的细胞。在某些方面，胰腺内分泌细胞为表达标记Pdx1的细胞。在某些方面，胰腺内分泌细胞为表达标记Nkx6.1和Pdx1的细胞。

[0073] 本文使用的“Pdx1”是指参与胰腺发育的同源结构域转录因子。在某些方面，本文使用的“Pax4”是β细胞特异性转录因子，而本文使用的“Pax6”是胰腺胰岛细胞(特异性)转录因子；二者均参与胰岛发育。“Hnf3β”属于转录因子的肝核因子家族，其特征在于高度保守的DNA结合结构域和两个短羧基末端结构域。“Hnf3β”也被称为“FoxA2”。本文使用的“NeuroD”是参与神经发生的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子。本文使用的“Ngn3”是碱性环-螺旋-环转录因子的神经元素家族成员。本文使用的“Nkx2.2”和“Nkx6.1”是Nkx转录因子家族成员。本文使用的“Islet-1”或“Isl1”是转录因子的LIM/同源结构域家族成员，并在发育中的胰腺中表达。本文使用的“MafA”是在胰腺中表达的转录因子，并控制参与胰岛素生物合成和分泌的基因的表达。

[0074] Nkx6.1和Pdx1与Ptf1a在早期胰腺多能细胞中共表达，所述早期胰腺多能细胞可以发育为成熟胰腺中存在的所有细胞类型(例如腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞)。在该细胞群中存在还瞬时表达Ngn3的细胞。一旦细胞表达或已表达Ngn3，则其成为内分泌谱系的一部分，产生以后将形成胰岛的内分泌细胞(一种产胰岛素的β细胞)。在没有Ngn3的情况下，在胰腺发育过程中没有内分泌细胞形成。随着发育进行，Nkx6.1和Pdx1在已经没有Ptf1a表达的胰腺的更中心区域中共表达，且Nkx6.1和Pdx1阳性细胞不能再产生腺泡细胞。在该Nkx6.1和Pdx1阳性细胞群中，大量细胞瞬时共表达Ngn3，与更早期发育一样Ngn3将这些细胞标记为内分泌谱系细胞。

[0075] DNER

[0076] 本文使用的“DNER”、“Dner”、“DNER蛋白”或“Dner蛋白”是指所有哺乳动物形式的DNER，包括人和小鼠。在某些方面，“DNER”、“Dner”、“DNER蛋白”或“Dner蛋白”是指所有脊椎动物形式的DNER。所述术语在用于本文时，可以完全以大写字母书写为“DNER”，或者仅首字母大写为“Dner”，并表示来自任何动物的DNER，包括人和小鼠。人类形式被称为：“包含δ/notch样EGF重复序列”，也被称为例如“bet”和“UNQ26”。小鼠形式被称为：“δ/notch样EGF相关受体”，也被称为例如“BET”、“Bret”、“MGC39059”和“A930026D19Rik”。
DNER在其C末端包含单跨膜结构域，推测为推定的细胞表面蛋白。其还在其胞外结构域中包括大量EGF样重复序列，其胞质羧基末端结构域包含基于酪氨酸的分选基序。在人和小鼠中，其均为737个氨基酸长，小鼠和人之间的相似性为90％。已在小鼠中鉴定出一个家族成员。DNER在小鼠小脑中的Bergmann神经胶质细胞形态发生过程中用作Notch的配体。
DNER于细胞-细胞接触面结合Notch1，并在体外活化Notch信号转导。

[0077] 人和小鼠DNER的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2。DNER的氨基酸序列在小鼠和人中均为737个氨基酸长。在某些方面，本发明的DNER为SEQ ID NO：1。在某些方面，本发明的DNER为SEQ ID NO：2。

[0078] 在某些方面，术语“DNER蛋白”包含70％同一性(例如80％、85％、90％、92％、94％同一性)的蛋白。在某些方面，术语DNER蛋白包含95％同一性(例如96％、97％、98％或99％同一性)的蛋白。在某些方面，测定相对于人或小鼠形式的蛋白的同一性百分率。同一性百分率可以如下确定：比对两个序列，确定比对的相同残基数减去不同的残基数，除以较长序列中的残基总数，并乘以100。

[0079] 本文使用的“人DNER蛋白”天然存在于染色体2的2q36.3位或229.93-230.29Mb位。人DNER蛋白的GenPept登录号为NP_620711.2。

[0080] 本文使用的“小鼠Dner蛋白”天然存在于染色体1的1C5位或84.25-84.58Mb位。小鼠Dner蛋白的GenPept登录号为NP_690879.1。

[0081] 本文使用的术语“DNER结合试剂”是指特异性结合DNER蛋白的化合物，或共价连接所述蛋白的分子，例如抗体、其抗体片段、合成的抗体衍生分子(其包括结合特定蛋白的抗体(这样的合成分子例如可以为scFV、多特异性抗体等)的CDR)、凝集素、δnotch家族的互作配偶体及其小分子或片段。

[0082] 在某些方面，所述结合试剂为特异性结合DNER蛋白的抗体。在某些方面，所述结合试剂为特异性结合天然碳水化合物(其在翻译后连接DNER蛋白)的抗体。如本文的实施例1所示，在DNER氨基酸序列中，碳水化合物修饰可能出现大量特定位点。在某些方面，所述结合试剂为特异性结合连接在DNER蛋白上的天然碳水化合物结构的凝集素。在某些方面，所述结合试剂为DNER蛋白的配体。在某些方面，DNER配体选自Notch-1、-2、-3和/或-4的胞外结构域。在某些方面，所述结合试剂为无毒的荧光标记的分子，其与浆膜的胞外侧或胞内侧上的DNER蛋白相互作用。“连接DNER的寡糖”为共价连接DNER蛋白的多糖分子。在某些方面，所述寡糖通过甘氨酸(G)残基连接。在某些方面，所述寡糖通过天冬酰胺(N)残基连接。在某些方面，所述寡糖通过苏氨酸(T)残基连接。术语“凝集素”是指识别特异性碳水化合物分子的蛋白。在某些方面，所述碳水化合物为连接DNER蛋白分子的寡糖的全部或部分。“配体”为被某种蛋白特异性结合的分子。所述术语还包括结合蛋白的分子，例如特异性结合蛋白的抗体。在某些方面，所述配体结合共价连接蛋白的分子，例如碳水化合物或寡糖。

[0083] 在某些方面，所述结合试剂为特异性结合DNER蛋白的抗体。术语“DNER结合试剂”还包括由DNER蛋白特异性结合的化合物，例如Notch-1、-2、-3和/或-4的胞外结构域。术语“结合试剂”包括天然抗体及其片段，以及由几个物种的元件组成的嵌合抗体，还有完全合成的抗体样分子，例如scFV和其它对抗体具有结合特异性的合成分子(由于包含天然CDR序列)。

[0084] 结合试剂用于鉴定或选择表达特定蛋白作为细胞表面标记的细胞。例如，DNER结合试剂用于鉴定或选择表达DNER蛋白作为细胞表面标记的细胞。

[0085] “具有”DNER蛋白“作为细胞表面标记”的细胞是这样的细胞：其在细胞表面上具有足够量的特定蛋白，以允许使用本文所述的特定蛋白的特异性结合试剂和方法(FACS、免疫细胞化学、免疫吸附和淘选)由细胞群选择或拣出所述细胞。在某些方面，所述方法为MACS。在某些方面，DNER抗体用于选择“具有DNER作为细胞表面标记”的细胞。

[0086] 在某些方面，所述DNER结合试剂用荧光染料标记，所述荧光染料例如选自PE、cy2、cy3、cy5或Alexa488。在某些方面，DNER结合试剂用半抗原(如DIG)、生物素、表位(例如FLAG、HA或Myc)标记。

[0087] 在某些方面，可以将一种或多种其它结合试剂与DNER结合试剂同时或序贯组合使用。在某些方面，可对其它结合试剂实施与DNER结合试剂相同的分析步骤。在某些方面，其它结合试剂选自DDR1蛋白、prominin 1(也称为CD133)和CD49f。参见例如Sugiyama等人(2007)，PNAS 140(1)：175-180。在某些方面，所述其它结合试剂为DDR1。

[0088] DDR1

[0089] 本文使用的“DDR1蛋白”、“Ddr1蛋白”、“DDR1”或“Ddr1”是指DDR/TKT型蛋白激酶，盘菌素结构域受体家族成员1。在用于本文时，所述术语可以完全以大写字母书写为“DDR1”，或者仅首字母大写为“Ddr1”，应当指包括人和小鼠的任何哺乳动物的盘菌素结构域受体家族成员1。在某些方面，“DDR1蛋白”、“Ddr1蛋白”、“DDR1”或“Ddr1”是指所有脊椎动物形式的DDR1。DDR1由多种类型的胶原蛋白活化，包括I型至IV型。胶原蛋白与DDR1蛋白的结合导致自体磷酸化以及延迟但持续的酪氨酸激酶活化。DDR1可用于细胞-细胞相互作用或识别。已在人类中报道了至少3种mRNA变体，其产生876、913和919个氨基酸的不同蛋白同种型。在小鼠中，已分别报道了874和911个氨基酸的两种同种型。已表明DDR1蛋白在人类乳腺、卵巢、食道和小儿脑肿瘤中过表达。蛋白具有胞内受体酪氨酸激酶活性，并由多种类型的胶原蛋白活化。迄今为止所测试的所有胶原蛋白(I型至VI型和XI型)都实现了其自体磷酸化。

[0090] 小鼠和人DDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：3至SEQ IDNO：7。

[0091] SEQ ID NO：来源 类型

[0092] 3 人 DDR1同种型a

[0093] 4 人 DDR1同种型b

[0094] 5 人 DDR1同种型c

[0095] 6 小鼠 DDR1同种型1

[0096] 7 小鼠 DDR1同种型2

[0097] 在某些方面，本发明的DDR1为SEQ ID NO：3。在某些方面，本发明的DDR1为SEQ ID NO：4。在某些方面，本发明的DDR1为SEQID NO：5。在某些方面，本发明的DDR1为SEQ ID NO：6。在某些方面，本发明的DDR1为SEQ ID NO：7。

[0098] 在某些方面，术语“DDR1蛋白”包含70％同一性(例如80％、85％、90％、92％、94％同一性)的蛋白。在某些方面，术语DDR1蛋白包含95％同一性(例如96％、97％、98％或99％同一性)的蛋白。在某些方面，测定相对于人或小鼠形式的蛋白的同一性百分率。同一性百分率可以如下确定：比对两个序列，确定比对的相同残基数减去不同的残基数，除以较长序列中的残基总数，并乘以100。

[0099] 本文使用的“人DDR1蛋白”天然存在于染色体c6COX的30.99-31.01Mb位或染色体6的6p21.3位。人DDR1蛋白同种型a的GenPept登录号为NP_054699.2。人DDR1蛋白同种型b的GenPept登录号为NP_001945.3。人DDR1蛋白同种型c的GenPept登录号为NP_054700.2。

[0100] 本文使用的“小鼠Ddr1蛋白”天然存在于染色体17的35.29-35.31Mb位或17C；1721.5cM。小鼠DDR1蛋白同种型1的GenPept登录号为NP_031610.2。小鼠DDR1蛋白同种型2的GenPept登录号为NP_766550.1。

[0101] 需要指出的是，术语“同种型”和“同工型”在本文可互换使用，是指不同形式的同一蛋白，其形成的原因是例如由于单核苷酸多态性，其中不同形式的蛋白可以由相关基因产生，或者可以通过可变剪接由相同基因产生。

[0102] 术语“DDR1结合试剂”在本文用于指特异性结合DDR1蛋白或共价连接DDR1蛋白的分子的化合物，例如抗体、其抗体片段、合成的抗体衍生分子，其包括来自DDR1结合抗体(这样的合成分子例如可以为scFV、多特异性抗体等)的CDR、凝集素、胶原蛋白类型及其小分子或片段。

[0103] 在某些方面，DDR1结合试剂为特异性结合DDR1蛋白的抗体。在某些方面，DDR1结合试剂为特异性结合天然碳水化合物的抗体，所述碳水化合物在翻译后连接DDR1蛋白；如本文实施例1所示，在DDR1氨基酸序列中，碳水化合物可能出现大量特定位点。在某些方面，DDR1结合试剂为特异性结合连接DDR1蛋白的天然碳水化合物结构的凝集素。在某些方面，DDR1结合试剂为DDR1蛋白的配体。在某些方面，所述配体选自胶原蛋白I-XI、转甲状腺素蛋白、跨膜4超家族成员1(TM4SF1)。在某些方面，DDR1结合试剂为无毒的荧光标记分子，其与浆膜的胞外或胞内侧上的DDR1相互作用。“连接DDR1的寡糖”为共价连接DDR1蛋白的多糖分子。在某些方面，寡糖通过天冬酰胺残基连接。术语“凝集素”是指识别特异性碳水化合物分子的蛋白。在某些方面，碳水化合物是连接DDR1蛋白分子的寡糖的全部或部分。“配体”是由蛋白特异性结合的分子。所述术语还包括结合蛋白的分子，例如特异性结合蛋白的抗体。在某些情况下，所述配体结合共价连接蛋白的分子，例如碳水化合物或寡糖。

[0104] 在某些方面，DDR1结合试剂为特异性结合DDR1蛋白的抗体。术语“DDR1结合试剂”还包括由DDR1蛋白特异性结合的化合物，例如胶原蛋白和胶原蛋白片段。所述术语包括天然抗体及其片段，以及由几个物种的元件组成的嵌合抗体，还有完全合成的抗体样分子，例如scFV和具有抗体结合特异性的其它合成分子(由于包含天然CDR序列)。

[0105] DDR1结合试剂用于鉴定或选择表达DDR1蛋白作为细胞表面标记的细胞。

[0106] “具有DDR1作为细胞表面标记”的细胞是这样的细胞：其在细胞表面上具有足够量的DDR1，以允许使用本文所述的DDR1特异性结合试剂和方法(例如FACS、免疫细胞化学、免疫吸附和淘选)由细胞群选择或拣出所述细胞。在某些方面，所述方法为MACS。在某些方面，DDR1抗体用于选择“具有DDR1作为细胞表面标记”的细胞。

[0107] 在某些方面，DDR1结合试剂用荧光染料标记，所述荧光染料例如选自PE、cy2、cy3、cy5或Alexa488。在某些方面，DDR1结合试剂用半抗原(如DIG)、生物素、表位(例如FLAG、HA或Myc)标记。

[0108] 涉及DDR1和DDR1结合试剂的其它方面及其用途描述于PCT/EP2008/068061，该文献通过引用结合到本文中。

[0109] 其它胞外标记

[0110] 本文使用的“DISP2”、“Disp2”、“DISP2蛋白”、“Disp2蛋白”是指一种内分泌细胞谱系的胞外标记蛋白，其主要见于在出现Ngn3表达之后并在完全成熟的胰腺内分泌细胞(包括β细胞)保持。然而，发现某些细胞共表达DISP2和Ngn3。当在本文中使用时，所述术语可以完全以大写字母书写为“DISP2”，或者仅首字母大写为“Disp2”，并应当指任何脊椎动物的DISP2，包括哺乳动物、人和小鼠。Disp2也被称为“dispatched B”或“dispatched同源物2”。人Disp2的GenPept登录号为NP_277045，小鼠Disp2的GenPept登录号为NP_733481。编码Disp2蛋白的人基因的GeneID号为85455，编码Disp2蛋白的小鼠基因的GeneID号为214240。

[0111] 本文使用的“SEZ6L2”、“Sez6l2”、“SEZ6L2蛋白”或“Sez6l2蛋白”是指一种内分泌细胞谱系的胞外标记蛋白，其主要在出现Ngn3表达之后存在并在完全成熟的胰腺内分泌细胞(包括β细胞)保持。然而，发现某些细胞共表达SEZ6L2和Ngn3。当在本文中使用时，所述术语可以完全以大写字母书写为“SEZ6L2”，或者仅首字母大写为“Sez6l2”，并应当指任何脊椎动物的SEZ6L2，包括哺乳动物、人和小鼠。Sez6l2也被称为“发作相关6同源物样2”或“发作相关6同源物(小鼠)样2”。Sez6l2存在两种同种型：Sez6l2的人同种型1的GenPept参阅号为NP_036542，Sez6l2的同种型2的GenPept参阅号为NP_963869。小鼠Sez6l2的GenPept参阅号为NP_659175。小鼠Sez6l2的GenPept参阅号为NP_659175。
编码Sez6l2蛋白的人基因的GeneID号为26470，编码Sez6l2蛋白的小鼠基因的GeneID号为233878。

[0112] 本文使用的“LRP11”、“Lrp11”、“LRP11蛋白”或“Lrp11蛋白”是指一种内分泌谱系的胞外标记蛋白，其主要在出现Ngn3表达后存在并在完全成熟的胰腺内分泌细胞(包括β细胞)保持。然而，发现某些细胞共表达LRP11和Ngn3。当在本文中使用时，所述术语可以完全以大写字母书写为“LRP11”，或者仅首字母大写为“Lrp11”，并应当指任何脊椎动物的LRP11，包括哺乳动物、人和小鼠。Lrp11也被称为“低密度脂蛋白受体相关蛋白11”。人Lrp11的GenPept参阅号为NP_116221，小鼠Lrp11的GenPept参阅号为NP_766372。编码Lrpl1蛋白的人基因的GeneID号为84918，编码Lrp11蛋白的小鼠基因的GeneID号为
237253。

[0113] 本文使用的“SLC30A8”、“Slc30a8”、“SLC30A8蛋白”或“Slc30a8蛋白”是指一种内分泌细胞谱系的胞外标记蛋白，其主要在出现Ngn3表达后存在并于完全成熟的胰腺内分泌细胞(包括β细胞)保持。当在本文中使用时，所述术语可以完全以大写字母书写为“SLC30A8”，或者仅首字母大写为“Slc30a8”，并应当指任何脊椎动物的SLC30A8，包括哺乳动物、人和小鼠。Slc30a8也被称为“溶质载体家族30(锌转运体)成员8”或“溶质载体家族30成员8”。人Slc30a8的GenPept参阅号为NP_776250，小鼠Slc30a8的GenPept参阅号为NP_766404。编码Slc30a8蛋白的人基因的GeneID号为169026，编码Slc30a8蛋白的小鼠基因的GeneID号为239436。

[0114] 在某些方面，术语DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白包含70％同一性(例如80％、85％、90％、92％、94％同一性)的蛋白。在某些方面，术语DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白包含95％同一性(例如96％、97％、98％或99％同一性)的蛋白。在某些方面，测定相对于人或小鼠形式的蛋白的同一性百分率。同一性百分率可以如下确定：比对两个序列，确定比对的相同残基数减去不同的残基数，除以较长序列中的残基总数，并乘以
100。

[0115] 本文使用的术语“DISP2结合试剂”、“SEZ6L2结合试剂”、“LRP11结合试剂”或“SLC30A8结合试剂”指分别特异性结合DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白的化合物，或者指分别特异性结合共价连接DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白的分子的化合物，例如抗体、其抗体片段、合成的抗体衍生分子(其分别包括DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合抗体(这样的合成分子例如可以为scFV、多特异性抗体等)的CDR)、凝集素及其小分子或片段。

[0116] 在某些方面，DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合试剂为分别特异性结合DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白的抗体。在某些方面，DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合试剂为特异性结合天然碳水化合物的抗体，所述碳水化合物在翻译后分别连接DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白。在某些方面，DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合试剂为特异性结合天然碳水化合物结构的凝集素，所述碳水化合物结构分别连接DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白。在某些方面，DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合试剂分别为DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白的配体。在某些方面，所述配体选自胶原蛋白I-XI、转甲状腺素蛋白、跨膜4超家族成员1(TM4SF1)。在某些方面，DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合试剂为无毒荧光标记分子，其与浆膜胞外侧或胞内侧上的DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8分别相互作用。“连接DISP2的寡糖”、“连接SEZ6L2的寡糖”、“连接LRP11的寡糖”或“连接SLC30A8的寡糖”是分别共价连接DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白的多糖分子。在某些方面，所述寡糖通过天冬酰胺残基连接。所述术语“凝集素”是指识别特定碳水化合物分子的蛋白。在某些方面，所述碳水化合物为连接DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白分子的寡糖的全部或部分。“配体”是由蛋白特异性结合的分子。所述术语还包含结合蛋白的分子，例如特异性结合蛋白的抗体。在某些情况下，所述配体结合共价连接蛋白的分子，例如碳水化合物或寡糖。

[0117] 在某些方面，DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合试剂为分别特异性结合DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白的抗体。所述术语“DISP2结合试剂”、“SEZ6L2结合试剂”、“LRP11结合试剂”或“SLC30A8结合试剂”还包括分别由DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白特异性结合的化合物，例如胶原蛋白和胶原蛋白片段。所述术语包括天然抗体及其片段，以及由几个物种的元件组成的嵌合抗体，还有完全合成的抗体样分子，例如scFV和其它具有抗体结合特异性的合成分子(由于包含天然CDR序列)。

[0118] DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合试剂用于鉴定或选择分别表达DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8蛋白作为细胞表面标记的细胞。

[0119] “具有DISP2作为细胞表面标记”、“具有SEZ6L2作为细胞表面标记”、“具有LRP11作为细胞表面标记”、“具有SLC30A8作为细胞表面标记”的细胞是这样的细胞：其在细胞表面上分别具有足够量的DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8，以允许分别使用本文所述的DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8特异性结合试剂和方法(例如FACS、免疫细胞化学、免疫吸附和淘选)，由细胞群选择或拣出所述细胞。在某些方面，所述方法为MACS。在某些方面，DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8抗体分别用于选择以下细胞：“具有DISP2作为细胞表面标记”的细胞、“具有SEZ6L2作为细胞表面标记”的细胞、“具有LRP11作为细胞表面标记”的细胞、“具有SLC30A8作为细胞表面标记”的细胞。

[0120] 在某些方面，DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合试剂用荧光染料标记，所述荧光染料例如选自PE、cy2、cy3、cy5或Alexa488。在某些方面，DISP2、SEZ6L2、LRP11或SLC30A8结合试剂用半抗原(例如DIG)、生物素、表位(例如FLAG、HA或Myc)标记。

[0121] 在某些方面，选自DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8的一种或多种标记可与DNER组合用于本发明的方法。在某些方面，选自DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的一种或多种结合试剂可与DNER结合试剂组合用于本发明的方法。

[0122] 在某些方面，选自DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8的一种或多种标记可代替DNER用于本发明的方法。在某些方面，选自DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的一种或多种结合试剂可代替DNER结合试剂用于本发明的方法。

[0123] 在某些方面，选自DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8的一种或多种标记可与DDR1(而不是DNER)组合用于本发明的方法。在某些方面，选自DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的一种或多种结合试剂可与DDR1结合试剂(而不是DNER结合试剂)组合用于本发明的方法。

[0124] 鉴别方法

[0125] 在某些方面，本发明涉及鉴定细胞的方法，所述细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括使包含胰腺细胞的细胞群与DNER结合试剂接触。在某些方面，可以测定结合DNER结合试剂的细胞(即DNER阳性细胞)的数量和/或比率。在某些方面，本发明涉及鉴定内分泌前祖细胞的方法，所述方法包括使含胰腺细胞的细胞群与DNER结合试剂接触。在某些方面，本发明涉及鉴定内分泌祖细胞的方法，所述方法包括使含胰腺细胞的细胞群与DNER结合试剂接触。在某些方面，本发明涉及鉴定细胞的方法，所述细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括使含胰腺细胞的细胞群与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂接触。在某些方面，可以测定与结合试剂(选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂)结合的细胞(即DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞)的数量和/或比率。在某些方面，本发明涉及鉴定内分泌前祖细胞的方法，所述方法包括使含胰腺细胞的细胞群与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂接触。在某些方面，本发明涉及鉴定内分泌祖细胞的方法，所述方法包括使含胰腺细胞的细胞群与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂接触。

[0126] 在某些方面，本发明涉及如下定量含胰腺细胞的DNER阳性细胞的方法：a)使所述细胞与DNER结合试剂接触；和b)测定具有DNER作为细胞表面标记的细胞(DNER阳性细胞)的量。在某些方面，本发明涉及如下定量含胰腺细胞的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞的方法：a)使所述细胞与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂接触；和b)测定具有DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8作为细胞表面标记的细胞(DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP 11和/或SLC30A8阳性细胞)的量。

[0127] 本领域技术人员将认识到，有许多检测DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1蛋白的方法。例如，可将特异性结合DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1蛋白的抗体用来检测DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP 11、SLC30A8和/或DDR1。DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1蛋白特异性抗体是本领域技术人员已知的，并市售可得，例如由R&D Systems，Research Diagnostics，Inc.；Abcam；
Ancell Immunology ResearchProducts；eBioscience；艾奥瓦大学的发育研究杂交瘤 库 (DevelopmentalStudies Hybridoma Bank of the Univeristy of Iowa)； 和ZymedLaboratories，Inc.，Abnova Corporation，Affinity BioReagents BioLegend，GeneTex Lifespan Biosciences，MBL International Novus Biologicals，Proteintech Group，Inc.，Santa Cruz Biotechnology，Inc.市售可得。识别DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1的胞外部分的抗体可用于本发明拣选细胞。识别DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1的胞外部分上的不同表位的不同抗体可以单独或组合使用。识别DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域中的任何部分的任何DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1结合试剂均可用于监测DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1的表达。本领域技术人员会认识到，以上或本文对DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1蛋白检测的描述应当也适用于其它可能设想用作本发明标记的胞外蛋白。

[0128] 许多不同的荧光分子可用于缀合抗体，例如荧光素(fluorescien)、cy2、cy3、cy5、PE、Alexa488或罗丹明。技术人员知晓，在某些情况下，使用缀合荧光分子的不同抗体可以检测一个以上的胞外标记。可以在鉴定一个以上的目标胞外标记的条件下进行FACS分析。

[0129] “抗体”是指含免疫球蛋白基因的构架区或其片段的多肽，其特异性结合并识别抗原。抗体(也称为免疫球蛋白)存在于脊椎动物血液或其它体液中的蛋白，免疫系统用其鉴定并中和外源物，例如细菌和病毒。尽管所有抗体的总体结构都非常相似，但在蛋白末端的小区域是极为可变的，使得数百万的抗体仅仅末端结构略微不同。该区域被称为超变区。其中每一种变体均可以结合称为抗原的不同靶。抗体的这种巨大的多变性使得免疫系统能识别同样各不相同的抗原。被抗体识别的抗原特定部位叫做表位。这些表位以高特异性相互作用结合其抗体，叫做诱导契合，其允许抗体在数百万个组成生物体的不同分子中间，仅识别并结合其独特的抗原。

[0130] 评价蛋白和/或核酸标记(例如mRNA)在培养或分离的细胞中的表达的方法在本领域是标准的，包括定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹和原位杂交(参见例如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑，2001增刊))和免疫测定，例如切片材料的免疫组织化学分析，蛋白质印迹，以及用于完整细胞中可得到的标记的流式细胞术分析(FACS)(参见例如Harlow和Lane，UsingAntibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring HarborLaboratory Press(1998))。也可以使用内分泌细胞分化的常规组织化学标记。通过免疫组织化学检验的细胞可以在玻璃腔室载玻片上培养，用于显微镜检查。或者，在常规组织培养物中生长的细胞可以由培养物中人工取出，并包埋入石蜡中以便切片。或者，在常规组织培养物中生长的细胞可以由培养物中人工、酶促或使用无酶的细胞解离缓冲液取出，并包埋入石蜡或TissueTech中，用于切片，或在包埋前于培养基中再温育。细胞分化标记是变化的，可以通过常规免疫组织化学检测。普遍适用的方案如下。

[0131] 在某些方面，在腔室载玻片中的细胞可以用PBS非常温和地淋洗，并用4％多聚甲醛溶液固定45分钟。然后用PBS淋洗细胞，并储存于+5，直至使用。在使用当天，通过乙醇梯度系列(以70％开始，变为96％，然后变为99％，然后再99％，然后变为96％，最后至70％，每个浓度使用5分钟温育)渗透细胞，然后在含正常血清或TNB(来自Perkin Elmer的TSA(酪胺信号放大)试剂盒)的封闭缓冲液中于室温温育。以合适的稀释度制备一抗，并加至细胞，于室温(RT)在湿润腔室中过夜(O/N)温育。在与一抗温育后，用PBS冲洗细胞。将以合适的稀释度制备的荧光二抗加入细胞，并在黑暗中温育。在采用二抗的情况下，可以包含DAPI染料，用于反染色细胞核。然后冲洗细胞，除去过量的液体，取出载玻片的腔室部分，并用盖玻片封装载玻片。干燥载玻片，并储存于暗处，直至使用荧光显微镜(例如共焦显微镜)检查。在某些方面，染色过程于除去载玻片的腔室部分时开始。细胞用缓冲液非常温和地冲洗，并用多聚甲醛溶液固定。然后将细胞在含正常血清的封闭溶液中于室温温育。细胞在封闭溶液中被非离子洗涤剂渗透。以合适的稀释度制备一抗，加至细胞并温育。在与一抗温育后，用缓冲液冲洗细胞。将以合适的稀释度制备的第二抗体加至细胞，并于暗处温育。在温育后，冲洗细胞，细胞核用DAPI反染色。除去过量的液体，封装载玻片，并用盖玻片覆盖。或者，除去过量的液体，封装载玻片，并用盖玻片覆盖。干燥载玻片，并储存于暗处。

[0132] 或者，可以使用HRP方法制备用于免疫细胞化学的细胞。简而言之，将细胞包埋入石蜡中，采用石蜡切片的载玻片于37℃过夜干燥。对细胞去石蜡，并浸入过氧化氢溶液中，以抑制内源过氧化物酶活性。将载玻片在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸15分钟，以恢复某些表位。用缓冲液冲洗载玻片，并使用正常血清于室温在湿润腔室中封闭。

[0133] 在某些方面，将一抗加入样品，并在湿润腔室中温育。洗涤载玻片，并与生物素-二抗温育。再用缓冲液冲洗载玻片，并与抗生物素蛋白-HRP温育。再冲洗载玻片，并与TSA试剂温育，以显现一抗。在某些方面，TSA是酪胺信号放大的缩写。将载玻片封装用于观察。

[0134] 或者，可以使用HRP(辣根过氧化物酶)方法制备细胞用于免疫组织化学。作为二抗，使用生物素偶联的二抗。然后用PBS冲洗载玻片，并与抗生物素蛋白-HRP温育。再冲洗载玻片，并与TSA试剂温育，以显现一抗。在某些方面，封装载玻片，以便使用常规光学显微镜目检。在某些方面，封装载玻片，以便使用荧光显微镜(例如共焦显微镜)目检。在某些方面，可以使用铬精试剂如AEC进行显色。

[0135] 对于组织切片中的蛋白鉴定，可以将组织在4％PFA(多聚甲醛)中过夜固定，然后在30％蔗糖中过夜冷冻保护，并以TissueTech包埋。然后用恒冷箱切片，风干，并储存于-80°，直至使用。由冰箱中取出切片，并置于室温融化，接着用PBS(磷酸缓冲盐水)冲洗切片，并在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中微波15分钟，以恢复表位。然后可以使用以上或本文的方法染色这样的切片，但省略梯度乙醇处理。就使用HRP型测定而言，使用过氧化氢溶液抑制内源过氧化物酶活性。在某些方面，然后用超薄切片机切切片，例如使用石蜡切片时。

[0136] 可以对活细胞或已用Lillys固定剂固定45分钟的细胞进行分析型FACS拣选。为除去上清液，在2ml管中于室温以1400rpm、10分钟沉淀细胞。或者，为除去上清液，在10ml v型管中于室温以1300rpm、5分钟沉淀细胞。然后用含0.1％BSA的PBS洗涤细胞。对于固定细胞：通过加入血清以达到产生二抗的动物血清为10％(终浓度)，封闭细胞1小时。然后沉淀细胞，并除去上清液。加入一抗溶液，并于室温过夜温育。第二天，以2ml管(使用1.8ml)洗涤细胞3x 5分钟。或者，第二天，以10ml v型管洗涤细胞2x 5分钟。加入二抗，并于室温温育1小时。以含0.1％BSA的PBS(使用1.8ml)洗涤细胞3x 5分钟。或者，以含0.1％BSA的PBS洗涤细胞2x 5分钟。最后，通过FACS测定细胞。活细胞：加入一抗溶液，并于4℃温育1小时。以10ml v型管洗涤细胞2x 5分钟。加入二抗，并于4°温育
30分钟。用10ml v型管以含0.1％BSA的PBS洗涤细胞2x 5分钟。最后，固定细胞，并通过FACS测定。

[0137] 在某些方面，可以通过使细胞群与DNER结合试剂接触，并评价染色，实现内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的鉴定。在某些方面，可以通过使细胞群与DNER结合试剂接触，并评价染色，实现内分泌前祖细胞的鉴定。在某些方面，可以通过使细胞群与DNER结合试剂接触，并评价染色，实现内分泌祖细胞的鉴定。该分析可以使用诸如荧光活化的细胞拣选(FACS)、免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹、PCR或ELISA的方法进行。在某些方面，可以通过使细胞群与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂接触，并评价染色，实现内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的鉴定。在某些方面，可以通过使细胞群与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂接触，并评价染色，实现内分泌前祖细胞的鉴定。在某些方面，可以通过使细胞群与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂接触，并评价染色，实现内分泌祖细胞的鉴定。

[0138] 在某些方面，本发明涉及选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞的分离细胞，其通过本文所述的方法获得。在某些方面，本发明涉及分离的内分泌前祖细胞，其通过本文所述的方法获得。在某些方面，分离的细胞为内分泌前祖细胞。在某些方面，本发明涉及分离的内分泌祖细胞，其通过本文所述的方法获得。在某些方面，本发明涉及分离的完全分化的内分泌细胞，其通过本文所述的方法获得。在某些方面，本发明涉及分离的胰腺β细胞，其通过本文所述的方法获得。

[0139] 在某些方面，本发明涉及DNER结合试剂用于鉴定或选择表达DNER蛋白作为细胞表面标记的细胞的用途。在某些方面，本发明涉及DNER蛋白作为细胞表面标记获得胰腺内分泌细胞培养物的用途。在某些方面，本发明涉及选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂鉴定或选择表达DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8蛋白作为细胞表面标记的细胞的用途。在某些方面，本发明涉及DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8蛋白作为细胞表面标记获得胰腺内分泌细胞培养物的用途。在某些方面，同时或序贯使用一种或多种其它的细胞表面标记，以获得胰腺内分泌细胞培养物。在某些方面，其它的细胞表面标记选自DDR1蛋白、prominin 1(也称为CD133)和CD49f。在某些方面，其它的细胞表面标记为DDR1蛋白。

[0140] 分离方法

[0141] 在某些方面，本发明涉及获得细胞培养物的方法，所述细胞培养物包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括：使含胰腺细胞的细胞群接触DNER结合试剂，并分离DNER阳性细胞级分中结合DNER结合试剂的细胞和不结合DNER结合试剂的细胞。在某些方面，本发明涉及获得包含内分泌前祖细胞的培养物的方法，所述方法包括：使含胰腺细胞的细胞群接触DNER结合试剂，并分离DNER阳性细胞级分中结合DNER结合试剂的细胞和不结合DNER结合试剂的细胞。在某些方面，本发明涉及获得包含内分泌祖细胞的培养物的方法，所述方法包括：使含胰腺细胞的细胞群接触DNER结合试剂，并分离DNER阳性细胞级分中结合DNER结合试剂的细胞和不结合DNER结合试剂的细胞。在某些方面，本发明涉及获得细胞培养物的方法，所述细胞培养物包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括：使含胰腺细胞的细胞群接触选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂，并分离DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞级分中结合选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂的细胞和不结合选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂的细胞。在某些方面，本发明涉及获得包含内分泌前祖细胞的培养物的方法，所述方法包括：使含胰腺细胞的细胞群接触选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂，并分离DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞级分中结合选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂的细胞和不结合选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂的细胞。在某些方面，本发明涉及获得包含内分泌祖细胞的培养物的方法，所述方法包括：使含胰腺细胞的细胞群接触选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂，并分离DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞级分中结合选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂的细胞和不结合选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂的细胞。

[0142] 在某些方面，分离步骤通过荧光活化的细胞分拣(FACS)进行。在某些方面，所述方法为MACS。在某些方面，所述分离步骤通过淘选进行。

[0143] FACS还可以基于荧光检测物理分离细胞群。通过电磁场使流动的细胞改向，电磁场的强度和方向根据检测的荧光信号强度改变。标记的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞可被改向到单独的容器中，并因此与未标记的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阴性细胞分离。

[0144] 在某些方面，将特异性结合DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8的荧光标记的分子(最常见的是抗体)与FACS联合用于选择DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞。简而言之，在某些方面，含胰腺细胞的细胞群与荧光标记的抗体温育，在抗体结合后，通过FACS分析细胞。细胞分拣仪使悬浮在液体中的单个细胞通过荧光计。检测荧光量，将可检测荧光水平高于对照未标记细胞的细胞选择作为阳性细胞。

[0145] 在某些方面，其中含胰腺细胞的细胞群分离自胰腺，首先将细胞培养一代或多代，然后用DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8特异性抗体标记。然后使用FACS筛选细胞，以分离DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞和DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阴性细胞。尽管该实施例已讨论了采用标记抗体的FACS分析，但特异性结合DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8的其它分子，例如凝集素和其它DNER结合配偶体，如以上或本文所列出的，也可用于实施本发明。在某些方面，分离DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞与DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阴性细胞的方法是将DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞亲和吸附到固体支持体上。

[0146] 还可以通过使用附着固体支持体的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8特异性结合分子，将DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞与DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阴性细胞分离。本领域技术人员会认识到，DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8特异性抗体可以通过抗体结合分子(例如G蛋白或A蛋白)结合固体支持体，或者可以直接缀合固体支持体。具有附着的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8抗体的固体支持体市售可得，例如均得自Stem Cell Technologies的StemSep和EasySepTM磁珠。在某些方面，分离步骤可以使用磁活化的细胞分拣(MACS)进行。

[0147] 还可以通过淘选技术将DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞与DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阴性细胞分离。如下进行淘选：用选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂包被固体表面，并在适宜的条件下将表面上的胰腺细胞温育适宜的时间。用选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂包被平整表面，例如培养皿。将胰腺细胞加至表面，并使其结合选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂。然后洗涤培养皿，由培养皿除去DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阴性细胞。在某些方面，使用DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8特异性抗体包被培养皿，并“淘选”胰腺细胞群中的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞。

[0148] 在某些方面，可以通过将细胞分离为Ptprn/IA2阳性细胞和Ptprn/IA2阴性细胞，在DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8选择之前或之后纯化细胞。在某些方面，可以通过将细胞分离为Ptprn/IA2阳性细胞和Ptprn阴性细胞，在DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8选择之前或之后纯化细胞。在某些方面，可以将细胞分离为Abcc8/Surl阳性细胞和Abcc8/Sur1阴性细胞。在某些方面，可以将细胞分离为Slc30a8/ZnT-8阳性细胞和Slc30a8/ZnT-8阴性细胞。在某些方面，可以在通过DNER连同一种或多种其它胞外标记(例如DDR1蛋白)选择之前或之后纯化细胞。在某些方面，可以在通过DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8连同一种或多种其它胞外标记(例如DDR1蛋白)选择之前或之后纯化细胞。

[0149] 所以，本发明包括以下方面：其中含胰腺细胞的细胞群为β细胞阳性级分，包括Ptprn阳性级分、Abcc8阳性级分和/或Slc30a8阳性级分。另外，通过以上或本文的任一种实施方案的方法获得的胰腺内分泌细胞的培养物可被进一步分离为β细胞阳性/阴性级分，包括Ptprn阳性/阴性级分、Abcb9阳性/阴性级分和/或Slc30a8阳性/阴性级分。

[0150] 本领域技术人员将认识到，以上和本章节中涉及分离方法的所有细节，尽管是明确针对DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8陈述，但也适用于其它胞外蛋白。这样的胞外蛋白包括选自DDR1、prominin 1(也称为CD133)和CD49f的蛋白。具体地说，这样的胞外蛋白可为DDR1。

[0151] 在胚胎干(ES)细胞分化为β细胞的过程中，预期还可以产生其它细胞类型，例如神经细胞和非胰腺内胚层。ES细胞还可以通过活化素A分化为内胚细胞，然后分化为胰腺细胞。一旦已获知胰腺结果，则可以分离目标细胞。然后DNER和/或DDR1可以用作标记，以分离需要的部分细胞。DNER结合试剂将特异性结合胰腺的内分泌前祖细胞及其子代，但一般还结合神经细胞。本发明人已进行了基因表达谱实验，其表明DNER不是肠内分泌祖细胞的标记。DDR1结合试剂还结合胰腺的导管/内分泌祖细胞以及内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞和早期内分泌细胞。另外，DDR1结合试剂将不结合神经细胞，但确实结合非胰腺细胞的其它内胚层细胞。

[0152] 可获得不同用于鉴定、富集和/或选择的策略，例如以下的实例：可对已被诱导分化为定形内胚层(包括胰腺内胚层)的ES细胞1)使用DDR1作为标记分离DDR1+细胞；接着2)使用DNER作为标记由DDR1+细胞群中分离DNER+细胞。该步骤允许直接分离可被称为胰腺内分泌前祖细胞的ES源性细胞群。在体外进一步介导这样的细胞分化后，随后可以使用例如Ptprn/IA2阳性细胞、Abcc8/Sur1阳性细胞或Slc30a8/ZnT-8阳性细胞的标记作为标记，分离早期完全分化的内分泌细胞。

[0153] 预期一部分DDR1阳性细胞能够增殖。因此，在某些方面，本发明涉及包含以下步骤的方法：a)使用DDR1结合试剂分离细胞群，b)任选培养细胞群，以利于增殖和/或分化，和c)使用DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8结合试剂分离部分细胞群。通过该方法分离的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞群包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞。

[0154] 在某些方面，本发明涉及包含以下步骤的方法：a)使用DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8结合试剂分离细胞群，b)任选培养细胞群，以利于增殖和/或分化，和c)使用DDR1结合试剂分离部分细胞群，d)任选培养所述细胞群，以利于增殖和/或分化，和e)任选重复步骤a)-d)，直至获得所需量的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞。

[0155] 在某些方面，使用DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8作为标记，将提供含内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞群，并带有低比率的其它细胞类型，例如低于20％、低于15％、低于10％、低于5％、低于2％或没有其它细胞类型，例如非胰腺细胞的内胚层细胞和神经细胞。如果起始细胞群仅是无神经细胞的胰腺或内胚层来源，则可能不需要使用DNER和DDR1结合试剂进行双重拣选。

[0156] 在某些方面，同时或序贯使用DDR1和DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8组合作为标记将提供含内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞和/或早期内分泌细胞的细胞群，并带有低比率的其它细胞类型，例如低于20％、低于15％、低于10％、低于5％、低于2％或没有其它细胞类型，例如非胰腺细胞的内胚层细胞和神经细胞。如果起始细胞群仅是无神经细胞的胰腺或内胚层来源，则可能不需要使用DNER和DDR1结合试剂进行双重拣选。

[0157] 在某些方面，如果起始细胞群仅是胰腺来源，则本发明涉及对DDR1的第一次拣选，由此获得DDR1阳性细胞的细胞群，和对DNER的第二次反拣选，由此由DDR1阳性细胞中除去DNER阳性细胞；该方法将留下表达DDR1但不表达DNER的原-内分泌(pro-endocrine)前祖细胞细胞群，连同留下某些导管/内分泌祖细胞。原-内分泌前祖细胞被定义为内分泌前祖细胞的直接前体。在某些方面，如果起始细胞群仅是胰腺来源，则本发明涉及对DDR1的第一次拣选，由此获得DDR1阳性细胞的细胞群，和对DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8的第二次反拣选，由此由DDR1阳性细胞中除去DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞；该方法将留下表达DDR1但不表达DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8的原-内分泌前祖细胞细胞群，连同留下某些导管/内分泌祖细胞。原-内分泌前祖细胞被定义为内分泌前祖细胞的直接前体。

[0158] 在某些方面，可以产生包含胰腺内分泌细胞而基本上没有其它细胞类型的组合物。在某些方面，可以产生包含胰腺内分泌前祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞而基本上没有其它细胞类型的组合物。在某些方面，可以产生包含胰腺内分泌前祖细胞而基本上没有其它细胞类型的组合物。在某些方面，可以产生包含胰腺内分泌祖细胞而基本上没有其它细胞类型的组合物。在某些方面，表述“基本上没有”理解为这样的细胞培养物或细胞群：相对于细胞总数，其含有低于20％的、非胰腺内分泌前祖细胞、胰腺内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞的其它细胞类型。在某些方面，表述“基本上没有”理解为这样的细胞培养物或细胞群：相对于细胞总数，其含有低于20％的、非胰腺内分泌前祖细胞的其它细胞类型。在某些方面，表述“基本上没有”理解为这样的细胞培养物或细胞群：相对于细胞总数，其含有低于20％的、非胰腺内分泌祖细胞的其它细胞类型。

[0159] 在某些方面，本发明涉及一种方法，其中所获得细胞群由至少30％(例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)选自以下的细胞组成：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞。
在某些方面，本发明涉及一种方法，其中所获得细胞群由至少30％(例如至少40％、至少
50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)内分泌前祖细胞组成。在某些方面，本发明涉及一种方法，其中所获得细胞群由至少30％(例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)内分泌祖细胞组成。

[0160] 在某些方面，本发明涉及一种方法，其中起始细胞群为内胚层来源，且所获得细胞群由至少30％(例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)选自以下的细胞组成：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞。在某些方面，本发明涉及一种方法，其中起始细胞群为内胚层来源，且所获得细胞群由至少30％(例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)内分泌前祖细胞组成。在某些方面，本发明涉及一种方法，其中起始细胞群为内胚层来源，且所获得细胞群由至少30％(例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)内分泌祖细胞组成。

[0161] 在某些方面，本发明涉及一种方法，其中起始细胞群包含内胚层和神经来源的细胞，且所获得细胞群由至少30％(例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)选自以下的细胞组成：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞。在某些方面，本发明涉及一种方法，其中起始细胞群包含内胚层和神经来源的细胞，且所获得细胞群由至少30％(例如至少40％、至少
50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)选自内分泌前祖细胞的细胞组成。在某些方面，本发明涉及一种方法，其中起始细胞群包含内胚层和神经来源的细胞，且所获得细胞群由至少30％(例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％)选自内分泌祖细胞的细胞组成。在某些方面，本发明涉及一种方法，其中当起始细胞群包含内胚层和神经来源的细胞时，DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8结合试剂同时或序贯与一种或多种其它结合试剂组合使用，其中起始细胞群包含内胚层和神经来源的细胞。在某些方面，本发明的其它结合试剂选自DDR1、prominin 1(也称为CD133)和CD49f结合试剂。在某些方面，本发明的其它结合试剂为DDR1结合试剂。

[0162] 在某些方面，本发明涉及分离的细胞，其选自通过本文限定的任一种方法获得的内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞。

[0163] 在某些方面，本发明涉及通过以本文限定方法中任一种方法获得的分离的内分泌前祖细胞。在某些方面，本发明涉及通过以本文限定方法中任一种限定方法获得的分离的内分泌祖细胞。

[0164] 在某些方面，本发明涉及包含通过以本文限定方法中任一种限定的方法获得的分离的细胞的组合物，所述分离的细胞选自以下的一种或多种细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞。在某些方面，本发明涉及包含通过以本文限定方法中任一种限定的方法获得的分离的内分泌前祖细胞的组合物。在某些方面，本发明涉及包含通过以本文限定方法中任一种限定的方法获得的分离的内分泌祖细胞的组合物。

[0165] 细胞分化标记

[0166] 在某些方面，本发明涉及获得细胞培养物的方法，所述细胞培养物包含选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞，所述方法包括：获得按照上述或本文所述的方法纯化的细胞，随后在有利于胰腺细胞分化为选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞的条件下培养所获得的细胞。在某些方面，本发明涉及获得包含内分泌前祖细胞的培养物的方法，所述方法包括：获得按照上述或本文所述的方法纯化的细胞，随后在有利于内分泌前祖细胞分化的条件下培养所获得的细胞。在某些方面，本发明涉及获得包含内分泌祖细胞的培养物的方法，所述方法包括：获得按照上述或本文所述的方法纯化的细胞，随后在有利于内分泌祖细胞分化的条件下培养所获得的细胞。

[0167] 有众多的细胞标记可用于鉴别胰腺细胞群。分离并培养的供体细胞开始表现出分化胰腺细胞的不同表型和基因型标记。所述表型和基因型标记的实例包括在兼性祖细胞(facultative progenitor cell)群中存在的调节性(例如上调或下调)的多种分子标记。这些分子标记包括CK-19或Pdx1/Nkx6.1/Ptf1a三阳性细胞，其被认定为胰腺兼性干细胞(即多能胰腺干细胞)的标记。

[0168] 通常，在哺乳动物干细胞成熟为它们的最终发育终点时，其经过了众多发育阶段。发育阶段经常可以通过鉴定在发育细胞中存在或不存在标记来确定。因为人内分泌细胞以相似的方式发育，所以在它们由干细胞样表型向假胰岛表型过渡时，可以使用多种标记鉴定细胞。

[0169] 在通过本发明的方法诱导增殖或分化的细胞中，标记的表达与正常人胰腺发育中的标记表达顺序具有一定相似性。在发育的很早时期，原始的上皮细胞表达早期细胞标记Pdx1，其是同源结构域核因子。随着细胞发育，它们开始出芽，并形成导管。这些细胞表达上皮导管细胞标记-细胞角蛋白19，并短暂表达在发育上产生内分泌细胞的Ngn3。因为这些细胞持续发育为内分泌细胞，所以它们获得了表达胰岛素、促生长素抑制素、胰高血糖素、生长激素释放激素或胰腺多肽的能力。最终的分化细胞仅能够表达一种，并变成α细胞(胰高血糖素)、β细胞(胰岛素)、δ细胞(促生长素抑制素)、ε细胞(生长激素释放激素)和PP细胞。

[0170] 据信本文使用的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞群可以分为以下的主要类别：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞。

[0171] DNER的胞外表达在胰腺的不同结构区中可能不同，并在胰腺内分泌细胞的发育阶段中改变，参见例如图1中的图示。

[0172] DNER在胰腺内胚层的某些细胞中表达。DNER在多能胰腺祖细胞中不表达。DNER在腺泡谱系中不表达。DNER在外分泌谱系中不表达。DNER在导管谱系中不表达。DNER在内分泌肠谱系中不表达。DNER似乎在处于Ngn3蛋白表达之前的分化阶段的新型细胞类型(即内分泌前祖细胞)中表达。因此，DNER可用于鉴定、富集和/或分离内分泌前祖细胞。DNER可以以高、中或低水平在内分泌祖细胞中表达。因此，DNER可用于鉴定、富集和/或分离内分泌祖细胞。DNER可以以高、中或低水平在早期内分泌细胞中表达。而且，DNER可以在激素阳性内分泌细胞和成熟胰腺内分泌细胞(例如完全分化的内分泌细胞)中表达。因此，DNER还可以用于鉴定、富集和/或分离完全分化的内分泌细胞。因此，DNER可用于鉴定、富集和/或分离选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的胰腺细胞。具体地说，尽管诸如ptprn/IA2、Abcc8/Sur1和Slc30a8/ZnT-8的许多蛋白可用于鉴定、富集和/或分离完全分化的内分泌细胞，但只有DNER可用于鉴定、富集和/或分离内分泌前祖细胞。

[0173] 无论细胞真正是发育路径中的前体实例还是仅仅为体外操作的结果，人们都认为DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞能够最终表达内分泌激素或由胰腺早期内分泌细胞成熟为更成熟的内分泌细胞类型，并因此可用于矫正任何胰岛细胞类型的缺陷。

[0174] 而且，人们认为DDR1阳性细胞群处于低分化发育阶段，但保留了分化为完全分化的内分泌细胞的潜力和增殖能力。无论细胞确实是发育路径中的前体实例还是仅为体外操作的结果，人们都认为DDR1阳性细胞能够增殖以及最终表达内分泌激素或由胰腺早期内分泌细胞成熟为更成熟的内分泌细胞类型，并因此有潜力用于修正任何胰岛细胞类型中的缺陷。

[0175] 目标标记为以时间特异性和组织特异性模式在胰腺中表达的分子(参见Hollingsworth，Ann N YAcad Sci 880：38-49(1999))。这些分子标记分为三大类：转录因子、notch途径标记和中间丝标记。转录因子标记的实例包括Pdx1、NeuroD、Nkx6.1、Isl1、Pax6、Pax4、Ngn3和HES 1。

[0176] notch途径标记的实例包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、Jagged2、Dll1和RBPjk。中间丝标记的实例包括CK19和巢蛋白。胰腺β细胞前体标记的实例包括Pdx1、Pax4、Ngn3和Hb9。完全分化的胰腺β细胞标记的实例包括胰岛素、ptprn/IA2、Abcc8/Sur1和Slc30a8/ZnT-8。

[0177] 胰岛素mRNA表达

[0178] 在某些方面，胰岛素mRNA的水平可用于表征胰腺细胞身份、分化或成熟度。例如，本发明的中间细胞群显示在限定范围内的胰岛素mRNA表达。定量胰岛素mRNA的方法包括RNA印迹、核酸酶保护和引物延伸。

[0179] 在某些方面，RNA由培养细胞群提取，胰岛素原信使的量通过定量逆转录PCR检测。在逆转录之后，使用与胰岛素cDNA序列杂交的引物和扩增产物量与样品中存在的mRNA量相关的扩增条件(参见例如Zhou等人(1997)，J Biol Chem 272：25648-51)，由样品特异性定量扩增胰岛素cDNA。在某些方面，由于可以测定起始mRNA水平的精确度，优选动力学定量方法。

[0180] 胰岛素mRNA的量经常对组成型表达的mRNA标准化，所述组成型表达的mRNA例如为肌动蛋白，其使用肌动蛋白特异性引物由相同的RNA样品特异性扩增。因此，胰岛素mRNA的表达水平可以以胰岛素mRNA扩增产物对肌动蛋白mRNA扩增产物的比率报告，或者仅以胰岛素∶肌动蛋白mRNA比率报告。编码其它胰腺激素(例如促生长素抑制素或胰高血糖素)的mRNA的表达可以通过相同方法定量。胰岛素和肌动蛋白mRNA水平还可以通过原位杂交确定，然后用于确定胰岛素∶肌动蛋白mRNA比率。原位杂交方法是本领域技术人员已知的。

[0181] 扩增方法

[0182] 在某些方面，本发明涉及扩增细胞数量的方法，所述细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括：获得按照上述或本文所述的方法纯化的细胞，随后在有利于所获得细胞类型扩增的条件下培养所获得细胞。在某些方面，本发明涉及扩增内分泌前祖细胞数量的方法，所述方法包括：获得按照上述或本文所述的方法纯化的细胞，随后在有利于内分泌前祖细胞扩增的条件下培养所获得细胞。在某些方面，本发明涉及扩增内分泌祖细胞数量的方法，所述方法包括：获得按照上述或本文所述的方法纯化的细胞，随后在有利于内分泌祖细胞扩增的条件下培养所获得细胞。

[0183] 在某些方面，本发明涉及扩增细胞数量的方法，所述细胞包含选自以下的细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞，所述方法包括：获得按照上述或本文所述的方法纯化并扩增的细胞，随后，在有利于胰腺细胞分化为选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞的条件下，培养所获得细胞。在某些方面，本发明涉及扩增内分泌前祖细胞数量的方法，所述方法包括：获得按照上述或本文所述的方法纯化并扩增的细胞，随后在有利于内分泌前祖细胞分化的条件下培养所获得细胞。在某些方面，本发明涉及扩增内分泌祖细胞数量的方法，所述方法包括：获得按照上述或本文所述的方法纯化并扩增的细胞，随后在有利于内分泌祖细胞分化的条件下培养所获得细胞。

[0184] 扩增来源于胎儿/成人组织的胰腺细胞和干细胞的方案例如但不限于下述方案：Heimberg，H.等人(2000)，Diabetes 49，571-9；Heremans，Y.等人(2002)，J Cell Biol
159，303-12；Miralles，F.等人(1998)，Development 125，1017-24；和Miralles，F.等人(1999)，Dev Dyn 214，116-26。

[0185] 功能测定

[0186] β细胞的重要功能之一是根据葡萄糖水平调节其胰岛素分泌。通常，可以对增殖粘附胰腺细胞进行静止葡萄糖刺激(SGS)测定，以鉴定它们是否能够响应于不同的葡萄糖水平分泌胰岛素。细胞一般在适宜的底物上培养，直至接近汇合。在SGS测试前3天，以特征相似但没有胰岛素并仅含1g/L葡萄糖的培养基更换培养基。3天内每天更换所述培养基，在第4天进行SGS测试。

[0187] 在测试前，可以收集培养基进行葡萄糖和胰岛素分析。为制备用于测试的细胞，用Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)+0.5％BSA洗涤细胞两次，每次洗涤温育5分钟，然后与单独的DPBS温育1次，也温育5分钟。在洗涤后，将细胞与10ml(在100mm碟中)或5ml(在60mm碟中)Krebs-Ringers SGS溶液和60mg/dl葡萄糖(KRB-60)在37℃培养箱中温育30分钟。然后重复该温育过程。

[0188] 为进行SGS测定，将在3ml(100mm碟)或4ml(T75瓶)或2ml(60mm碟)KRB-60中的细胞于37℃温育20分钟。吸出培养基并离心，收集培养基进行胰岛素测定，此称为LG-1(低葡萄糖刺激步骤)。然后按照与上文或本文相同的体积加入KRB-450+theo(KRB和450mg/dl葡萄糖和10mM茶碱)，在与上文或本文相同的条件下培养细胞。收集上清液进行胰岛素测定，此为HG(高葡萄糖刺激)。然后再将细胞与KRB-60温育，并收集培养基，此为LG-2，再一次则为LG-3。收集培养基进行胰岛素分析，并储存于-20℃，直至通过放射免疫测定(RIA)或其它适宜的测定确定胰岛素含量。

[0189] SGS测试的结果经常用刺激指数表示，刺激指数定义为HG胰岛素值除以LG-1胰岛素值。一般来说，约2或以上的刺激指数被认为是SGS测定的阳性结果，尽管可以使用其它值(例如1.5、2.5、3.0、3.5等)限定具体的细胞群。

[0190] 治疗方法

[0191] 在某些方面，本发明涉及向不能产生至少一种胰腺激素的哺乳动物提供胰腺内分泌功能的方法，其中通过上文或本文所述的任一种方法获得细胞，所述方法进一步包含以下步骤：将所获得细胞以足以在哺乳动物中产生可检测量的至少一种胰腺激素的量植入哺乳动物中。

[0192] 本领域技术人员会认识到，DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8选择的细胞或进一步培养和分化的细胞为在哺乳动物中植入和恢复胰腺功能提供了可更新的来源。

[0193] DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性胰腺细胞在植入哺乳动物中之前首先分化。或者，将DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8选择的细胞以祖细胞状态植入，并使其在机体中分化。如果用户需要，可以在植入之前囊化DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8细胞。

[0194] 在植入哺乳动物之前，DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性胰腺细胞的分化可达到选自以下的分化阶段：完全分化的内分泌细胞，包括葡萄糖响应性胰岛素生产β细胞，即等同于分离的胰岛的β细胞。使用所谓的Edmonton方案植入分离的胰岛的实例可见于Shapiro AM(2000)，N Engl J Med.；343(4)：230-8。

[0195] 通过DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8选择的细胞可以祖细胞状态植入，所述祖细胞状态即不成熟的细胞，例如包含选自以下细胞的细胞群：胰腺前祖细胞、胰腺祖细胞和/或早期内分泌细胞，并使其在体内分化。在某些方面，通过DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8选择的细胞可以胰腺前祖细胞的祖细胞状态植入。在某些方面，通过DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8选择的细胞可以胰腺祖细胞状态植入。因此，DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞可直接用于移植。在该情况下，预期体内环境引起DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞分化为治疗性β细胞。不成熟胰腺细胞用于移植的实例描述于Kroon E等人(2008)，Nat Biotechnol26，443-452。

[0196] DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞的囊化导致形成在囊状物中细胞聚集物。囊化可以使胰腺细胞被移植入1型糖尿病宿主中，同时使宿主动物的免疫应答最小。可以选择囊膜的孔隙率，以允许由囊状物分泌生物物质，如胰岛素，同时限制宿主免疫系统接近外源细胞。

[0197] 囊化方法是本领域已知的，公开于以下参考文献：vanSchelfgaarde&de Vos，J.Mol.Med.77：199-205(1999)，Uludag等人Adv.DrugDel Rev.42：29-64(2000)以及美国专利号5,762,959、5,550,178和5,578,314。

[0198] 囊化方法详述于申请PCT/US02/41616；该文献通过引用结合到本文中。

[0199] 可以按照常用于胰岛移植的方法，向哺乳动物进行植入或移植以及随后监测内分泌功能；参见例如Ryan等人，Diabetes 50：710-19(2001)；Peck等人，Ann Med 33：186-92(2001)；Shapiro等人，N Engl JMed 343(4)：230-8(2000)；Carlsson等人，Ups J Med Sci 105(2)：107-23(2000)以及Kuhtreiber，WM，Cell Encapsulation Technology andTherapeutics，Birkhauser，Boston，1999。在某些方面，优选的植入部位包括腹腔、肝脏和肾包膜。

[0200] 本领域技术人员会认识到，就使用含不成熟的胰腺细胞的胰腺细胞进行移植而言，β细胞功能的检测，例如胰腺激素和血糖水平的检测，应当在移植后至少2周，例如至少4周、至少6周或至少8周进行。相反，当使用分化的胰腺细胞进行移植时，β细胞功能，例如胰腺激素和血糖水平检测，应当在移植后马上进行，例如在移植后12小时前、24小时前或36小时前。

[0201] 本领域技术人员能够确定用于预定接受者的完全分化的β细胞或微囊的数目的适宜剂量。所述剂量取决于接受者的胰岛素需求。由限定数目的β细胞或微囊分泌的胰岛素水平可以经免疫学或生物活性量确定。在确定剂量时还可以考虑接受者的体重。如有需要，可以在监测接受者对(任选囊化)细胞的反应的同时，进行1次以上的植入。因此，对植入的反应可以用作(任选囊化)细胞剂量的指引。(Ryan等人(2001)，Diabetes 50：710-19)。

[0202] 接受者中(任选囊化)细胞的功能可以通过监测接受者对葡萄糖的反应来确定。植入(任选囊化)细胞可以导致对血糖水平的控制。另外，胰腺内分泌激素、胰岛素、C-肽、胰高血糖素和促生长素抑制素的水平增加的证据可以指示移植的(任选囊化)细胞的功能。

[0203] 本领域技术人员将认识到，可以不同的方式监测血糖控制。例如，可以直接检测血糖，也可以通过体重和胰岛素需求来检测。还可以进行口服葡萄糖耐受测试。还可以测定肾功能，也可以检测其它代谢参数。(Soon-Shiong，P.等人(1993)，PNAS USA 90：5843-5847；Soon-Shiong，P.等人(1994)，Lancet 343：950-951)。

[0204] 本文使用的术语“生产胰岛素的内分泌胰腺细胞”是指以血糖依赖方式生产胰岛素并分泌胰岛素的细胞。

[0205] 在某些方面，(本发明)由培养源分离包含胰腺细胞的细胞群。然后，分离的细胞例如用于进一步的培养或按照美国专利号5,762,959的微囊化方法微囊化。

[0206] 术语“向需要这样的功能的哺乳动物提供胰腺功能”是指在其自身不能产生胰腺激素的哺乳动物体内生产这些胰腺激素的方法。在某些方面，所述胰腺激素选自胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和生长激素释放激素。在某些方面，胰岛素在糖尿病哺乳动物体内产生。胰腺功能通过将生产胰岛素的胰腺细胞(通过本文公开内容的方法产生)植入或移植入哺乳动物中提供。植入的聚集物的数目是足以在哺乳动物中产生可检测量的胰岛素的量。胰岛素可以通过Elisa测定或放射免疫测定来检测，或通过本领域技术人员已知的其它检测方法来检测，包括胰岛素功能测定，例如血糖水平的保持。

[0207] 胰岛素以等摩尔量与C-肽共分泌。因此，胰岛素分泌活性还可以通过检测血液中的C-肽来检测。在某些方面，提供的胰腺功能足以降低或消除哺乳动物对体外生产的胰岛素的依赖。

[0208] “囊化”是指其中细胞被生物相容性非细胞物质(例如海藻酸钠和聚赖氨酸)环绕的方法。优选地，诸如糖和低分子量蛋白的小分子，可以由囊化周围细胞的环境中吸收或分泌入该环境中。同时，限制较大分子和免疫细胞接近囊化细胞。

[0209] “植入”是细胞移植或放置入接受者中。其包括囊化细胞和非囊化细胞。所述细胞可以通过本领域已知的方法皮下、肌内、门内(intraportally)或腹膜间放置。

[0210] 在某些方面，分离步骤通过荧光活化的细胞拣选进行。在某些方面，分离步骤通过淘选进行。在某些方面，分离步骤通过流化床进行。

[0211] 在某些方面，本发明还涉及选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂鉴定或选择表达DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8蛋白作为细胞表面标记的细胞的用途。在某些方面，本发明涉及选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂与一种或多种其它结合试剂组合，同时或序贯鉴定或选择表达DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8蛋白作为细胞表面标记的细胞的用途，所述其它结合试剂与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂经受相同的分析步骤。在某些方面，其它结合试剂选自DDR1、prominin1(也称为CD133)和CD49f结合试剂。在某些方面，所述其它结合试剂为DDR1结合试剂。

[0212] 本发明还涉及使用DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8蛋白作为细胞表面标记，以获得胰腺内分泌祖细胞或胰腺激素分泌细胞或早期内分泌细胞的培养物。在某些方面，本发明涉及使用DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8蛋白作为细胞表面标记，与一种或多种其它结合试剂同时或序贯组合，获得胰腺内分泌祖细胞或胰腺激素分泌细胞或早期内分泌细胞的培养物。在某些方面，其它结合试剂可以与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂经受相同的分析步骤。在某些方面，所述其它结合试剂选自DDR1、prominin 1(也称为CD133)和CD49f结合试剂。在某些方面，所述其它结合试剂为DDR1结合试剂。在某些方面，所述其它结合试剂选自Ptprn/IA2、Abcc8/Sur1和Slc30a8/ZnT-8结合试剂，其可用于分离早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞。

[0213] 在某些方面，本发明还涉及通过给需要胰腺功能的哺乳动物提供胰腺功能以治疗I型糖尿病的方法。

[0214] 体外方案优化

[0215] 在某些方面，定期监测包含胰腺细胞的体外培养物的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8表达。在某些方面，一种或多种其它标记可以与DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8同时或序贯组合使用。在某些方面，所述其它标记选自DDR1蛋白、prominin1(也称为CD133)和CD49f。在某些方面，所述其它标记为DDR1蛋白。定向变为内分泌细胞但处于表达Ngn3蛋白之前的发育阶段的DNER标记细胞高水平表达。

[0216] 为了有效优化胚胎干细胞的分化，非常重要的是具有鉴定胰腺细胞发育为完全分化的内分泌细胞的各个阶段的标记。DNER和DDR1可以单独或组合用于指示重要且特殊的细胞分化阶段，这些阶段至今还不可能使用其它标记检测。DNER和/或DDR1可以与一种或多种其它标记组合使用。DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和DDR1可以单独或组合用于指示重要且特殊的细胞分化阶段，这些阶段至今还不可能使用其它标记检测。DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11、SLC30A8和/或DDR1可以与一种或多种其它标记组合使用。

[0217] 可以使用上述或本文所述的方法，例如FACS，鉴定、富集和/或分离表达DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8的细胞。

[0218] 在某些方面，顺序分离DDR1+和DNER+细胞，提供了例如由ES细胞衍生的定形内胚层细胞群产生内分泌前祖细胞纯培养物的显著优势。在某些方面，顺序分离DDR1阳性细胞和DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞，提供了例如由ES细胞衍生的定形内胚层细胞群产生内分泌前祖细胞纯培养物的显著优势。由此获得的培养物可以进行进一步的扩增和/或分化为更纯的内分泌细胞群。

[0219] 本文提及的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都整体通过引用结合到本文中，其程度如同每个参考文献单独具体指出通过引用结合到本文中并且在本文中整体记载(达到法律允许的最大程度)。

[0220] 本文使用的所有标题和子标题仅仅为了方便，不应被视为以任何方式限制本发明。

[0221] 本文提供的任何实施例或示例性语言(例如“如”)仅用于更好地阐述本发明，除非另有说明，不对本发明的范围形成限制。本说明书中的语言不应解释为任何非权利要求要素为实施本发明必需的要素。

[0222] 本文仅为了便利而提及和援引专利文件，不反映这样的专利文件的有效性、专利性和/或强制性的任何观点。

[0223] 本发明包括随附权利要求记载的主题的所有修饰方案和等同方案，这是适用法律允许的。实施例

[0224] 本文的实施例中所用抗体的动物来源和浓度示于表1。所有的二抗都按照生产商的说明稀释和使用。

[0225] 表1.抗体的来源和浓度

[0226]

[0227] 1)前缀m或h分别表示是针对小鼠还是人来源的蛋白产生的抗体，即mX表示针对小鼠蛋白X产生的抗体，hX表示针对人蛋白X产生的抗体。

[0228] N.A.)未获得浓度信息

[0229] 实施例1：小鼠和人Dner的生物信息学分析

[0230] 为了发现胞外和跨膜结构域，使小鼠和人Dner通过CBS的跨膜预测器TMHMM服务器v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/)。结果表明，人和小鼠Dner均被预测为单跨膜蛋白(I型)，主要的前638个氨基酸在人和小鼠中均在胞外侧，跨膜结构域预测为氨基酸639-661。在Dner蛋白的第一个部分中由TMHMM预测的跨膜样区域为信号肽，其还在以下涉及SignalP的结果中论述。

[0231] 使用CBS的SignalP 3.0预测服务器(http://www.cbs.dtu.dk/)分析Dner的小鼠和人信号肽。小鼠：信号肽概率：1.000；信号锚概率：0.000；最大切割位点概率：0.494，39位和40位之间。人：信号肽概率：1.000；信号锚概率：0.000；最大切割位点概率：0.379，
34位和35位之间。结果表明，在小鼠和人Dner中观察到的跨膜样结构不是跨膜结构域，而是概率为1的信号肽。

[0232] 为研究小鼠和人Dner之间的氨基酸差异，使用Clustal W(在http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/)比对蛋白的氨基酸序列。结果示于图2。比对同一性为90％。因此，小鼠和人中的Dner的氨基酸序列高度保守。跨膜结构域加下划线：氨基酸639-661。

[0233] 然后使小鼠和人Dner通过CBS的翻译后预测服务器(在http://www.cbs.dtu.dk/)，以获得有关也可以被Dner结合试剂结合的修饰的信息。结果示于图3-6。为研究GlcNAc O-糖基化，使小鼠和人Dner通过DictyOGlyc 1.1服务器(在http://www.cbs.dtu.dk/)。图3表明，预测GlcNAc O-糖基化存在于小鼠和人Dner的胞外侧，并以“G”指示。为研究赖氨酸的ε氨基的糖化，使小鼠和人Dner通过NetGlycate 1.0服务器(在http://www.cbs.dtu.dk/)。图4表明，预测糖化存在于小鼠和人Dner的胞外侧，并以“G”指示。为研究天冬酰胺的N-糖基化，使小鼠和人Dner 通过NetGlycate 1.0服务器(在http://www.cbs.dtu.dk/)。图5表明，预测N-糖基化存在于小鼠和人Dner的胞外侧，并以“N”指示。为研究粘液素型GalNAc O-糖基化，使小鼠和人Dner通过NetOGlyc 3.1服务器(在http://www.cbs.dtu.dk/)。图6表明，预测糖基化存在于小鼠和人Dner的胞外侧，并以“T”指示。下划线，即“_____”，表示被切除的信号肽。

[0234] 这些结果(TMHMM、SignalP和图2-6)表明，Dner非常可能在胞外侧翻译后修饰。因此，小鼠和人形式的Dner均可以被识别这样的修饰的结合试剂结合。

[0235] 可以按照PCT/EP2008/068061的实施例1进行小鼠和人DDR1的生物信息学分析，其结果示于其中。可以按照PCT/EP2008/068061的实施例2进行小鼠DDR1同种型研究，其结果示于其中。

[0236] 实施例2：Dner和Ddr1在胰腺β细胞系中的表达

[0237] 总RNA分离自小鼠内分泌样细胞系：Ins1、βHC、βTCtet(条件：用四环素培养(+tet))、βTCtet(条件：无四环素培养(-tet))、Min6、αTC，以及分离自e15.5NMRI胃肠道(胃、十二指肠、脾和胰腺)组织。细胞系Ins1描述于M Asfari等人，Endocrinology，130卷，167-178。细胞系BetaHC-9描述于Noda M等人，Diabetes，1996年12月；45(12)：
1766-73。细胞系βTC-tet描述于Fleischer N等人，Diabetes，1998年9月；47(9)：
1419-25。细胞系Min6描述于J Miyazaki等人，Endocrinology，1990年7月；127(1)：
126-32。细胞系αTC描述于Powers AC等人，Diabetes，1990年4月；39(4)：406-14。制备使用RNA作为模板随机引发的cDNA。对这些cDNA进行35轮PCR(96℃，180秒，然后(96℃，
30秒，55℃，30秒，72℃，30秒)x35次)。e15.5cDNA用作阳性对照，水H2O用作阴性对照。

[0238] 结果表明，Ddr1在研究的所有细胞系中都表达，Dner在除Ins1之外的所有细胞系中表达。这表明，有可能在细胞培养物中获得Dner和Ddr1表达。预期可以对分化为胰腺细胞的ES细胞获得相似的结果。

[0239] 实施例3：Dner和Ddr1在内分泌样细胞系αTC中的表达，在腔室载玻片中的IHC显现

[0240] αTC在含1000mg/L D-葡萄糖、丙酮酸钠(0.5mM)、P/S(青霉素(10IU/ml)、链霉素(10μg/ml))和10％FCS的DMEM中生长。细胞系αTC描述于Powers AC等人，Diabetes，1990年4月；39(4)：406-14。细胞用Lilliys固定液固定45分钟，然后用PBS洗涤，并于+5℃储存于PBS中，直至使用。通过以乙醇梯度(以70％开始，变为96％，然后变为99％，然后再变为99％，随后变为96％，最后变为70％，每个浓度使用5分钟温育)渗透细胞，随后用0.5％TNB封闭试剂(来自Perkin-Elmer)封闭，进行染色。然后加入山羊抗-Dner(R&D系统，AF2254，1∶150)或小鼠抗-Ddr1(R&D Systems，MAB2396，1∶50)，并于室温(RT)过夜(O/N)温育。第二天，用PBS洗涤细胞，并加入生物素化抗驴或抗小鼠抗体，温育45分钟。在以PBS洗涤细胞后，加入链霉抗生物素蛋白-HRP，并温育15分钟，随后用PBS洗涤。
最后加入酪胺(tyramid)-cy3，以显色染色。

[0241] 结果表明，可以在αTC中检测到异源Dner和Ddr1免疫反应性。在约10％细胞中观测到对Dner强而显著的免疫反应性。还在约10％的细胞中观测到对Ddr1的明确免疫反应性。

[0242] 当ES细胞分化为β细胞时，预期还产生其它细胞类型。然后，Dner和/或Ddr1可用于分离需要的细胞亚型。这在本文的实施例4-7中以异源Dner和Ddr1染色示例。ES细胞通过活化素A分化为内胚层细胞，然后分化为胰腺细胞。一旦已获知胰腺结果，就分离需要的细胞。1)为分离导管/内分泌祖细胞，可以使用Ddr1结合试剂。2)为分离内分泌前祖细胞和内分泌祖细胞，可以单独使用Dner结合试剂或将Dner结合试剂与Ddr1结合试剂组合使用。

[0243] 预期使用Dner作为标记分离的细胞可用于产生内分泌细胞类型，而使用Ddr1作为标记分离的细胞可以产生内分泌细胞和导管细胞类型。因此预期Ddr1+细胞包含具有表达DNER的潜力的细胞亚群。

[0244] 在某些方面，研究Ddr1在小鼠中的表达谱可以按照PCT/EP2008/068061的实施例3进行，其结果示于其中。

[0245] 实施例4：Dner在小鼠e15.5、e18.5和成熟胰腺中的定位，通过荧光染色显现[0246] 收获小鼠e15.5、e18.5胚胎和成熟组织，并用4％多聚甲醛(PFA)的PBS固定过夜(O/N)。组织以30％蔗糖的PBS溶液平衡，并在TissueTech中包埋。切8μm切片，并储存于-80℃。于室温(RT)融化切片，用PBS洗涤，以0.01M柠檬酸盐缓冲液微波，并与1％H2O2的PBS溶液温育30分钟，随后用0.5％TNB封闭试剂(来自Perkin-Elmer)封闭。然后加入山羊抗Dner 1∶75、豚鼠抗胰岛素(Gp抗-Ins)1∶200和小鼠抗胰高血糖素(小鼠抗-Glu001)1∶75，并于室温过夜温育。第二天，细胞用PBS洗涤，并加入生物素化抗驴抗体、抗小鼠-cy5抗体和抗gp-cy2抗体，温育45分钟。在以PBS洗涤细胞后，加入链霉抗生物素蛋白-HRP，并温育15分钟。随后，以PBS洗涤细胞。最后，加入酪胺(tyramid)-cy3，以显色染色。

[0247] 结果表明，Dner在e15.5和e18.5胰腺中强表达。然而，在成熟胰腺中，检测到异源且较弱的Dner。于e15.5，在带有中心Nkx6.1阳性结构区的胰腺分散细胞中，检测到强Dner免疫反应性。Dner在胰腺中的定位明显类似于Ngn3蛋白的定位。Dner信号仅偶尔在胰岛素或胰高血糖素阳性细胞中观察到。于e18.5，仍存在既不共表达胰岛素也不共表达胰高血糖素的Dner群，但共表达Dner的胰岛素和胰高血糖素阳性细胞的量急剧增加。而且，还观察到为Dner阴性的胰岛素和胰高血糖素阳性细胞。有时发现Dner与和导管系统密切结合的胰高血糖素或胰岛素阳性细胞共表达。还在周围的间充质中观察到Dner表达。间充质中的Dner信号可能来自神经支配的神经细胞，因为它们对HuC/D阳性。于e18.5，Dner似乎不如e15.5强。在成熟胰腺中，在胰岛中发现Dner免疫反应性。其与胰岛素和胰高血糖素共定位。在成熟胰腺中，Dner也似乎不如e15.5和e18.5强。然而，某些细胞以高水平表达Dner。总而言之，在定位于胰腺中央结构区的细胞类型中，Dner免疫反应性于小鼠胰腺发育的e15.5天最高表达-并具有高度特征性“Ngn3样”染色模式(现在已知包含作为内分泌前祖细胞和内分泌祖细胞的细胞(Ngn3+细胞)。Dner可以在晚期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞中以较低水平表达。Dner在神经元中表达(均支配胰腺和胰腺间充质)。

[0248] 实施例5：Dner、Pdx1和Huc/HuD在e15.5野生型和Ngn3无效突变小鼠胰腺中的定位，以荧光染色显现

[0249] 为检验在Ngn3蛋白表达之前是否会出现Dner表达，将野生型和Ngn3无效突变e15.5小鼠胰腺对Dner、Pdx1和神经标记HuC/HuD进行染色。数据清楚表明，Dner在缺乏ngn3表达的小鼠中表达。因此，Dner为在Ngn3之前表达的标记。

[0250] 参见本文的实施例4的方法描述。具体地说，小鼠抗HuC/HuD(Molecular Probes，A-21271)以1∶150使用，并用驴抗小鼠-cy2显色。兔抗Pdx1(Hm-253)以1∶600使用，并用驴抗兔cy5显色。

[0251] 结果表明，到目前为止，在e15.5野生型胰腺中，Dner阳性细胞共表达Pdx1，但不高共表达Pdx1 。某些Dner免疫反应性在胰腺中不与Pdx1共定位，与神经标记HuC/HuD共定位。Dner和HuC/HuD的共定位是支配胰腺的神经。HuC/HuD染色强。还在胰腺中观察到强Dner染色。一些Dner阳性细胞既不共表达Pdx1，也不共表达HuC/HuD。在e15.5Ngn3无效突变胰腺中，在长串细胞中观察到许多Dner免疫反应性(箭头)。这样的Dner阳性细胞为HuC/HuD和Pdx1阴性。发现仅非常少的Dner阳性细胞共表达Pdx1。确实共表达Pdx1的Dner阳性细胞似乎与Pdx1阳性内胚层脱层。并且在C’-C””中观察到的Dner+/Pdx1细胞串可能代表这样的脱层细胞(箭头)。这应当意味着一旦细胞开启Dner，就需要Ngn3来保持Pdx1。

[0252] 实施例6：Dner、Pax6、Pdx1、Ngn3和Ptf1a在小鼠e15.5胰腺中的定位，以荧光染色显现

[0253] 关于切片制备，参见本文的实施例4。山羊抗Dner在切片上以1∶75使用(用TSA-cy3显色)，在整装切片中以1∶250使用(用驴抗山羊-cy2显色)。兔抗Pax6(Covance，PRB-278P)在切片上以1∶200使用(用驴抗兔cy5显色)，在整装切片中以1∶2000使用(用TSA-cy3显色)。兔抗Pdx1(Hm-253)在切片上以1∶500使用(用驴抗兔cy5显色)。豚鼠抗Pdx1在整装切片中以1∶1000使用(Abcam，ab47308-100，用驴抗兔cy5显色)。小鼠抗Ngn3(AbCore，F25A1B3)在切片上以1∶100使用(用驴抗兔cy2显色)。兔抗Ngn3(AbCore，2369B)在整装切片中以1∶16000使用(用TSA-cy3显色)。兔抗Ptf1a在整装切片中以1∶5000使用(用驴抗兔cy5显色)。关于整装切片方法，参见 J等人，JHistochem Cytochem.2007年9月；55(9)：925-30。

[0254] 整装结果表明，Dner定位于中央内分泌Pax6结构域。然而，在切片上观察到Dner阳性细胞对Pax6主要为阴性，但非常接近于Pax6表达细胞表达。某些Dner阳性细胞的确高共表达Pax6。由进一步的整装研究显而易见，Dner定位在其中定位表达Pdx1 的细胞的高
胰腺的中央结构区中。在切片上观察到Dner对Pdx1 细胞核主要为阴性，但接近所有的表达Pdx1的Dner表达细胞。用Ngn3的整装Dner染色表明，Dner定位于胰腺的中央结构区中，其中的其它细胞类型包含表达Ngn3的内分泌祖细胞。在切片上观察到某些Dner阳性细胞共表达Ngn3，而其它Dner阳性细胞对Ngn3为阴性。最后观察到Dner不与在该阶段标记腺泡细胞的Ptf1a共表达。由这些结果可见，Dner于e15.5在胰腺内胚层中表达(Dner与Pdx1共定位)，Dner主要在胰腺内胚层中表达。Dner与Ngn3共表达，而且在Ngn3之前在细胞中开启(要注意的是，大部分Dner阳性细胞不与Pax6共定位，Pdx1阳性Dner细胞存在于Ngn3无效突变胰腺中(本文的实施例5)。因此，Dner似乎在处于Ngn3之前的发育期的新的细胞类型(即内分泌前祖细胞)中表达。还观察到Dner不是腺泡谱系的组成部分，因为Dner不与Ptf1a共定位。因此，Dner可用于纯化内分泌前祖细胞。而且，Dner还在某些内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和许多完全分化的内分泌细胞中表达(本文的实施例4)，并因此也可以用于纯化这样的细胞。

[0255] 实施例7：通过荧光染色显现Dner和Ddr1在e15.5小鼠中的定位

[0256] 进行荧光染色，以确定Dner和Ddr1在e15.5小鼠胰腺和其它内胚层细胞类型中的定位。参见本文的实施例4关于方法的描述。山羊抗Ddr1(R&D systems，AF2396)以1∶150使用，山羊抗Dner以1∶75使用，二者均用TSA-cy3显色。

[0257] 进行试验来确定Dner和Ddr1在e15.5小鼠胚胎中的定位，其通过荧光染色在邻近切片上显现。结果表明，Ddr1在胰腺的中央结构区中广泛地高度表达(类似Nkx6.1)，其中的其它细胞类型包含处于该时间点但不在邻近的内胚层-十二指肠或后胃中的内分泌祖细胞。Ddr1更远离胰腺在前胃、食道和肺的某些部分中表达。在神经管中，于中央部分观察到某些表达。Ddr1一般不在神经组织中表达，神经管的中央部分中的某些表达除外。Dner还在胰腺的内胚层中表达。但除此之外，其不在内胚层中表达，如在前胃和后胃、十二指肠、食道和肺中所观察到的。但是Dner在神经管的非中央部分强表达。而且，Dner在机体的神经元中广泛表达。观察到Dner在胃、十二指肠和食道周围的神经元中。在神经管中，Ddr1和Dner似乎以互补模式表达。通过比较内胚层中的Ddr1和Dner表达，显然Dner仅在胰腺中表达，而Ddr1更广泛地表达。在胰腺中，Ddr1也比Dner更广泛地表达，因为Dner仅在一部分Ddr1阳性细胞中表达。结果还表明，在除动眼核和滑车神经核中的头盖运动神经元以外的所有分化神经元中表达的Phox2b与Dner共表达。

[0258] 结果进一步表明，Dner和Ddr1双阳性细胞以及Dner或Ddr1双阳性细胞均存在于e15.5胰腺中，以荧光染色显现。

[0259] 结果进一步表明，Dner或Ddr1阳性细胞在e15.5胰腺中不共表达生长激素释放激素，以荧光染色显现。

[0260] 结果进一步表明，约90％的Ngn3阳性细胞在e15.5胰腺中共表达Ddr1，以荧光染色显现。

[0261] 结果进一步表明，在e15.5胰腺中没有Dner阳性细胞增殖，约5-10％的Ddr1阳性细胞增殖，因为它们为细胞增殖标记Ki-67阳性，以荧光染色显现。

[0262] 结果进一步表明，在e15.5小鼠中，Dner在少数细胞中表达，Ddr1在接近导管与十二指肠接合处的主胰腺管的几乎所有的细胞中表达。值得注意的是，Dner和Ddr1均仅在胰腺中表达，观察到Dner阳性细胞或Ddr1阳性细胞在主胰腺管中以及Dner阴性细胞和Ddr1阴性细胞在十二指肠中的明显边界，以荧光染色显现。

[0263] 在分化主要变成内胚层和某些胰腺细胞的ES培养物中，观察到Dner结合试剂特异性结合胰腺的内分泌前祖细胞，而且普遍地结合神经细胞。Ddr1结合试剂也结合内分泌前祖细胞，但胰腺中的导管/内分泌祖细胞除外。然而，与Dner结合试剂相反，Ddr1结合试剂不结合神经细胞，而是与胰腺细胞之外的其它内胚层细胞反应。因此，通过首先使用Ddr1结合试剂，导管/内分泌内胚层细胞将与某些其它内胚层一起被纯化，但是到那时同时或序贯使用Dner结合试剂，仅内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞和早期内分泌细胞被纯化，而完全分化的内分泌细胞未被纯化。然而，因为Dner免疫反应性于e15.5似乎比于e18.5和成熟胰岛中更强，这可以用于选择性纯化内分泌前祖细胞和内分泌祖细胞，所获得细胞群具有低比率的其它细胞类型，例如内胚层和神经细胞类型。

[0264] 在某些方面，可以按照PCT/EP2008/068061的实施例4进行通过荧光染色显现的Ddr1在e15.5小鼠胰腺中的定位，其结果示于其中。

[0265] 实施例8：通过荧光染色显现DNER、胰岛素和胰高血糖素在WG21人胰腺中的定位[0266] 进行荧光染色，以确定Dner、胰岛素和胰高血糖素在人WG21胰腺中的定位。首先去除切片的石蜡。山羊抗Dner(R&D Systems，0.2mg/ml)以1∶75(即2.7μg/ml)使用，并用TSA-cy3显色。用豚鼠抗人胰岛素1∶100(Abcam，全血清)检测胰岛素，用兔抗人胰高血糖素1∶100(DAKO，全血清)检测胰高血糖素。染色用驴抗豚鼠Cy2和驴抗兔Cy5显现。参见本文实施例4的方法描述。

[0267] 结果表明，DNER表达存在于人胰腺中。某些细胞对DNER为强阳性，某些细胞为弱阳性。发现DNER强阳性细胞一般不共表达胰岛素或胰高血糖素。然而，某些DNER弱阳性细胞对胰岛素或胰高血糖素为阳性。

[0268] 实施例9：使用Dner分拣αTC细胞

[0269] 通过分析型FACS分拣使用已用Lillys固定液固定45分钟的细胞进行αTC的Dner分拣。为除去上清液，用2ml管于室温以1400rpm、10分钟沉淀细胞。在此之后，用含0.1％BSA的PBS洗涤细胞，通过加入血清，以达到其中产生二抗的动物的血清为10％(终浓度)来封闭细胞，封闭为1小时。然后沉淀细胞，并除去上清液。加入一抗溶液，并于室温过夜温育。第二天，细胞以2ml管(使用1.8ml)洗涤3x5分钟。加入二抗，并于室温温育1小时。细胞用含0.1％BSA的PBS(使用1.8ml)洗涤3x5分钟。最后，通过FACS测定细胞。具体地说，山羊抗Dner以1∶150使用，并用驴抗山羊cy2(1∶300)显色。

[0270] 结果示于图7：采用Dner抗体的αTC的FACS。结果表明，对与山羊抗Dner一抗和驴抗山羊Cy2二抗均没有温育的αTC进行FACS，产生的细胞群具有非常弱的Cy2荧光(即背景)。加入驴抗山羊Cy2二抗导致荧光显著增强一这归因于所述二抗与细胞的非特异性结合(即背景)。加入原初山羊IgG同种型对照产生与单独的二抗(即背景)几乎相同的荧光。然而，加入山羊抗Dner导致荧光显著增强，表明Dner蛋白可以在FACS中用作标记。

[0271] ES细胞培养物分化，主要变为含胰腺细胞的内胚层，某些神经细胞可以和α细胞相同的方式通过FACS纯化。通过使用标记Dner拣选，有可能将内分泌前祖细胞群与某些神经细胞一起纯化。通过使用标记Ddr1拣选，导管/内分泌祖细胞、内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞和/或早期内分泌细胞将与其它内胚层细胞一起被纯化(还包含Dner内分泌前祖细胞)。然而，使用标记Ddr1和Dner组合进行双重拣选，应产生纯内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞和/或早期内分泌细胞的群。如果起始群仅由无神经细胞的胰腺来源的内胚层组成，则可能不需要双重拣选。

[0272] 在某些方面，可以按照PCT/EP2008/068061的实施例5，使用Ddr1经FACS拣选细胞，如βTC3细胞，其结果示于其中。

[0273] 实施例10：通过FACS分拣e15.5小鼠胰腺的Dner阳性细胞

[0274] 实验目标是研究是否可以针对Dner分拣原初细胞。

[0275] 通过在冰冷的PBS中进行微解剖分离NMRI e15.5胚胎的胰腺。通过与蕲蛇酶于30℃温育约1小时或直至获得单细胞，由组织制备单细胞，这取决于例如组织的量。通过加入5ml冰冷的DMEM/F12+P/S并以1200rpm于4度离心沉淀细胞，并重悬浮在3mlDMEM/F12+P/S+10％FCS中，以10ml v型管洗涤细胞2次。然后于37℃再温育细胞2.5小时，沉淀，并重悬浮在冰冷的PBS+0.1％BSA中。加入一抗溶液(大鼠抗mDner，IgG1型，10μg/ml或同种型，10μg/ml)，并在冰上温育45分钟。以v型管用5ml PBS+0.1％BSA洗涤细胞3次。加入二抗(驴抗大鼠-cy2，Jackson ImmunoResearch，母液浓度1.5mg/ml，以1∶300使用，即5μg/ml)，并在冰上温育30分钟。以v型管用5ml PBS+0.1％BSA洗涤细胞3次。
最后，通过FACS测定细胞。

[0276] 结果示于图8，表明了使用10μg/ml的Dner抗体(A)和10μg/ml的IgG1同种型对照(B)的结果。结果表明，与同种型抗体相比，采用特异性抗体，e15.5细胞群的荧光明显变得更强。

[0277] 在某些方面，可以按照PCT/EP2008/068061的实施例6，经由FACS使用Ddr1拣选小鼠胚胎胰腺细胞，其结果示于其中。

[0278] 实施例11：表征通过FACS分拣的e15.5小鼠胰腺的Dner阳性细胞

[0279] 实验目标是确定得自胚胎胰腺的Dner阳性细胞产生什么细胞类型，并测试这样的细胞的电位。

[0280] 如本文的实施例10一样，由胚胎胰腺分拣为Dner阳性和阴性的细胞。如Kroon，E.等人(2008)，Nat Biotechnol 26，443-452所述，将两个细胞群植入肾囊下。按照本文的实施例4和6处理移植物，并通过IHC染色。在体内成熟后，体外回收移植的细胞，并进行功能性测试，例如测试葡萄糖调节的胰岛素分泌。预期Dner阳性细胞群植入物将包含表达胰岛素/胰高血糖素的细胞，Dner阴性细胞植入物将包含外分泌细胞，并因此对淀粉酶和DBA染色阳性。因此，Dner阳性细胞也能够使血糖水平正常化。

[0281] 在某些方面，可以按照PCT/EP2008/068061的实施例7或8，对在经由Ddr1使用FACS分离的胎儿胰腺源细胞或ES衍生细胞中的胰岛素生产进行检测。

[0282] 实施例12：Ddr1和Dner在分化为胰腺结果的人ES细胞中的表达

[0283] 为了确定DDR1和DNER在分化为胰腺结果的hES细胞中的表达，可以按照本文实施例4所述的方法固定并染色这样的细胞。

[0284] 实施例13：由hES细胞分化的胰腺内分泌细胞的纯化

[0285] 实验目标是纯化β细胞和其它内分泌细胞以及3种内分泌定向前体。

[0286] 可以按照Kroon，E.等人(2008)，Nat Biotechnol 26，443-452所述的方案分离和分化胚胎干细胞，直至达到第4期。为纯化导管内分泌祖细胞、内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞或早期内分泌细胞的亚群，将ES来源的细胞制成单个细胞，并如本文的实施例6所述(具有以下修改：使用小鼠抗Ddr1(R&D Systems，MAB2396)和小鼠抗Dner(R&DSystems，MAB3646)抗体)对单独或组合的Dner和Ddr1染色。在二抗和洗涤后，细胞未被固定，而是用FACSArian将活体拣选入含DMEM/F 12+10％FCS+P/S的两个管中。将阳性细胞分拣到第一个管中。阴性细胞被拣选到另一个管中。此后，如Kroon，E.等人(2008)，NatBiotechnol26，443-452所述，将细胞植入肾囊下、测试并表征。预期来自阳性群的植入物包含表达胰岛素/胰高血糖素的细胞，而采用阴性细胞的植入物包含淀粉酶阳性细胞。

[0287] 实施例14：Lrp11、Disp2和Sez6l2的定位

[0288] 以冷冻切片对来自成熟小鼠胰腺的Lrp11、Disp2和Sez6l2进行原位杂交(ISH)。在内分泌胰岛中观察到特异性的ISH信号。另外，于e18.5和e15.5，ISH信号定位于内分泌区室。这通过使用识别Lrp11、Disp2或Sez6l2的抗体证实。成熟胰腺中的IHC表明，Lrp11、Disp2和Sez6l2全部与产生激素的细胞共定位在内分泌胰岛中。在胚胎胰腺中，某些对Lrp11、Disp2或Sez6l2阳性的细胞的确共表达激素，而另一些不共表达激素。但是，Lrp11、Disp2或Sez6l2IHC信号在所有时间均存在于胚胎胰腺的中央内分泌结构区中。

[0289] 实施例15：通过FACS分拣Disp2或Sez6l2阳性细胞

[0290] 实验表明，小鼠的成熟胰岛可以通过使用针对Disp2的单克隆抗体进行FACS分拣。对Sez6l2特异性的兔血清已用于FACS分拣βTC细胞。

[0291] 实施例16：通过定量DNER、DDR1和/或Ngn3的表达优化干细胞分化的体外方案[0292] 为了有效优化ES分化，非常重要的是具有鉴定胰腺细胞发育为完全分化的内分泌细胞的各个阶段的标记(参见图1)。Dner、Ddr1和Ngn3可以组合用于查明细胞分化重要的特殊阶段，这些阶段直至现在还不能使用其它标记检测。Dner、Ddr1和Ngn3可以与一种或多种其它标记组合使用。

[0293] 可以通过使细胞群与Dner结合试剂、Ddr1结合试剂和/或用于另一种内胚层标记的结合试剂(例如Pdx1或E-粘附素结合试剂)接触，并评价染色，实现内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的鉴定。结合试剂的选择可能取决于在细胞培养物中是否存在神经细胞，因为Ddr1将标记内胚层，而不标记神经支配胰腺的神经细胞。然而，高表达水平的Dner标记细胞(其为内分泌前祖细胞或内分泌祖细胞)定向变为内分泌细胞。通过对Ngn3和Ddr1共染色，为三阳性的细胞可被分类为内分泌祖细胞组和具有高水平Dner免疫反应性的细胞，且没有Ngn3，但具有属于内分泌前祖细胞的Ddr1免疫反应性。该分析可以使用诸如FACS、IHC或淘选的方法进行。

[0294] 在某些方面，优化干细胞分化的体外方案的方法是筛选优化培养条件。

[0295] 在某些方面，优化干细胞分化的体外方案的方法包含以下步骤：

[0296] a)通过1)使细胞群与DNER结合试剂接触，和2)测定具有DNER作为细胞表面标记的细胞(DNER阳性细胞)的量，定量DNER阳性细胞；

[0297] b)任选将DNER阳性细胞级分中结合DNER结合试剂的细胞与不结合DNER结合试剂的细胞分离；

[0298] c)任选通过在促进所获得细胞类型扩增的条件下培养包含DNER阳性细胞的细胞群，扩增选自导管/内分泌祖细胞、内分泌祖细胞和早期内分泌细胞的胰腺细胞的数量；

[0299] d)在促进包含DNER阳性细胞的细胞群分化为选自导管/内分泌祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化的内分泌细胞的胰腺细胞的条件下，培养所述细胞群；

[0300] e)任选通过在促进所获得细胞类型扩增的条件下培养包含DNER阳性细胞的细胞群，从而扩增选自导管/内分泌祖细胞、内分泌祖细胞和早期内分泌细胞的胰腺细胞的数量；

[0301] f)如下定量DNER阳性细胞：1)使细胞群与DNER结合试剂接触，和2)测定具有DNER作为细胞表面标记的细胞(DNER阳性细胞)的量；

[0302] g)测定步骤f)的DNER阳性细胞量是否大于步骤a)的DNER阳性细胞量；

[0303] h)任选将DNER阳性细胞级分中结合DNER结合试剂的细胞与不结合DNER结合试剂的细胞分离；

[0304] i)任选通过改变影响分化的条件，例如1)分化因子的浓度或组合，2)生长培养基的浓度或组成，3)生长培养基的添加物的浓度或组成，4)温育时间，和/或5)氧张力，引入培养条件调节，以便增加DNER阳性细胞的量；

[0305] j)任选将DNER阳性细胞级分中结合DNER结合试剂的细胞与不结合DNER结合试剂的细胞分离；

[0306] k)重复步骤a)至h)的顺序，直至获得令人满意的DNER阳性细胞量。

[0307] 在某些方面，优化干细胞分化的体外方案的方法包括顺序使用DDR1结合试剂和DNER结合试剂。在某些方面，在使用DNER结合试剂之前使用DDR1结合试剂。以上由步骤a)-k)限定的使用DNER结合试剂的方法可以组合使用DDR1结合试剂，例如在步骤a)之前和/或步骤d)之前使用以下步骤α)-γ)：

[0308] α)如下定量DDR1阳性细胞：1)使细胞群与DDR1结合试剂接触，和2)测定具有DDR1作为细胞表面标记的细胞(DDR1阳性细胞)的量；

[0309] β)任选将DDR1阳性细胞级分中结合DDR1结合试剂的细胞与不结合DDR1结合试剂的细胞分离；

[0310] γ)任选通过在有利于所获得细胞类型扩增的条件下培养包含DDR1阳性细胞的细胞群，从而扩增选自导管/内分泌祖细胞、内分泌祖细胞和早期内分泌细胞的胰腺细胞的数量；

[0311] 在某些方面，优化干细胞分化的体外方案的方法包括顺序使用DDR1结合试剂、DNER结合试剂以及LRP11和/或DISP2和/或SEZ6L2和/或SLC30A8结合试剂，其中DNER结合试剂的使用可以如以上步骤a)-k)限定，DDR1结合试剂的使用可以如以上步骤α)-γ)限定，并在步骤a)之前和/或步骤d)之前以及步骤γ)或c)之后使用：

[0312] i)如下定量LRP11、DISP2、SEZ6L2和/或SLC30A8阳性细胞：1)使细胞群与LRP11、DISP2、SEZ6L2和/或SLC30A8结合试剂接触，和2)测定具有LRP11、DISP2、SEZ6L2和/或SLC30A8作为细胞表面标记的细胞(LRP11、DISP2、SEZ6L2和/或SLC30A8阳性细胞)的量；

[0313] ii)任选将LRP11、DISP2、SEZ6L2和/或SLC30A8阳性细胞级分中结合LRP11、DISP2、SEZ6L2和/或SLC30A8结合试剂的细胞与不结合LRP11、DISP2、SEZ6L2和/或SLC30A8结合试剂的细胞分离。

[0314] 在某些方面，优化干细胞分化的体外方案的方法包括顺序使用DDR1结合试剂以及LRP11和/或DISP2和/或SEZ6L2和/或SLC30A8结合试剂，其中DDR1结合试剂的使用可以如以上步骤α)-γ)限定，而LRP11、DISP2、SEZ6L2和/或SLC30A8结合试剂的使用如步骤γ)之后的步骤i)和ii)限定。

[0315] 在某些方面，可以使用自动化染色系统(例如采用荧光检测)进行DNER和/或DDR1阳性细胞量的测定。

[0316] 可以如下实现内分泌祖细胞和/或早期内分泌细胞的鉴定：使细胞群与DDR1结合试剂以及任选的另一种内分泌标记的其它结合试剂(例如Pdx1结合试剂)接触，然后评价染色情况。结合试剂的选择可取决于细胞培养物的组成，例如在细胞培养物中是否存在神经细胞，因为DDR1将标记内胚层，而不标记神经支配胰腺的神经细胞。通过对Ngn3和DDR1共染色，为双阳性的细胞可被分组为内分泌祖细胞组。该分析可以使用诸如FACS、MACS、IHC或淘选的方法进行。

[0317] 在某些方面，通过定量DDR1以优化干细胞分化的体外方案可以按照PCT/EP2008/068061的实施例9进行。

[0318] 本文所述的本发明得到NIH/NIDDK的支持(#5U01-DK072473)由Vanderbilt大学完成。

[0319] 本发明的实施方案

[0320] 1.一种鉴定内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的方法，所述方法包括使包含胰腺细胞的细胞群与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的一种或多种结合试剂接触。

[0321] 2.一种鉴定内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的方法，所述方法包括使包含胰腺细胞的细胞群与DNER结合试剂接触。

[0322] 3.一种获得细胞培养物的方法，所述细胞培养物包含选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞，所述方法包括：使包含胰腺细胞的细胞群与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的一种或多种结合试剂接触，并将DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞级分中结合DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8结合试剂的细胞，与不结合DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8结合试剂的细胞分离。

[0323] 4.一种获得细胞培养物的方法，所述细胞培养物包含选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞，所述方法包括：使包含胰腺细胞的细胞群与DNER结合试剂接触，并将DNER阳性细胞级分中结合DNER结合试剂的细胞与不结合DNER结合试剂的细胞分离。

[0324] 5.一种获得细胞培养物的方法，所述细胞培养物包含选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞，所述方法包括：获得按照实施方案3或4的方法纯化的细胞，随后在有利于胰腺细胞分化为选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞的条件下，培养所获得细胞。

[0325] 6.一种获得细胞培养物的方法，所述细胞培养物包含选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的细胞，所述方法包括：获得按照实施方案3或4的方法纯化的细胞，随后在有利于细胞分化为胰腺细胞的条件下培养所获得细胞，所述胰腺细胞包含选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化内分泌细胞的细胞。

[0326] 7.一种扩增细胞数的方法，所述细胞包含选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞，所述方法包括：获得按照实施方案3或4纯化的细胞，随后在有利于所获得细胞类型扩增的条件下培养所获得细胞。

[0327] 8.一种扩增细胞数的方法，所述细胞包含选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞，所述方法包括：获得按照实施方案7纯化并扩增的细胞，随后在有利于胰腺细胞分化为选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞的条件下培养所获得细胞。

[0328] 9.一种扩增细胞数的方法，所述细胞包含选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的细胞，所述方法包括：获得按照实施方案7纯化并扩增的细胞，随后在有利于细胞分化为选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和/或完全分化的内分泌细胞的胰腺细胞的条件下培养所获得细胞。

[0329] 10.一种为不能生产至少一种胰腺激素的哺乳动物提供胰腺内分泌功能的方法，其中细胞通过实施方案1-9中任一方法获得，所述方法进一步包括以下步骤：将所获得细胞以足以在哺乳动物中产生可检测量的至少一种胰腺激素的量植入哺乳动物中。

[0330] 11.实施方案10的方法，其中，检测胰腺激素的量不早于移植后的第1天，或者，在体内成熟后检测，例如在移植后至少1、2、3或4周。

[0331] 12.实施方案10或11的方法，其中所述至少一种胰腺激素为胰岛素。

[0332] 13.实施方案10-12中任一种的方法，其中所述哺乳动物为人类。

[0333] 14.任一项前述实施方案的方法，其中所述至少一种胰腺激素选自胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和生长激素释放激素。

[0334] 15.一种如下定量包含胰腺细胞的DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞的方法：a)使所述细胞与选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的一种或多种结合试剂接触；和b)测定具有DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8细胞表面标记的细胞(DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞)的量。

[0335] 16.一种如下定量包含胰腺细胞的DNER阳性细胞的方法：a)使所述细胞与DNER结合试剂接触；和b)测定具有DNER细胞表面标记的细胞(DNER阳性细胞)的量。

[0336] 17.一种优化体外方案的方法，其中定期监测表达DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8的细胞(DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞)的数量。

[0337] 18.一种优化体外方案的方法，其中定期监测表达DNER的细胞(DNER阳性细胞)的数量。

[0338] 19.任一项前述实施方案的方法，其中一种或多种其它结合试剂与一种或多种选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和SLC30A8结合试剂的结合试剂同时或序贯组合使用。

[0339] 20.任一项前述实施方案的方法，其中一种或多种其它结合试剂与DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8结合试剂同时或序贯组合使用。

[0340] 21.任一项前述实施方案的方法，其中一种或多种其它结合试剂与DNER结合试剂同时或序贯组合使用。

[0341] 22.实施方案20或21的方法，其中其它结合试剂选自DDR1、prominin 1(也称为CD133)和CD49f结合试剂。

[0342] 23.实施方案20或21的方法，其中其它结合试剂为DDR1结合试剂。

[0343] 24.任一项前述实施方案的方法，其中DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8阳性细胞进一步分化为产胰岛素细胞，任选地还进一步分化为选自以下的细胞：胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和/或生长激素释放激素生产细胞。

[0344] 25.任一项前述实施方案的方法，其中DNER阳性细胞进一步分化为产胰岛素细胞，任选地还进一步分化为选自以下的细胞：胰高血糖素、促生长素抑制素、胰腺多肽和/或生长激素释放激素生产细胞。

[0345] 26.实施方案1-25中任一种的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群得自胰腺。

[0346] 27.实施方案1-25中任一种的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群得自体细胞群。

[0347] 28.实施方案27的方法，其中所述体细胞群已被诱导去分化为多能细胞，例如ES样细胞。

[0348] 29.实施方案1-25中任一种的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群得自多能细胞，例如ES细胞。

[0349] 30.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为脊椎动物来源的细胞群。

[0350] 31.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为哺乳动物来源的细胞群。

[0351] 32.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为人类来源的细胞群。

[0352] 33.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为小鼠来源的细胞群。

[0353] 34.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为大鼠来源的细胞群。

[0354] 35.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为鸡来源的细胞群。

[0355] 36.实施方案30-35中任一项的方法，其中所述细胞群分化为胰腺内分泌细胞谱系。

[0356] 37.实施方案36的方法，其中细胞分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。

[0357] 38.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为β细胞阳性分离部分。

[0358] 39.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为ptprn/IA2阳性细胞。

[0359] 40.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为Abcc8/Sur1阳性细胞。

[0360] 41.任一项前述实施方案的方法，其中包含胰腺细胞的细胞群为Slc30a8/ZnT-8阳性细胞。

[0361] 42.任一项前述实施方案的方法，其中通过以上或本文的任一种实施方案的方法获得的胰腺内分泌细胞培养物进一步分离为β细胞阳性细胞分离部分。

[0362] 43.任一项前述实施方案的方法，其中通过以上或本文的任一种实施方案的方法获得的胰腺内分泌细胞培养物进一步分离为ptprn/IA2阳性细胞。

[0363] 44.任一项前述实施方案的方法，其中通过以上或本文的任一种实施方案的方法获得的胰腺内分泌细胞培养物进一步分离为Abcc8/Sur1阳性细胞。

[0364] 45.任一项前述实施方案的方法，其中通过以上或本文的任一种实施方案的方法获得的胰腺内分泌细胞培养物进一步分离为Slc30a8/ZnT-8阳性细胞。

[0365] 46.任一项前述实施方案的方法，其中DNER结合试剂为特异性结合DNER蛋白的抗体。

[0366] 47.任一项前述实施方案的方法，其中Disp2结合试剂为特异性结合Disp2蛋白的抗体。

[0367] 48.任一项前述实施方案的方法，其中Sez6l2结合试剂为特异性结合Sez6l2蛋白的抗体。

[0368] 49.任一项前述实施方案的方法，其中Lrp11结合试剂为特异性结合Lrp11蛋白的抗体。

[0369] 50.任一项前述实施方案的方法，其中Slc30a8结合试剂为特异性结合Slc30a8蛋白的抗体。

[0370] 51.任一项前述实施方案的方法，其中DDR1结合试剂为特异性结合DDR1蛋白的抗体。

[0371] 52.任一项前述实施方案的方法，其中分离或监测步骤通过荧光活化的细胞分选进行。

[0372] 53.任一项前述实施方案的方法，其中分离或监测步骤通过磁力活化的细胞分选进行。

[0373] 54.任一项前述实施方案的方法，其中分离步骤通过淘选进行。

[0374] 55.任一项前述实施方案的方法，其中所述细胞为内分泌前祖细胞。

[0375] 56.任一项前述实施方案的方法，其中使用Disp2结合试剂代替DNER结合试剂。

[0376] 57.任一项前述实施方案的方法，其中使用Sez6l2结合试剂代替DNER结合试剂。

[0377] 58.任一项前述实施方案的方法，其中使用Lrp11结合试剂代替DNER结合试剂。

[0378] 59.任一项前述实施方案的方法，其中使用Slc30a8结合试剂代替DNER结合试剂。

[0379] 60.任一项前述实施方案的方法，其中Disp2结合试剂与DDR1结合试剂组合使用代替DNER结合试剂。

[0380] 61.任一项前述实施方案的方法，其中Sez6l2结合试剂与DDR1结合试剂组合使用代替DNER结合试剂。

[0381] 62.任一项前述实施方案的方法，其中Lrp11结合试剂与DDR1结合试剂组合使用代替DNER结合试剂。

[0382] 63.任一项前述实施方案的方法，其中Slc30a8结合试剂与DDR1结合试剂组合使用代替DNER结合试剂。

[0383] 64.一种通过实施方案1-63中任一项限定的方法获得的分离细胞，所述分离细胞选自内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化内分泌细胞。

[0384] 65.实施方案64的分离细胞，其中所述分离细胞为内分泌前祖细胞。

[0385] 66.实施方案64的分离细胞，其中所述分离细胞为完全分化的内分泌细胞。

[0386] 67.一种包含通过实施方案1-63中任一项限定的方法获得的分离细胞的组合物，所述分离细胞选自以下的一种或多种细胞：内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞和完全分化内分泌细胞。

[0387] 68.选自DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP 11和/或SLC30A8结合试剂的结合试剂用于鉴定或选择表达DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8蛋白作为细胞表面标记的细胞的用途。

[0388] 69.DNER结合试剂用于鉴定或选择表达DNER蛋白作为细胞表面标记的细胞的用途。

[0389] 70.DNER、DISP2、SEZ6L2、LRP11和/或SLC30A8蛋白作为细胞表面标记用于获得胰腺内分泌培养物的用途。

[0390] 71.DNER蛋白作为细胞表面标记用于获得胰腺内分泌细胞培养物的用途。

[0391] 72.实施方案70或71的用途，其中一种或多种其它细胞表面标记同时或序贯使用，以获得胰腺内分泌细胞培养物。

[0392] 73.实施方案72的用途，其中其它细胞表面标记选自DDR1蛋白、prominin 1(也称为CD133)和CD49f。

[0393] 74.实施方案72的用途，其中其它细胞表面标记为DDR1蛋白。

[0394] 75.实施方案68-74中任一项的用途，其中使用Disp2结合试剂代替DNER结合试剂。

[0395] 76.实施方案68-74中任一项的用途，其中使用Sez6l2结合试剂代替DNER结合试剂。

[0396] 77.实施方案68-74中任一项的用途，其中使用Lrp11结合试剂代替DNER结合试剂。

[0397] 78.实施方案68-74中任一项的用途，其中使用Slc30a8结合试剂代替DNER结合试剂。

[0398] 79.实施方案68-74中任一项的用途，其中Disp2结合试剂与DDR1结合试剂组合使用代替DNER结合试剂。

[0399] 80.实施方案68-74中任一项的用途，其中Sez6l2结合试剂与DDR1结合试剂组合使用代替DNER结合试剂。

[0400] 81.实施方案68-74中任一项的用途，其中Lrp11结合试剂与DDR1结合试剂组合使用代替DNER结合试剂。

[0401] 82.实施方案68-74中任一项的用途，其中Slc30a8结合试剂与DDR1结合试剂组合使用代替DNER结合试剂。