荷包猪SLA-2基因及其应用

摘要

荷包猪SLA-2基因及其应用，包括对我国特色品种荷包猪包括4个SLA-2等位基因cDNA的扩增、序列测定和分析。所述的4个SLA-2等位基因碱基序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。这些基因序列及以此为基础所得到的基因分子特征及分子进化图谱可用于荷包猪基因库的构建、荷包猪的品种鉴别及指导荷包猪的遗传育种。

权利要求

1.荷包猪SLA-2基因，其特征在于是4个SLA-2等位基因，其碱基序列如SEQ ID NO：

1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

2.权利要求1所述的荷包猪SLA-2基因，其特征在于利用RT-PCR扩增荷包猪SLA-2基因，扩增所用的上、下游引物序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；扩增PCR程序为：

94℃ 5min；

94℃ 45s，64℃ 30s，72℃ 1min，3循环；

94℃ 45s，62℃ 30s，72℃ 1min，3循环；

94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 1min，31循环；

72℃ 10min。

3.权利要求1所述的荷包猪SLA-2基因在荷包猪品种鉴别上的应用，是根据荷包猪SLA-2基因编码区所编码的氨基酸序列的特征性氨基酸位点进行鉴别，其特征在于所述的特征性氨基酸位点位于荷包猪SLA-2基因编码区所编码的氨基酸序列的47位F、48位I、67位A、68位K、74位Q、97位N、119位I、138位R和240位S。

4.权利要求1所述的荷包猪SLA-2基因在荷包猪优化遗传育种上的应用。

说明书

荷包猪SLA-2基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及我国特色品种荷包猪SLA-2等位基因(SLA-2-HB)cDNA的扩增、序列测定和分析，以及利用其进行荷包猪品种鉴定及优化遗传育种。

背景技术

[0002] 荷包猪是东北民猪的一个小型类群，分布于辽西封闭山区，因其外形酷似“荷包”而得名。该品种猪长期自繁自育，自然进化，已有300多年历史；该品种猪野生性强，具有良好的抗病能力；另外该品种猪肉质鲜美，味感醇香，俗有“北方香猪”之称。1987年被农业部列为国家一级保护猪种，2002年被列入《国家畜禽遗传资源保护名录》，2006年被确定为《国家级畜禽遗传资源保护品种》，是东北地区唯一得到国家保护的猪种。由于荷包猪还没有开发出利用市场，其保种目前完全依靠国家投入，成本昂贵，保种压力非常大。为了维持荷包猪数量的稳定，除了自繁自育外，每年要从一些山区农户收购一些散落的荷包猪。但对其的品种鉴别和人工繁育都缺乏科学有效的指导，这给荷包猪商品化养殖繁育带来巨大的难题。

[0003] 本申请的发明人通过长期对荷包猪资源的调查研究，考虑到该品种独特的性能和地位，推测其在进化上也具有独特的地位和背景。此外，猪的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)，又称之为猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen，SLA)，其中SLA-2(又称为SLA-B)是一重要的功能基因。Piontkivska等(2003)报道，脊椎动物的MHC分子代表物种的进化特征，据此推测猪MHC类分子重要功能基因SLA-2有可能反映荷包猪的分子进化背景。基于此，本申请的发明人拟从荷包猪的SLA-2基因入手，针对性地研发准确可靠的品种鉴别方法，并为荷包猪品系优化和培育新品种提供指导性的数据。

发明内容

[0004] 本发明的目的之一在于提供荷包猪SLA-2基因序列，发明人通过设计特异性引物，经RT-PCR扩增荷包猪SLA-2基因cDNA，再克隆至pMD-18T载体，然后测序。结果显示，共克隆出荷包猪SLA-2基因的4个等位基因，即SLA-2-HB01～04，其碱基序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

[0005] 本申请的发明人利用RT-PCR扩增得到上述荷包猪SLA-2等位基因，扩增所用的引物序列是：

[0006] 上游引物S1：5’-AGATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAG-3’(SEQ ID NO：5)；

[0007] 下游引物S2：5’-CAGTCCCCACAAGGC AGCTGTCTC-3’(SEQ ID NO：6)；

[0008] 扩增PCR程序为：

[0009] 94℃ 5min；

[0010] 94℃ 45s，64℃ 30s，72℃ 1min，3循环；

[0011] 94℃ 45s，62℃ 30s，72℃ 1min，3循环；

[0012] 94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 1min，31循环；

[0013] 72℃ 10min。

[0014] 本发明的另一目的是提供用于荷包猪品种鉴别及指导遗传育种的方法。基于上述克隆得到的荷包猪SLA-2基因的4个等位基因序列，发明人调集DDBJ/EMBL/GenBank上除荷包猪外其他44个SLA-2等位基因，利用Gentyx 9.0(Software Development co.，Ltd)推导基因的氨基酸序列、DNAMAN Version5.2.2(Lynnon Biosoft)对SLA-2各等位基因进行序列对比，最后通过Mega2(Mega software Co.，Ltd)的neighbor-joining法绘制各基因的分子进化图谱。

[0015] 通过分析荷包猪SLA-2-HB的基因分子特征，即特征性氨基酸位点，发明人发现荷包猪SLA-2-HB基因在其编码区的47位、48位、67位、68位、74位、97位、119位、138位、240位均为特征性氨基酸，具体信息如下表：

[0016]位置 氨基酸 氨基酸英文名称 氨基酸缩写
47 苯丙氨酸 Phenylalanine F或Phe
48 异亮氨酸 Isoleucine I或Ile
67 丙氨酸 Alanine A或Ala
68 赖氨酸 Lysine K或Lys
74 谷氨酰胺 Glutamine Q或Gln
97 天冬酰胺 Asparagine N或Asn
119 异亮氨酸 Isoleucine I或Ile
138 精氨酸 Arginine R或Arg
240 丝氨酸 Serine S或Ser

[0017] 根据这些位点，可以进行荷包猪品种的鉴别。

[0018] 根据荷包猪SLA-2等位基因的分子进化树，可以分析得出与其亲缘关系近或远的品系，从而可以选择进行优势杂交育种。

[0019] 根据上文所述，本发明的荷包猪SLA-2基因序列及以此为基础所得到的基因分子特征及分子进化图谱可用于荷包猪基因库的构建、荷包猪的品种鉴别及指导荷包猪的遗传育种。

附图说明

[0020] 本发明附图5幅，

[0021] 图1是荷包猪SLA-2-HB 01基因及氨基酸序列分析结果；

[0022] 图2是荷包猪SLA-2-HB 02基因及氨基酸序列分析结果；

[0023] 图3是荷包猪SLA-2-HB 03基因及氨基酸序列分析结果；

[0024] 图4是荷包猪SLA-2-HB 04基因及氨基酸序列分析结果；

[0025] 图5是荷包猪SLA-2-HB分子进化关系图谱；

[0026] 其中，图1～4中加下划线的氨基酸为荷包猪SLA-2-HB基因的特异性氨基酸位点。

具体实施方式

[0027] 以下以具体实施例的方式对本发明的技术方案作进一步的说明，该部分内容不以任何形式限制本发明的内容。本部分内容所使用的荷包猪样品采自辽宁省荷包猪原种场，所使用的仪器包括高速冷冻离心机(J-250，BECKMAN)、PCR仪(iCycler，BIORAD)、核酸电泳仪(DYY-7C，北京市六一仪器公司)、凝胶成像系统(UVP GDS-8000，美国UVP公司)、紫外分析仪(WD-9403C，北京市六一仪器公司)、空气浴振荡器(HZQ-C，哈尔滨市东明医疗仪器厂)等。

[0028] 实施例1：克隆荷包猪SLA-2等位基因

[0029] 1、引物设计

[0030] 利用RT-PCR扩增上述荷包猪SLA-2等位基因，扩增所用的引物序列是：

[0031] 上游引物S1：5’-AGATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAG-3’(SEQ ID NO：5)；

[0032] 下游引物S2：5’-CAGTCCCCACAAGGC AGCTGTCTC-3’(SEQ ID NO：6)；

[0033] 2、提取荷包猪总RNA

[0034] 采集荷包猪脾脏，采用TRIZOL试剂盒(BS409，Canada Bio Basic Inc.)提取核酸总RNA，方法按照试剂盒说明进行。

[0035] 3、RT-PCR

[0036] 以Oligo dT做为反转录引物，按照反转录试剂盒(M-MLV，RNase H-，宝生物工程(大连)有限公司)说明将核酸反转录为cDNA；然后以PCR扩增引物S1/S2扩增SLA-2。

[0037] 扩增RT-PCR程序为：

[0038] 94℃ 5min；

[0039] 94℃ 45s，64℃ 30s，72℃ 1min，3循环；

[0040] 94℃ 45s，62℃ 30s，72℃ 1min，3循环；

[0041] 94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 1min，31循环；

[0042] 72℃ 10min。

[0043] 扩增PCR产物经纯化试剂盒(TaKaRa DNA Fragment Purification，宝生物工程(大连)有限公司)回收。

[0044] 4、基因克隆及重组子筛选

[0045] 将纯化后的SLA-2与pMD-18-T(宝生物工程(大连)有限公司)载体连接，并转化宿主菌JM109(宝生物工程(大连)有限公司)。重组菌含Amp抗性，重组菌经培养碱裂解法提质粒，EcoR I(宝生物工程(大连)有限公司)和HindIII(宝生物工程(大连)有限公司)双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切电泳结果筛选阳性重组菌，保存至-80℃备用。

[0046] 5、测序

[0047] 重组菌阳性克隆送至上海生工测序。

[0048] 实施例2：序列分析及品种的鉴别

[0049] 实施例1所得基因序列经过Gentyx9.0(Software Development co.，Ltd)进行基因分析，并推导其氨基酸序列；调集DDBJ/EMBL/GenBank上除荷包猪外其他44个SLA-2等位基因氨基酸序列，氨基酸序列对比采用DNAMAN Version5.2.2(Lynnon Biosoft)。

[0050] 分析结果如附图1～4所示：荷包猪SLA-2基因在其编码区的47位、48位、67位、68位、74位、97位、119位、138位、240位均为特征性氨基酸，具体信息如下表：

[0051]位置 氨基酸 氨基酸英文名称 氨基酸缩写
47 苯丙氨酸 Phenylalanine F或Phe
48 异亮氨酸 Isoleucine I或Ile
67 丙氨酸 Alanine A或Ala
68 赖氨酸 Lysine K或Lys
74 谷氨酰胺 Glutamine Q或Gln
97 天冬酰胺 Asparagine N或Asn
119 异亮氨酸 Isoleucine I或Ile
138 精氨酸 Arginine R或Arg
240 丝氨酶 Serine S或Ser

[0052] 根据这些位点特征的氨基酸信息，可以进行荷包猪品种的鉴别。

[0053] 参考荷包猪SLA-2-HB等位基因的分子特征，辽宁省荷包猪原种场保种中心人员已从建昌、青龙、奈曼、库伦等产区县40多头当地品系猪中筛选到了14头带有荷包猪SLA-2-HB基因特征的民间荷包猪以补充荷包猪群体，而且筛选到的猪外形特征及性能均符合典型荷包猪特征，经过3代繁育，荷包猪的典型特征仍存在。与之前仅通过猪外观特征判断是否为荷包猪的方法比较，本方法更具有科学性。目前研究人员在基因水平上可以很方便的区分民间荷包猪与其它品系猪，有利于荷包猪资源的保护。

[0054] 实施例3：分子进化图谱的绘制及其在优化遗传育种中的应用

[0055] 分子 进 化图 谱采 用DNAMAN和Mega2 软件(Mega software Co.，Ltd) 的neighbor-joining法绘制。分子进化图谱如附图5。通过分子进化图谱，所有SLA-2等位基因聚类为3大类，即I类、II类和III类，荷包猪SLA-2等位基因属于B III区。由此可以很清楚地判断出荷包猪品系与美国Hanford AF464039、美国大白EF125047、及细胞系10sk21 EU432083的遗传关系接近；而与我国杂交品系AF205147、美国NIH小型猪EU867814及美国CMS小型猪EU431219等遗传关系较远。根据遗传育种的原则，在优势性状同等条件下，尽量选择遗传关系较远的品系，才能体现杂交优势；而为了保种选育，又应该尽量选择遗传关系较近的品系。

[0056] 基于以上信息及育种原则，辽宁省畜牧科学研究院荷包猪原种场制定合理的选配计划，避免亲缘选配(三代之内避开血缘关系)、采取同质选配。优秀公猪加大配种强度，优良组合可重复选配。选留种的重点放在体型外貌、生产性能、遗传缺陷等性状的选择上。经过三个世代的选育，各项指标具体为：成年公猪体重91kg、成年母猪体重76kg，公猪体高
64cm，母猪体高57cm，公猪体长111cm，母猪体长104cm，公猪性成熟年龄135d，母猪90d。初产母猪产仔数9头，经产母猪产仔数10头；肥育期日增重410克，料肉比3.9∶1；屠宰率
74％，瘦肉率48％，肌内脂肪含量5.1％；与零世代相比：初产母猪产仔数提高0.4头，经产母猪提高0.5头；肥育期日增重提高52克；料重比降低0.4个比例点；瘦肉率提高0.9个百分点；种猪体尺、体重、体型外貌达到育种指标。