农杆菌介导喷花转基因方法及应用

摘要

本发明涉及一种通过农杆菌介导喷花的转基因方法。采用大田环境活体条件下将农杆菌悬液直接喷雾于散粉前至散粉阶段花蕊上的方法，不仅操作更简便，同时也避免了对花器官造成的伤害，如按照出现的转基因植株数/转化花朵计算，在棉花中转化效率可以达到10％。本发明在植物遗传转化、分子育种中具有重大的实际应用价值。所用的转化材料可以是锦葵科的棉花，也可以是水稻、玉米、小麦、大豆、油菜、黄瓜、西红柿、烟草、果树、林木、花卉、药用等单、双子叶种子繁殖的植物，在单、双子叶植物遗传转化和分子育种中具有一定的应用价值。

权利要求

1.棉花农杆菌介导喷花法遗传转化方法，包括以下步骤：

1)将含有目的基因的农杆菌用悬浮液稀释至0.3～0.5OD，所述的悬浮液含有蔗糖和SilwetL-77。

2)在活体条件下进行转化：在大田中利用微型喷壶，将农杆菌悬浮液喷雾于棉花散粉前的花朵上或者雌蕊和柱头上，利用农杆菌将目的基因整合于棉花基因组中。待转化的棉铃成熟后收取棉花种子，播种于大田，利用筛选标记基因筛选即可获得转基因植株。

2.根据权利要求1所述的棉花转化方法，其特征在于：所述的农杆菌悬浮液中含有

5～10％蔗糖或者5～10％蔗糖加20～50μL/L的SilwetL-77。

3.根据权利要求1所述的棉花转化方法，其特征在于：所述的农杆菌介导喷花法采用喷雾法，将农杆菌悬浮液用微型喷壶均匀喷洒于棉花柱头和花药等花器官上，悬浮液每朵花用量为400～600μL。

4.根据权利要求1所述的棉花转化方法，其特征在于：所述的农杆菌介导喷花法转化时间为散粉前至刚散粉阶段。

5.根据权利要求1所述的棉花转化方法，其特征在于：所述含有目的基因的农杆菌的获得时将目的基因插入植物表达载体中，再将该表达载体导入农杆菌中。

6.根据权利要求5所述的棉花转化方法，其特征在于：所用的植物表达载体包括但不限于pBin系列载体(如pBin19等)、pBI系列载体(如pBI121等)、Gateway系列载体(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA1302等)。

7.根据权利要求1所述的棉花转化方法，其特征在于：所用的农杆菌包括但不限于：LBA4404、EHA105等。

8.根据权利要求1～7所述的棉花转化方法，其特征在于所述的棉花植株为健壮的完整开花植株，喷雾部位为棉花活体状态下盛花期的花朵。

9.根据权利要求1所述的棉花转化方法，其特征在于：所用的转化材料不仅可以是锦葵科的棉花，还可以用于禾本科、豆科、十字花科、茄科、葫芦科、伞型花科以及其他果树、林木、花卉、药用等种子繁殖植物的遗传转化。

说明书

农杆菌介导喷花转基因方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及棉花基因工程，尤其涉及一种通过农杆菌介导喷花的方法转化棉花的转基因方法。

背景技术

[0002] 植物基因工程是应用重组DNA技术，将外源基因导入到受体植物细胞内，使受体植物获得新的遗传性状。20世纪80年代，在细胞和组织培养、分子生物学研究领域取得一系列重大进展的基础上，植物基因工程到得到了迅猛的发展。棉花是我国重要的经济作物，对农业和棉纺行业的发展具有举足轻重的作用，但传统的育种方法多限于品种间或种间的染色体重组，具有很大的局限性。因此利用基因工程技术培育棉花新品种具有十分重要的意义。我国棉花生物技术研究起始于20世纪70年代，近年来随着植物转基因研究的蓬勃发展，转基因技术的不断改进和完善，转基因技术已经应用于棉花抗虫、抗除草剂、抗病、提高产量和品质改良育种的实践中，并得到了抗虫、抗除草剂、抗病等转基因新品种(系)，有些已经进入商品化生产，取得了显著的经济效益和社会效益，特别是中国农业科学院郭三堆等科学家培育成功的转基因抗虫棉的大面积推广，极大地促进了我国棉花产业的发展，不仅使棉花产量得到了显著提高，也大量减少了杀虫剂的使用，充分体现了转基因作物在农业生产中重要的经济与社会价值。因此，充分运用转基因技术，在高产、优质的棉花品种上，进一步导入抗病虫、抗除草剂、耐盐碱、耐干旱等基因，获得抗逆性优良的转基因棉花种质新材料，对转基因棉花新品种具有重要的现实意义。应用于棉花的转基因技术主要有农杆菌介导的外源基因导入方法和外源基因直接导入的花粉管通道法、基因枪法，这3种方法也是应用最广泛的植物遗传转化手段。

[0003] 自从1987年Umbeck和Firoozababy等通过根癌农杆菌介导转化获得第一个表达外源基因的转基因植物以来，该方法在棉花遗传转化中得到了迅速应用。当前通过各种转基因技术已获得的近200种转基因植物，其中80％以上是利用根癌农杆菌转化方法获得的。该方法以转基因低拷贝、遗传稳定性好、能够转化大片段的DNA、转化效率高等优点倍受人们的关注，是目前转化机理研究最清楚，应用最广泛的方法。棉花的遗传转化采用的是根癌农杆菌，为土壤喜居菌，革兰氏染色呈阴性(李俊兰，2002)。利用农杆菌转移外源基因的过程一般是(1)将目的基因导入具有中间载体或二元载体。(2)将带有目的基因的中间载体或二元载体导入农杆菌。(3)使农杆菌感染寄主(受体)植物细胞或组织。(4)筛选转化细胞并诱导其再生植株。(5)对转基因植株进行分子检测。农杆菌介导的基因转移所适用的外植体非常广泛，包括叶片、茎段、胚轴、叶柄、子叶、幼胚或成熟种子。在棉花上常用的为下胚轴。

[0004] 郭三堆等(1999)采用农杆菌介导法将Bt基因导入中棉所12、泗棉3号等主栽品种中，获得了高抗棉铃虫的转基因棉株。孟钊红(2001)等通过农杆菌介导法将含GUS基因、NPT基因、Bt基因的Ti质粒转入棉花细胞中，结果表明，GUS基因在转化愈伤组织细胞有丝分裂增殖过程中能稳定遗传给后代细胞。李宝平等(2001)利用农杆菌介导法将Bt基因融合tfdA基因导入棉花，获得再生植株；焦改丽等(2002) 以新陆地品种Cok-er312和晋棉7号的10mm侧根切断和发育8～12天的无菌苗为转化受体材料，成功获得了转基因棉株。
李晓等(2002)转化棕色棉雄性不育的恢复系“G007”，产生的转化体不存在转化与非转化细胞间的嵌合现象。

[0005] 农杆菌介导法与其它转基因方法相比，具有转化机理清楚，转化率高，方法成熟，简便易行，转移基因明确(T-DNA左右边界之间序列)，能够转化大片段的DNA，转化的外源基因以单或低拷贝整合到植物基因组中，遗传稳定性好，符合孟德尔定律等特点，成为棉花等作物常用的基因转化方法。

[0006] 但是，影响农杆菌介导法的因素较多，主要有外植体类型和生理状态、外植体是否进行预培养、Vir基因活化状况、pH值、温度、渗透压、肌醇浓度以及一些糖类。棉花农杆菌介导遗传转化方法，由于其转化受体材料严格受基因型的限制、通过再生途径获得的转基因苗周期长、获得转基因苗由于其脱分化和再分化导致体细胞变异而突变率高等因素，制约了农杆菌介导的遗传转化方法在棉花基因工程中的应用。

[0007] 花粉管通道途径(pollen tube pathway)是周光宇等人(1978)提出DNA片段杂交理论之后设计的自花授粉后外源DNA导入植物的转基因技术。棉花胚珠在授粉之前，珠心是一个封闭的体系，授粉后随花粉管的伸入，从珠孔到胚囊的一些珠心细胞退化形成一条通道，以利于花粉管进入胚囊，外源DNA可以通过花粉管通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞从而参与到新形成的种子中。由于这些细胞不具备正常的细胞壁，可作为天然的原生质体，易于DNA转化，受精后细胞DNA复制活跃，易于外源DNA的整合。用同位素示踪技术已经证实外源DNA是通过花粉管通道而不是通过花粉管进入胚囊的(龚蓁蓁，1988；黄国存，1998)。黄骏麒等(1981)应用花粉管通道法成功地将抗病基因导入高产、优质、感病的棉花品种中，获得耐黄萎病、抗枯萎病的棉花3118新品种。倪万朝等(1998)通过花粉管通道法将Bt基因导入泗棉3号，选育出了我国第一批通过审定的转基因抗虫棉GK1。

[0008] 花粉管通道法应用于棉花基因工程，不仅打破了转化受体材料的基因型限制，无需大型仪器设备，而且整个转化过程在大田中实施、对转化条件要求比较简单、由转基因材料培育出新品种的周期短，可直接获得正常种子，因此在国内棉花遗传转化中得到了广泛的应用。但是，该方法转化后对子房机械损伤大，单棉铃的得籽率较低(单棉铃可收10粒以下种子)，转化效率较低(按照转化的花朵数算，其转化效率0.03％～0.1％左右)，工作量大，转化用的载体骨架结构也整合于棉花基因组中，获得的转基因材料中外源DNA一般为多拷贝，后代纯合速度较慢。

[0009] 基因枪法(particle gun)又称粒子轰击法(Microprojectile bombardment；Particlebombardment；Biolistics)。是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞的一种转化技术。其基本原理是通过火药爆炸高压放电或高压气体作为动力加速带有基因的金属颗粒、金粒或钨粒，并使其进入带壁细胞。在此过程中质粒首先沉淀在微弹(金粒或钨粒)表面，结合有DNA分子的微弹经加速而获得足够的动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞，随后释出DNA分子并随机的整合到寄主的基因组内。Finer和Mullen(1990)以棉花胚性悬浮细胞为转化受体最先用基因枪法将GUS和NPTⅡ基因导入到棉花中，成功地获得了转基因棉花；吴敬音等 (1994)应用基因枪轰击法将CPTI基因和NPTⅡ基因的重组质粒导入到棉花茎尖分生组织，培养获得卡那霉素抗性植株；刘传亮等(2003)采用基因枪导入技术将外源导入受体棉花品种的茎尖或茎尖分生组织，成功地育成转基因棉花品种(系)。 [0010] 基因枪法由于将整个质粒表达载体通过金属颗粒引入细胞中，获得的转基因材料外源DNA一般为多拷贝，表达载体骨架结构序列也整合于基因组中；该方法也需要受体材料通过组织培养过程获得再生苗，导致转化受体材料严格受基因型的限制、通过再生途径获得的转基因苗周期长、获得转基因苗由于其脱分化和再分化引起体细胞变异而突变率高；转化用的金属颗粒比较昂贵，技术成本较高。因此该方法在棉花遗传转化中应用较少。 [0011] 花器官浸泡转化是一种植物原位转基因方法，即一种不需要组织或细胞培养手段而达到植物在活体而非离体状态下的遗传转化方法。该方法是利用受体材料花序与农杆菌接触，在活体条件下完成细胞遗传转化，并通过后代筛选获得转基因植株。该方法操作简单、直接在大田环境条件下操作、具备了农杆菌介导通过再生途径获得转基因苗的遗传转化方法的全部优点，自1998年作者报道了在实验室条件下通过浸花法成功用于拟南芥遗传转化以来，该方法得到了广泛应用，但是在棉花遗传转化中未见报道。 发明内容

[0012] 针对以上现有技术条件，本发明提供一种改进的喷花法转化棉花的方法。该方法参考拟南芥转化方法，依据棉花花器官大、雌雄同花、开花后授粉等特征，对喷花法的转化用农杆菌稀释液配方、转化时间、转化方法方面进行优化。转化方法上采用大田环境条件下将农杆菌悬液直接喷雾于棉花花蕊上，比花器官浸泡转化方法操作更简便，而且也避免了浸泡操作过程对植物造成的意外伤害。

[0013] 本发明提供的棉花农杆菌介导喷花法遗传转化方法具体如下：

[0014] 1)将含有目的基因的农杆菌用悬浮液稀释至0.3～0.5OD，所述的悬浮液含有蔗糖和SilwetL-77。

[0015] 2)在活体条件下进行转化：在大田中利用微型喷壶，将农杆菌悬浮液喷雾于棉花散粉前的花朵上或者雌蕊和柱头上，利用农杆菌将目的基因整合于棉花基因组中。待转化的棉铃成熟后收取棉花种子，播种于大田，利用筛选标记基因筛选即可获得转基因植株。 [0016] 本发明中的农杆菌悬浮液含有5～10％蔗糖或者5～10％蔗糖加20～50μL/L的SilwetL-77，其中最关键的因素是蔗糖，糖的粘性能够使农杆菌充分棉花花器官组织细胞相结合。加入SilwetL-77可以增加棉花花器官细胞膜的通透性，可以更好的使农杆菌与棉花花器官组织细胞相结合。

[0017] 本发明采用直接将农杆菌悬浮液喷雾于棉花花朵上的方法，每朵花大约喷雾400～600μL悬浮液。经过雾化的农杆菌悬浮液均匀的覆盖于柱头及花药等花器官上，保证了农杆菌和花器官组织充分接触，同时不会由于湿度过大而影响授粉。 [0018] 上述含有目的基因的农杆菌的获得，是将含有目的基因的质粒植物表达载体，通过电击或热击转化导入农杆菌细胞中。所用的植物表达载体包括但不限于pBin系列载体(如pBin19等)、pBI系列载体(如pBI121 等)、Gateway系列载体(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA1302等)；所用的农杆菌包括但不限于：LBA4404、EHA105等。 [0019] 本发明利用改进的喷花法转化方法，已成功获得了棉花转基因植株。该转化方法简单、条件要求粗放、转化周期短、工作量小、对子房无机械损伤，转化后单棉铃的得种率高(单个棉铃的种子基本上都能收获)、转化效率高(按照所转化的花朵算转化效率达到
1％～4％，按照转化获得的T0代种子算转化效率达到了0.2～0.3％)。该方法转化机理清楚，打破了受体材料的基因型限制，可以直接对棉花育种材料进行转化，具有较大的实用价值。

附图说明

[0020] 图1是实施例中质粒pGBIF4ABC-EPSPS。

[0021] 图2是实施例中PCR检测T1代转基因植株Bt基因的电泳结果。

[0022] 图3是实施例中PCR检测T1代转基因植株EPSPS基因的电泳结果。

[0023] 具体实施方式

[0024] 下面结合附图，通过实例对本发明做进一步说明，但不以任何方式限制本发明的范围。

[0025] 实施例：农杆菌介导喷花法转化获得棉花转基因植株

[0026] 一、材料与方法

[0027] 1)棉花材料：棉花材料选用自选品种Y18R。

[0028] 2)菌种：农杆菌LBA4404。

[0029] 3)载体：pGBIF4ABC-EPSPS(图1)。本实验室构建的植物表达载体，含有两个独立的表达盒，启动子均为35S Promoter，终止子为Nos。第一个表达盒编码基因为草甘膦抗性基因EPSPS，第二个表达盒编码基因为Bt基因和Cpti基因的融合基因。

[0030] 4)工具酶和修饰酶：各种限制性内切酶和修饰酶购自TaKaRa公司、NEB公司及Fermentas公司。

[0031] 5)化学试剂：化学药品均为国内外分析纯。

[0032] 6)引物合成：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0033] 二、农杆菌介导喷花法转化获得棉花转基因植株

[0034] 1.农杆菌的培养及转化菌液的准备

[0035] 挑取含有质粒pGBIF4ABC-EPSPS的农杆菌单克隆子，接种于50mL YEB(含卡那霉素50mg/L、链霉素50mg/L)液体培养基中，28℃ 250rpm过夜培养。吸取过夜培养菌液2mL接种于200mL YEB(含卡那霉素50mg/L、链霉素50mg/L)液体培养基中(置于1L三角瓶中)，28℃ 250rpm过夜培养，直至OD600＝0.8～1。将培养好的菌液在4500rpm离心15min，弃上清，收集沉淀，用稀释液(含有5～10％蔗糖或5～10％蔗糖加SilwetL-77的灭菌水溶液)重悬至OD600＝0.4～0.5，用于植物转化。

[0036] 2.植株选择准备与转化时间

[0037] 选取露天生长处于盛花期，生长健壮的植株，作为转化株。第一天下午对第二天盛开的花用自交夹子做自交(种植于隔离区内的受体材料可以不做自交)，然后第二日上午5点至10点(散粉前至刚散粉)进行转化。

[0038] 3.农杆菌菌液侵染棉花花朵

[0039] 采用了两种稀释液(含有5～10％蔗糖或5～10％蔗糖加SilwetL-77的灭菌水溶液)稀释的农杆菌，利用微型喷壶喷雾于棉花花朵进行转化，每喷一次大约为200μL悬浮液，每朵花喷2～3次(约400～600μL悬浮液)。对转化的花朵用自交夹子隔离(种植于隔离区内的受体材料可以不做隔离)，然后挂牌标记。

[0040] 4.T0代种子收获及T1代筛选

[0041] 种子成熟后将T0代种子混收，播种于大田，使用卡那霉素和除草剂筛选抗性植株。卡那霉素筛选三次，第一次为子叶期，用毛笔将1mg/mL的卡那霉素溶液涂抹于子叶上，于3～4日后检查子叶是否有斑点出现，无斑点的植株即为转基因候选植株。第二次筛选在2～4片真叶时期，对第一次筛选获得的候选植株的真叶涂抹1mg/mL的卡那霉素溶液，无斑点出现的植株即为转基因候选植株。第三次筛选在5～6片真叶时期，对第二次筛选获得的候选植株的真叶涂抹1mg/mL的卡那霉素溶液，无斑点出现的植株即为转基因候选植株。最后将三次筛选获得的转基因候选植株用草甘膦除草剂筛选，没有死亡的即为T1代转基因阳性植株。

[0042] 5.T1代转基因阳性植株PCR检测

[0043] 对表现卡那霉素和草甘膦抗性的植株，PCR检测Bt基因和EPSPS基因，基因组提取方法采用改良的CTAB法。设计引物序列如下：

[0044] Bt基因引物

[0045] Bt-Fp(正向引物)GCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAG

[0046] Bt-Rp(反向引物)GTTGCAGTAACTGGAATGAACTCG

[0047] EPSPS基因引物

[0048] EPSPS-Fp(正向引物)GCGAAATGGGCGTGCAGGTGAAATC

[0049] EPSPS-Fp(反向引物)GGCGGCGACAGCGAGAATCGG

[0050] 利用Bt基因引物和EPSPS基因引物以抗性转基因植株基因组为DNA模板，扩增Bt基因和EPSPS基因，扩增体系为：

[0051] 模板 1μl(10pg)

[0052] PCR Buffer 5μl

[0053] 2.5mM dNTP 3μl

[0054] 正向引物(10μM) 1μl

[0055] 反向引物(10μM) 1μl

[0056] Taq 1μl(2.5U)

[0057] ddH2 38μl。

[0058] PCR条件：94℃，5min；94℃，45Sec；58℃，45Sec；72℃，45Sec；30cycle；72℃，10min。

[0059] 反应结束后，对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如果转化成功可检测到1.8kb的Bt基因片段和500bp的EPSPS基因片段(图2，图3)。

[0060] 本实验共进行了3次独立的转基因事件，每次转化500朵花，最后共获得了33株转基因植株。

[0061] 以上实验证明，利用该方法可以对棉花进行高效的遗传转化，对棉花基因工程及分子育种具有重要意义。