一种杀藻菌的复合培养基及其制备方法

摘要

一种杀藻菌的复合培养基及其制备方法，涉及一种培养基。提供一种适合于培养杀藻菌Alteromonas addita DH46、可显著提高其细胞密度的杀藻菌的复合培养基及其制备方法。复合培养基的组成为，在1L的陈海水中含有胰蛋白胨1～15g；酵母粉0.5～5g；可溶性淀粉0.5～5g；NaNO3 0.1～3g；MgSO4 0.1～3g。pH为7.2～7.8；陈海水的盐度为20‰～40‰。制备时，将胰蛋白胨、酵母粉、可溶性淀粉、NaNO3和MgSO4加入陈海水中定容，调节pH为7.2～7.8，灭菌后，即得杀藻菌的复合培养基。

权利要求

1.一种杀藻菌的复合培养基，其特征在于所述杀藻菌为交替单胞菌(Alteromonas addita)DH46，已于2010年07月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010177；

所述杀藻菌的复合培养基的组成为，在1L的陈海水中：胰蛋白胨 1～15g；

酵母粉 0.5～5g；

可溶性淀粉 0.5～5g；

NaNO3 1～3g；

MgSO4 0.1～3g；

所述杀藻菌的复合培养基的pH为7.2～7.8；

所述陈海水的盐度为20‰～40‰。

2.一种杀藻菌的复合培养基，其特征在于所述杀藻菌为交替单胞菌(Alteromonas addita)DH46，已于2010年07月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010177；

所述杀藻菌的复合培养基的组成为，在1L的陈海水中：胰蛋白胨 14g；

酵母粉 1.63g；

可溶性淀粉 5.0g；

NaNO3 1.6g；

MgSO4 2.3g；

所述杀藻菌的复合培养基的pH为7；

所述陈海水的盐度为30‰。

3.一种如权利要求1所述的杀藻菌的复合培养基的制备方法为：将所述胰蛋白胨、酵母粉、可溶性淀粉、NaNO3和MgSO4加入陈海水中定容，调节pH为

7.2～7.8，灭菌后，即得杀藻菌的复合培养基，所述陈海水的盐度为20‰～40‰。

4.如权利要求3所述的杀藻菌的复合培养基的制备方法，其特征在于所述灭菌，是采用高压灭菌121℃，20min。

说明书

一种杀藻菌的复合培养基及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种培养基，尤其是涉及一种杀藻菌Alteromonas addita DH46的复合培养基及其制备方法。

背景技术

[0002] 随着全球水体富营养化的加剧，有害赤潮的发生频率、规模和危害大增，造成了严重的生态、资源、环境问题和重大的经济损失。目前，由于赤潮已成为一种世界性的公害，美国、日本、中国、加拿大、法国、瑞典、挪威、菲律宾、印度、印度尼西亚、马来西亚、韩国、香港等30多个国家和地区赤潮发生都很频繁，因此研究赤潮防治方法，制定有关防治对策已经成为许多国家和地区的当务之急。海洋浮游藻是引发赤潮的主要生物，在全世界4000多种海洋浮游藻中有260多种能形成赤潮，其中有70多种能产生毒素。目前藻类的控制技术可归纳为物理方法、化学方法和生物方法。在采用物理和化学方法杀藻存在种种局限性的情况下，具有安全、高效、简易的生物方法控藻目前正处在研究发展的初级阶段(杨小茹，苏建强，郑天凌.化感作用在赤潮调控中的意义及前景[J].环境科学学报，2008，8(2)：219-226)。生物方法主要是利用生物相互之间的生态关系来消除赤潮，这些生物包括动物、植物和微生物，其中利用溶藻细菌等方法对有害赤潮进行生物防治是国内外的研究热点。

[0003] 溶藻细菌(algicidal bacteria)是一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称。当前，国内对溶藻细菌的研究尚处于初步阶段，对于细菌溶藻活性代谢产物的研究也才刚刚开始(张勇，席宇，吴刚.溶藻细菌杀藻物质的研究进展[J].微生物学通报，2004，31(1)：127-131)。杀藻细菌中见诸报道最多的是倚靠释放胞外物质杀藻，而分泌胞外物质的多少通常与细胞密度的高低相关联系，优化培养基则是一种提高细胞密度的有效方法。为了获取一定量的杀藻物质用于后续活性物质的有效分离及杀藻机制研究工作的展开，杀藻菌培养基及培养条件的优化工作就显得尤为重要(何培青，田黎，李友光，等.海洋细菌B-9987发酵条件的优化及胞外抑菌物质的理化特性[J].中国海洋药物，2001，2(80)：8-12)。培养基组分是人为提供给微生物生长的最重要的培养环境，是影响微生物生长增殖和代谢产物合成的重要因素。影响微生物生长过程的因素包括培养组成(成分、浓度)以及培养条件(温度、pH值、摇床转速和接种量等)，由于发酵培养基成份众多，且各因素常存在交互作用，因此培养基优化工作的量大且复杂。数学统计学中的多种优化方法已开始广泛地应用于微生物培养基的优化工作中，其中比较常用的实验方法有单因素法、正交实验设计、均匀设计、全因子实验设计和响应面方法等(Xia Li，Tongcheng Xu，Xiaohang Ma，et al.2008.Optimization of culture conditions for production of cis-epoxysuccinic acid hydrolase using response surface methodology.Bioresource Technology.99，5391-5396)。

[0004] 单因子实验法是发酵的优化传统操作中的常用方法，即每次只改变一个因素的水平，其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。日常实验中，由于不需要数学统计方面的知识，操作简单，结果也能用图表显示，因此是最常用的培养基优化方法之一。虽然该法也存在一些缺点，如需要多次的实验和较长的试验周期，也无法显示各因素之间的相互作用关系。但是当考察的因素数量较多时，常用单因子实验法观察各因素对微生物生长和产物生成的影响，筛选出较大的影响因素及确定因素的水平范围，用于统计学方法设计多因素水平实验，从而大大减小实验数量及分析难度。

[0005] 均匀设计是我国数学家方开泰等独创的一种多因素试验优化法(方开泰，王元.均匀设计与均匀设计表[M].北京：科学出版社，1994，21-23)。该方法将数论的原理和多元统计相结合，首先在我国飞航式导弹设计中取得卓越应用，近几年在微生物培养基的优化方面已取得不少成功的例子。均匀设计的基本思路就是尽量使实验点均匀分散，使每个实验点具有更好的代表性，但同时舍弃整齐可比的要求，以减少实验次数，这其与正交试验设计法的最大不同之处；然后通过多元统计的方法来弥补这一缺陷，使得实验结果同样可靠有效。在实验数相同的条件下，均匀设计的偏差远比正交设计小。由于均匀设计不再考虑正交试验的整齐可比性，因此其试验结果的处理要采用回归分析方法—线性回归或多项式回归分析。

[0006] 当前，针对细菌胞外产物的发酵优化的报道已有很多，主要侧重于培养基成分和发酵条件的优化。但针对杀藻菌和杀藻物质的优化方面的研究鲜有报道。前期试验表明杀藻菌DH46能够分泌胞外活性物质，对宿主藻类起抑制或杀灭作用。目前，国内对杀藻菌的研究尚处于起步阶段，但借由杀藻细菌筛选高效、专一，能够生物降解的杀藻物质已成为开发杀藻剂的一个新思路。为了将其活性产物应用于实践中，首先遇到的问题就是培养过程的优化。发酵产物的多少通常与细胞密度的高低关联，而优化培养基及其培养条件则是一种提高细胞密度的有效方法。

[0007] 此外，培养基是人为提供给菌体生长、繁殖和合成产物之用，为使菌体生长达到高密度势必要设计一种含有必须成分的平衡性营养培养基。Zobell 2216E培养基作为常用的海洋好气性细菌分离培养基，是由代海洋微生物学之父—佐贝尔(C.E.ZoBell)发明，配方为：蛋白胨(Peptone)5g，酵母提取物(Yeast Extract)1g，磷酸高铁0.1g，琼脂粉10g(固体培养基)，pH7.0-7.2，陈海水定容到1L(参见文献：Su，J.Q.，Yang，X.R.，Zheng，T.L.，Tian，Y.，Jiao，N.Z.，Cai，L.Z.，Hong，H.S.Isolation and characterization of a marine algicidal bacterium against the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense[J].Harmful Algae，2007，6(6)：799-810)。它作为分离、培养海洋细菌的传统培养基在实践中具有重要作用，但不同的细菌有不同的营养需求。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种适合于培养杀藻菌Alteromonas addita DH46、可显著提高其细胞密度的杀藻菌的复合培养基及其制备方法。

[0009] 所述杀藻菌为Alteromonas addita DH46，已于2010年07月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学(邮编430072)，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010177。

[0010] 所述杀藻菌的复合培养基的组成为，在1L的陈海水中含有：

[0011] 胰蛋白胨 1～15g；

[0012] 酵母粉 0.5～5g；

[0013] 可溶性淀粉 0.5～5g；

[0014] NaNO3 0.1～3g；

[0015] MgSO4 0.1～3g。

[0016] 所述杀藻菌的复合培养基的pH可为7.2～7.8；所述陈海水的盐度可为20‰～40‰。

[0017] 所述杀藻菌的复合培养基的组成最好为，在1L的陈海水中含有：

[0018] 胰蛋白胨 14g；

[0019] 酵母粉 1.63g；

[0020] 可溶性淀粉 5.0g；

[0021] NaNO3 1.6g；

[0022] MgSO4 2.3g。

[0023] 所述杀藻菌的复合培养基的pH最好为7；所述陈海水的盐度最好为30‰。

[0024] 所述杀藻菌的复合培养基的制备方法为：

[0025] 将胰蛋白胨、酵母粉、可溶性淀粉、NaNO3和MgSO4加入陈海水中定容，调节pH为7.2～7.8，灭菌后，即得杀藻菌的复合培养基。

[0026] 所述灭菌，可采用高压灭菌121℃，20min。

[0027] 杀藻菌Alteromonas addita DH46作为一株具有特殊生理功能的微生物，由于其生长可能受到各种外界条件的影响，如温度、pH、盐度、溶氧量等，因此急需对杀藻菌培养基及培养条件进行优化，从而促进杀藻物质的产生和杀藻剂的研制。

[0028] 本发明以ZoBell 2216E培养基为基础，考察了培养基的组成和浓度，以及培养条件等对杀藻菌Alteromonas addita DH46摇瓶培养的影响，并利用均匀设计实验对培养基进行了优化，给出了一种适合高密度培养杀藻菌Alteromonas addita DH46的简单复合培养基。

附图说明

[0029] 图1为不同温度对杀藻菌DH46的生长及杀藻效果的影响。在图1中，横坐标为温度(℃)，左纵坐标为杀藻率(％)，右纵坐标为波长600nm下的光密度值OD600；斜线部分为杀藻率，●为OD600。

[0030] 图2为不同pH值对杀藻菌DH46的生长及杀藻效果的影响。在图2中，横坐标为pH值，左纵坐标为杀藻率(％)，右纵坐标为波长600nm下的光密度值OD600；斜线部分为杀藻率，●为OD600。

[0031] 图3为不同盐度对杀藻菌DH46的生长及杀藻效果的影响。在图3中，横坐标为盐度(‰)，左纵坐标为杀藻率(％)，右纵坐标为波长600nm下的光密度值OD600；斜线部分为杀藻率，●为OD600。

[0032] 图4为不同转速对杀藻菌DH46的生长及杀藻效果的影响。在图4中，横坐标为转速(r/min)，左纵坐标为杀藻率(％)，右纵坐标为波长600nm下的光密度值OD600；斜线部分为杀藻率，●为OD600。

[0033] 图5为不同复合营养成分对杀藻菌DH46的生长及杀藻效果的影响。在图5中，横坐标为复合营养成分，从左至右为牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨，左纵坐标为杀藻率(％)，右纵坐标为波长600nm下的光密度值OD600；斜线部分为杀藻率，●为OD600。

[0034] 图6为不同添加成分对杀藻菌DH46的生长及杀藻效果的影响。在图6中，横坐标为复合营养成分，从左到右为对照1(Control1)、对照2(Control2)、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸钠、可溶性淀粉、大豆蛋白胨、酸水解酷蛋白胨、甘氨酸、NaNO3、MgSO4，左纵坐标为波长600nm下的光密度值OD600，右纵坐标为杀藻率(％)；a为杀藻率，b为OD600。

具体实施方式

[0035] 以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

[0036] 1.菌种和藻种

[0037] 菌种：DH46来源于厦门大学资源与环境微生物研究所于2003年赤潮973项目MC2003-2航次从东海赤潮区采集到的海水样品中分离并筛选到的，是一株具有杀藻作用的交替单胞菌。

[0038] 藻种：Alexandrium tamarense(AT)无菌株，藻种系由暨南大学水生生物研究所提供，经本申请人无菌藻技术除菌得到的塔玛亚历山大藻无菌株。藻类所用培养液为f/2培养液。藻类置于室内三角瓶中培养，温度为20±1℃，光照条件为12h光照∶12h黑暗。

[0039] 2.测定方法

[0040] 浊度测定法(optical density，OD)：取适当原液或是稀释的菌体发酵液，以空白培养基做对照，用风光光度计于波长600nm下测定光密度值OD。

[0041] 细胞干重(DCW)：吸取发酵液10ml，8000r/min离心10min，弃去上清后用去离子水洗涤菌体3次，80℃恒温烘至恒重，称重计算DCW(g/L)。

[0042] 杀藻率：取发酵培养后的无细胞滤液，按照5％的比例添加入测试藻类中，作用24h后用卢戈氏液固定，在光学显微镜下计数。Algicidal activity(％)＝(NC-NT)/NC×100，式中，NC表示对照组中的活细胞数，NT表示实验组中的活细胞数。

[0043] 以下给出所述杀藻菌的复合培养基的优化过程。

[0044] 从培养基的影响因子中找出显著影响因子，采用均匀设计法进行优化。本发明中的实验设计、数据分析采用Data Processing System(DPS)3.01数据处理软件。

[0045] 首先采用Zobell 2216E为初始培养基，进行单因素法优化培养条件的探索。

[0046] 温度的影响：分别设定培养温度为20、25、28、30和32℃，pH7.0～7.2，1％接种量，250ml三角摇瓶装液量为100ml，150r/min摇床培养24h后，取菌液于波长600nm下测定光密度值(即OD600)和杀藻率；结果如图1所示。

[0047] 初始pH的影响：分别设定培养基的初始pH值为3～11，培养温度为28℃，1％接种量，250ml三角摇瓶装液量为100ml，150r/min摇床培养24h后，取菌液测定OD600和杀藻率；结果如图2所示。

[0048] 盐度的影响：用人工海水分别设定培养基的盐度为0、10、20、30、40和68‰，初始pH7.0～7.2，其余条件与上述相同，然后取发酵液测定OD600和杀藻率；结果如图3所示。

[0049] 转速的影响：分别设定摇床震荡速度为120、150、180和210r/min，其余条件与上述相同，培养24h后取发酵液测定OD600和杀藻率；结果如图4所示。

[0050] 实验结果显示，该菌在28～30℃培养条件下，其生物量和杀藻率都可达到较高值，菌体产活性物质的能力在20～30℃间内受温度影响较小，但细胞密度先随着温度的升高而增大，随后下降。温度改变过程中，菌体生长和杀藻物质的产生规律是一致的。考虑到节省能源故选择28℃为今后培养条件。对于微生物发酵来说有其各自的最适生长pH，DH46在pH值高于9及低于6的偏酸或者偏碱环境下菌体生长受抑，当pH为7时，取得生物量和杀藻率的最高值。盐度对于海洋微生物的生长增值有着重要意义，由结果可知，DH46生长及其杀藻活性物质的产生都受到盐浓度变化的显著影响。当培养基盐度为0时，菌体几乎不生长，杀藻率仅为14.1％；随着盐度增加菌体生长迅速，杀藻效果明显增强；当盐度大于30‰，该菌的杀藻率虽有略微增加，但菌体生长明显减慢。因此30‰的是适合杀藻菌DH46的盐度范围。转速的改变直接影响的就是微生物的溶氧量，过高或过低的的溶氧速率都不利于菌体生长，在转速为180r/min时，生物量和杀藻率分别为1.085，100％，该值为适宜菌体生长和产活性物质的摇床转速。

[0051] 故此，DH46的最佳培养条件为：培养温度为28℃，适宜的培养基初始pH为7，盐度为30‰，转速为180r/min。

[0052] 培养基主要包括碳源、氮源和无机盐几大成分，由于发酵培养基成份众多，且各因素常存在交互作用，很难建立理论模型；另外，由于测量数据常包含较大的误差，也影响了培养基优化过程的准确评估，因此培养基优化工作的量大且复杂。在本发明中首先选择几种复合营养源，即那些既可以做为碳源又可作氮源的营养物质(如蛋白胨、酵母粉等)，然后在它们的基础上添加不同微量成分，考察各成分对杀藻菌的生长及产活性物质的影响。

[0053] 以Zobell 2216E培养基为筛选优化的基础(无碳源、氮源)，以5g/L牛肉膏，酵母粉，胰蛋白胨，和蛋白胨为复合营养源，其余组分含量同于基础培养基。培养条件为：接种量为1％，28℃，180r/min，pH为7，盐度为30‰，摇瓶培养24h后测定OD600和杀藻率。结果如图5，显示DH46在以胰蛋白胨为营养源的培养液中生长，其菌体生物量和杀藻率俱佳，其值分别为1.18和96.9％，故选择它作为主要营养物质，继续后续的实验。

[0054] 参考经典培养基Zobell 2216E培养基的配方，在胰蛋白胨的基础上分别加入各种物质成分，研究它们对胰蛋白胨的营养补充效果，为筛选优化培养基做进一步准备。具体为：在5g/L胰蛋白胨的基础上分别加入1g/L的葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠、可溶性淀粉、酵母粉、大豆蛋白胨、酸水解酪蛋白胨、甘氨酸、NaNO3和MgSO4，其余组分含量同于基础培养基。培养条件为：接种量为1％，28℃，180r/min，pH为7，盐度为30‰，摇瓶培养24h后测定OD600和杀藻率。结合生长量和杀藻率考察加入的组分是否对杀藻菌存在促进作用。其中，对照1中仅只加入胰蛋白胨一种成分，对照2为在胰蛋白胨基础上加入酵母粉(即Zobell2216E培养基)。结果如图6所示，表明不同试验组培养基DH46的发酵液生物量差别不大，但是杀藻效果区别很明显，可能由于培养基成分及配比不同影响了DH46产生活性杀藻物质的能力，其中原理有待进一步的研究。

[0055] 仅加有胰蛋白胨的对照1无论是生长量还是杀藻率都明显低于对照2，即原基础培养基；碳源添加组分中，添加蔗糖的培养基收获的菌体细胞滤液杀藻率仅为23.6％，葡萄糖为68.9％，柠檬酸钠为71.6％，皆低于原基础培养基的89.3％的杀藻率，表明这些碳源成分对杀藻菌DH46分泌活性物质无促进作用；氮源添加组分中的大豆蛋白胨，酸水解酪蛋白胨，甘氨酸的菌体生物量和杀藻率亦不及原基础培养基效果。添加两种无机盐NaNO3、MgSO4的培养基的杀藻率都达到95％以上，有效地提高了菌体产生杀藻物质的能力。考虑到可溶性淀粉对菌体生物量的巨大贡献(其OD600为1.47)，合同胰蛋白胨、酵母粉、NaNO3、MgSO4都列入影响因子，参与培养基优化过程。

[0056] 筛选优化杀藻菌复合培养基，采用均匀设计法确定该培养基最佳配方组成。

[0057] 综合上述结果，选择胰蛋白胨、淀粉、酵母粉、NaNO3、MgSO4为影响因子进行5因素15水平的均匀设计，其余组分同于初始培养基。5因素分别为自变量X1、X2、X3、X4和X5，菌体干重为因变量Y。培养条件选择：接种量为1％，28℃，180r/min，pH为7，盐度为30‰。
胰蛋白胨设置15水平，其余皆设置5水平。将实验结果经DPS软件数据处理系统二次多项式逐步回归分析，并对该模型进行显著性检验，实验设计及结果见表1。

[0058] 表1 5因素15水平均匀设计表U15(54×15)及试验结果

[0059]

[0060] 多元回归方程如下：

[0061] Y＝3.219+0.0969X1+0.484X2-0.543X3-0.0542X5+0.00174X1*X1-0.0325[0062] 相关系数R＝1，F值＝38461.5，显著水平p＝0.004，剩余标准差S＝0.00015，调整后的相关系数Ra＝0.99999，Durbin-Watson统计量d＝1.78。说明该方程对菌体干重的模拟预测是可信的。

[0063] 由以上均匀设计实验，可知各因素对杀藻率和菌体生长量均有一定的影响，该杀藻菌DH46的的最佳培养基方案为(g/L)：胰蛋白胨14.0，酵母粉1.63，淀粉5.0，NaNO3 1.6，MgSO4 2.3。

[0064] 以下给出本发明制备所述杀藻菌的复合培养基的实施例。

[0065] 实施例1

[0066] 所述杀藻菌的复合培养基的组成为，在1L的陈海水中含有：

[0067] 胰蛋白胨 14g；

[0068] 酵母粉 1.63g；

[0069] 可溶性淀粉 5.0g；

[0070] NaNO3 1.6g；

[0071] MgSO4 2.3g；

[0072] 调节pH为7，所述陈海水的盐度为30‰，其制备方法为：将胰蛋白胨、酵母粉、可溶性淀粉、NaNO3和MgSO4加入陈海水中定容，调节pH为7，高压灭菌121℃，20min。即得杀藻菌的复合培养基。

[0073] 通过上述优化实验，得到了杀藻菌DH46的最适培养基配方和最佳培养条件。将初始培养基和优化培养基分别用于DH46的摇瓶培养，培养条件采用优化培养条件。优化后的菌体发酵增产效果显著，如表2。在摇瓶中培养24h后，其稳定期的菌体干重值可高达7.36g/L，超过与回归模型的预测值的6.37g/L，且比优化前的基础培养基提高了近一倍。说明利用均匀设计优化实验不仅可行性的，还是有效地。

[0074] 表2优化前后培养效果对比

[0075]

[0076] 实施例2

[0077] 与实施例1类似，其区别在于培养基的组分为在1L的陈海水中含有：

[0078] 胰蛋白胨 1g；

[0079] 酵母粉 1g；

[0080] 可溶性淀粉 0.5g；

[0081] NaNO3 1g；

[0082] MgSO4 0.1g；

[0083] 调节pH为7.5，所述陈海水的盐度为20‰。

[0084] 实施例3

[0085] 与实施例1类似，其区别在于培养基的组分为在1L的陈海水中含有：

[0086] 胰蛋白胨 15g；

[0087] 酵母粉 5g；

[0088] 可溶性淀粉 5g；

[0089] NaNO3 3g；

[0090] MgSO4 3g；

[0091] 调节pH为7.8，所述陈海水的盐度为40‰。

[0092] 实施例4

[0093] 与实施例1类似，其区别在于培养基的组分为在1L的陈海水中含有：

[0094] 胰蛋白胨 5g；

[0095] 酵母粉 1g；

[0096] 可溶性淀粉 1g；

[0097] NaNO3 1g；

[0098] MgSO4 1g；

[0099] 调节pH为7.2，所述陈海水的盐度为35‰。

[0100] 实施例5

[0101] 与实施例1类似，其区别在于培养基的组分为在1L的陈海水中含有：

[0102] 胰蛋白胨 10g；

[0103] 酵母粉 3g；

[0104] 可溶性淀粉 3g；

[0105] NaNO3 1.5g；

[0106] MgSO4 1.5g；

[0107] 调节pH为7.4，所述陈海水的盐度为25‰。