一种基因表达组合物、猪生殖与呼吸道综合症口服疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了关于一种可表达猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的抗原蛋白(ORF5)的基因表达组合物、其疫苗表达载体、及含其的口服疫苗；基因表达组合物包括启动子、编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的聚核苷酸、NOS终结子及香蕉重泛素基因3’MAR的聚核苷酸；本发明亦提供该等基因表达组合物、其疫苗表达载体、及含其的口服疫苗的制备方法。此外，本发明亦提供一种预防猪只感染猪生殖与呼吸道综合症(PPRS)的方法，通过基因转殖技术将该等疫苗表达载体转殖于植物体内，再将该等转殖基因植物喂食猪只以使其产生可对抗猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的抗体，以预防猪只感染猪生殖与呼吸综合症(PPRS)。

权利要求

1.一种基因表达组合物，其特征在于，包含：

启动子；

编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的聚核苷酸；

NOS终结子；及

香蕉重泛素基因3’MAR的聚核苷酸，其为SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；

其中该编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的聚核苷酸的5’端连接于该启动子的

3’端，而该编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的聚核苷酸的3’端连接于该NOS终结子的5’端，该NOS终结子的3’端再与香蕉重泛素基因3’MAR的聚核苷酸的5’端连接；该启动子于含有该基因表达组合物的生物体内，驱动下游编码胜肽的聚核苷酸的转录作用。

2.如权利要求1所述的基因表达组合物，其特征在于，所述编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的聚核苷酸，其为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的基因表达组合物，其特征在于，所述启动子包含CaMV35S、香蕉重泛素基因启动子，其为SEQ ID No：3所示的核苷酸序列、或其他可于该生物体内表达目标基因的适用启动子。

4.如权利要求1所述的基因表达组合物，其特征在于，所述编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的聚核苷酸，其3’端可进一步与编码内质网保留讯息胜肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码内质网保留讯息胜肽的聚核苷酸的3’端与如权利要求1所述的NOS终结子的5’端连接。

5.如权利要求4所述的基因表达组合物，其特征在于，所述编码内质网保留讯息胜肽的聚核苷酸，其序列选自SEQ ID No：4或SEQ ID No：5。

6.如权利要求1所述的基因表达组合物，其特征在于，所述编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的聚核苷酸，其3’端可进一步与编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF6胜肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF6胜肽的聚核苷酸，其3’端可进一步与编码内质网保留讯息胜肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码内质网保留讯息胜肽的聚核苷酸的3’端与如权利要求1所述的NOS终结子的5’端连接。

7.如权利要求1所述的基因表达组合物，其特征在于，所述启动子3’端可进一步与编码热不稳定毒素B次单元胜肽的聚核苷酸的5’端连接；其3’端与编码L胜肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码L胜肽的聚核苷酸的3’端与如权利要求1所述的编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的聚核苷酸的3’端与编码内质网保留讯息胜肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码内质网保留讯息胜肽的聚核苷酸的3’端与如权利要求1所述的NOS终结子的5’端连接；

其中该编码热不稳定毒素B次单元胜肽的聚核苷酸为SEQ ID No：6所示的核苷酸序列；该编码L胜肽的聚核苷酸，其聚核苷酸序列选自SEQ ID No：7、SEQ ID No：8和SEQ ID No：9中至少一种。

8.一种重组融合蛋白，其特征在于，包含：热不稳定毒素B次单元胜肽、L胜肽、猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽、猪生殖与呼吸综合症病毒ORF6胜肽及内质网保留讯息胜肽；

其中该热不稳定毒素B次单元胜肽位于重组融合蛋白的N端；该L胜肽的N端与热不稳定毒素B次单元LTB胜肽的C端连接；该L胜肽的C端与该猪生殖与呼吸综合症病毒ORF5胜肽的N端连接；该猪生殖与呼吸综合症病毒ORF6胜肽的C端与该内质网保留讯息胜肽的N端连接；该内质网保留讯息胜肽位于重组融合蛋白的C端；

其中该热不稳定毒素B次单元胜肽为SEQ ID No：10所示的氨基酸序列；该L胜肽，其氨基酸序列选自SEQ ID No：11、SEQ ID No：12和SEQ ID No：13中至少一种；该内质网保留讯息胜肽为SEQ ID No：14所示的氨基酸序列。

9.一种基因表达载体，包含如权利要求1所述的基因表达组合物。

10.一种以植物生产的猪生殖与呼吸道综合症口服疫苗，其特征在于，包含如权利要求

1所述的基因表达组合物。

11.一种以植物生产的猪生殖与呼吸道综合症口服疫苗，其特征在于，以下列步骤制备而得：步骤1：构筑含有如权利要求1所述的基因表达组合物的基因表达转殖载体以得到重组转殖质体；

步骤2：将步骤1的重组转殖质体转殖入植物细胞或组织，以得到含有该重组转殖质体的植物转殖细胞或植物转殖组织；

步骤3：培养步骤2所得的植物转殖细胞或植物转殖组织，以产生含有如权利要求1所述的基因表达组合物的转殖植物或转殖植物的部份器官、组织或细胞，其中该转殖植物或转殖植物的部份器官、组织或细胞即为直接供猪只口服的疫苗。

说明书

一种基因表达组合物、猪生殖与呼吸道综合症口服疫苗及

其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种可表达猪生殖与呼吸综合症病毒的抗原蛋白的基因表达组合物、其疫苗表达载体、及含其基因表达组合物的口服疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 猪生殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是近年来非常重要的猪病毒性疾病，造成欧美及世界各地严重的经济损失。PRRS为一种以
母猪繁殖障碍及各年龄层猪只呼吸道感染为主的猪只传染病，易并发二次性感染而死亡。
而越年幼的猪其并发症越为严重，导致死亡率增加，因而造成经济上很大的损失。

[0003] 本病首先于1987年在美国大多数猪场爆发，因本病有时会造成猪只四肢末端及耳朵的瘀血或发紫，故又称为蓝耳病(blue ear disease)。PRRS主要感染猪的肺脏而造成
间质性肺炎，导致猪只除了呼吸困难外，因肺及全身性的巨噬细胞及与单核球受感染破坏，
因而导致猪的免疫功能缺损，因此易感染二次性病原如沙门杆菌、巴斯德杆菌或其他病毒
性病原(Chiou et al.，2000)。

[0004] 而在血清抗体阳性或肺脏及肺门淋巴结的病毒分离率发现，PRRSV已普遍感染国内猪场。本病的致病病毒，猪生殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductiveand
respiratory syndrome virus，PRRSV)，为正向、单股、具有脂质封套的RNA病毒，可影响猪
只肺脏巨噬细胞的活性，使其伪足变短、减少或呈叶状细胞破裂死亡，而肺脏巨噬细胞的吞
噬和杀菌力亦明显受到抑制(邱等，1998)。

[0005] 近年报告显示RNA活毒疫苗的病毒回变，已造成许多使用疫苗的猪场爆发疫情，显示传统的RNA活毒疫苗或许不可靠且有其危险性，以植物为基础开发此病毒的多价次单
位疫苗，为兼具经济与方便的口服投与方式免疫的途径，若能顺利开发完成，将可降低猪生
殖与呼吸道综合症病毒的危害，并解除传统疫苗在分装、输送、贮存、纯化上的诸多顾虑。

发明内容

[0006] 本发明的目的即在于提供一种以植物生产的猪生殖与呼吸道综合症(PPRS)口服疫苗。

[0007] 本发明的次一目的在于提供各种适用于植物生产猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)抗原的表达载体。

[0008] 本发明的另一目的在于提供该等可于植物体中表达猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)抗原的表达载体的用途，该用途包含以植物体生产病毒抗原、转基因植物、口服疫
苗等。

[0009] 为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

[0010] 一种基因表达组合物(expression cassette)，包含：

[0011] 启动子；

[0012] 编码猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)ORF5胜肽的聚核苷酸；

[0013] NOS终结子；及

[0014] 香蕉重泛素基因3’MAR的聚核苷酸，其具有如SEQ ID No：2的核苷酸序列；其中该编码PRRSV ORF5胜肽的聚核苷酸的5’端连接于该启动子的3’端，而该编码PRRSV ORF5
胜肽的聚核苷酸的3’端连接于该NOS终结子的5’端，该NOS终结子的3’端再与香蕉重泛
素基因3’MAR的聚核苷酸的5’端连接；该启动子可于含有该基因表达组合物的生物体内，
驱动下游编码胜肽的聚核苷酸的转录作用(transcription)。

[0015] 其中该编码PRRSV ORF5胜肽的聚核苷酸，其3’端可进一步与编码内质网保留讯息(HDEL)胜肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码HDEL胜肽的聚核苷酸的3’端与前述
的NOS终结子的5’端连接，即可制得疫苗表达载体，如：本发明所提供的疫苗表达载体
pGKU-35PRRSV、pGKU-79PRRSV。

[0016] 其中该疫苗表达载体pGKU-35PRRSV、pGKU-79PRRSV可分别进一步包含第二启动子(与编码PRRSV ORF5胜肽的聚核苷酸的5’端连接的启动子，称第一启动子)、一码PPRSV
ORF6胜肽的聚核苷酸、第二NOS终结子；其中该第二启动子的3’端与该编码PPRSV ORF6胜
肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码PPRSV ORF6胜肽的聚核苷酸的3’端与该第二NOS终结
子的5’端连接；即可制备含有两个或两个以上启动子的疫苗表达载体(如：本发明所提供
的疫苗表达载体pGKU-5-6)，其中该等启动子可为相同的启动子或不同的启动子。

[0017] 其中该编码PPRSV ORF5胜肽的聚核苷酸，其3’端可进一步与编码PPRSVORF6胜肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码PPRSV ORF6胜肽的聚核苷酸，其3’端可进一步与编码
内质网保留讯息(HDEL)胜肽的聚核苷酸的5’端连接；该编码HDEL胜肽的聚核苷酸的3’
端与前述的NOS终结子的5’端连接，即可制得疫苗表达载体，如：本发明所提供的疫苗表达
载体pGKU-56Fusion。

[0018] 其中该启动子3’端可进一步与编码热不稳定毒素B次单元(heat-labile toxinBsubunit，LTB)胜肽的聚核苷酸的5’端连接；其3’端与编码L胜肽的聚核苷酸的5’端连
接；该编码L胜肽的聚核苷酸的3’端与前述的编码PPRSV ORF5胜肽的聚核苷酸的5’端连
接；该编码PPRSV ORF5胜肽的聚核苷酸的3’端与编码内质网保留讯息(HDEL)胜肽的聚核
苷酸的5’端连接；该编码HDEL胜肽的聚核苷酸的3’端与前述的NOS终结子的5’端连接，
即可制得疫苗表达载体，如：本发明所提供的疫苗表达载体pLTB-L2-ORF5、pLTB-L4-ORF5
及pLTB-L6-ORF5。

[0019] 其中编码PRRSV ORF5胜肽的聚核苷酸，其具有如SEQ ID No：1的核苷酸序列；该启动子(第一启动子或第二启动子)包含但不限于：CaMV35S、香蕉重泛素基因启动子，其具
有如SEQ ID No：3的核苷酸序列、或其他可于该生物体内表达目标基因的适用启动子；该
编码HDEL胜肽的聚核苷酸，具有如SEQ IDNo：4或SEQ ID No：5的核苷酸序列；该编码LTB
胜肽的聚核苷酸具有如SEQ IDNo：6的核苷酸序列；该编码L胜肽的聚核苷酸，其聚核苷酸
序列选自SEQ IDNo：7、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9中至少一种。

[0020] 本发明亦提供通过该等疫苗表达载体所表达出的重组融合蛋白，其包含：热不稳定毒素B次单元(heat-labile toxin B subunit，LTB)胜肽、L胜肽、猪生殖与呼吸综合
症病毒(PRRSV)ORF5胜肽、猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)ORF6胜肽及内质网保留讯息
(HDEL)胜肽。

[0021] 其中该LTB胜肽位于重组融合蛋白的N端；该L胜肽的N端与LTB胜肽的C端连接；该L胜肽的C端与该PRRSV ORF5胜肽的N端连接；该PRRSVORF5胜肽的C端与该HDEL
胜肽的N端连接；该HDEL胜肽位于重组融合蛋白的C端。

[0022] 其中该LTB胜肽具有如SEQ ID No：10的氨基酸序列；该L胜肽，其氨基酸序列选自SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：13中至少一种；该HDEL 胜肽具有如SEQ ID
No：14的氨基酸序列。

[0023] 此外，本发明亦提供包含前述基因表达组合物的基因表达载体(vector)，及利用该等基因表达组合物或其载体于基因转殖方面的应用。该应用包含：一种以植物生产
之猪生殖与呼吸道综合症(PPRS)口服疫苗，及一种预防猪只感染猪生殖与呼吸道综合症
(PPRS)的方法。

[0024] 其中该口服疫苗的制备方法，包含：

[0025] 步骤1：构筑含前述基因表达组合物的基因表达转殖载体(transfer vector)以得到重组转殖质体；

[0026] 步骤2：将步骤1的重组转殖质体转殖入植物细胞或组织，以得到含有该重组转殖质体的植物转殖细胞或植物转殖组织；

[0027] 步骤3：培养步骤2所得的植物转殖细胞或植物转殖组织，以产生含有前述基因表达组合物的转殖植物或转殖植物的部份器官、组织或细胞，其中该转殖植物或转殖植物的
部份器官、组织或细胞即为直接供猪只口服的疫苗。

[0028] 其中该预防猪只感染猪生殖与呼吸道综合症(PPRS)的方法，包含：

[0029] 通过转殖该等基因表达载体于植物，以于植物体表达PRRSV ORF5或其他下述欲表达的蛋白，再将该等转殖基因植株喂食猪只，以使其对猪生殖与呼吸综合症病毒(Porcine
reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)产生抗体，以预防感染猪生殖与
呼吸道综合症(PPRS)。

[0030] 进一步，本发明亦提供一种单离自香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1)的3’侧区(3’Flanking region，3’MAR)的聚核苷酸序列，具有如SEQ ID No：2的序列；该香蕉重泛素
基因的GenBank accession number为AF502575(SEQ ID No：15)。基质结合区序列(matrix
attachment region，MAR)为一段与细胞核基质具有专一性结合的DNA序列，其序列特性为
富含AT碱基且多半位于基因两端的染色质边缘区域。MAR与染色质的缠绕结构解开与否相
关，因此推测MAR参与调控基因的表达(Gasser et al.，1989)。一般而言，MAR的存在有利
于转录作用的进行，即表示此基因具有较高的表达量。

[0031] 上述的核苷酸序列、氨基酸序列，包含但不限于：将本发明所提供的序列，经突变(mutation)、删除(deletion)、插入(insertion)、或取代(replacement)等现有方式，将1
至复数个核苷酸或氨基酸改变，但仍适用本发明目的。较佳者，其应 至少具有80％的序列
互补性(complementary)，或是至少90％的序列同一性(Identitty)。

[0032] 其 中 上述 的 基 因 转 殖 表 达 载 体，包括 但 不 限 于：pBI101、pBI121、pBIN19(ClonTech)、pCAMBIA1301、pCAMBIA1305、pGREEN(GenBank Accession No：
AJ007829)、pGREEN II(GenBank Accession No：EF590266)(www.pGreen.ac.uk)、
pGreen0029(John Innes Centre)。

[0033] 上述转殖基因的方式包括但不限于：农杆菌媒介法、基因重组病毒感染法、跳跃子载体转殖法、基因枪转殖法、电穿孔法、显微注射法、花粉管法、脂质体媒介转
殖法、超音波媒介转殖法、碳化硅纤维媒介转殖法(silicon carbidefiber-mediated
transformation)、电泳法(electrophoresis)、雷射微光束(lasermicrobeam)、聚乙烯二
醇(polyethylene glycol，PEG)、磷酸钙转殖法、DEAE-dextran转殖法等。

[0034] 本发明所提供的以植物生产的猪生殖与呼吸道综合症口服疫苗及其用途，与其他现有技术相互比较时，更具有下列的优点：

[0035] 1.本发明所提供的疫苗表达载体，除可于植物体内表达抗原外，且通过转殖基因技术可产生含其的基因转殖植物，即可做为口服疫苗。

[0036] 2.本发明所提供的口服疫苗，相较于传统制备，除可避免活毒疫苗安全性的问题、亦可解除传统制备疫苗上在分装、输送、贮存、纯化上的诸多顾虑。

附图说明

[0037] 图1A为中间载体PRRSV-35PGHT的构筑策略图，其中p35PGHT经Nco I酶切后再以Sac I进行部分酶切；图1B为疫苗表达载体pGKU-35PRRSV的构筑策略图；

[0038] 图2A为中间载体PRRSV-79PSGHT的构筑策略图，其中p79PSGHT经NcoI酶切后再以Sac I进行部分酶切；图2B为疫苗表达载体pGKU-79PRRSV的构筑策略图；

[0039] 图3A为中间载体ORF6-79PSGHT的构筑策略图，其中p79PSGHT经Nco I酶切后再以Sac I进行部分酶切；图3B为中间载体中间载体P-ORF6-T的构筑策略图；图3C为疫苗
表达载体pGKU-5-6的构筑策略图；图3D为中间载体 ORF56F-79PSGHT的构筑策略图；图3E
为疫苗表达载体pGKU-56Fusion的构筑策略图；

[0040] 图4A为中间载体79LTB-L2-ORF5-PSGHT的构筑策略图，其中p79PSGHT经Sac I部分酶切后再以Nco I酶切；图4B为疫苗表达载体pLTB-L2-ORF5的构筑策略图；图4C
为中间载体79LTB-L4-ORF5-PSGHT的构筑策略图，其中p79PSGHT经Sac I部分酶切后
再以Nco I酶切；图4D为疫苗表达载体pLTB-L4-ORF5的构筑策略图；图4E为中间载体
79LTB-L6-ORF5-PSGHT的构筑策略图，其中p79PSGHT经Sac I部分酶切后再以Nco I酶切；
图4F为疫苗表达载体pLTB-L6-ORF5的构筑策略图；

[0041] 图5A为转殖疫苗表达载体pGKU-35PRRSV的烟草拟转殖植株(1、2、3)的PCR分析结果，其中P为疫苗表达载体pGKU-35PRRSV的PCR分析结果；图5B为转殖疫苗表达
载体pGKU-79PRRSV的烟草拟转殖植株(1、2)的PCR分析结果，其中P为疫苗表达载体
pGKU-79PRRSV的PCR分析结果；图5C为转殖疫苗表达载体pGKU-35PRRSV的烟草拟转殖植
株(1、2、3、4、5、6)的南方氏杂交分析结果，其中P为疫苗表达载体pGKU-35PRRSV的南方氏
杂交分析结果、WT表示未转殖植株；图5D为转殖疫苗表达载体pGKU-79PRRSV的烟草拟转
殖植株(1、2)的南方氏杂交分析结果，其中P为疫苗表达载体pGKU-79PRRSV的南方氏杂交
分析结果、WT表示未转殖植株；

[0042] 图 6A 为 PRRSV ORF5 于 烟 草 转 殖 植 株 (pGKU-35PRRSV(1、2、3、4、5)、pGKU-79PRRSV(6))的RT-PCR 分 析 结 果；图 6B为PRRSV ORF5 于 烟 草 转 殖 植 株
(pGKU-35PRRSV(1、2、3、4、5、6))的RT-PCR分析结果。

[0043] 图7A为PRRSV ORF5于烟草转殖植株pGKU-35PRRSV转殖植株(1、2、3、4、5)、或pGKU-79PRRSV(6)的免疫转渍分析(Immunoblot analysis)结果；其中WT表示未转殖植株；
E.coli表达的重组蛋白做为阳性对照组，其大小约为42kD；图7B为PRRSV ORF5于烟草转
殖植株pGKU-35PRRSV转殖植株(1、2、3、4、5、6)的免疫转渍分析(Immunoblot analysis)
结果；

[0044] 图8A为pGKU-35PRRSV烟草转殖植株(1，2，3，4，5，6)的ELISA结果，其中WT为未转殖植株；图8B为图8A定量后的结果，其中*表示具统计显着意义(P＜0.05)，WT为未转
殖植株；

[0045] 图9A为以pGKU-35PRRSV转殖烟草植株(GP5-T组)喂食猪只后，进行淋巴球增殖反应(DCPM)分析的结果；图9B为以pGKU-35PRRSV转殖烟草植株(GP5-T组)喂食猪只后，
于各时间点侦测IgG抗体量的结果；图9C为以pGKU-35PRRSV转殖烟草植株(GP5-T组)喂
食猪只后，于各时间点侦测IgA抗体量的结果；

[0046] 图10A至图10D分别为香蕉转殖植株不同部位的GUS活性组织化学染色分析结果；

[0047] 图11A为转殖疫苗表达载体pGKU-35PRRSV的香蕉拟转殖植株(1、2、3、4、5)的PCR分析结果，其中P为疫苗表达载体pGKU-35PRRSV的PCR分析结果；图11B为转殖疫苗表达
载体pGKU-79PRRSV的香蕉拟转殖植株(1、2、3、4)的PCR分析结果，其中P为疫苗表达载体
pGKU-79PRRSV的PCR分析结果；

[0048] 图12为转殖疫苗表达载体pGKU-35PRRSV的香蕉拟转殖植株(1、2、3、4、5)的南方氏杂交分析结果，其中P为疫苗表达载体pGKU-35PRRSV的南方氏杂交分析结果、WT表示未
转殖植株；

[0049] 图13为PRRSV ORF5于香蕉转殖植株(pGKU-35PRRSV(1、2、3、4、5))的RT-PCR分析结果；

[0050] 图14为PRRSV ORF5于香蕉转殖植株pGKU-35PRRSV转殖植株(1、2、3、4、5)的免疫转渍分析(Immunoblot analysis)结果；其中WT表示未转殖植株；E.coli表达的重组蛋
白做为阳性对照组；

[0051] 图15A为pGKU-35PRRSV香蕉转殖植株(1，2，3，4，5)的PRRSV ORF5(GP5)抗原表达的ELISA结果，其中WT为未转殖植株；图15B为图15A定量后的结果，其中*表示具统计
显着意义(P＜0.05)，WT为未转殖植株；

[0052] 图16为图9B为以pGKU-35PRRSV转殖香蕉植株(GP5-B组)喂食猪只后，于各时间点侦测IgG抗体量的结果；

[0053] 图17为以pGKU-35PRRSV转殖香蕉植株(GP5-B组)喂食猪只后，进行淋巴球增殖反应(DCPM)分析的结果；

[0054] 图18A为以ORF5基因为探针的疫苗表达载体体pGKU-56Fusion烟草拟转殖植株(1至7)的南方氏杂交分析结果；图18B为以ORF6基因为探针的疫苗表达载体体
pGKU-56Fusion烟草拟转殖植株(1至7)的南方氏杂交分析结果，其中 P为pGKU-56Fusion
的南方氏杂交分析结果、WT为未转殖植株；

[0055] 图19A为以ORF5基因为探针的疫苗表达载体体pGKU-5-6烟草拟转殖植株(1至5)的南方氏杂交分析结果；图19B为以ORF6基因为探针的疫苗表达载体pGKU-5-6烟草拟
转殖植株(1至5)的南方氏杂交分析结果，其中P为pGKU-5-6的南方氏杂交分析结果、WT
为未转殖植株；

[0056] 图20A为PRRSV ORF5-ORF6融合基因于烟草转殖植株(pGKU-56Fusion(1至7))的RT-PCR分析结果；图20B为烟草转殖植株(pGKU-5-6(1至5))的RT-PCR分析结果，其中
是以ORF5基因的专一性引物进行RT-PCR；图20C为烟草转殖植株(pGKU-5-6(1至5))的
RT-PCR分析结果，其中是以ORF6基因的专一性引物进行RT-PCR；

[0057] 图21A为转殖疫苗表达载体pLTB-L2-ORF5的烟草拟转殖植株(1至4)的PCR分析结果，其中P为疫苗表达载体pLTB-L2-ORF5的PCR分析结果、WT为未转殖植株；图21B
为转殖疫苗表达载体pLTB-L4-ORF5的烟草拟转殖植株(1至4)的PCR分析结果，其中P为
疫苗表达载体pLTB-L4-ORF5的PCR分析结果、WT为未转殖植株；图21C为转殖疫苗表达
载体pLTB-L6-ORF5的烟草拟转殖植株(1至8)的PCR分析结果，其中P为疫苗表达载体
pLTB-L6-ORF5的PCR分析结果、WT为未转殖植株；

[0058] 图22A为转殖疫苗表达载体pLTB-L6-ORF5的烟草拟转殖植株(1至8)以ORF基因为探针(0.6kb)的南方氏杂交分析结果，其中P为疫苗表达载体pLTB-L6-ORF5的南方氏
杂交分析结果、WT表示未转殖植株；图22B为转殖疫苗表达载体pLTB-L6-ORF5的烟草拟转
殖植株(1至8)以LTB基因为探针(0.4kb)的南方氏杂交分析结果，其中P为疫苗表达载
体pLTB-L6-ORF5的南方氏杂交分析结果、WT表示未转殖植株；

[0059] 图23A为pLTB-L2-ORF5于烟草转殖植株(1至4)的RT-PCR分析结果；图23B为pLTB-L4-ORF5于烟草转殖植株(1至4)的RT-PCR分析结果；图23C为pLTB-L6-ORF5于烟
草转殖植株(1至4)的RT-PCR分析结果；

[0060] 图24A为烟草转殖株(pGKU-35PRRSV(ORF5)、pLTB-L2-ORF5(LTB-ORF5))的PRRSVORF5(GP5)抗原表达的ELISA结果，其中WT为未转殖植株；图24B为图24A定量后的结果；

[0061] 图25A为分别以pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、pGKU-PRRSV-ORF5转殖烟草植株喂食猪只后，进行淋巴球增殖反应(CPM)分析的结果；图25B为分别以pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、
pGKU-PRRSV-ORF5转殖烟草植株喂食猪只后，于各时间点侦测IgA抗体量的结果；图25C为
分别以pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、pGKU-PRRSV-ORF5转殖烟草植株喂食猪只后，于各时间点侦
测IgG抗体量的结果；其中W-T为未转殖植株。

具体实施方式

[0062] 本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。

[0063] 本发明系以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明所用之药物、生物材料皆市售易于取得。

[0064] 实施例1疫苗表达载体的构筑

[0065] (丨)材料及方法

[0066] A.质体材料

[0067] 质体p35PGHT：全长8.1kb，含有0.4kb的CaMV 35S启动子、GUS报导基因、NOS终结子及香蕉重泛素基因3’MAR。

[0068] 质体p79PSGHT：全长9.1kb，含有香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1)启动子、GUS报导基因、NOS终结子及香蕉重泛素基因3’MAR。

[0069] 质体pGKU：全长7.4kb，含有left border和right border，以CaMV 35S启动子分别驱动筛选基因nptII及报导基因GUS。

[0070] 质体pBluescript II SK(-)：全长2.9kb，具有multiple cloning site(MCS)。

[0071] 其中质体pGKU及质体pBluescript II SK(-)皆为市售易于取得的质体；而质体p35PGHT及质体p79PSGHT则通过下列构筑策略以得：

[0072] 请参阅台湾专利申请案(TW patent appl.No.097131520)。首先，通过PCR及适用的引物对BMARR及BMARF，以选殖出香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1)的3’侧区(3’Flanking
region，3’MAR)的聚核苷酸片段，具有如SEQ ID No：2的序列；该香蕉重泛素基因
(Mh-UBQ1)的GenBank accession number为AF502575(SEQ ID No：15)；该3’MAR位于香
蕉重泛素基因(Mh-UBQ1)的3’端序列终止码下游2968bp片段。将选殖出的3’MAR片段
以EcoRI及SalI进行酶切后，构筑于pMhUBQ1p-GUS(TW patent appl.No.097131520的中
间质体)，以得到具有如图1A所示的p35PGHT质体及如图2A所示的p79PSGHT质体。其中
该p35PGHT的启动子为CaMY 35S启动子；该p79PSGHT的启动子为Mh-UBQ1的启动子，具有
如SEQ ID No：3的聚核苷酸序列(TW patent appl.No.097131520)。

[0073] B.引子

[0074] 本发明中所用的引物，如表1所示：

[0075] 表1引物列表

[0076]：
oN
DI
QES 61 71 81 91 02 12 22 32 42
H H
D E D E
L * L *
I ca I ca
S ’ S ’
3-gC 3-CA I
TACC gTTT apA ’3-T
I iS CCAg I ATAC II I a ’3 CAAg
N ’ CAgg ocN ggTT caS I pA -TCA gggT
3-gT ggTg ’3- TgTA ’3 ocN ’3-T Aggg TgTA
TCgT CTAC ATCC CTAC -ATg ’3- CAAg gTTg ACCT
CAAg TCgA CTgC TTAA TCCC CCCA gggT TATC ggTC
gggT AACT Tggg CATT CAAC gCAg TgTA CAgg CAgg
TACg CTCg gTAC CTCg ggCg ggTA CCCg CCCg CCCg
列序物引 TAgAC-’5 AgCgT-’5 CgAAT-’5 AgCgg-’5 CCTAA-’5 CCAAT-’5 ggATT-’5 ggATT-’5 ggATT-’5

向
反
/
向 向 向 向 向 向 向 向 向 向
正 正 反 正 反 正 反 正 正 正

称名 6 6 2cS5 N5 25 45 65
物引 FRP RRP FRO5 FRO3 FRO5 FRO3 FRO5 FRO5 FRO5

[0077] [0077]Apa I
BMARR 反向 5’-actgaattcgtccgctgctttgctgt-3 28
BMARF 正向 5’-gcgcgtcgaccaaatttttgttagattgcatg-3’ 29

[0078] C.植物材料

[0079] 本 发 明 以 烟 草 (Nicotiana tabacum L.cv Wisc.38)及 北 蕉 (Musa spp.cvPei-Chiao，AAA group)作为农杆菌基因转殖的试验材料，但任何适用于本发明的品种及
转殖方法皆包含于本发明可应用的范围。

[0080] D.基因转殖方法

[0081] 烟草叶圆片的转殖及筛选

[0082] 本方法修改自Horsch等(1985)，试验材料为烟草(Nicotiana tabacumL.cvWisc.38)。取无菌播种烟草植株的叶片，直接于农杆菌液下切取叶圆片进行转殖。叶
-1
圆片置于N01B1培养基(MS Macro(1X)，MS Micro(1X)，MS vitamins(1X)，0.1mg1 NAA，
-1 -1 -1
1mgl BA，30gl sucrose，7gl agar，pH5.7)上，于25℃、16小时光照环境下共培养三天。将
叶圆片以含250mg/L cefotaxime的N01B1清洗后，移置含250mg/L头孢噻肟(cefotaxime)
及100mg/L卡拉霉素(kanamycin)的N01B1固体培养基上，于25℃、16小时光照环境下
进行筛选约三星期。待叶圆片长出不定芽后，移至含有250mg/L cefotaxime及200mg/L
kanamycin的N01B1固体培养基上，于25℃、16小时光照环境下进行次筛选培养。经筛选的
不定芽分切后移入含有250mg/L cefotaxime及200mg/L kanamycin的N01B1固体培养基
中，待其发根后可移出瓶，进行后续分析。

[0083] 香蕉悬浮细胞的转殖及筛选

[0084] 本方法依据林(1997)，香蕉悬浮培养细胞经自然沉降后，制备成50％(v/v)细胞液与农杆菌液均匀混合后，经共培养三天后将细胞移至含200mg/L cefotaxime及
50mg/L G418的SHGC固体培养基(SH Macro(1X)，SH Micro(1X)，MS vitamins(1X)，
-1 -1 -1 -1 -1
100mgl glutamine，1mgl biotin，230mgl proline，10gl lactose，45gl sucrose，
-1 -1 -1 -1 -1
0.1gl maltextract，0.2mgl NAA，0.2mgl 2ip，0.1mgl kinetin，0.05mgl zeatin，
-1 -1 -1
200mgl cefotaxime，50mgl G418，3gl gelrite，pH5.3)上进行筛选，并待其发育为体胚。
之后再将体胚移至 发芽培养基于25℃、16小时光照环境下继续筛选培养，待其发芽并成
为植株后，进行后续分析。

[0085] (二)ORF5基因的构筑

[0086] 本发明欲表达PRRSV ORF所编码的主要外套糖 蛋白5(ORF5-encodedmajorenvelop glycoprotein 5)于植物体内，进而将该等转殖基因植物做为口服疫苗以喂
食动物，以使其可产生对抗PRRSV的抗体，进而对抗PPRS。因此，进行下述构筑：

[0087] 请参阅图1A、图1B、图2A、图2B所示，以猪生殖与呼吸道综合症病毒(poreinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的ORF5基因片段作为模板，利
用引物PRF和PRR进行PCR合成末端带有内质网保留讯息HDEL片段的ORF5基因片段，以
NsiI酶切后以Klenow处理将3’端切平，再以SacI酶切后回收0.6kb的片段，接入经NcoI
及SacI酶切的载体p35PGHT及p79PSGHT，可得中间载体PRRSV-35PGHT及PRRSV-79PSGHT。
中间载体PRRSV-35PGHT及PRRSV-79PSGHT经PstI酶切后分别回收4.2kb及5.2kb片段，
接入以PstI酶切的pGKU，得到分别由CaMV 35S启动子及香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1)启动
子驱动ORF5基因的疫苗表达载体pGKU-35PRRSV及pGKU-79PRRSV，且均具有含基质结合区
的香蕉泛素基因3’端邻近序列(Mh-UBQ 1flanking region，MAR)、报导基因GUS及NOS终
结子。

[0088] (三)同时表达ORF5与ORF6基因的构筑

[0089] 请参阅图3A至图3B所示，以PRRSV ORF6基因作为模板，利用引物5ORF6和3ORF6进行PCR合成末端带有内质网保留讯息HDEL片段的ORF6基因片段，以NcoI及
SacI酶切后回收0.5kb的片段，接入经NcoI及SacI酶切的载体p79PSGHT，可得中间载体
ORF6-79PSGHT。中间载体ORF6-79PSGHT以HindIII及EcoRI酶切后接入载体pSK(-)中，
于NOS终结子(T)后加上PstI切位，且去除含基质结合区的香蕉泛素基因3’端邻近序列
(Mh-UBQ13’franking region)，即可得到中间载体P-ORF6-T；再以PstI酶切后回收2.3kb，
与中间载体PRRSV-79PSGHT经PstI酶切后回收的5.2kb片段，同时接入以PstI酶切的
pGKU，即可得到分别由香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1)启动子驱动ORF5及 ORF6基因的疫苗表
达载体pGKU-5-6(图3C)。

[0090] 请参阅图3D所示，利用引物5ORF5Sc2和3ORF5N进行PCR，合成带有NcoI切位的ORF5基因末段片段，经NcoI及SacII酶切后回收50bp片段，与经HindIII及NcoI酶切
的中间载体ORF6-79PSGHT，及以HindIII及SacII酶切pGKU-79PRRSV后所回收的0.7kb
片段进行三段接合反应，得到中间载体ORF56F-79PSGHT。请参阅图3E所示，中间载体
ORF56F-79PSGHT经PstI酶切后回收5.7kb片段，接入以PstI酶切的pGKU，得到由香蕉重
泛素基因(Mh-UBQ1)启动子驱动ORF5与ORF6融合基因的疫苗表达载体pGKU-56Fusion，且
具有含基质结合区的香蕉泛素基因3’端邻近序列、报导基因GUS及NOS终结子。

[0091] (四)表达ORF5与LTB融合基因的构筑

[0092] 请参阅图4A至4B所示，以PCR方式将LTB基因及ORF5基因相接，并使二基因间具有甘氨酸(glycine，G)及脯氨酸(proline，P)。由于ApaI切位认定序列为gggCCC，转译
的氨基酸为GP，故使用ApaI切位连接LTB与ORF5基因。利用引物5LTB和3LTB2合成带
有BspHI及ApaI切位的LTB基因片段，而利用引物5ORF52和PRR合成前端带有GP(SEQ ID
No：11)、末端带有HDEL的ORF5基因片段。LTB基因片段以BspHI及ApaI酶切后回收0.4kb
的片段，与经ApaI及SacI酶切后回收的ORF5基因片段，共同接入经NcoI及SacI酶切的载
体p79PSGHT，可得中间载体79LTB-L2-ORF5-PSGHT。之后中间载体79LTB-L2-ORF5-PSGHT经
PstI酶切后回收5.6kb片段，接入以PstI酶切的pGKU，得到由香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1)
启动子驱动LTB与ORF5融合基因的疫苗表达载体pLTB-L2-ORF5，且具有含基质结合区的香
蕉泛素基因3’端邻近序列、报导基因GUS及NOS终结子；其中疫苗表达载体pLTB-L2-ORF5
所含LTB-L2-ORF5核苷酸片段，具有如SEQ ID No：25的序列。请参阅图4C至4F所示，分别
利用引物5ORF54和PRR、5ORF56和PRR合成前端带有二个重复GP(SEQ ID No：12)、三个重
复GP(SEQ ID No：13)，而末端带有HDEL的ORF5基因片段。以上述方式与LTB基因共同接
入以PstI酶切的pGKU，得到由香蕉重泛素基因(Mh-UBQ1)启动子驱动LTB与ORF5融合基
因的疫苗表达载体pLTB-L4-ORF5及pLTB-L6-ORF5；其中疫苗表达载体pLTB-L4-ORF5所含
LTB-L4-ORF5核苷酸片段，具有如SEQ ID No：26的序列；其中疫苗表达载体pLTB-L6-ORF5
所含LTB-L6-ORF5核苷酸片段，具有如SEQ ID No：27的序列。

[0093] 将前述制得的各疫苗表达载体分别于烟草、香蕉进行基因转殖，以取得含有该些疫苗表达载体的基因转殖植物。该基因转殖方法可由该领域具有通常知识者，以现有技艺
进行基因转殖，亦可参阅台湾专利申请案(申请日：2008年12月26日、申请号：097150905)
所揭露的方法。

[0094] 实施例2表达ORF5基因烟草转殖植株的分析

[0095] 烟草转殖植株的分子验证

[0096] 经抗生素筛选得到的烟草拟转殖植株，其GUS活性组织化学染色分析结果呈现蓝色正反应。抽取拟转殖植株叶片的基因组DNA，以适用的引物进行PCR。PCR结果显示，可于
pGKU-35PRRSV拟转殖植株(图5A)及pGKU-79PRRSV拟转殖植株(图5B)中侦测到预期的
合成片段；而南方氏杂交分析结果亦有预期的讯号片段，其中图5C为pGKU-35PRRSV拟转殖
植株分析结果、图5D为pGKU-79PRRSV拟转殖植株分析结果。

[0097] 烟草转殖植株的基因表达分析

[0098] 抽取表达PRRSV ORF5基因的烟草转殖株叶片总量RNA，并于PRRSVORF5基因片段5’端及3’端设计专一性序列作为引物，进行反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)，请参阅图
6A所示，第1道(lane)至第5道为pGKU-35PRRSV拟转殖植株、第6道为pGKU-79PRRSV拟
转殖植株，皆有预期长度的0.6kb片段合成；请参阅图6B所示，第1道(lane)至第6道为
pGKU-35PRRSV拟转殖植株皆有预期长度的0.6kb片段合成。

[0099] 烟草转殖植株的PRRSV的GP5(ORF5-encoded major envelop glycoprotein5)蛋白表达及定量分析

[0100] 抽取表达PRRSV ORF5基因的烟草转殖株叶片蛋白，经10％的12烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sμlfate polyacrylamide gelelectrophoresis，
SDS-PAGE)后转渍于膜上，以相对应于PRRSV的专一性抗体(anti-PRRSV rabbit
serum)进行免疫转渍分析；结果显示，无论于pGKU-35PRRSV 转殖植株(1，2，3，4，5)、或
pGKU-79PRRSV(6)(如图7A所示)、或pGKU-35PRRSV转殖植株(1，2，3，6)(如图7B所示)皆
可侦测到GP5的表达。而以酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，
ELISA)进行转殖烟草的表达抗原定量分析；以适量大肠杆菌表达的GP5重组蛋白作为定
量标准，各pGKU-35PRRSV(1，2，3，4，5，6)转殖烟草的ELISA测量结果，如图8A所示，将之
定量后，pGKU-35PRRSV转殖烟草所表达的GP5蛋白量约为112ng/mgTSP(total soluble
protein)，占总水溶性蛋白的0.01％(如图8B所示)。转殖烟草于猪只的口服免疫测试结
果

[0101] 剪取pGKU-35PRRSV转殖烟草植株(GP5-T组)叶片或未转殖烟草植株(WT)叶片50g分别喂食仔猪，共喂食四次(第0天、第14天、第28天、及第42天)，每次间隔两
周，并分别于第1、6、13、20、27、34、41、48天收集血清、唾液样本、及周边血液单核球细胞
(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)以进行免疫能力的分析；其中分别测定样
本中抗PRRSV的总IgG、总IgA量，及对PRRSV的特异性淋巴球增殖反应(PRRSV-specific
lymphocyte blastogenicresponse)。该淋巴球增殖反应以每分钟的计量变化(difference
in counts per minute，DCPM)代表。

[0102] 结果显示，经喂食GP5-T(试验组)或WT叶片(对照组)后，并无仔猪出现呼吸的或其他临床征兆，此即证实服用转殖烟草植株或未转殖烟草植株对于仔猪无安全之虞。将
前述各时间点所收集的PBMC，将之以104TCID50PRRSV病毒株MD-001进行刺激。经72小
3
时刺激后，将[H]-thymidine加入其中，待培养18小时后即可测量每分钟计量值(counts
per minute，CPM)，进而计算DCPM。请参阅图9A所示，专一对PRRSV所产生的淋巴球增殖
反应最早可于第13天(经第1天GP5-T叶片的口服接种后)即可观察到，并随着第2次至
第4次GP5-T叶片口服接种，该淋巴球增殖反应(DCPM)亦随之明显增加(P＜0.05)。

[0103] 另，请参阅图9B所示，为前述各时间点所收集的血清中对抗PRRSV GP5的IgG抗体的量。于第1天及第13天(days post-initial oral vaccination，DPIOV)期间，该对抗
PRRSV GP5的IgG抗体的量无明显变化。然而，于第20天后(距第2次口服接种后6天)
可观察到喂食GP5-T叶片的猪只，其对抗PRRSV GP5 的IgG抗体明显增加。随着第2次至
第4次GP5-T叶片口服接种，该对抗PRRSVGP5的总IgG抗体量亦随之逐渐增加。

[0104] 请参阅图9C所示，最早可于第20天后(DPIOV)可观察到喂食GP5-T叶片的猪只，其对抗PRRSV GP5的IgA抗体明显增加。随着第2次至第4次GP5-T叶片口服接种，该对
抗PRRSV GP5的总IgA抗体量亦随之逐渐增加。

[0105] 上述结果显示，口服喂食(接种)可表达PRRSV GP5蛋白的转殖植株予猪只，可使其产生可对抗PRRSV的免疫反应，进而避免感染PRRS。

[0106] 实施例3表达ORF5基因香蕉转殖植株的分析

[0107] 香蕉转殖植株的染色分析

[0108] 将实施例1中所制得的pGKU-35PRRSV、pGKU-79PRRSV质体转殖入香蕉，如：北蕉(Pei Chiao)，并以GUS活性组织化学染色检测该香蕉转殖植株各部位以分析该是否香蕉转
殖植株表达PRRSV GP5蛋白。请参阅图10A至图10D，结果显示，图10A为对照组的根部；
图10B为pGKU-79PRRSV转殖香蕉植株幼苗的根部；图10C及图10D分别代表pGKU-35PRRSV
转殖香蕉植株幼苗的根部及叶片；分别可于根部及叶片呈现蓝色正反应。

[0109] 香蕉转殖植株的分子验证

[0110] 另，抽取表达PRRSV ORF5基因的香蕉转殖株基因组DNA，并于PRRSVORF5基因片段5’端及3’端设计专一性序列作为引物，进行聚合酶连锁反应。请参阅图11A为
pGKU-35PRRSV香蕉转殖植株的聚合酶连锁反应分析结果，结果显示，香蕉拟转殖植株(1、
2、3、4、5、6)皆有预期长度的0.6kb片段被合成；请参阅图11B为pGKU-79PRRSV香蕉转殖植
株的聚合酶连锁反应分析结果，结果显示，香蕉拟转殖植株(2、3、4)皆有预期长度的0.6kb
片段被合成，证实转殖基因已确实插入植株基因组内。且南方氏杂交分析结果亦有预期的
讯号片段(图12)。

[0111] 香蕉转殖植株的基因表达分析

[0112] 抽取香蕉转殖植株pGKU-35PRRSV(1，2，3，4，5)的叶片总量RNA，并于 PRRSV ORF5基因片段5’端及3’端设计专一性序列作为引物，进行反转录聚合酶连锁反应，皆显示有预
期长度的0.6kb片段合成(图13)。

[0113] 香蕉转殖植株的PRRSV的GP5(ORF5-encoded major envelop glycoprotein5)蛋白表达及定量分析

[0114] 抽取香蕉转殖植株pGKU-35PRRSV(1，2，3，4，5)的叶片蛋白，经10％的SDS-PAGE后转渍于膜上，以相对应于PRRSV的专一性抗体进行免疫转渍分析，亦可侦测到GP5的表达
(图14)。而以ELISA进行转殖香蕉的表达抗原定量分析，以适量大肠杆菌表达的GP5重组
蛋白作为定量标准，各pGKU-35PRRSV(1，2，3，4，5，6)转殖香蕉的ELISA测量结果，如图15A
所示，将之定量后，pGKU-35PRRSV转殖香蕉所表达的GP5蛋白量约为285ng/mg TSP，约占总
水溶性蛋白的0.03％(图15B)。

[0115] 转殖香蕉于猪只的口服免疫测试结果

[0116] 以MTS(Promega)方法检测PRRSV特异性淋巴细胞增殖反应。实验中分别于第0、14、28天时以口服方式，将pGKU-35PRRSV转殖香蕉植株(GP5-B)、或未转殖香蕉植株(WT)
叶片，给予5-6周龄猪只(无猪生殖与呼吸综合症病毒感染，PRRSV-free)，同时由第7天开
始，每隔14天采集血液、唾液样本，之后再以MTS方式检测周边血液单核球(PBMC)内特异
性T cell的表达能力。检测方式如下，以三个重复的方式于96wells平底盘内加入100μl
5
PBMCs(2×10cells/well)，并以100μl、104TCID50PRRSV进行刺激，于37℃、5％CO2下培
养三天后，加入20μl检测试剂并于OD490nm下判读其数值。StimulationIndex(SI)＝有
PRRSV刺激下所得的平均吸光值/无PRRSV刺激下所得的平均吸光值。

[0117] 请参阅图16所示，结果显示于第21天即可观察到喂食GP5-B叶片的猪只，其对抗PRRSV GP5的IgG抗体明显增加。随着第2次至第3次GP5-B叶片口服接种，该对
抗PRRSV GP5的总IgG抗体量亦随之逐渐增加。将前述各时间点所收集的PBMC，将之以
104TCID50PRRSV病毒株MD-001进行刺激。经72小时刺激后，将MTS加入其中，并测量其吸
光值(OD value)。请参阅图17所示， 专一对PRRSV所产生的淋巴球增殖反应最早可于第
21天(经第1次GP5-B叶片的口服接种后)即可观察到，并随着第2次至第3次GP5-B叶
片口服接种，该淋巴球增殖反应亦随之明显增加(P＜0.05)。

[0118] 综上所述，表达ORF5基因的转殖烟草、香蕉经喂食猪只后，可于猪只血清及唾液内侦测到相对应的IgG及IgA产生。为进一步提高抗体产生效价及病毒中和能力，本发明
亦进行新一批疫苗表达载体的构筑。

[0119] 新疫苗表达载体的特性

[0120] 肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)热不稳定毒素B次单元(heat-labile toxin B subunit，LTB)为五环状结构的蛋白，因其可与小肠黏膜
细胞结合，故可帮助抗原进入并进一步诱发肠道免疫反应，所以常被作为佐剂(adjuvant)
使用。此外，研究指出PRRSV ORF6会利用半胱氨酸(cysteine)与ORF5形成异型双元体
(heterodimer)，若同时表达ORF5及ORF6，则产生的相对应抗体具有较佳的病毒中和能力
(Jiang et al.，2006)。

[0121] 因此，本发明通过LTB及ORF6的特性，选殖出LTB基因及ORF6基因，所得到的选殖经序列比对，与NCBI资料库的LTB基因(Accession No.M17873)及文献相符(Chueh and
Lee，2001)，将之构筑于新一批的疫苗表达载体(请参阅实施例1(四)表达ORF5与LTB融
合基因的构筑)，并于实施例4及实施例5分别进行基因表达、分子验证、免疫能力等分析。

[0122] 实施例4同时表达ORF5及ORF6基因的烟草转殖植株的分析

[0123] 烟草转殖植株的分子验证

[0124] 抗生素筛选得到的烟草拟转殖植株，剪取其叶片进行GUS活性组织化学染色呈蓝色正反应。进一步抽取下列植株的基因组DNA：1.表达ORF5与ORF6融合基因的转殖烟
草(pGKU-56Fusion)，2.同时表达ORF5与ORF6融合基因的转殖烟草(pGKU-5-6))；分别
以ORF5及ORF6基因片段作为探针，其南方氏杂交分析结果皆有预期的讯号片段(分别
如图18A、18B、19A、19B所示)。其中图18A以ORF5基因为探针(0.6kb)的烟草转殖质体
pGKU-56Fusion转殖植株的南方氏杂交分析结果；图18B以ORF6基因为探针(0.5kb)的烟
草转殖质体pGKU-56Fusion转殖植株的南方氏杂交分析结果；图19A以ORF5基因为探针
(0.6kb)的烟草转殖质体pGKU-5-6转殖植株的南方氏杂交分析结果；图19B以ORF6基因
为探针(0.5kb)的烟草转殖质体pGKU-5-6转殖植株的南方氏杂交分析结果。

[0125] 烟草转殖植株的基因表达分析

[0126] 抽取烟草pGKU-56Fusion转殖植株叶片总量RNA，并以ORF5及ORF6基因专一性引物进行反转录聚合酶连锁反应以确认目标基因正常表达，可合成预期的1.1kb片段(第
1，2，3，4，7道)(图20A)；抽取烟草pGKU-5-6转殖植株叶片总量RNA，分别以ORF5及ORF6
基因的专一性引物进行反转录聚合酶连锁反应均可合成预期长度的0.6及0.5kb片段(图
20B、图20C)。

[0127] 实施例5表达表达ORF5与LTB融合基因的烟草转殖植株的分析

[0128] 烟草转殖植株的分子验证

[0129] 请参阅图21A至21C所示，将表达LTB与ORF5融合基因的拟转殖烟草的基因组DNA，以LTB及ORF5基因的专一性引物进行聚合酶连锁反应。PCR结果显示，可于表达LTB与
ORF5融合基因的拟转殖植株中侦测到预期的合成片段(1kb)；其中图21A为pLTB-L2-ORF5
拟转殖植株的PCR分析结果；其中图21B为pLTB-L4-ORF5拟转殖植株的PCR分析结果；其
中图21C为pLTB-L6-ORF5拟转殖植株的PCR分析结果。

[0130] 另，请参阅图22A至22B所示，分别以LTB及ORF5基因片段作为探针，其南方氏杂交分析结果亦有预期的讯号片段；其中图22A为pLTB-L6-ORF5拟转殖植株以ORF基因为探
针(0.6kb)的南方氏杂交分析结果；其中图22B为pLTB-L6-ORF5拟转殖植株以LTB基因为
探针(0.4kb)的南方氏杂交分析结果。

[0131] 烟草转殖植株的基因表达分析

[0132] 请参阅图23A至23C所示，分别抽取烟草pLTB-L2-ORF5(具编码重复甘氨酸及脯氨酸的聚核苷酸序列，简称编码L胜肽的聚核苷酸序列)、pLTB-L4-ORF5(具编码二个重复
甘氨酸及脯氨酸的聚核苷酸序列)、pLTB-L6-ORF5(具编码三个重复甘氨酸及脯氨酸的聚
核苷酸序列)转殖植株叶片 总量RNA，并分别以LTB及ORF5基因专一性引物进行反转录聚
合酶连锁反应以确认目标基因正常表达，均可合成预期长度的1kb片段(图23A至23C)。
烟草转殖植株的PRRSV的GP5(ORF5-encoded major envelop glycoprotein5)蛋白表达及
定量分析

[0133] 请参阅图24A至24B所示，抽取表达LTB与ORF5融合基因的烟草转殖株(pGKU-35PRRSV(ORF5)、pLTB-L2-ORF5(LTB-ORF5))叶片蛋白，以ELISA进行转殖烟草的表
达抗原定量分析，抗体为：anti-GP5单株抗体(图24A)，使用大肠杆菌所表达的GP5重组蛋
白作为定量标准，经定量后，转殖烟草pLTB-L2-ORF5转殖株所表达的GP5蛋白量为155ng/
mg TSP(total solubleprotein)，占总水溶性蛋白的0.015％(图24B)。

[0134] 转殖烟草于猪只的口服免疫测试结果

[0135] 剪取转殖烟草植株叶片50g喂食仔猪，共喂食三次，每次间隔两周。请参阅图25A所示，实验中分别于第0、14、28天时以口服方式，将50g PRRSV-ORF5基因转殖
烟草(pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、pGKU-PRRSV-ORF5)分别给予八周龄无猪生殖与呼吸综合
症病毒感染的猪只(n＝4)，同时由第七天开始，每隔14天以EDTA抗凝管采集血液，之
后再以blastogenesis方式检测周边血液单核球(PBMC)内特异性淋巴求的增殖能力
(CPM)(检测样本的收集，如实施例2所述)。结果显示，相较于W-T(对照组)，无论是
pGKU-PRRSV-ORF5-LTB或pGKU-PRRSV-ORF5转殖烟草皆可于第一次口服接种后，约第3周可
观察到对PRRSV的特异性淋巴球增殖反应(CPM)明显增加，且随着第2次至第3次口服接
种，该淋巴球增殖反应亦随之明显增加。

[0136] 另，请参阅图25B及图25C所示，分别于第0、14、28天时以口服方式，将50g基因转殖烟草(pGKU-PRRSV-ORF5-LTB、pGKU-PRRSV-ORF5)分别给予八周龄无猪生殖与呼吸综合
症病毒感染的猪只(n＝4)，同时由第七天开始，每隔14天采集血液一次，之后再以ELISA
方式检测唾液内PRRSV特异性抗体(IgA)及特异性抗体(IgG)的力价。结果显示，相较于
W-T(对照组)，无论是pGKU-PRRSV-ORF5-LTB或pGKU-PRRSV-ORF5转殖烟草皆可于第一次
口服接 种后，约第3周可观察到对PRRSV的特异性抗体(IgA)量、特异性抗体(IgG)量明
显增加，且随着第2次至第3次口服接种，该特异性抗体(IgA)量、特异性抗体(IgG)量亦
随之明显增加。

[0137] 上列详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。