蝇蛆提取物及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种蝇蛆提取物，其主要成分为水溶性蛋白质，所述的蝇蛆提取物中水溶性蛋白质的质量百分含量为50％-70％；所述的水溶性蛋白质的分子量为2-16KDa。该蝇蛆提取物不仅在体外对人原髓细胞白血病HL-60细胞、人红白血病K562细胞、人肝癌SMMC-7721、小鼠白血病P388细胞、人肺腺癌A549细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人前列腺癌PC3细胞、人宫颈癌HeLa具有明显的抑制作用；而且对小鼠S180肉瘤和小鼠Heps肝癌实体瘤有显著抑制作用，同时它还具有增强机体体液免疫作用。本发明还公开了蝇蛆提取物的制备方法，该方法操作简便、易于控制、成本低，适于工业化生产。

权利要求

1.一种蝇蛆提取物，其特征在于，所述的蝇蛆提取物的主要成分为水溶性蛋白质，所述的蝇蛆提取物中水溶性蛋白质的质量百分含量为50％-70％；所述的水溶性蛋白质的分子量为2-16千道尔顿。

2.根据权利要求1所述的蝇蛆提取物，其特征在于，所述的水溶性蛋白质主要由如下质量百分比的氨基酸组成：天门冬氨酸6.3％-7.2％、苏氨酸3.6％-4.0％、丝氨酸

3.6％-3.9％、谷氨酸14.5％-15.5％、甘氨酸5.5％-6.0％、丙氨酸17.8％-19.6％、胱氨酸1.6％-1.8％、缬氨酸5.6％-6.5％、甲硫氨酸2.3％-2.4％、异亮氨酸3.1％-3.8％、亮氨酸4.2％-5.2％、酪氨酸2.5％-2.7％、苯丙氨酸2.6％-3.1％、赖氨酸8.4％-8.9％、组氨酸3.4％-3.8％、精氨酸1.1％-1.3％和脯氨酸4.2％-4.8％。

3.根据权利要求1所述的蝇蛆提取物，其特征在于，所述的蝇蛆提取物中糖的质量百分含量为0.5％-2.0％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的蝇蛆提取物的制备方法，包括步骤：

(1)粉碎：将蝇蛆漂洗干净后干燥、粉碎成蝇蛆粉；

(2)脱脂：向步骤(1)得到的蝇蛆粉中加入蝇蛆粉1-5倍体积量的石油醚，室温浸泡

6-12小时，除去石油醚，得到脱脂后的蝇蛆粉；

(3)超声水提：向步骤(2)得到的脱脂后的蝇蛆粉中加入脱脂后的蝇蛆粉5-10倍体积量的水超声提取1-3次，每次超声10-30分钟，过滤；滤渣再用滤渣4-8倍体积量的水超声提取1-3次，每次超声10-30分钟，过滤；合并二次滤液；经离心、超滤和冷冻干燥，得到蝇蛆提取物。

5.根据权利要求1-3任一项所述的蝇蛆提取物在制备用于治疗白血病、肝癌、肺腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、宫颈癌中的一种或多种的药物、制备增强机体体液免疫作用的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物的剂型为注射剂。

7.根据权利要求1-3任一项所述的蝇蛆提取物在制备用于抑制人原髓细胞白血病HL-60细胞、人红白血病K562细胞、人肝癌SMMC-7721细胞、小鼠白血病P388细胞、人肺腺癌A549细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人前列腺癌PC3细胞、人宫颈癌HeLa细胞、小鼠S180肉瘤和小鼠Heps肝癌实体瘤中的一种或多种的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物的剂型为注射剂。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的蝇蛆提取物和/或药学上可接受的载体。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为注射剂。

说明书

蝇蛆提取物及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及药用提取物领域，具体涉及一种蝇蛆提取物及其制备方法和用途。 背景技术

[0002] 家蝇幼虫，为丽蝇科大头金蝇(Chrysomiamegacephala，Fab.)。作为药用，明朝李时珍的《本草纲目》中就有记载：“蛆，又称‘五谷虫’、‘罗仙子’、‘水仙子’，可治小儿疳热、为治疳疾之良药。”蝇蛆性寒无毒，是一种优质的动物蛋白源，不但蛋白质含量丰富，而且蛋白质中氨基酸的组分也非常合理俱全，蝇蛆干粉中蛋白质的质量百分含量一般在62％左右，脂肪的质量百分含量一般在10％-15％。据报道，任何种类的病原菌，在蝇蛆体内的存活时间都不超过七天。因此，科学家认为，它极可能具有一种抵御病原菌感染的独特的免疫防疫机制。

[0003] 恶性肿瘤是严重威胁人民生命和健康的多发病及常见病，全世界每年有700万人发生肿瘤，500万人被肿瘤夺去生命，现肿瘤患者在1000万人以上。目前估计全国每年肿瘤发病人数约160万，全国每年死于肿瘤病的人数已达130万人，并且仍有上升趋势，恶性肿瘤疾病正在超过心血管疾病而成为人口死亡的第一原因。另外，肿瘤对病人造成的痛苦、对家庭带来的精神及经济负担、对社会生产力造成的影响更是难以估计。因此，各国都高度重视肿瘤的防治研究。

[0004] 当今，手术治疗、放射治疗、化学药物治疗仍然是治疗肿瘤疾病最常用最重要的三大治疗手段，其中化学药物治疗虽然发展历史较短，却在肿瘤的综合治疗上发挥越来越重要的作用。但是化学药物治疗存在着很大的缺点，这主要是现有的抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性抑制不强、全身用药毒性较大且大部分具有免疫抑制作用，这在一定程度上限制了它的使用。随着我国加入WTO，西药将面临着严峻的挑战，因受知识产权的保 护，西药仿制将受到限制，而研究开发拥有自主知识产权的中药产品将是我国医药产品发展的关键。同时，研究开发高效低毒的天然抗肿瘤药物也是紧迫而重要的全球性课题。

[0005] 2003年集美大学邱晓燕等研究了舍蝇抗菌肽的提取及其对肿瘤细胞生长的抑制作用，表明提取的舍蝇抗菌肽能有效地抑制人胃癌细胞MGC80-3和BGC-823、人乳腺癌细胞MCF-7及人肺癌细胞SPC-A-1的体外增殖，并且呈浓度依赖关系(中华卫生杀虫药械，2003，9(1)：13-16)。

[0006] 2006年天津科技大学曹小红等对工程蝇蛆体内活性物质及体外抗肿瘤作用进行了研究，结果表明工程蝇蛆体内活性物质在体外对K562细胞具有抑制生长的作用(中国食品学报，2006，6(1)：316-319)。

[0007] 2008年浙江省医学科学院徐水祥等研究了大头金蝇蛆提取物对白血病和肺癌细胞的抑制作用。对大头金蝇蛆干粉提取物不饱和脂肪酸、粗脂肪分别作体外抑瘤试验，观察到了不饱和脂肪酸、粗脂肪对人原髓细胞白血病HL-60有明显的增殖抑制作用(药物生物技术，2008，15(4)：284-286)。

[0008] 以上文献对蝇蛆提取物的研究均停留在体外细胞水平，且大多是提取蝇蛆中的抗菌肽、脂肪酸等，未对蝇蛆中的其他成分进行进一步的研究。

发明内容

[0009] 本发明提供了一种对多种癌细胞具有显著抑制作用的蝇蛆提取物。

[0010] 本发明还提供了一种蝇蛆提取物的制备方法，该方法操作简单、易于控制、成本低，适于工业化生产。

[0011] 一种蝇蛆提取物，其主要成分为水溶性蛋白质，所述的蝇蛆提取物中水溶性蛋白质的质量百分含量为50％-70％；所述的水溶性蛋白质的分子量为2-16千道尔顿(KDa)。 [0012] 为了达到更好的发明效果，优选：

[0013] 所述的水溶性蛋白质主要由如下质量百分比的氨基酸组成：天门冬氨酸6.3％-7.2％、苏氨酸3.6％-4.0％、丝氨酸3.6％-3.9％、谷氨酸14.5％-15.5％、甘氨酸
5.5％-6.0％、丙氨酸17.8％-19.6％、胱氨酸1.6％-1.8％、缬氨酸5.6％-6.5％、甲硫氨酸2.3％-2.4％、异亮氨酸3.1％-3.8％、亮氨酸4.2％-5.2％、酪氨酸2.5％-2.7％、苯丙氨酸2.6％-3.1％、赖氨酸8.4％-8.9％、组氨酸 3.4％-3.8％、精氨酸1.1％-1.3％和脯氨酸4.2％-4.8％。

[0014] 所述的蝇蛆提取物中糖的质量百分含量为0.5-2.0％。

[0015] 所述的蝇蛆提取物的制备方法，包括步骤：

[0016] (1)粉碎：将蝇蛆漂洗干净后干燥、粉碎成蝇蛆粉；

[0017] (2)脱脂：向步骤(1)得到的蝇蛆粉中加入蝇蛆粉1-5倍体积量的石油醚，室温浸泡6-12小时，除去石油醚，得到脱脂后的蝇蛆粉；

[0018] (3)超声水提：向步骤(2)得到的脱脂后的蝇蛆粉中加入脱脂后的蝇蛆粉5-10倍体积量的水超声提取1-3次，每次超声10-30分钟，过滤；滤渣再用滤渣4-8倍体积量的水超声提取1-3次，每次超声10-30分钟，过滤；合并二次滤液；经离心、超滤和冷冻干燥，得到蝇蛆提取物。

[0019] 所述的蝇蛆提取物可用于制备治疗白血病、肝癌、肺腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、宫颈癌等中的一种或多种的药物，如可制备用于抑制人原髓细胞白血病HL-60细胞、人红白血病K562细胞、人肝癌SMMC-7721细胞、小鼠白血病P388细胞、人肺腺癌A549细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人前列腺癌PC3细胞、人宫颈癌HeLa细胞、小鼠S180肉瘤和小鼠Heps肝癌实体瘤等中的一种或多种的药物。所述的药物的剂型优选为注射剂，给药途径最佳为静脉注射。

[0020] 所述的蝇蛆提取物还可以制备用于增强机体体液免疫作用的药物。所述的药物的剂型优选为注射剂，给药途径最佳为静脉注射。

[0021] 所述的蝇蛆提取物还可以用于制备含有蝇蛆提取物的药物组合物。所述的药物组合物的剂型优选为注射剂，给药途径最佳为静脉注射。

[0022] 本发明所述的蝇蛆一般可选用采用中国发明专利ZL200510060277.4中具有抗肿瘤生物活性蝇蛆的养殖方法养殖的蝇蛆。

[0023] 与现有技术相比，本发明的优点在于：

[0024] 本发明的蝇蛆提取物，具有高效低毒、抗肿瘤、增强机体体液免疫的作用。这种蝇蛆提取物不仅在体外对人原髓细胞白血病HL-60细胞、人红白血病K562细胞、人肝癌SMMC-7721、小鼠白血病P388细胞、人肺腺癌A549细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人前列腺癌PC3细胞、人宫颈癌HeLa具有明显的抑制作用；而且对小鼠S180肉瘤和小鼠Heps肝癌实体瘤有显著抑制作用，同时它还能够增强机体体液免疫作用。

[0025] 本发明制备方法操作简便、易于控制、成本低，适于工业化生产，提取得到的蝇蛆提取物高效无毒，可用于治疗肿瘤患者，极具开发潜力。

附图说明

[0026] 图1为实施例1制备的蝇蛆提取物、蝇蛆粉以及蛋白分子量标准品(Mark)的分子量的SDS-PAGE电泳图；

[0027] 图2为光学显微镜观察不同浓度实施例1制备的蝇蛆提取物引起人原髓细胞白血病HL-60细胞凋亡形态学变化；其中，A表示对照组细胞；B表示蝇蛆提取物0.056mg/ml处理组细胞；C表示蝇蛆提取物0.167mg/ml处理组细胞；D表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；标尺(Bar)＝50μm；

[0028] 图3为光学显微镜观察不同浓度实施例1制备的蝇蛆提取物引起人肝癌SMMC-7721细胞凋亡形态学变化；其中，A表示对照组细胞；B表示蝇蛆提取物0.056mg/ml处理组细胞；C表示蝇蛆提取物0.167mg/ml处理组细胞；D表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；Bar＝50μm；

[0029] 图4为AO/EB荧光双染后荧光显微镜下观察不同浓度实施例1制备的蝇蛆提取物引起人原髓细胞白血病HL-60细胞的形态学变化；其中，A和B表示对照组细胞；C和D表示蝇蛆提取物0.056mg/ml处理组细胞；E和F表示蝇蛆提取物0.167mg/ml处理组细胞；G和H表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；A、C、E和G为普通光源下细胞形态，B、D、F和H为激发光下细胞内AO/EB荧光；Bar＝50μm；

[0030] 图5为AO/EB荧光双染后荧光显微镜下观察不同浓度实施例1制备的蝇蛆提取物引起人肝癌SMMC-7721细胞的形态学变化；其中，A和B表示对照组细胞；C和D表示蝇蛆提取物0.056mg/ml处理组细胞；E和F表示蝇蛆提取物0.167mg/ml处理组细胞；G和H表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；A、C、E和G为普通光源下细胞形态，B、D、F和H为激发光下细胞内AO/EB荧光；Bar＝50μm；

[0031] 图6为Hoechst 33342/PI荧光双染后荧光显微镜下观察不同浓度实施例1制备的蝇蛆提取物引起人原髓细胞白血病HL-60细胞的形态学变化；其中，A、B和C表示对照组细胞；D、E和F表示蝇蛆提取物0.056mg/ml处理组细胞；G、H和I表示蝇蛆提取物0.167mg/ml处理组细胞；J、K和L表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；A、D、G和J为普通光源下细胞形态；B、E、H和K为激发光下细胞内Hoechst荧光；C、F、I和L为激发光下细胞内PI荧光；Bar＝25μm；

[0032] 图7为Hoechst 33342/PI荧光双染后荧光显微镜下观察不同浓度实施例1制备的蝇蛆提取物引起人肝癌SMMC-7721细胞的形态学变化；其中，A、B和C表示对照组细胞；D、E和F表示蝇蛆提取物0.056mg/ml处理组细胞；G、H和I表示蝇蛆提取物0.167mg/ml处理组细胞；J、K和L表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；A、D、G和J为普通光源下细胞形态；B、E、H和K为激发光下细胞内Hoechst荧光；C、F、I和L为激发光下细胞内PI荧光；Bar＝25μm；

[0033] 图8为Annexin V/PI荧光双染后荧光显微镜下观察不同浓度实施例1制备的蝇蛆提取物引起人原髓细胞白血病HL-60细胞磷脂酰丝氨酸外翻情况；其中，A、B和C表示对照组细胞；D、E和F表示蝇蛆提取物0.056mg/ml处理组细胞；G、H和I表示蝇蛆提取物0.167mg/ml处理组细胞；J、K和L表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；A、D、G和J为普通光源下细胞形态；B、E、H和K为激发光下细胞Annexin V荧光；C、F、I和L为激发光下细胞内PI荧光；Bar＝50μm；

[0034] 图9为Annexin V/PI荧光双染后荧光显微镜下观察不同浓度实施例1制备的蝇蛆提取物引起人肝癌SMMC-7721细胞磷脂酰丝氨酸外翻情况；其中，A、B和C表示对照组细胞；D、E和F表示蝇蛆提取物0.056mg/ml处理组细胞；G、H和I表示蝇蛆提取物0.167mg/ml处理组细胞；J、K和L表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；A、D、G和J为普通光源下细胞形态；B、E、H和K为激发光下细胞Annexin V荧光；C、F、I和L为激发光下细胞内PI荧光；Bar＝50μm；

[0035] 图10为透射电镜下观察受试物实施例1制备的蝇蛆提取物引起人原髓细胞白血病HL-60的细胞形态学变化；其中，A表示对照组细胞；B表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；Bar＝5μm；

[0036] 图11为透射电镜下观察受试物实施例1制备的蝇蛆提取物引起人肝癌SMMC-7721细胞的细胞形态学变化；其中，A表示对照组细胞；B表示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞；Bar＝5μm。

具体实施方式

[0037] 实施例1：制备蝇蛆提取物

[0038] (1)特种养殖蝇蛆

[0039] 大头金蝇以动物蛋白35％、40％、45％、红糖20％、25％、30％、水果30％、35％、40％为食物，其中动物蛋白为蛆浆。以中药淫羊藿20％、25％、30％、加赖氨酸15％、20％、
25％、蛋氨酸15％、20％、25％、维生素B225％、30％、35％作为″催卵素″，用集卵盘子收集蝇卵。采用通风的蝇蛆房，放置多个蝇蛆池，在育蛆池内放入蝇蛆饵料，同时放入上述蝇卵，温度控制在28℃-60℃，用经过粉碎发酵4-6天的饵料喂养蝇蛆。饵料选择A：青蛙15％、23％、30％、淡水鱼15％、23％、30％、冬虫夏草0.1％、0.15％、0.2％、灵芝粉1％、
1.5％、2％、鸡20％、25％、30％、水果25％、30％、35％，其余为植物饲料；饵料选择B：猪肺
25％、30％、35％青蛙15％、23％、30％、淡水鱼15％、23％、30％、灵芝粉为1％、1.5％、2％、人参粉0.1％、0.15％、0.2％、水果20％、25％、30％，其余为植物饲料；饵料C为青蛙、淡水鱼或猪肺。

[0040] 将上述特种养殖的蝇蛆经漂洗、冻干和粉碎得到蝇蛆粉。

[0041] (2)蝇蛆粉的提取

[0042] 50g蝇蛆粉中加入蝇蛆粉5倍体积量的石油醚，室温浸泡6小时，除去石油醚，得到脱脂后的蝇蛆粉。

[0043] 在脱脂后的蝇蛆粉中加入脱脂后的蝇蛆粉10倍体积量的水超声提取3次，每次超声提取10分钟，过滤；滤渣再用滤渣8倍体积量的水超声提取3次，每次超声提取10分钟，过滤，合并二次滤液；在5℃于16000转/分钟的转速下离心30分钟，经超滤膜超滤后的超滤液冷冻干燥，得到棕黄色蝇蛆提取物9.6g。

[0044] 经Lowry法测定该蝇蛆提取物中水溶性蛋白的质量百分含量为59.3％；苯酚硫酸法测定该蝇蛆提取物中糖的质量百分含量为1.0％；采用SDS-PAGE电泳技术鉴定该蝇蛆提取物的分子量为2-16KDa，见图1；用氨基酸分析仪测定该蝇蛆提取物的氨基酸组成，检测样品中蝇蛆提取物的 浓度为1.1320毫克/毫升(溶剂为水)，检测结果见表1。

[0045] 表1

[0046]

[0047] 实施例2：制备蝇蛆提取物

[0048] 向实施例1中采用特种养殖蝇蛆制备的50g蝇蛆粉中加入蝇蛆粉2倍体积量的石油醚，室温浸泡12小时，除去石油醚，得到脱脂后的蝇蛆粉。

[0049] 脱脂后的蝇蛆粉中加入脱脂后的蝇蛆粉10倍体积量的水超声提取2次，每次超声提取10分钟，过滤；滤渣再用滤渣8倍体积量的水超声提取2次，每次超声提取10分钟，过滤，合并二次滤液；在5℃于16000转/分钟的转速下离心30分钟，经超滤膜超滤后的超滤液冷冻干燥，得到棕黄色蝇蛆提取物7.4g。

[0050] 经Lowry法测定该蝇蛆提取物中水溶性蛋白的质量百分含量为62.7％；苯酚硫酸法测定该蝇蛆提取物中糖的质量百分含量为1.8％；采用SDS-PAGE电泳技术鉴定该蝇蛆提取物的分子量为2-16KDa；用氨基酸分析仪测定该蝇蛆提取物的氨基酸组成，检测样品中蝇蛆提取物的浓度为 1.7940毫克/毫升(溶剂为水)，检测结果见表2。

[0051] 表2

[0052]

[0053] 实施例3

[0054] 蝇蛆提取物注射剂的制备

[0055] 处方：实施例1制得的蝇蛆提取物 125g

[0056] 注射用水 加至1000mL。

[0057] 制法：在实施例1制得的蝇蛆提取物125g中加注射用水至1000mL，维持等渗等张pH7.0～7.2，滤过，灌封安瓿瓶中即制得蝇蛆提取物注射剂。全程无菌，去热源，去过敏原。 [0058] 一、将实施例1制得的蝇蛆提取物，采用噻唑蓝(MTT)法对体外培养的人肿瘤细胞株进行广谱筛选，检测蝇蛆提取物体外广谱抗肿瘤作用。

[0059] 1细胞株：

[0060] 人原髓细胞白血病HL-60，人肝癌SMMC-7721，人红白血病K562，小鼠白血病P388，人肺腺癌A549，人前列腺癌PC3，人鼻咽癌CNE，人宫颈癌Hela。

[0061] 2方法

[0062] 取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度，每孔100μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，接种24h后给药(100μl/孔)，分别设空白对照组、细胞对照组以及5个剂量受试药物组。继续培养72h后每孔加入100μlMTT(1mg/ml，以DMEM培养液溶解)，37℃培养2h，弃去各孔内液体后加入150μl酸化异丙醇(含0.04mol/L HCl)，避光放置30min，DG3022A型酶联免疫检测仪测定570nm处吸光度，计算受试药物对多种肿瘤细胞的增殖抑制率。

[0063] 3结果：

[0064] 表3蝇蛆提取物对体外肿瘤细胞增殖抑制作用(％)

[0065]

[0066] 实施例1制得的蝇蛆提取物在体外对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用，其中对白血病细胞(包括人原髓细胞白血病HL-60细胞、人红白血病K562细胞和小鼠白血病P388细胞)以及人肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制作用相对较强。

[0067] 二、考察本发明蝇蛆提取物对小鼠S180肉瘤和小鼠Heps肝癌实体瘤的抑制作用 [0068] 1方法

[0069] 无菌抽取S180小鼠或Heps小鼠腹水瘤液，显微镜下计数，调整细胞 悬液浓度，于小鼠右侧腋窝皮下无菌接种上述腹水瘤液0.2ml，次日按体重随机分组，分别为荷瘤模型组、阳性对照组(顺铂)以及不同剂量受试药物组即0.400g/kg、0.160g/kg和0.064g/kg(表示每千克小鼠注射的蝇蛆提取物的克数，采用实施例1制备的蝇蛆提取物)。各组每日给药1次，连续9天。末次给药24小时后处死动物，称体重，解剖瘤块称重，计算抑瘤率，并取胸腺和脾脏称重，计算胸腺指数和脾脏指数。

[0070] 数据统计：计算各组动物的体重、瘤重、脏器指数的平均值和标准差，采用t检验进行统计分析。

[0071] 2结果

[0072] 表4蝇蛆提取物对小鼠S180肉瘤的抑制作用

[0073]

[0074] Mean±SD，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001vs.荷瘤模型，t-test。

[0075] 表5蝇蛆提取物对小鼠Heps肝癌实体瘤的抑制作用

[0076]

[0077] Mean±SD，*P表示＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001vs.荷瘤模型，t-test。

[0078] 从表4和表5的结果可看出，本发明蝇蛆提取物注射剂量为 0.064-0.400g/kg对小鼠S180肉瘤有显著抑制作用(P＜0.05)；注射剂量为0.026-0.160g/kg对小鼠Heps肝癌实体瘤有显著抑制作用(P＜0.05)。

[0079] 三、考察本发明蝇蛆提取物体外诱导肿瘤细胞凋亡作用

[0080] 1细胞株

[0081] 人原髓细胞白血病HL-60细胞及人肝癌SMMC-7721细胞

[0082] 2细胞凋亡形态学检测

[0083] 取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度，每孔3ml细胞悬液接种于6孔细胞培养板中，接种24h后给药(3ml/孔)，分别设细胞对照组及不同浓度受试药物处理组，继续培养24h后光学显微镜、荧光显微镜观察(AO/EB荧光双染、Hoechst 33342/PI荧光双染)、透射电镜观察、AnnexinV检测、流式细胞仪检测细胞凋亡。

[0084] 3结果

[0085] 结果显示，受试物实施例1制得的蝇蛆提取物均可显著抑制人原髓细胞白血病HL-60细胞及人肝癌SMMC-7721细胞增殖，且具有浓度依赖性，IC50分别为
0.384±0.029mg/ml和0.349±0.019mg/ml；光学显微镜和透射电镜观察发现细胞形态发生显著变化，见图2、图3、图10和图11；AO/EB荧光双染及Hoechst 33342/PI荧光双染后荧光显微镜下观察，均显示蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组HL-60细胞及SMMC-7721细胞表现出典型的细胞凋亡变化，甚至出现细胞坏死，见图4、图5、图6和图7；AnnexinV/PI荧光双染后荧光显微镜下观察发现HL-60细胞及SMMC-7721细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，进一步证明蝇蛆提取物0.500mg/ml处理组细胞发生凋亡，见图8和图9；流式细胞仪定量检测显示细胞凋亡率在30％以上。

[0086] 四、蝇蛆提取物对体内免疫增强作用的筛选

[0087] 1分组：荷瘤模型组、阳性对照组(胸腺肽)以及不同剂量受试药物组即0.400g/kg、0.160g/kg和0.064g/kg(表示每千克小鼠注射的蝇蛆提取物的克数，采用实施例1制备的蝇蛆提取物)

[0088] 2方法：

[0089] (1)体内荷S180肉瘤小鼠免疫增强试验：分组及给药：无菌抽取S180小鼠腹水，7
显微镜下计数，调整细胞悬液浓度为4×10/ml，于小鼠右侧腋窝皮下无菌接种腹水瘤液
6
0.2ml(每鼠接种细胞数为8×10 个)，次日按体重随机分组，分别为荷瘤模型组、阳性对照组(胸腺肽)以及不同剂量受试药物组。各组每日给药1次，连续9天。末次给药24小时后处死动物，称体重，取胸腺和脾脏称重，计算胸腺指数和脾脏指数。

[0090] (2)二硝基氯苯(DNCB)诱导小鼠耳肿胀试验：给药第4天小鼠腹部皮肤用硫化钠脱毛，范围约3cm×3cm，用二硝基氯苯溶液50μl均匀涂抹脱毛处致敏，5天后(即给药第9天)，用DNCB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，24小时后处死动物，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，计算耳肿胀率。

[0091] (3)血凝法测血清溶血素试验：给药第5天小鼠腹腔注射2％羊红细胞0.2ml/只进行免疫，免疫后第5天(即末次给药24小时后)小鼠股动脉放血，室温放置1小时后，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。血清用生理盐水作倍比稀释，吸取稀释的血清0.4ml加入另一试管中，加入0.5％羊红细胞0.4ml，混匀，加至凝血板上，加盖并放置37℃温箱温育3小时。观察红细胞凝集程度，分5级记录，并按公式计算抗体积数：抗体积数＝ε(S1+2S2+3S3+4S4+......nSn)。式中1、2、3......n代表倍比稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

[0092] 数据统计：计算各组动物的体重、脏器湿重、脏器指数、血清抗体积数、耳肿胀率的平均值和标准差，采用t检验进行统计分析

[0093] 3结果

[0094] 表6蝇蛆提取物对荷S180肉瘤小鼠胸腺、脾脏的影响

[0095]

[0096] Mean±SD，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001vs.荷瘤模型，t-test。

[0097] 表6的结果显示，实施例1制备的蝇蛆提取物0.064-0.400g/kg可显著增加荷S180肉瘤小鼠脾脏湿重及脾脏指数(P＜0.01)，对荷S180肉瘤小鼠胸腺湿重及胸腺指数无显著影响(P＞0.05)。

[0098] 表7蝇蛆提取物对荷S180肉瘤小鼠血清抗体积数的影响

[0099]

[0100] Mean±SD，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001vs.荷瘤模型，t-test。

[0101] 表7的结果显示，实施例1制备的蝇蛆提取物对荷S180肉瘤小鼠耳肿胀无显著影响(P＞0.05)。

[0102] 表8蝇蛆提取物对荷S180肉瘤小鼠耳肿胀的影响

[0103]

[0104] Mean±SD，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001vs.荷瘤模型，t-test。

[0105] 表8的结果显示，实施例1制备的蝇蛆提取物0.160-0.400g/kg可显著增加荷S180肉瘤小鼠血清抗体积数，表明本发明蝇蛆提取物具有增强机体体液免疫作用。

[0106] 实施例1制备的蝇蛆提取物对荷S180肉瘤小鼠耳肿胀无显著影响，表明本发明蝇蛆提取物无增强机体细胞免疫作用。

[0107] 五、小鼠腹腔注射急性毒性试验

[0108] 1方法：

[0109] 采用最大耐受量试验法。ICR小鼠，雌雄各半，用药效学试验的给药途径腹腔注射，以动物能耐受的最高浓度、最大容积的剂量1次给予动物，连续观察14天，详细记录动物反应情况，以不产生死亡的最大剂量为最大耐受量。

[0110] 2结果

[0111] 将实施例3制备的蝇蛆提取物注射剂以蝇蛆提取物最大剂量1.5g/kg腹腔注射给予小鼠，14天内无动物死亡。最大耐受量为1.5g/kg。