抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体及其应用

摘要

抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体及其应用，轻链的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示；轻链的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示，重链的核苷酸序列如SEQIDNo:4所示；上述抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体在制备抗H5N1型禽流感病毒药物中的应用。鸡胚保护试验结果表明，4F5抗体对禽来源和人来源的H5N1型禽流感病毒感染预防具有100%的保护率；4F5抗体对禽来源的H5N1型禽流感病毒感染治疗具有100%的保护率。对人来源的H5N1型高致病性禽流感病毒感染治疗的保护率最高也可达到62.5%。

权利要求

1.一种抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体，其特征在于轻链的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

2.一种抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体，其特征在于表达轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，表达重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

3.权利要求1或2所述抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体在制备抗H5N1型禽流感病毒药物中的应用。

说明书

抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于抗H5N1型高致病性禽流感抗体技术领域，涉及一株抗H5N1型高致病性禽流感病毒中和scFv抗体4F5及其应用。

背景技术

[0002] 禽流感是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。近十年来，以H5N1亚型为代表的高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI）肆虐全球，不仅给世界养禽业造成损失，甚至出现了越来越多的人感染H5N1禽流感致死病例,甚至已有少数报道的人传人禽流感。由于人体内没有针对禽流感病毒的抗体，特别是针对H5抗原的抗体，所以，人感染H5N1型禽流感病毒后具有较高的致死率，对人类健康和世界公共卫生安全已构成重大威胁。

[0003] H5N1禽流感病毒基因组由8个RNA片段组成，编码11种病毒蛋白质。病毒基因组可通过基因重排的方式引起抗原移位(antigenic shift)，产生新的血清型（如H5N2型），病毒基因亦容易发生突变，引起抗原漂移（antigenic drift）（特别是HA基因）。血凝素蛋白(haemagglutinin，HA)是禽流感病毒最主要的表面抗原蛋白，是禽流感疫苗、中和抗体及诊断试剂的最主要靶点。血凝素编码的基因是禽流感病毒基因组中变异最大的基因，很大程度上决定了禽流感病毒的抗原性和致病性。美国两个独立的研究小组于2009年2月首次报道，在甲型流感病毒（包括H5N1）HA蛋白三聚体的颈干部存在一个（或多个）序列和结构保守的抗原表位，抗体与该区域结合后，可有效阻止流感病毒与细胞膜的融合过程，使其丧失感染人体细胞的能力。说明在H5N1型禽流感病毒HA分子上确实存在着保守的中和表位，目前在国内尚无类似的相关报道。因此，寻找针对HA蛋白的中和抗体用于H5N1禽流感的预防和临床治疗在临床应用上具有重要的作用。

发明内容

[0004] 技术问题：本发明旨在提供抗H5N1型高致病性禽流感病毒中和scFv抗体4F5；本发明的另一目的在于所述抗H5N1型高致病性禽流感病毒中和scFv抗体4F5在制备预防和治疗H5N1型禽流感病毒感染药物中的应用。

[0005] 技术方案：一种抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

[0006] 一种抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体，轻链的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。

[0007] 上述抗H5N1型高致病性禽流感scFv抗体在制备抗H5N1型禽流感病毒药物中的应用。

[0008] 有益效果：本发明从禽流感病毒疫苗免疫并产生抗体的人全血中分离的B淋巴细胞中克隆了基因组所有的抗体重、轻链可变区基因，采取基因工程方法，构建库容量为8
6.5×10 的全人源免疫型scFv 抗体库，用纯化的杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达的血凝素蛋白HA1对噬菌体抗体库进行富集筛选，分离了9株抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA1的特异性人源scFv抗体。经MDCK细胞微量中和试验，获得1株对不同来源的H5N1禽流感病毒株具有广谱中和活性的全人源scFv 抗体4F5。

[0009] 鸡胚保护试验结果表明，4F5抗体对禽来源和人来源的H5N1型禽流感病毒感染预防具有100%的保护率；4F5抗体对禽来源的H5N1型禽流感病毒感染治疗具有100%的保护率。对人来源的H5N1型高致病性禽流感病毒感染治疗的保护率最高也可达到62.5%。人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程抗体的获得不仅为高致病性禽流感病毒H5N1的预防和治疗带来了希望，其保守中和表位的发现也为其疫苗研制提供了新的思路。

[0010] 四、附图说明

[0011] 图1抗体重链、轻链可变区基因及其单链抗体scFv基因PCR产物；

[0012] 图2 SDS-PAGE检测纯化的单链scFv抗体；

[0013] 图3三轮富集后ELISA 检测人源scFv抗体的特异性；

[0014] 图4六株H5N1病毒进化树的构建；

[0015] 图5 Western-blot检测4F5抗体对不同病毒株的HA结合特异性，其中1:rHA1、2:A/CK/Hongkong/、3:A/goose/jilin/514-1、4:A/Jiangsu/07-4、5:A/Jiangsu/08-6、6:A/Goose/ZD/8-9106、7: A/Jiangsu/1/2007。

[0016] 图6荧光免疫检测4F5 抗体对不同病毒株感染MDCK细胞后的HA结合特异性；其中a：MDCK (normal)、b：MDCK(A/CK/Hongkong/3-69) 、c：MDCK (A/Goose/Jilin/514-1)、d： MDCK (A/Jiangsu/07-4)、e：MDCK (A/Goose/ZD/8-9106)、f：MDCK (A/Jiangsu/08-6)、g：MDCK (A/Jiangsu/1/2007)；

[0017] 图7为4F5抗体对A/CK/Hongkong/3-69(H5N1)病毒株感染的鸡胚预防的保护率;

[0018] 图8为A/Jiangsu/08-6 (H5N1) 病毒株感染的鸡胚预防的保护率;

[0019] 图9为4F5抗体对A/CK/Hongkong/3-69(H5N1)病毒株感染的鸡胚治疗的保护率；

[0020] 图10为A/Jiangsu/08-6 (H5N1)病毒株感染的鸡胚治疗的保护率。

[0021] 五、具体实施方式

[0022] 1．全人源免疫型scFv噬菌体抗体库的构建

[0023] 从H5N1型禽流感病毒疫苗免疫并产生抗体的人全血中分离的B淋巴细胞中克隆8
了基因组所有的抗体重、轻链可变区基因，采取基因工程方法，构建库容量为6.5×10 的全人源免疫型scFv 抗体库

[0024] 2．抗H5N1型高致病性禽流感病毒特异性抗体的筛选表达及纯化[0025] 用纯化的杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达的血凝素蛋白HA1对构建的噬菌体抗体库进行富集筛选，分离了9株抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA1的特异性人源scFv抗体。

[0026] 3．具有结合活性和光谱中和活性的全人源scFv 抗体的鉴定

[0027] 经MDCK细胞微量中和试验，获得1株对不同来源的H5N1禽流感病毒株具有广谱中和活性的全人源scFv 抗体4F5。Western blotting 和免疫荧光鉴定表明这株scFv抗体与变性及天然的H5N1型禽流感病毒都可以结合。

[0028] 4．scFv 4F5 抗体在预防及治疗H5N1型禽流感病毒感染鸡胚试验中的应用。

[0029] 实施例1 全人源免疫型scFv噬菌体抗体库的构建

[0030] 采集禽流感病毒疫苗免疫并产生抗体的人全血40份，分离淋巴细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)20为引物，逆转录生成cDNA。然后利用特 异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。经Overlap PCR合成scFv基因（图1），与经相同酶切的表达载体pComb3XSS连接，构建scFv的原核重组表达载体；电转化感受态8
大肠杆菌XL1-Blue，构建了容量为6.5×10 的全人源免疫型scFv 抗体库。

[0031] 所述构建的scFv基因与pComb3xSS载体连接是指：将纯化定量后的scFv基因分别以SfiI内切酶进行双酶切消化；纯化、定量后与同样双酶切pComb3xSS 载体连接；所述的转化是指：a）0.2cm电转杯，25 μF，2.5 kV ，200Ω的电转条件转化感受态大肠杆菌XL1-Blue；b）转化产物加入LB培养基后37℃振荡培养2 h，10倍梯度稀释将菌液涂布于8
SOBAG琼脂板上，30℃过夜培养；c）次日计算平板上的克隆数，估算库容为6.5×10 ；d）将电转化后菌液加入辅助噬菌体 M13K07超感染，离心沉淀菌体，用LB培养基重悬，37℃振荡过夜，离心沉淀菌体，吸取上清即为ScFv噬菌体表面展示文库。

[0032] 实施例2 抗H5N1型高致病性禽流感病毒特异性抗体的筛选，表达及纯化[0033] (1) 用纯化的杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达的血凝素蛋白HA1包被固相筛选ELISA板，每孔1μg，洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体；加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增值，辅助噬菌体M13K07超感染；重复以上筛选步骤，共进行三轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选；

[0034] (2) 将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于培养板上培养过夜，挑取564个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔中分别转移5μL菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体M13K07超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm计算每孔吸光值；当P/N值(Positive/Negative)大于2.1时，该菌株为阳性单克隆噬菌体菌株；共得到25个阳性克隆(图2A)。阳性克隆经核酸序列分析后，发现有9株不同序列scFv 克隆与HA1重组蛋白有较强的结合活性， scFv重、轻链可变区基因序列分析应用以下两个服务器：

[0035] http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquestlivret=0&Option=mouseIg[0036] http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

[0037] 对所得9条序列与现有已报道的其他抗体基因进行同源性比较，并分析其胚系基因来源，结果下表.

[0038]NO. Clones IGHV
1A2 2 IGHV3-23*04
1C1 1 IGHV3-74*02
1C2 1 IGHV5-a*04
1F8 1 IGHV3-7*02
2G1 1 IGHV4-34*12
3D1 6 IGHV3-43*02
3F5 3 IGHV3-43*02
4F5 5 IGHV3-43*02
6F9 5 IGHV3-43*02

[0039] (3) 分别将9株阳性克隆噬菌体感染非抑制型Top10F’，含有重组质粒pComb3x-ScFv的菌株接种10mL的LB液体培养基中（含有100ug/mL的氨苄青霉素），37℃摇床培养至OD600nm至0.9，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导4小时。用SDS-PAGE和Western-blot鉴定高表达菌株。

[0040] (4) scFv单链抗体的纯化

[0041] 缓冲液

[0042] 结合缓冲液：20mM 磷酸钠缓冲液，0.5M NaCl，45mM咪唑，pH7.4.[0043] 洗脱缓冲液：20mM 磷酸钠缓冲液，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH7.4.[0044] 样品准备

[0045] 经鉴定的高表达菌株，挑单克隆置25mL的LB液体培养基中（含有100ug/mL的氨苄青霉素），250rpm，37℃培养过夜。

[0046] 把25mL过夜培养物加至500mL的LB 液体培养基中（含有氨苄青霉素），250rpm，37℃培养2小时，加入IPTG至终浓度为1mm。再诱导表达4小时。

[0047] 培养物 5,000g离心20分钟，弃上清。用50mL预冷的结合缓冲液（含有1mM的蛋白酶抑制剂PMSF）重悬菌体沉淀，在冰浴条件下超声波破碎细菌。

[0048] 在菌体裂解物中加入终浓度为1%的 Triton X-100，室温轻轻搅拌30分钟，以利于破碎包涵体。20,000g离心 30分钟，上清液过0.45um滤膜，备用。

[0049] 纯化

[0050] 把NiSO4亲和层析柱安装至蛋白质纯化仪上，用10个柱床体积的结合缓冲液冲洗酒精。用10个柱床体积的结合缓冲液平衡柱床后，上样品，流速为1mL/分钟。

[0051] 用结合缓冲液洗涤柱床至A280nm吸光度到基线，用5-10个柱床体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用SDS-PAGE鉴定（图2）。

[0052] 实施例3 具有结合活性和光谱中和活性的全人源scFv抗体的鉴定[0053] 用于中和实验的6株H5N1病毒株A/CK/Hongkong/3-69(H5N1)、A/DK/Beijing/wy12107 (H5N1)、A/Goose/Jilin/514-1 (H5N1)、A/Jiangsu/07-4 (H5N1)、A/Goose/ZD/8-9106 (H5N1)、A/Jiangsu/08-6 (H5N1)、 A/Jiangsu /1/2007(H5N1) (GenBank: EU434686.1)由江苏省疾病预防控制中心提供。提取6株病毒株的RNA，RT-PC扩增HA全长进行测序，利用MEGA5.0软件构建进化树，以WHO提供的H5N1 病毒株进行比对，将其进行clade 的划分。

[0054] 对6株H5N1病毒株的HA蛋白进行测序，利用MEGA5.0软件分析，构建进化树。结果显示，A/CK/Hongkong/3-69(H5N1)属于clade 9，A/Goose/Jilin/514-1 (H5N1) 属于clade 2.2, A/Jiangsu/07-4 (H5N1)、A/Goose/ZD/8-9106 (H5N1)、A/Jiangsu/08-6 (H5N1)、A/Jiangsu/1/2007(H5N1)均属于 clade 2.3.4（图4）。

[0055] 以上述6株病毒分别感染MDCK细胞，用Reed-Muench方法测定各clade H5N1病毒对MDCK细胞的组织细胞半数感染量（TCID50）。中和试验，不同稀释浓度的9株 scFv抗体与100 TCID50病毒混合，37℃孵育2h，然后加入到MDCK细胞单层中，置37℃、5%CO2培养箱培养3d，细胞单层经充分洗涤、丙酮固定后，加入鼠源抗禽流感病毒核蛋白NP单抗，弃上清，洗去未结合的抗体，加HRP标记的抗鼠IgG二抗显色，观察人源抗体对病毒感染细胞的抑制作用。结果发现4F5抗体能与6株病毒起中和反应，证明其具有广谱H5N1中和活性，中和反应的浓度从0.39～45 μg/mL（下表）。其余抗体则只对A/Jiangsu/07-4 (H5N1)有中和作用或者对所有病毒株都没有中和作用。

[0056] scFv抗体对各病毒株的中和作用及血凝抑制作用

[0057]InfluenzaAvirus 4F5(μg/ml)
IC50 activity
A/CK/Hongkong/3-69 <0.39
A/Goose/Jilin/514-1 <0.39
A/Jiangsu/07-4 6.25
A/Goose/ZD/8-9106 <0.39
A/Jiangsu/08-6 6.25
A/Jiangsu/1/2007 <0.39

[0058] 分别用1μg病毒量与SDS-PAGE上样缓冲液混合, 煮沸5min，12 000g 离心10min, 以 10% SDS-PAGE进行电泳后, Western blot转印NC膜, 用4F5抗体为一抗，anti-His HRP为二抗进行检测。与各个病毒株进行特异性杂交检测，结果如图5，六个病毒株均能检测到70KD、43KD大小的2条带，分别为HA0及HA1蛋白的大小。同时也证明了scFv识别的抗原决定簇在HA1亚基上。

[0059] 各个病毒株分别感染MDCK细胞，当细胞70%出现病变特征时用遇冷的80%丙酮固定，先加入scFv抗体，依次加入anti-His及FITC羊抗鼠IgG荧光抗体后，加入DAPI染色5min后封片，激光共聚焦显微镜观察细胞荧光。免疫荧光图片如图6，从图中可见各个病毒感染后的细胞有红色荧光，正常MDCK细胞只能观察到细胞核的紫色荧光。

[0060] Western-blot及免疫荧光检测结果证明4F5抗体既可以与变性的HA蛋白结合，也与天然的HA蛋白有结合活性。

[0061] 实施例4 scFv 4F5 抗体在H5N1型禽流感病毒感染鸡胚试验中的预防及治疗作用

[0062] 鸡胚保护试验分为预防组和治疗组，10日龄SPF级鸡胚，平均重约50g。用Reed-Muench对各个病毒株对鸡胚的LD50致死量进行测定。选用禽来源的毒力较弱的A/CK/Hongkong/3-69(H5N1) 及人来源的毒力较强的A/Jiangsu/08-6 (H5N1)的病毒株进行试验。预防试验组中，先注射25μg/kg, 50μg/kg, 75μg/kg, 100μg/kg, 200μg/kg梯度的scFv抗体4F5，0.5h后再注射含有10 倍LD50的H5N1病毒稀释液，实验于第8d结束。治疗试验组中，首先给鸡胚注射给10 倍LD50 的病毒量， 60min后，给鸡胚注射100μg/kg, 150μg/kg, 200μg/kg, 250μg/kg, 500μg/kg scFv抗体4F5, 观察鸡胚的存活情况，共观察8天，根据鸡胚的存活率决定抗体的保护活性。图7～8显示了不同浓度的4F5抗体对2个病毒株感染预防的保护效率。从图6显示随着scFv抗体4F5用量的增加，鸡胚的存活率明显增加，对2株病毒株感染鸡胚预防的保护率均可达到100%。图9～10显示了不同浓度的4F5抗体对2株病毒株感染后的保护效率，可以看出用量为250μg/kg 4F5抗体对A/CK/Hongkong/3-69(H5N1) 病毒株的保护率可以达到100%，对毒力较强的人源禽流感病毒株A/Jiangsu/08-6保护率最高也可达62.5%。