能够高效降解二氯甲烷的罗得西亚甲基杆菌H13及其应用

摘要

本发明提供了一株能高效降解DCM的菌株——罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)H13，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期：2010年5月20日，保藏编号：CCTCC No：M2010121。该菌株为好氧革兰氏阴性杆菌，能够以DCM为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物，为生物法高效净化含DCM废水及废气的工程应用奠定了基础。

权利要求

1.一株二氯甲烷高效降解菌——罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)H13，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期：2010年5月20日，保藏编号：CCTCCNo：M 2010121。

2.如权利要求1所述的罗得西亚甲基杆菌H13在微生物降解二氯甲烷中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述甲基杆菌H13用于降解废水中的二氯甲烷。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述甲基杆菌H13用于降解废气中的二氯甲烷。

5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述降解在pH 5.5～10.0、温度10℃～-

40℃、Cl 浓度≤1.36M的条件下进行。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述降解在无机盐培养基中进行，所述无机盐培养基按如下组成配制：4.5g Na2HPO4·12H2O、1.0gKH2PO4、1.8g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.03g CaCl2·2H2O，1mL微量元素，用KH2PO4和K2HPO4调pH至7.0，蒸馏水补足至

1L；微量元素溶液按如下组成配制：1L蒸馏水中加入1.0g FeSO4·7H2O、0.02gCuSO4·5H2O、

0.014g H3BO3、0.10g MnSO4·4H2O、0.10g ZnSO4·7H2O、0.02g Na2MoO4·2H2O、0.02g CoCl2·6H2O。

说明书

能够高效降解二氯甲烷的罗得西亚甲基杆菌H13及其应用

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一株能够高效降解二氯甲烷的罗得西亚甲基杆菌H13及其应用。(二)背景技术

[0002] DCM(二氯甲烷)是一类使用非常广泛的化学试剂与溶剂。由于其沸点低(40.1℃)、蒸汽压高(20℃时47Pa)，气态排放是其进入环境的主要方式。当前，DCM被认为是大气污染中毒性较大的卤代烃类物质，在水中的溶解度小，但在脂类中的溶解度较大，容易在生物体的脂肪组织中积累，具有很强的致癌、致畸、致突变作用，被美国环境保护署列入129种优先控制的有毒污染物名单。因此探索有效去除DCM的技术对社会和环境有着重要的意义。

[0003] 多年以来，DCM一度被认为是不可生物降解的物质，在水体及大气环境中广泛存在。直至后来人们通过实验证明了DCM可以被微生物降解及矿化，相关的研究才得以进一步开展。自从1980年Brunner等首次从工业废水中分离出能以DCM作为唯一碳源和能源的Pseudomonas sp.DM1以来，迄今报道已相继分离到包括Hyphomicrobium sp.KDM2在内的10余株具备分解DCM能力的菌株。通过多年的研究，人们充分肯定了微生物降解工业废气中有机物的效果，具有投资少、运行费用低、能耗小及管理方便等优点，成为低浓度有机3
废气(＜2000mg/m 时)治理的一个发展方向。

[0004] 近些年来，出现了许多不同的技术应用于从废气中除去DCM，如焚烧，吸附，湿擦洗法等，但这些方法在处理相对较低浓度和大流量的DCM时价格非常昂贵。而生物工艺法因其较低的运行费用、较好的安全性和处理DCM的高效性，所以在处理废气中的DCM方面越来越受到重视。其中Hatmans等的研究表明用生物滴滤池处理废气中的DCM在技术上是可行的，当气体空床停留时间(EBRT)为9.6s时，其实验室DCM的去除率为57.0％，而当EBRT为20.8s时，其实验室去除率可达85.0％左右。Young等也指出，较高的液相回流率和自动、准确的控制pH值是生物滴滤池稳定运行的关键因素。但国内鲜见相关的研究报道。

[0005] 迄今尚未有罗得西亚甲基杆菌降解DCM的报道。(三)发明内容

[0006] 本发明的目的是针对现有DCM生物降解效率低、微生物世代时间长的问题，提供了一株能高效降解DCM的菌株及其应用技术。

[0007] 本发明采用的技术方案是：

[0008] 一株DCM高效降解菌——罗得西亚甲基杆菌(Methylobacteriumrhodesianum)H13，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期：2010年5月20日，保藏编号：CCTCC No：M 2010121。

[0009] 所述罗得西亚甲基杆菌H13菌落特征如下：菌体呈短杆状，无芽孢；菌落呈小圆状、粉色、形态饱满、光滑湿润、易挑起，菌苔沿划线生长；氧化酶、接触酶反应为阳性；精氨酸双水解酶、硝酸盐还原反应、半乳糖苷酶反应、吲哚反应均为阴性；不能水解淀粉和明胶；糖发酵实验为阴性，革兰氏染色阴性。该菌株的16S rDNA的GenBank登录号为HM245434。

[0010] 本发明还涉及所述的罗得西亚甲基杆菌H13在微生物降解DCM中的应用。-
M.rhodesianum H13能利用DCM作为唯一碳源和能源生长，将DCM完全矿化成Cl、CO2和H2O。在纯培养条件下，该菌能在23h内能将5mM DCM完全降解。

[0011] 具体的，所述甲基杆菌H13可用于降解废水或废气中的DCM。

[0012] 优选的，所述降解在pH 5.5～10.0、温度10℃～40℃、Cl-浓度≤1.36M(0～-1.36M，优选0～0.68M)的条件下进行。实验发现，Cl 浓度为0时，H13菌对DCM的降解效-
果和生长情况最好；随Cl 浓度的增加，H13菌的生长延滞期相应延长，且DCM的降解速率-
变慢，当Cl 浓度高于0.68M时，H13菌基本不生长，对DCM的降解也很差。

[0013] 用于降解废气中的二氯甲烷时，所述降解可在无机盐培养基中进行，所述无机盐培养基组成如下：4.5g Na2HPO4·12H2O、1.0g KH2PO4、1.8g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.03g CaCl2·2H2O，1mL微量元素，用KH2PO4和K2HPO4调pH至7.0，蒸馏水补足至1L；微量元素溶液按如下组成配制：1L蒸馏水中加入1.0g FeSO4·7H2O、0.02g CuSO4·5H2O、0.014g H3BO3、0.10g MnSO4·4H2O、0.10g ZnSO4·7H2O、0.02gNa2MoO4·2H2O、0.02g CoCl2·6H2O。

[0014] 本发明的有益效果主要体现在：提供了一株能高效降解DCM的菌株，该菌株为好氧革兰氏阴性杆菌，能够以DCM为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物，为生物法净化含DCM废水及废气的工程应用奠定了基础。(四)附图说明

[0015] 图1为H13菌的生长曲线及Cl-浓度的变化曲线。

[0016] 图2为不同pH对H13菌降解DCM的影响。

[0017] 图3为不同温度下菌体浓度及DCM浓度随时间变化情况。

[0018] 图4为不同Cl-浓度对DCM降解菌的影响。(五)具体实施方式

[0019] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0020] 实施例1：M.rhodesianum H13的分离与鉴定

[0021] (1)样品采集及驯化

[0022] 现场采集台州某医药厂污水处理池的活性污泥，以DCM为唯一碳源和能源，进行驯化、富集。数月后，经富集后的活性污泥，接种到含50mL无机盐培养基的250mL密封盐水瓶中，以DCM作为唯一碳源和能源，继续培养、富集。实验需恒温(30±1℃)，并保持在好氧条件下进行。

[0023] 无机盐培养液成分：1L蒸馏水中加入4.5g Na2HPO4·12H2O、1.0gKH2PO4、1.8g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.03g CaCl2·2H2O，1mL微量元素溶液。

[0024] 微量元素溶液成分：1L蒸馏水中加入1.0g FeSO4·7H2O、0.02gCuSO4·5H2O、0.014g H3BO3、0.10g MnSO4·4H2O、0.10g ZnSO4·7H2O、0.02gNa2MoO4·2H2O、0.02g CoCl2·6H2O。

[0025] (2)菌株分离与鉴定

[0026] 将在盐水瓶中经过多次传代富集的混合菌液，进行稀释涂布，依据菌体群落的差异性，挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接至以DCM为唯一碳源和能源的无机盐培养液中，测试降解活性。选择具有DCM降解能力的纯菌，进一步分离纯化，获得有DCM降解活性的菌株H13。

[0027] 菌株H13细胞呈短杆状，无芽孢；菌落呈小圆状、透明、粉色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；革兰氏染色呈阴性。

[0028] 经API细菌鉴定系统获得H13的生理生化特征为：氧化酶、接触酶反应为阳性；精氨酸双水解酶、硝酸盐还原反应、半乳糖苷酶反应、吲哚反应为阴性；不能水解淀粉和明胶；糖发酵实验为阴性。

[0029] 上述特征与文献(常见细菌鉴定手册)编录的甲基杆菌属的生理生化性状相吻合。该菌株经16S rDNA同源性分析，H13与M.rhodesianum的亲缘关系最近，相似度达99％。结合以上生理生化特征，因此确定本实验获得的DCM降解菌为M.rhodesianum。

[0030] 实施例2：M.rhodesianum H13降解DCM的特性

[0031] 接种M.rhodesianum H13种子液(OD600＝0.186)2mL于50mL无机盐培养基，加入DCM使初始DCM浓度为5mM，置于温度为30℃、转数为160r/min的摇床中培养，每隔一定时间取样检测。结果见图1。随着反应的进行，菌体浓度逐渐增大；至23h时，DCM被完全降解，菌体浓度达到OD600＝0.192。本实施例说明降解菌M.rhodesianum H13可利用DCM作为唯一碳源和能源进行生长，并且具有高效降解DCM的能力。

[0032] 调 节 反 应 体 系pH 分 别 为 5.5、6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。在各反应体系中的加入DCM使初始浓度为5mM；接入初始OD600＝0.186的M.rhodesianum H13种子液2mL，置于恒温摇床里振荡(30℃，160r/min)，18h后取样测其降解率，结果见图2。在pH5.5～10.0，微生物均能降解DCM并伴随细胞浓度的增加。随着pH从5.5增大到10.0，菌体浓度及DCM降解率均先增大后减小，M.rhodesianum H13降解DCM的较适宜的pH值为7.0。本实施例说明菌株H13在中性和偏碱性的较宽pH范围内能较好得降解DCM，为其在不同pH环境的应用提供了保证。

[0033] 控制反应体系pH为7.0，加入DCM使初始浓度为5mM，添加初始OD600＝0.186的M.rhodesianum H13种子液2mL，分别置于温度为25℃、30℃、37℃摇床(转数160r/min)中恒温振荡，定时取样检测M.rhodesianumH13菌体浓度和DCM残留浓度。结果见图3。M.rhodesianum H13在25℃、30℃、37℃都能够较好地生长，且能较快地降解DCM。其中30℃为菌株生长及DCM降解较适宜的温度。另外，当温度低至10℃或高于40℃时，DCM的降解仍可进行，但速度比较缓慢。

[0034] 分别控制初始反应体系Cl-浓度分别为0M、0.017M、0.17M、0.34M、0.68M、1.02M、1.36M，加入DCM使初始浓度为5mM，添加初始OD600＝0.186的M.rhodesianum H13种子液-
2mL。定时检测菌体浓度和DCM残留浓度。由图4可知，当Cl 浓度为0M时，H13菌对DCM-
的降解效果和生长情况最好；随Cl 浓度的增加，H13菌的生长延滞期相应延长，且DCM的-
降解速率变慢。当Cl 浓度高于0.68M时，H13菌基本不生长，对DCM的降解也很差。本实-
施例说明H13菌能在Cl 浓度为0M～0.68M时生长。

[0035] 实施例3：M.rhodesianum H13净化DCM废气

[0036] 在有机玻璃生物滴滤塔内的聚丙烯填料表面上，用M.rhodesianumH13菌悬液接种和挂膜，用无机盐培养基作为生物滴滤塔内H13菌的营养液进行循环喷淋，液体喷淋量-3 -3 310×10 ～12×10 m/h，pH6.5～7.5，控制温度30℃左右，连续通入DCM气体，进口浓度
3
5～500mg/m，停留时间30～45s。挂膜30天后，生物滴滤塔对DCM的净化效率可达80％～
99％。