抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用

摘要

本发明涉及一种杂交瘤细胞株、抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体及其应用。本发明通过细胞的融合、筛选和克隆，获得保藏编号为CGMCC NO.4171杂交瘤细胞株，将筛选到的杂交瘤细胞扩大培养，注入经产母鼠腹腔，制备出了高效价的腹水抗体，该抗体能够中和鸭源性冠状病毒；以本发明杂交瘤细胞株制备单克隆抗体成本低、操作简单、生产周期短，生产的抗体含量高、特异性强；该发明为建立鸭源性冠状病毒感染禽类的诊断方法奠定良好的基础，具有重要的经济价值和社会意义。

权利要求

1.一种分泌抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体的杂交瘤细胞株CH/HN/2004，其保藏编号为 CGMCC NO.4171。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株CH/HN/2004用于制备抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体的用途。

3.权利要求1所述杂交瘤细胞株CH/HN/2004产生的抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体。

4.权利要求3所述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体在快速检测鸭源性冠状病毒ZZ2004中的应用。

说明书

抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株、抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 1937年，冠状病毒(Coronaviruses)首先从鸡身上分离出来。1965年，分离出第一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒科分为冠状病毒和环曲病毒两个属。冠状病毒科的代表株为禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。该病毒为有囊膜、呈中等多形性球状或椭圆形的病毒粒子，表面有杆状突起。

[0003] 禽传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒科的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种常见多发的急性高度接触性传染病，表现为呼吸型、肾型、肠型、腺胃型等多种病型。该病可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低。IBV往往引起复合感染，如新城疫(Newcastle Disease，ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可继发细菌性疾病，如大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了对鸡群的危害。据《世界家禽》1999年资料，全世界的禽病中，以呼吸系统疾病最为严重，其中IB是世界大多数地区危害养鸡业的主要疾病。1988年以来，IB在我国大部分地区相继流行，疫区的发病率可达100％，死亡率可达10～
30％。国内外已报道的IBV有26种以上血清型，因血清型及新变型众多，不同血清型之间缺乏交叉保护，新的变异株不断出现和流行，是造成鸡群免疫失败的原因，这使得IB对养鸡业造成的威胁持续存在，因此要建立快速而又有效的检测方法。

[0004] 2004年5月，河南省郑州某养殖场发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100％，死亡率达10％以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个
1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造成大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落，腺胃乳头肿大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”，肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌及肝脏出血为主要特征。在同地区的其它鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的调查、研究工作，结果从发病鸭体内分离到一株可疑病毒，经鉴定为一种新IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株，保藏编号为CGMCC NO.3842，其专利申请号为201010225577.4，此为第一次有关家鸭感染IBV的报道。本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖场，其不仅引起鸡的大批发病及死亡，还感染了鸭群，严重影响了家鸭的生长发育并导致鸭的死亡。与其它禽类的冠状病毒相比，鸭源性冠状病毒ZZ2004变异的程度较大，对动物的感染谱更广。目前，对于该病毒还缺乏有效的检测方法，而在检测方法的建立中，取得有效的抗体尤为关键。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种杂交瘤细胞株、抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体及其制备与应用，该杂交瘤细胞株产生的抗体特异性强，其生产方法操作简单、生产周期短，生产的抗体含量高，且生产成本低。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

[0007] 一种分泌抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体的杂交瘤细胞株CH/HN/2004，其保藏编号为CGMCC NO.4171。

[0008] 所述杂交瘤细胞株CH/HN/2004用于制备抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体的用途。

[0009] 所述杂交瘤细胞株CH/HN/2004产生的抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体。

[0010] 所述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体在快速检测鸭源性冠状病毒ZZ2004中的应用。

[0011] 所述杂交瘤细胞株CH/HN/2004的制备方法包括以下步骤：

[0012] (1)小鼠免疫将鸭源性冠状病毒ZZ2004接种于10日龄SPF鸡胚的尿囊腔中进行繁殖，72h后，收取鸡胚病毒尿囊液，梯度离心，分别为：4000rpm，30分钟，取上清；8000rpm，30分钟，取上清；200000g，4小时，用生理盐水稀释沉淀，用分光光度计测量病毒蛋白含量为3.5毫克/毫升，然后根据50微克病毒蛋白/只的病毒量和200微升/只的免疫抗原量，计算出所需要的病毒量为14微升，用生理盐水稀释至100微升，再与100微升的佐剂行充分乳化，用乳化的免疫抗原对小鼠进行背部皮下多点免疫，分4次免疫；

[0013] (2)细胞融合

[0014] ①对免疫小鼠的效价进行测定，选择效价高(1∶4000)的小鼠，置于超净台内取其脾脏，制备脾细胞；

[0015] ②将骨髓瘤细胞和制备的脾细胞按照1∶10的比例混合，加入1毫升的诱导剂PEG-1500，促进细胞融合，用HAT培养基进行培养；

[0016] (3)杂交瘤细胞的筛选和克隆

[0017] ①采用间接ELISA方法，对融合细胞进行多次筛选，找出强阳性细胞，其OD(光密度)值为1.105，P/N(待测样品OD值/阴性对照的OD值)值达到12.5，且为最大，P/N大于2即判为阳性；

[0018] ②对筛选到的强阳性细胞，用有限稀释克隆的方法进行多次克隆，使得每个孔内最多只有一个杂交瘤细胞，最后获得能分泌单抗的杂交瘤细胞

[0019] (4)杂交瘤细胞冻存

[0020] 及时冻存筛选到的杂交瘤细胞，当细胞长至瓶底70％且处于对数生长期时，轻轻吹打细胞，离心，800rpm，5分钟，弃上清，打散细胞团，加入细胞冻存液，分装入细胞冻存管中，每管加细胞悬液1毫升，然后放置于4℃/30分钟，-20℃/2小时，-80℃/过夜，最后放入液氮中长期冻存。

[0021] 本发明具有积极有益的效果：

[0022] 本发明利用单克隆抗体技术，通过细胞的融合、筛选和克隆，获得杂交瘤细胞株，将筛选到的杂交瘤细胞扩大培养，注入经产母鼠腹腔，制备出了高效价的腹水抗体，该抗体能够中和鸭源性冠状病毒；以本发明杂交瘤细胞株制备单克隆抗体成本低、操作简单、生产周期短，生产的抗体含量高、特异性强；该发明为建立鸭源性冠状病毒感染禽类的诊断方法奠定良好的基础，具有重要的经济价值和社会意义。

[0023] 本发明所述杂交瘤细胞株CH/HN/2004，建议的分类命名为抗鸭源性冠状病毒ZZ2004毒株的单克隆抗体细胞，已于2010年9月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该鸭源性冠状病毒的保藏编号为CGMCC NO.4171。

具体实施方式

[0024] 实施例1杂交瘤细胞株制备

[0025] (1)小鼠免疫

[0026] 将鸭源性冠状病毒ZZ2004接种于10日龄SPF鸡胚的尿囊腔中进行繁殖，72h后，收取鸡胚病毒尿囊液，梯度离心，分别为：4000rpm，30分钟，取上清；8000rpm，30分钟，取上清；200000g，4小时，用生理盐水稀释沉淀，用分光光度计测量病毒蛋白含量为3.5毫克/毫升，然后根据50微克病毒蛋白/只的病毒量和200微升/只的免疫抗原量，计算出所需要的病毒量为14微升，用生理盐水稀释至100微升，再与100微升的佐剂行充分乳化，用乳化的免疫抗原对小鼠进行背部皮下多点免疫，分4次免疫。

[0027] (2)细胞融合

[0028] 对免疫的小鼠进行效价测定，选择效价高(1∶4000)的小鼠，取其脾脏，制备脾细胞，将骨髓瘤细胞和脾细胞按照1∶10的比例混合，加入1毫升诱导剂PEG-1500促进细胞融合，在HAT选择性的培养基的环境下进行培养。

[0029] (3)杂交瘤细胞的筛选和克隆

[0030] 对出现克隆的细胞孔，用间接ELISA方法进行多次筛选，选择阳性强的细胞孔，其OD(光密度)值为1.105，P/N(待测样品OD值/阴性对照的OD值)值达到12.5，且为最大。P/N大于2即判为阳性。

[0031] 对筛选到的强阳性细胞进行扩大培养，并进行有限稀释克隆，使得每个孔内最多只有一个杂交瘤细胞；最后获得了一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为CH/HN/2004，测得细胞上清液的ELISA效价为1∶320。

[0032] (4)杂交瘤细胞的冻存

[0033] 对筛选到的杂交瘤细胞CH/HN/2004，要及时冻存。当细胞长至瓶底70％且处于对数生长期时，轻轻吹打细胞，离心，800rpm，5分钟，弃上清，打散细胞团，加入细胞冻存液，分装入1.5毫升的细胞冻存管中，每管加入细胞悬液1毫升，然后放置于4℃/30分钟，-20℃/2个小时，-80℃/过夜，最后放入液氮中长期冻存。

[0034] 实施例2腹水单抗的制备

[0035] ①将扩大培养的杂交瘤细胞CH/HN/2004注射到经产Balb/c小鼠腹腔内，每只小6
鼠注射1×10 个细胞；

[0036] ②20天后收集腹水，测其抗体效价为1∶8.2×106。

[0037] 实施例3单抗对病毒的中和作用