一种以壳聚糖为载体的固定化方法

摘要

本发明公开了一种以壳聚糖为载体的固定化方法，将壳聚糖溶液与酶、细胞、菌体、发酵液或蛋白质等待固定物质的溶液或悬浮液直接混合，交联，再在碱性条件下固化，分散得到颗粒状的交联壳聚糖。本发明形成的固定化颗粒具有多孔结构，机械强度好，过滤性能强，不需要复杂的设备。本发明可用于大规模的细胞固定化、酶固定化、不经固液分离的发酵液的直接固定化，例如瓜氨酸生产中2000L规模的发酵液直接固定化，以及制备S-2，2-二甲基环丙甲酰胺、R-氟比洛芬、N-乙酰神经氨酸或R-3-羟基-戊二酸乙酯的转化反应。本发明还可用于溶液的除菌或澄清处理。

权利要求

1.一种以壳聚糖为载体的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：a.制备待固定的壳聚糖溶液：

1)向壳聚糖中加入冰醋酸、盐酸或硫酸，配制成壳聚糖溶液，

2)准备待固定物质的溶液或悬浮液，

3)将上述1)的溶液与待固定物质的溶液或悬浮液直接混合，其中待固定物质选自细胞、菌体、发酵液或蛋白质；

b.交联：将交联剂与上述步骤a得到的混合物混合，进行反应，反应完成后的混合物呈凝胶状；

c.向上述步骤b得到的凝胶状混合物中加入碱性物质，搅拌使凝胶固化，分散成颗粒状，收集颗粒状的交联壳聚糖，其中碱性物质选自碳酸钠和/或碳酸氢钠的固体或溶液；

d.可选择地，通过粉碎、切割或者过筛方法将上述步骤c得到的交联壳聚糖再加工成各种形态的颗粒或粉末。

2.根据权利要求1所述的方法，其中待固定物质选自酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中交联剂为戊二醛。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤a的待固定壳聚糖溶液中壳聚糖的含量为0.1-3％(w/v)，交联剂与步骤b得到的凝胶状混合物的体积比在5％以下。

5.根据权利要求1所述方法的用途，该方法应用于瓜氨酸、二甲基环丙甲酰胺、N-乙酰神经氨酸或4-氰基-3-羟基-丁酸或氟比洛芬的生产中。

6.根据权利要求5所述的用途，应用于瓜氨酸生产中的精氨酸脱亚胺酶产生菌的菌体固定化步骤或精氨酸脱亚胺酶产生菌发酵液的直接固定化步骤。

7.根据权利要求6所述的用途，精氨酸脱亚胺酶产生菌为粪链球菌。

8.根据权利要求1所述方法的用途，该方法应用于溶液的除菌或澄清处理。

说明书

一种以壳聚糖为载体的固定化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种以壳聚糖为载体的固定化方法，特别是用于酶、细胞、菌体、发酵液或蛋白质的固定化方法。

背景技术

[0002] 固定化是相对于游离酶或细胞而言的。通过化学或物理的手段使目标物质束缚在载体区域中，同时又保持了催化活性并且可以反复利用。固定化后，酶或细胞随着载体的移动而移动，因而在科研和生产中人们可以通过操作肉眼可见的固体状的载体而控制不可见的酶和细胞的行为。

[0003] 固定化的方法主要有吸附法、包埋法和交联法。决定固定化工艺是否具有实际经济价值的关键性因素是载体的价格和性能。海藻酸钠、卡拉胶和壳聚糖是研究最多的载体，来源丰富，价格便宜，然而应用到工业化的例子却不多。这些物质用于固定化的共同程序是制胶、造粒和硬化，其中造粒和硬化可以同时进行。对于固定化的工业应用，颗粒的形状不是衡量的指标，更加重要的是比表面积、机械强度和过滤性能。上述常规技术还存在一些缺陷。第一个缺陷是造粒技术往往是挤出成型，非常难以实现大规模操作，且颗粒大小极难控制。第二个缺陷是通过上述常规工艺形成的颗粒机械性能差，难以耐受持续的机械搅拌，其弥补方法是装成酶柱，然而这样又极大地限制了它的应用范围，要求反应液必须有一定的流动性能才能应用。第三个缺陷是常规的发酵液固定化手段必须先收菌得到菌体，而许多微生物发酵液过滤困难，采用大规模离心手段收集菌体并非工业化首选，因此工业上不得不采取陶瓷膜等其他手段代替固定化。

[0004] 以壳聚糖为固定化载体的报道较多。例如，王俊等(王俊等，《化工进展》，2004，23(10)，1117-1120)报道了“以壳聚糖为载体固定化海藻糖合成酶”；赵江等(赵江等，《郑州工程学院学报》，2004，25(2)，34-37)报道了“胃蛋白酶固定化条件的研究”；蔡俊等(《生物技术》，2003，13(5)：11-12)报道了谷胱苷肽硫转移酶(GST)的固定化及酶学特性研究；
任广智等(《离子交换与吸附》，2000，16(4))报道了磁性壳聚糖微球用于脲激酶的固定化研究。上述方法都是将壳聚糖先造粒，经过处理后再与目标产物交联或吸附固定，其中也包括将壳聚糖包裹到磁性颗粒表面的做法，但这种做法难以放大，且成本更高，吸附量更小。上述方法都存在固定化颗粒交联度不均一，强度不均一的缺点。上述方法应用于发酵液固定化时，都需要将发酵液进行固液分离、收集菌体后再进行固定化操作，固液分离的效果对设备的依赖性较高。

[0005] 本申请发明人将壳聚糖的絮凝作用与固定化作用相结合，并做了工艺上的改进，形成了一种独特的固定化工艺。与上述两种固定化程序不同，本发明中壳聚糖溶液与待固定物质的溶液或悬浮液先交联成凝胶状，再通过该凝胶在弱碱性环境下的硬化作用而自动脱水固化，再通过搅拌将凝胶分散成颗粒。分离出颗粒后，滤液澄清，在显微镜下滤液中看不到菌体残留。该颗粒具有很好的强度和过滤性能，通过机械粉碎成更小颗粒后仍保持合适的强度和过滤性能。

[0006] 尤其需要说明的是，本发明可以直接将发酵液中的菌体或蛋白成分固定化，避免了发酵液工业化收菌的困难，对于工业酶制剂的开发具有很大的应用价值。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种适合于工业化生产操作的固定化方法。以壳聚糖为载体，与目标物质经充分交联后，再固化分散成颗粒。本发明具有普遍适用性，可用于酶、细胞、菌体、发酵液及蛋白质等物质的固定化。

[0008] 本发明通过以下技术方案解决上述问题：

[0009] 一种以壳聚糖为载体的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0010] a.制备待固定的壳聚糖溶液：

[0011] 1)向壳聚糖中加入酸，配制成壳聚糖溶液，

[0012] 2)准备待固定物质的溶液或悬浮液，

[0013] 3)将上述1)的溶液与待固定物质的溶液或悬浮液直接混合；

[0014] b.交联：将交联剂与上述步骤a得到的混合物混合，进行反应，反应完成后的混合物呈凝胶状；

[0015] c.向上述步骤b得到的凝胶状混合物中加入碱性物质，搅拌使凝胶固化分散成颗粒状，收集颗粒状的交联壳聚糖；

[0016] d.可选择地，通过粉碎、切割或者过筛方法将上述步骤c得到的交联壳聚糖再加工成各种形态的颗粒或粉末。

[0017] 本发明的固定化方法中，所述待固定物质选自酶、细胞、菌体、发酵液或蛋白质。

[0018] 一般常用的酸都可以实现本发明，优选自冰醋酸、盐酸或硫酸，更优选体积比0.1-80％的冰醋酸水溶液。

[0019] 一般常规的碱性物质都可以实现本发明，优选能与壳聚糖溶液反应生成气体的物质，如碳酸钠和/或碳酸氢钠的固体或溶液，这样可以达到更好的固定化效果，又不会剧烈改变pH而对生物活性造成大的影响。

[0020] 一般常规的交联剂都可以实现本发明，优选交联剂为戊二醛，交联剂与步骤b得到的凝胶状混合物的体积比在5％以下。

[0021] 本发明固定化方法的步骤a中，待固定壳聚糖溶液中壳聚糖的含量为0.1-3％(w/v)。

[0022] 本发明的固定化方法可应用于瓜氨酸、二甲基环丙甲酰胺、N-乙酰神经氨酸、4-氰基-3-羟基-丁酸或氟比洛芬的生产中。

[0023] 优选的，本发明的固定化方法应用于瓜氨酸生产中的精氨酸脱亚胺酶产生菌的菌体固定化步骤或精氨酸脱亚胺酶产生菌发酵液的直接固定化步骤。更优选的，上述精氨酸脱亚胺酶产生菌为粪链球菌。

[0024] 本发明的固定化方法还可应用于溶液的除菌或澄清处理。

[0025] 为了更清楚叙述本发明内容，下面具体叙述本发明涉及到的方法：

[0026] 一种以壳聚糖为载体的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0027] a.制备待固定的壳聚糖溶液：

[0028] 1)向壳聚糖中加入0.1-80％(v/v)的冰醋酸水溶液，以冰醋酸调节pH，搅拌，溶解，配制成0.1-6％(w/v)的壳聚糖溶液；

[0029] 2)准备浓度为0.1-80％(w/v)的酶液、菌体溶液或发酵液；

[0030] 3)将上述1)的壳聚糖溶液与上述2)的酶液、菌体溶液或发酵液直接混合均匀；

[0031] b交联

[0032] 将交联剂与上述步骤a得到的混合物混合，可以在步骤a得到的混合物中加入交联剂，也可以将交联剂预先加入到步骤a的1)液或2)液中。

[0033] 加入交联剂后，充分搅拌均匀，静置使交联反应充分完成。完成反应后的混合物成凝胶状。优选交联剂为戊二醛，优选戊二醛与步骤b得到的凝胶状混合物的体积比为0.1-5％(v/v)。

[0034] c.向上述步骤b得到的凝胶状混合物中加入碱性物质，搅拌使凝胶固化分散成颗粒状，收集颗粒状的交联壳聚糖；

[0035] 经过搅拌分散的固定化颗粒可以通过过滤或离心收集，因颗粒过滤性能很好，一般可以直接过滤收集，然后再以缓冲液或水洗涤，驱除残留的戊二醛。收集的固定化颗粒可以继续用离心机，如三足式离心机甩干。

[0036] 上述方法制造的固定化颗粒具有多孔结构，交联充分，机械性能好，过滤性能强，可以不用进一步处理而直接用于下游产品的开发过程。

[0037] 上述方法制造的固定化颗粒也可以通过粉碎、切割、过筛等方法再加工成各种形态的颗粒或粉末，用于下游产品的开发过程。

[0038] 本发明的固定化方法应用于瓜氨酸生产中精氨酸脱亚胺酶产生菌的菌体固定化条件为：步骤a的待固定的壳聚糖溶液中含有0.1-3％(w/v)的壳聚糖，并含有0.1-40％(w/v)的菌体；步骤b得到的凝胶状混合物中戊二醛的浓度为0.1-3％(v/v)；碱性物质为碳酸氢钠和/或碳酸钠固体或溶液。

[0039] 本发明的固定化方法应用于瓜氨酸生产中精氨酸脱亚胺酶产生菌的发酵液直接固定化条件为：步骤a的待固定的壳聚糖溶液中含有0.1-3％(w/v)的壳聚糖，并含有发酵液；步骤b得到的凝胶状混合物中戊二醛的浓度为0.1-3％(v/v)；碱性物质为碳酸氢钠和/或碳酸钠固体或溶液。

[0040] 本发明固定化方法的应用拓展

[0041] 本发明的固定化方法除了可以制造固定化颗粒外，还可以用于液体的澄清处理。上述步骤b得到的混合物呈凝胶状，能将微生物等能与戊二醛或壳聚糖反应的物质全部交联包裹，经步骤c处理后，溶液成为澄清透明状，显微镜下检测无菌。

[0042] 本发明的优势在于，将壳聚糖配制成溶液，与待固定物质液液混和，直接吸附，之后交联，再加碱形成菌丝固定化颗粒，最后固液分离。相比现有技术，本发明的原料混和更加充分，且不用对待固定物质做预先处理。得到的颗粒均匀性好，韧性好，机械强度高，可实现工业化规模，吸附完全，易过滤，滤液澄清，产率高。

[0043] 下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明实施例的制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

[0044] 在上下文中，除非另有说明，w/w表示质量比(g/g)，w/v表示质量体积比(g/ml)，v/v表示体积比(ml/ml)。

具体实施方式

[0045] 实施例1菌体固定化

[0046] 取粪链球菌菌体1Kg，配制成5L的菌液；配制3L2％(v/v)的冰醋酸水溶液，加入100g壳聚糖，搅拌充分溶解；将菌液加入到壳聚糖溶液中，搅拌均匀；加入80ml 50％(v/v)的戊二醛水溶液，搅拌均匀，静置3小时；加入100g碳酸氢钠，搅拌2小时；过滤水洗，收集得到固定化细胞。在显微镜下观察滤液，采用血球记数板计数，找不到残留的菌体细胞。

[0047] 将上述固定化细胞用于精氨酸到瓜氨酸的转化反应。取上述固定化细胞100g，加入到2000ml 10％(w/v)的精氨酸水溶液中反应，反应结束后过滤，含有瓜氨酸的滤液用于进一步提取瓜氨酸，固定化细胞继续用于下一批反应。经过7批反应，得到的反应液中含有瓜氨酸1220g，转化率为87.1％。固定化细胞使用时间为182小时。

[0048] 实施例2发酵液固定化

[0049] 配制400L 3％(v/v)的冰醋酸水溶液，加入壳聚糖20Kg，搅拌使充分溶解；加入2000L粪链球菌的发酵液，搅拌均匀；加入50L 50％(v/v)的戊二醛水溶液，搅拌均匀，静置
3小时；加入20Kg碳酸氢钠，搅拌2小时；过滤水洗，收集得到固定化细胞。在显微镜下观察滤液，采用血球记数板计数，找不到残留的菌体细胞。

[0050] 将上述固定化细胞用于精氨酸到瓜氨酸的转化反应。反应液为2000L 10％(w/v)的精氨酸水溶液，加入上述固定化细胞，反应结束后过滤，含有瓜氨酸的滤液用于进一步提取瓜氨酸，固定化细胞继续用于下一批反应。经过5批反应，得到的反应液中含有瓜氨酸970Kg，转化率为97％。固定化细胞使用时间为150小时。

[0051] 实施例3酶液固定化

[0052] 配制30ml 2％(v/v)的冰醋酸水溶液，加入1g壳聚糖，搅拌充分溶解；加入60ml R-酰胺酶酶液，搅拌均匀；加入1.6ml 25％(v/v)的戊二醛水溶液，搅拌均匀，静置3小时；加入1g碳酸氢钠，搅拌2小时；过滤水洗，得到R-酰胺酶固定化酶。将R-酰胺酶固定化酶用于4-氰基-(R)-3-羟基-丁酸乙酯的转化反应，得到R-3-羟基-戊二酸乙酯。

[0053] 配制30ml 2％(v/v)的冰醋酸水溶液，加入1g壳聚糖，搅拌充分溶解；加入60ml R-氟比洛芬酯酶酶液，搅拌均匀；加入1.6ml 25％(v/v)的戊二醛水溶液，搅拌均匀，静置3小时；加入1g碳酸氢钠，搅拌2小时；过滤水洗，得到R-氟比洛芬酯酶固定化酶。将R-氟比洛芬酯酶固定化酶用于氟比洛芬乙酯的转化反应，得到R-氟比洛芬。

[0054] 配制30ml 2％(v/v)的冰醋酸水溶液，加入1g壳聚糖，搅拌充分溶解；加入60ml神经氨酸醛缩酶酶液，搅拌均匀；加入1.6ml 25％(v/v)的戊二醛水溶液，搅拌均匀，静置3小时；加入1g碳酸氢钠，搅拌2小时；过滤水洗，得到神经氨酸醛缩酶固定化酶。将神经氨酸醛缩酶固定化酶用于N-乙酰甘露糖胺的转化反应，得到N-乙酰神经氨酸。

[0055] 实施例4基因工程菌的固定化

[0056] 取二甲基环丙甲酰胺酰胺酶基因工程菌菌体100g，配制成500ml的菌液；配制300ml2％(v/v)的冰醋酸水溶液，加入10g壳聚糖，搅拌充分溶解；将菌液加入到壳聚糖溶液中，搅拌均匀；加入16ml 25％(v/v)的戊二醛水溶液，搅拌均匀，静置3小时；加入10g碳酸氢钠，搅拌2小时；过滤水洗，得到酰胺酶工程菌固定化细胞。

[0057] 取上述固定化细胞100g，加入到500ml 6g/l的外消旋二甲基环丙甲酰胺水溶液