一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法

摘要

本发明公开了一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法，该方法创新之处在于所使用的材料是在由鳞片叶诱导产生愈伤组织的基础上，再经预分化培养过程获得了有一定分化特征的紧密愈伤组织，将其切成小块后浸泡于秋水仙素溶液中进行多倍体诱变处理，可大大减轻秋水仙素溶液对处理材料的伤害，提高了卷叶贝母多倍体鳞茎的诱导率。

权利要求

1.一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法，其特征在于包括下列步骤：(1)选择卷叶贝母新鲜鳞茎的鳞片叶作为外植体；

(2)剥取上述鳞茎内层中无病和无机械损伤的鳞片叶，先用洗衣粉液洗净后于流水下冲洗25～30min，再用2.0％次氯酸钠溶液漂洗12～15min，用清水洗净并吸干水后，将其放入0.1％升汞溶液中消毒7～10min，然后用无菌水冲洗2～3次，再用无菌滤纸吸干表-1 -1 -1面的水分，最后将其接入诱导愈伤组织的MS+6-BA1mg·L +IAA0.5mg·L +蔗糖30g·L +-1琼脂6.5g·L 培养基中进行诱导培养；

(3)将(2)步骤获得的新生、质地较疏松的愈伤组织接入预分化培养基-1 -1 -1 -1

MS+6-BA2.0mg·L +NAA0.2mg·L +蔗糖30g·L +琼脂6.5g·L 中获得紧密愈伤组织；

(4)将(3)步骤获得的卷叶贝母紧密愈伤组织切成小块，浸泡于已过滤灭菌浓度为-1

1500mg·L 的秋水仙素溶液中浸泡处理24h，处理后用无菌水洗2～3次，再用无菌滤纸吸-1 -1 -1干水后，接入不含有秋水仙素的MS+6-BA 1.0mg·L +NAA0.3mg·L +蔗糖30g·L +琼脂-1

6.5g·L 分化培养基中进行诱导培养而获得多倍体鳞茎；

上述所有培养基的配制pH值为5.6～6.5；

上述培养条件除了诱导愈伤组织培养初期采用12～15天的暗培养外，其余均为温度

15～24℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx。

说明书

一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种多倍体鳞茎的诱导方法，特别是涉及一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法。

背景技术

[0002] 川贝母药材为百合科植物卷叶贝母F.cirrhosa、暗紫贝母F.unibracteata、甘肃贝母F.przew alskii Maxim.及梭砂贝母F.delavayiFranch.的干燥鳞茎，为著名的川产道地药材之一，以鳞茎入药。卷叶贝母植株对生长环境要求苛刻，它喜冷阴气候条件，具有耐寒、喜湿、喜荫蔽、怕高温的特性。气温达到30℃或地温超过25℃，植株就会枯萎，在海拔低、气温高的地区不能生存，所以卷叶贝母在海拔3500m-4500m的高度才能正常生长。卷叶贝母由于受生长条件的限制，再加之近年来无计划盲目的采挖，其自然资源日趋枯竭，预计在近几十年内也难以缓解。组织培养技术生长周期短，繁殖率高，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，对植物生长极为有利，便于稳定地进行培养生产，因此应用组织培养的方法进行川贝母快速繁殖是解决川贝母药材资源短缺问题的有效方法之一。

[0003] 多倍体药用植物由于染色体的加倍，使得植物器官表现出“巨型性”的显著特征，因而通过多倍体诱导技术可以提高植物药用部位的生物产量，同时由于药用植物染色体数目加倍，也使得染色体上基因调控有效化学成分的含量较正常二倍体增高，因此培养的多倍体药材其有效化学成分的含量也明显增加。

[0004] 王强等发表的《秋水仙素诱导川贝母愈伤组织多倍体的研究》(武汉植物学研究2002.20(6)：449～452)一文中公开了两种秋水仙素处理方法，一种是秋水仙素加入培养基处理法，另一种是秋水仙素溶液浸泡处理法，他们得出的结论是：秋水仙素溶液浸泡处理法对愈伤组织的伤害较直接，其加倍效果不如秋水仙素加入培养基处理法好。事实上，只要对产生的愈伤组织进行适当处理，可大大地减轻秋水仙素溶液对愈伤组织的伤害，其多倍体的诱导率远高于文中所提到的70％。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种以卷叶贝母鳞片叶为外植体的多倍体鳞茎诱导方法，该方法由于对新产生的愈伤组织进行了预分化的培养处理，使得秋水仙素溶液对处理后的愈伤组织伤害作用大大地减轻，从而提高了其多倍体的诱导率。

[0006] 为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤：

[0007] (1)选择卷叶贝母的新鲜鳞茎的鳞片叶作为外植体；

[0008] (2)剥取上述鳞茎内层中无病和无机械损伤的鳞片叶，先用洗衣粉液洗净后于流水下冲洗25～30min，再用2.0％次氯酸钠溶液漂洗12～15min，用清水洗净并吸干水后，将其放入0.1％升汞溶液中消毒7～10min，然后用无菌水冲洗2～3次，再用无菌滤纸吸干表面的水分，最后将其接入诱导愈伤组织的培养基中进行诱导培养，诱导初期采用12～15天的暗培养；

[0009] (3)将(2)步骤获得的新生、质地较疏松愈伤组织接入预分化培养基-1 -1MS+6-BA2.0mg·L +NAA0.0～0.3mg·L 中培养获得紧密愈伤组织；

[0010] (4)将(3)步骤获得的卷叶贝母紧密愈伤组织切成小块，浸泡于已过滤灭菌的秋水仙素溶液中，处理后用无菌水洗2～3次，再用无菌滤纸吸干水后，接入不含有秋水仙素-1 -1的MS+6-BA1.0mg·L +NAA0.0～0.3mg·L 分化培养基中进行诱导多倍体鳞茎培养；

[0011] 上述所有培养基的配制pH值为5.6～6.5、蔗糖30～50g·L-1、琼脂6.0～-17.0g·L 。

[0012] 上述培养条件均为温度15～24℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx。

[0013] 上述(2)步骤中所采用的诱导愈伤组织的培养基为MS+6-BA0.1～-1 -1 -1 -12.0mg·L +IAA0.4 ～ 1.5mg·L + 蔗 糖 30 ～ 50g·L + 琼 脂 6.0 ～ 7.0g·L 或-1 -1 -1 -1
MS+6-BA2.0mg·L +NAA0.4～1.0mg·L +蔗糖30～50g·L +琼脂6.0～7.0g·L 。

[0014] 上述(4)步骤中所采用的秋水仙素浓度为0.01～0.22％，处理时间为6～72h。

[0015] 本发明是采用秋水仙素溶液浸泡方法诱导多倍体鳞茎。其创新处在于所使用的材料是在由鳞片叶诱导产生愈伤组织的基础上，再经预分化培养过程获得的有一定分化特征的紧密愈伤组织，在采用秋水仙素溶液浸泡处理时，可大大减轻药液对材料的伤害，从而提高了处理材料的存活率和多倍体的诱导率，经测试多倍体鳞茎的诱导率最高可达80.3％。

具体实施方式

[0016] 实施例1

[0017] (1)获得卷叶贝母紧密愈伤组织

[0018] a.选择在四川康定折多山野生抚育基地栽种的卷叶贝母新鲜鳞茎，剥取内层无病和无机械损伤的鳞片叶，用洗衣粉液洗净后于流水下冲洗30min，再用2％次氯酸钠溶液漂洗15min，用清水洗净吸干水后，在超净工作台上将处理后的鳞片叶放入0.1％升汞溶液中消毒9min，无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干表面水，最后将其接入-1 -1 -1 -1
MS+6-BA1mg·L +IAA0.5mg·L +蔗糖30g·L +琼脂6.5g·L 的培养基中在温度18～
22℃、每天光照8～16小时、光照强度为1200lx的培养条件下进行诱导培养，诱导初期先进行14天的暗培养；

[0019] b. 将 上 述 获 得 的 新 生、质 地 较 疏 松 愈 伤 组 织 转 接 入-1 -1 -1 -1MS+6-BA2.0mg·L +NAA0.2mg·L +蔗糖30g·L +琼脂6.5g·L 的预分化培养基中在温度18～22℃、每天光照8～16小时、光照强度为1200lx的培养条件下，培养40d可获得紧密愈伤组织；

[0020] (2)多倍体鳞茎的诱导

[0021] 将获得的卷叶贝母紧密愈伤组织切成小块放于已过滤灭菌浓度为1500mg.L-1的秋水仙素溶液中浸泡处理24h，然后用无菌水洗三次，再用无菌滤纸吸干水，最后接入不含-1 -1 -1 -1有秋水仙素的MS+6-BA1.0mg·L +NAA0.3mg·L +蔗糖30g·L +琼脂6.5g·L 培养基中进行多倍体鳞茎分化培养，其多倍体鳞茎的诱导率为80.3％；

[0022] (3)多倍体鳞茎的形态学特征