一种节能减排的鲍鱼育苗方法

摘要

本发明公开了一种节能减排的鲍鱼育苗方法，育苗过程如下：(1)培藻；(2)育苗：在育苗过程中添加蛭弧菌游泳体浓缩液，使游泳体最终在水体浓度至少达到10pfu/mL；所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 209172，保藏日期为2009年8月7日；(3)换水：布卵后每5-30天一次，换水后立即添加蛭弧菌游泳体浓缩液；(4)采收。所述蛭弧菌游泳体对养殖环境中的常见细菌有很强的消除作用。由于蛭弧菌游泳体对鲍鱼无毒副作用，因此适合于鲍鱼大规模工厂化养殖，能提高鲍苗培育成活率。

权利要求

1.一种节能减排的鲍鱼育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)培藻：在育苗池中注入海水并曝气，自然培藻，附着基为聚乙烯波纹板，接藻后开始曝气，光照控制在2000-5000lux，水温控制在15-28℃；

(2)育苗：培藻40天后，开始在育苗池中布鲍鱼受精卵，并添加蛭弧菌游泳体菌液，使游泳体在水体中的浓度至少达到10pfu/mL；其中光照控制在200-3000lux，水温控制在

15-28℃；

(3)换水：布卵后每5-30天换水一次，每次为全池换水；换水后立即添加蛭弧菌游泳体菌液，并使蛭弧菌游泳体在水体中的浓度至少达到10pfu/mL；

(4)采收：待幼鲍壳长到3.0-6.5mm，即可进行采收；

所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中国典型培养物保藏中心保藏，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 209172，保藏日期为2009年8月7日。

2.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(2)中在鲍鱼布卵前，育苗池彻底换水，所述蛭弧菌游泳体菌液在换水后立即添加进去。

3.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中所述蛭弧菌游泳体7

在水体中的浓度为10-10pfu/mL。

4.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(1)中所述海水经过砂滤和沉淀处理。

5.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(1)中所述藻为底栖硅藻。

6.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(2)中所述曝气量控制在3

10-100L/h/m。

7.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤(2)中所述鲍鱼布卵初始量为

3 3

1～3万粒/m，布卵后，根据藻生长状态，添加营养盐3-5g/m，2-4天添加一次。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的育苗方法，其特征在于，所述蛭弧菌游泳体菌液的制备方法为：在含有副溶血弧菌的DNB培养基中接入蛭弧菌BDFM05，恒温摇床160rpm～250rpm、

25～32℃培养12～36h；培养物经过6000rpm、4℃离心20min，取上清液，再将上清液

16000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清液，保留沉淀并向沉淀中加入DNB液体培养基重新悬浮蛭弧菌沉淀物，即制得蛭弧菌游泳体菌液。

说明书

一种节能减排的鲍鱼育苗方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种水产养殖贝类育苗方法，特别涉及促进鲍苗快速生长、增强免疫力，并能提高鲍苗成活率的方法。

背景技术

[0002] 鲍是珍贵的海产贝类之一，具有很高的营养价值。从1970年代开始，我国已开始了人工鲍养殖，经过近三十年的发展，在辽宁、山东、福建、广东等地区鲍养殖业已成为当地支柱产业之一，但是随着养殖规模的扩大、集约化程度的提高及沿海水质日趋恶化等原因，造成鲍病日益频繁发生，且有愈演愈烈之势。鲍病在养殖的很多阶段都有可能发生，特别是在育苗过程中，常常会爆发大规模的掉板现象，很多养殖场连续几月多批培苗却颗粒无收，给养殖户带来了极大的负面影响。

[0003] 病原体感染是引起掉板的主要原因，人工养殖条件下主要是细菌性疾病和病毒性疾病。常见的细菌性病原体有副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等。副溶血弧菌主要导致鲍鱼肌肉萎缩病，死亡率可达50％左右，而河流弧菌和溶藻弧菌引发的感染可造成60-70％的死亡率。目前常规的防治鲍鱼掉板的方法主要是定期施用抗生素，抗生素的优点是药物直接入水、浓度高、吸收快、疗效好；缺点是可能会对鲍鱼产生刺激性、引发新病症。如果长期大量使用抗生素不仅会使致病菌抗药性增强，也会使一些鲍病例变得难以治愈。此外鲍体内抗生素残留会影响鲍鱼品质，不利于销售，进而造成养殖者的经济损失。中草药防治鲍鱼掉板也是一种常见的办法，虽具有无药物残留、经济效益高的优点，但也有见效慢的缺点，因而寻求一种更高效、经济的办法显得极为迫切。

[0004] 蛭弧菌为寄生性革兰氏阴性菌，具有寄生、进而裂解其它细菌的作用，是一种优良的微生物控制剂，蛭弧菌游泳体是指蛭弧菌侵入宿主细菌前的生长形式。蛭弧菌游泳体侵入宿主细菌的过程非常快，一般几秒钟内即可完成。相对于蛭弧菌蛭质体而言，用蛭弧菌游泳体控制和消除鲍鱼潜在致病菌具有起效快、活力强的优点。同时由于传统的鲍鱼育苗采用的是流水养殖，这样会消耗 大量的人力、物力和资源，同时养殖废水的大量排放也会给环境带来污染。

[0005] 因此，“绿色养殖”成为近年来国家的重大需求，引起水产界的广泛关注。目前，用蛭弧菌游泳体来进行鲍鱼育苗的方式在国内外尚未报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种节能减排的鲍鱼育苗方法，在节能减排的同时，能够提高鲍鱼免疫力，提高鲍苗的成活率。

[0007] 本发明的目的通过下述方案实现：

[0008] 一种节能减排的鲍鱼育苗方法，其特征在于，育苗过程如下： [0009] (1)培藻：在育苗池中注入海水并曝气，自然培藻，附着基为聚乙烯波纹板，光照控制在2000-5000lux，海水水温控制在15-28℃；

[0010] (2)育苗：培藻40天后，开始在育苗池中布鲍鱼受精卵，并添加蛭弧菌游泳体菌液，使游泳体在水体中的浓度至少达到10pfu/mL；其中光照控制在200-3000lux，水温控制在15-28℃；

[0011] (3)换水：布卵后每5-30天换水一次，每次为全池换水；换水后立即添加蛭弧菌游泳体菌液，并使蛭弧菌游泳体在水体中的浓度至少达到10pfu/mL；

[0012] (4)采收：待幼鲍壳长达到3.0-6.5mm，即可进行采收；

[0013] 所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，由中国典型培养物保藏中心保藏，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 209172，保藏地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学内，保藏日期为2009年8月7日。蛭弧菌BDFM05呈单细胞，椭圆形，大小为1.43×0.53μm，端生鞭毛，鞭毛长度至少2μm；蛭弧菌BDFM05以双层平板法于28℃培养三天可形成直径2～3mm的透明圆形噬菌斑。

[0014] 优选地，步骤(2)中所述布卵前，育苗池彻底换水，所述蛭弧菌游泳体浓缩液在换水后立即添加进去。

[0015] 优选地，步骤(2)和(3)中所述蛭弧菌游泳体在水体浓度为10-107pfu/mL。 [0016] 优选地，步骤(1)所述海水经过砂滤和沉淀处理。

[0017] 优选地，步骤(1)中所述藻为底栖硅藻。

[0018] 优选地，步骤(1)所述曝气量控制在10-100L/h/m3。

[0019] 优选地，步骤(2)中所述布卵初始量为1～3万粒/m3。

[0020] 优选地，步骤(2)中所述布卵后，根据藻生长状态，添加营养盐3-5g/m3，2-4天添加一次。

[0021] 优选地，采用游泳体高密度发酵方法发酵制备蛭弧菌游泳体浓缩液，具体步骤为：

[0022] 在含有副溶血弧菌的DNB培养基中接入蛭弧菌BDFM05(CCTCCM209172)，恒温摇床160rpm～250rpm、25～32℃培养12～36h；培养物经过6000rpm、4℃离心20min，取上清液，再将上清液16000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清液，保留沉淀并向沉淀中加入DNB液体培养基重新悬浮蛭弧菌沉淀物，即制得蛭弧菌游泳体菌液。

[0023] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

[0024] 1、本发明所述的蛭弧菌游泳体能消除养殖环境中的鲍鱼致病菌。 [0025] 所述蛭弧菌游泳体对养殖环境中的常见细菌，包括副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等鲍鱼致病菌有很强的消除作用。对于蛭弧菌游泳体而言，虽然存在着制备繁琐、不易保存的弱点，但用蛭弧菌游泳体控制和消除鲍鱼致病菌具有起效快、活力强的优点。 [0026] 2、本发明所述的蛭弧菌游泳体能显著提高鲍苗体质，增强免疫力。 [0027] 本发明中所述的蛭弧菌游泳体在控制鲍鱼养殖环境、水体中细菌的效果显著，能够明显改善鲍苗体质，增强免疫力，从而提高了鲍苗培育的成活率。

[0028] 3、本发明所述的蛭弧菌游泳体在控制和消除鲍鱼细菌应用中安全性好。蛭弧菌游泳体通过裂解致病菌的方法是生物方法。蛭弧菌游泳体可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑止或清除生物体及其环境中细菌的生物净化因子，且其在裂解完宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，从而克服了抗生素滥用带来的副作用和常规消毒剂对鲍鱼的不利影响。同时已有研究证明蛭弧菌对人等无毒。

[0029] 4、所述的蛭弧菌游泳体能净化水质并促进鲍鱼生长。

[0030] 蛭弧菌游泳体对水质有净化作用，能改善动物胃肠道环境，促进生长。 [0031] 5、含有本发明所述的蛭弧菌游泳体适合推广应用于鲍鱼和其他水产养殖过程。 [0032] 蛭弧菌游泳体对人和鲍鱼无毒副作用。适合于鲍鱼大规模工厂化养殖，可以为鲍鱼的绿色加工生产提供保障并且为控制和消除鲍鱼致病菌提供了一种新方法。 [0033] 6、现有的工厂大都采用流水式养殖，如此下来，不仅耗费了巨大的人力、物力、财力，更会对环境造成一定的污染。而采用周期换水进行布卵，可以 减少了供水量的需求，节约了生产成本，并且不会对环境造成不良影响。

[0034] 7、相对于蛭弧菌蛭质体而言，用蛭弧菌游泳体控制和消除鲍鱼潜在致病菌具有起效快、活力强的优点。这些优点使得蛭弧菌游泳体适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，从而克服了抗生素滥用带来的副作用和中草药见效慢的缺点，对防止脱板症，提高鲍苗在波纹板上的附着量和生长速度有着极其重要的意义。 具体实施方式

[0035] 下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

[0036] 本发明的实施地位山东某养殖场，本发明的鲍苗为皱纹盘鲍，由该养殖场提供。本发明实施地的养殖池建在养殖大棚内，每个水池规格为2×2×0.75m，水深为0.45m，每池放置曝气管8条。培藻前各池均用高锰酸钾溶液消毒，反复冲洗干净。水池上方盖上遮光度为60％的遮光布，光照强弱可以调节，避免光照过强。光照强度一般控制在(200-5000)lux。

[0037] 实施例1

[0038] 蛭弧菌游泳体的制备

[0039] 使用的蛭弧菌菌株为蛭弧菌BDFM05。蛭弧菌BDFM05于2009年8月7日在武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M209172。BDFM05呈单细胞，椭圆形，大小为1.43×0.53μm，端生鞭毛，鞭毛长度至少2μm；所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05以双层平板法于28℃培养三天可形成直径2～3mm的透明圆形噬菌斑，所用的蛭弧菌游泳体通过高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵：在装有100mL营养肉汤7
(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，pH 7.4±0.2)的锥形瓶中接种0.5mL10cfu/mL副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，购于美国典型微生物菌种保藏中心AmericanType Culture Collection，编号：ATCC 17802)，200rpm、28℃摇床培养18小时，培养液分别于
4℃、5000rpm离心15min，弃上清。用5mL生理盐水悬浮沉淀菌体，之后加入到一个装有
100mL DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，海水晶28g，溶于1000mL蒸馏水，pH值为7.2～7.6)的锥形瓶中，再加入
3
1mL含10pfu/mL的蛭弧菌BDFM05(CCTCC M209172)。恒温摇床250rpm、28℃培养36h。培养液 于4℃6000rpm离心20min，取上清液，再将上清液于4℃16000rpm离心20min，保留沉淀，加入10mL DNB液体培培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，
7 9
海水晶28g，溶于1000mL蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)重新悬浮沉淀物，得到10-10pfu/mL的蛭弧菌游泳体。

[0040] 实施例2

[0041] 1、蛭弧菌游泳体在育苗中应用

[0042] 本发明一共可以分为两个阶段。第一阶段是培藻，在育苗池中注入经过砂滤和沉淀处理的海水并曝气，附着基为聚乙烯波纹板，培藻时间为40天，这一阶段不添加蛭弧菌游泳体；第二阶段是育苗，本发明的内容主要在此阶段展开，育苗时间为40天，这一阶段实验组在每次换水后立即添加蛭弧菌游泳体。将实施例1得到的蛭弧菌游泳体，以不同的换水周期，分别向养殖水体投不同浓度的蛭弧菌游泳体。所有实验池所处环境条件，包括温度、光照、pH值、盐度等相同。所有试验池换水周期及加菌浓度如下： [0043] 下面具体对本实施步骤进行描述：

[0044] A组：正常流水，日换水量为池水量的2倍，每天早上6:00用高压水冲洗池子，期间不加蛭弧菌游泳体，同工厂生产方式一样；

[0045] B组(B-1、B-2、B-3、B-4)：5天换(全池)水一次；

[0046] C组(C-1、C-2、C-3、C-4)：10天换(全池)水一次；

[0047] D组(D-1、D-2、D-3、D-4)：15天换(全池)水一次；

[0048] E组(E-1、E-2、E-3、E-4)：20天换(全池)水一次；

[0049] F组(F-1、F-2、F-3、F-4)：25天换(全池)水一次；

[0050] G组(G-1、G-2、G-3、G-4)：30天换(全池)水一次；

[0051] B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌游泳体，使水体中蛭弧菌游泳体菌体浓度达到10pfu/mL。

[0052] B-2、C-2、D-2、E-2、F-2、G-2组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌游泳体，使3
水体中蛭弧菌游泳体菌体浓度达到10pfu/mL。

[0053] B-3、C-3、D-3、E-3、F-3、G-3组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌游泳体，使5
水体中蛭弧菌游泳体菌体浓度达到10pfu/mL。

[0054] B-4、C-4、D-4，E-4、F-4、G-4组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌游泳体，使7
水体中蛭弧菌游泳体菌体浓度达到10pfu/mL。

[0055] 在第一阶段培藻过程中，曝气量控制在50L/h/m3，并密切观察，从第五天开始，可以观察到黄色的波纹板两面不均匀附有褐藻，此时控制光照在2000-5000lux左右，水温控制在15-28℃；根据藻生长状况适量添加营养盐N∶P∶Si∶Fe＝5∶1∶1∶1(ppm)，，3
一般的，3-5g/m 水体，2-4天添加一次，并及时将采苗框翻转，利于藻均匀附着在波纹板上。
十天后，可以观察到波纹板的两面都较均匀的附着一薄层褐藻，取少量在显微镜下镜检，所见藻类主要有大型舟形藻、小型舟形藻、菱形藻和卵形藻等，比例不一。 [0056] 在第二阶段育苗过程中，需要合理调节光照强度，以防止藻生长过快加速老化或生长速度过慢而被鲍苗消耗殆尽。在藻培起来后，把皱纹盘鲍的受精卵泼洒到水池里。每池泼洒(也叫布卵)5万个，布卵后5天附板，光照控制在200-3000lux之间，为藻提供比较适度的光照条件，水温控制在15-28℃。布卵三天内，可以观察到水体中很多担轮幼虫，七天后，在藻板的两面都可以看到附着有微小匍匐幼体，小心刮取显微镜下镜检，观察其活力。 [0057] 从培藻到收苗，时间为80天，稚鲍体长至3.0-6.5mm即可收苗，波纹板上的单细胞藻类部分老化，少数波纹板上的藻已被吃光，所有水池没有发现白板或脱板现象，每张波纹板上的附苗量为300-600粒不等，最多的一张板上可以到达1200粒左右，具体育苗指标与测量方法如下：

[0058] (1)鲍苗初始量，每池5万苗。

[0059] (2)收苗平均壳长，随机抽取50粒鲍苗，测量壳长，取平均值。 [0060] (3)壳长平均日增长量，收苗平均壳长，取40天的平均值。

[0061] (4)鲍苗平均个体重量，随机抽取50粒鲍苗，称其总重后取平均值。 [0062] (5)收苗量，称取5g鲍苗，计算其粒数，将收集的鲍苗称其总重，后估算鲍苗的粒数。

[0063] (6)成活率，某阶段结束时鲍苗量占该阶段投苗量的百分率。

[0064] 2、鲍鱼免疫指标测定

[0065] 试验结束每组取样120个，20个/管放于6个分别盛有lmLHank’s缓冲液(pH值7-8)的2mL-Eppendorf管中，贮于-80℃以备抗免疫指标的测定。测定时取出样品，使其在冰上融化，进行匀浆，然后6000r/min，-4℃离心5min，取上清用于免疫指标的测定。 [0066] ①酚氧化物酶的测定

[0067] 酚氧化物酶的活性测定是通过测定和L-DOPA(左旋多巴)反应生成的 多巴胺的吸光值来计算的。把每个样品100μL加到1.5mL的Eppendorf管中，每个样品重复三次。再加入用PBS液配制的0.5mg/mL海藻酸钠在26-27℃下反应30min，加入50μL的用PBS液配制的3mg/mL的L-DOPA(左旋多巴)，10min后，在490nm处读取吸光值。对照液用相应的PBS液代替海藻酸钠。

[0068] ②溶菌酶活力测定

[0069] 以溶壁微球菌冻干粉为底物。用0.1mol/L，pH＝6.4的磷酸盐缓冲液配成底物悬液(OD570nm≈0.3)，取3.0mL该悬液于试管内置冰浴中，再加入50μL待测血清，混合，测A0值。然后将试液移入37℃温浴中置30min，取出后再置于冰浴中10min，以终止反应，测其A值。溶菌活力UL按(A0-A)/A式计算。

[0070] 表1 5天换(全池)水一次对皱纹盘鲍育苗的影响

[0071]

[0072] 表2 10天换(全池)水一次对皱纹盘鲍育苗的影响

[0073]

[0074]

[0075] 表3 15天换(全池)水一次对皱纹盘鲍育苗的影响

[0076]

[0077] 表4 20天换(全池)水一次对皱纹盘鲍育苗的影响

[0078]

[0079]

[0080] 表5 25天换(全池)水一次对皱纹盘鲍育苗的影响

[0081]

[0082] 表6 30天换(全池)水一次对皱纹盘鲍育苗的影响

[0083]

[0084] 从表1-6可以看出，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌游泳体的浓度升高，成活率都明显升高，且都明显高于A组，说明采用新型的添加蛭弧菌游泳体 的方法，在非正常流水的情况下，能明显提高鲍鱼育苗的成活率，这在实际生产过程中，不仅大大节约了用水量，而且节省了大量的人力，物力资源，节约了养殖成本；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组苗成活率，体长等都没有太大的变化，说明新型育苗方法下，5-30天不换水蛭弧菌游泳体都能催进苗的生长。综合来看，在10pfu/mL浓度下，30天不换水是比较经济的方式，采用这样的方法，效果较佳。

[0085] 从鲍苗免疫力指标来看，添加蛭弧菌游泳体的各组免疫水平却明显高于对照A