HPV16型E7E6融合蛋白基因、表达载体、方法、细胞和用途

摘要

本发明提供一种编码HPV 16型E7E6融合蛋白的基因、表达载体、方法、细胞和用途。本发明利用重组腺病毒，将经修饰失去转化活性的E6、E7蛋白基因融合，并根据融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳细胞密码子优化改造，使之在哺乳细胞中能高水平表达。本发明成功设计了E7E6融合蛋白哺乳细胞密码子优化基因，并成功构建了高表达HPV 16型E7E6融合蛋白的重组腺病毒，其具有强的免疫源性，可诱发特异性T细胞免疫反应，完全保护免疫小鼠抵抗肿瘤细胞的攻击。本发明可用于研发宫颈癌的治疗性宫颈癌疫苗。

权利要求

1.一种用于编码人乳头瘤病毒（HPV）16型E7E6融合蛋白的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.2所示的序列。

2.一种用于表达权利要求1所述的DNA序列编码的人乳头瘤病毒（HPV）16型E7E6融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的DNA序列。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组腺病毒。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述重组腺病毒是复制缺陷型腺病毒，其是由腺病毒穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染腺病毒包装细胞得到的。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述腺病毒穿梭质粒选自pDC316、pDC311、pDC312和pDC315，其是通过将权利要求1所述的DNA序列插入至所述腺病毒穿梭质粒的Bgl Ⅱ位点之间来构建的；和/或所述腺病毒骨架质粒为pBHGloxΔE1,3Cre。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的表达载体，其特征在于，所述重组腺病毒包装细胞选自人胚肾293细胞、人胚肾293T细胞、人胚肾293FT细胞和人胚肾293F细胞。

7.权利要求1所述的DNA序列在制备用于治疗人乳头瘤病毒（HPV）16型感染及相关疾病药物中的应用。

8.权利要求2至6中任一项所述的表达载体在制备用于治疗人乳头瘤病毒（HPV）16型感染及相关疾病药物中的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述相关疾病为宫颈癌。

10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。

11.一种用于治疗宫颈癌的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1所述的DNA序列或权利要求2至6中任一项所述的表达载体。

说明书

HPV 16型E7E6融合蛋白基因、表达载体、方法、细胞和用途

技术领域

[0001] 本发明属于医学生物技术领域。具体地，本发明涉及一种表达人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的基因、表达载体、方法和免疫治疗用途。

背景技术

[0002] 大量研究资料证明，生殖道的高危型人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染与宫颈癌有十分密切的关系。90％的宫颈癌患者可查到HPV DNA的存在，其中HPV16型占50％，是引起宫颈癌的主要致病因子。目前尽管早期宫颈癌患者手术及放疗治疗效果较好，但中晚期患者必须在手术治疗的基础上给予放疗和一定的化疗。由于放疗的巨大副作用及宫颈癌对化疗的不敏感性，仍有35％的患者出现目前尚无法治疗的严重合并症，费用大且复发率高。这一切表明有必要发展更有效的预防和治疗性疫苗来防治HPV的感染和宫颈癌以及相关肿瘤。

[0003] 由于HPV癌基因E6，E7早期蛋白在宫颈上皮中是持续表达，在正常组织中并不存在，因此这两种蛋白可以作为发展HPV相关宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原。大多数肿瘤特异性抗原是正常或突变的细胞蛋白，而E6和E7完全是外源病毒蛋白，因此可能比突变的细胞蛋白具有更好的免疫原性。并且由于E6和E7的持续存在是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的，因此宫颈癌细胞不可能通过抗原丢失来逃避免疫监视。动物实验已经显示，以E6和E7蛋白作为靶抗原，可产生好的免疫治疗作用。

[0004] 复制缺陷型重组腺病毒嗜性广泛，是将外源基因导入动物细胞内常用的载体之一。接种后，重组腺病毒在体内进行核酸复制和蛋白表达，产生大量抗原，刺激机体产生特异性免疫反应，并且它的感染与自然过程相似，表达的抗原在宿主细胞内被加工和呈递，可以产生强的体液免疫和细胞免疫，病毒载体本身还可发挥佐剂效果增强免疫反应；同时由于重组腺病毒不整合到宿主基因组中，具有良好的生物安生性；理化性质较稳定，易于分离纯化；这些特性都使腺病毒成为肿瘤疫苗的合适载体被广泛用于基因治疗、体外基因转染及基因疫苗制备等实验及临床研究中。

[0005] 腺病毒载体疫苗有许多优点，但也存在着不足，其原有的高本底感染产生的中和抗体影响着它在新型疫苗中的广泛使用，此外免疫接种后产生的抗病毒抗体可能抑制再次免疫，从而影响免疫治疗效果，但人们通过异源性疫苗联合免疫的治疗方法克服了这一缺点。2000年He Z.等在Virology上发表了在腺病毒中分别表达E6、E7蛋白，并进行了免疫效果观察。

发明内容

[0006] 下面详细讨论本发明各种技术方案的制备和使用，但应该理解，本发明提供了许多适用的发明构思，其可以体现在各种各样的具体方面上。

[0007] 为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语可用于说明的具体实例的一般类别，但它们的使用不限制本发明，权利要求中所概括的除外。

[0008] 除非另外指出，本文所述的“HPV”是指人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus)；

[0009] 除非另外指出，本文所述的“bp”是指碱基对(base pair)；

[0010] 除非另外指出，本文所述的“ELISPOT”是指酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot)；

[0011] 除非另外指出，本文所述的“SDS-PAGE”是指十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)；

[0012] 除非另外指出，本文所述的“IFN-γ”是指γ-干扰素(Interfern gamma)；

[0013] 除非另外指出，本文所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffered saline)；

[0014] 本发明利用腺病毒载体，将经修饰失去转化活性的E6、E7蛋白基因融合，并根据融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳细胞密码子优化改造，使之在哺乳细胞能高水平表达。本发明成功设计出E7E6融合蛋白哺乳细胞密码子优化基因，并成功构建了高表达HPV16型E7E6融合蛋白的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6，该重组腺病毒疫苗具有强的免疫源性，可诱发特异性T细胞免疫反应，完全保护免疫小鼠抵抗肿瘤细胞的攻击。本发明可用于研发宫颈癌的治疗和治疗性宫颈癌疫苗。

[0015] 具体地，本发明的一个目的在于，提供一种人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白。本发明的另一个目的在于，提供一种用于编码前述的人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列。本发明的又一个目的在于，提供一种表达载体及包含人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合基因的重组腺病毒。本发明的再一个目的在于，提供一种用于生产前述的人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白重组腺病毒的细胞。

[0016] 本发明的还一个目的在于，提供一种生产前述的表达人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的方法。此外，本发明还提供了上述HPV 16型E7E6融合蛋白的DNA序列、表达载体、腺病毒及细胞的用途。

[0017] 针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0018] 一方面，本发明提供一种人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列为SQE.ID.NO.1所示的序列。

[0019] 另一方面，本发明提供一种用于编码上述人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列，所述DNA序列是根据哺乳细胞密码子进行优化的序列，其核苷酸序列为SQE.ID.NO.2所示的序列。

[0020] 又一方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有上述表达人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列；优选地，所述表达载体包括重组腺病毒。由于本发明所提供的上述优化DNA序列是根据哺乳细胞密码子进行优化合成的，从理论上来说，既然其适合在腺病毒载体上表达，就应当可以在其它哺乳细胞表达系统中高效表达。

[0021] 又一方面，本发明提供一种重组腺病毒质粒，所述的质粒含有上述编码人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列和克隆质粒或腺病毒穿梭质粒；优选地，所述的克隆质粒选自pUC18、pUC19和pUC57等；所述的腺病毒穿梭质粒选自pDC316、pDC311、pDC312和pDC315等；更优选地，所述的重组腺病毒质粒是将编码上述人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的DNA序列插入至克隆质粒pUC 18或腺病毒穿梭质粒pDC316的Bgl II位点之间来构建的。

[0022] 此外，本发明提供一种用于表达上述人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的重组腺病毒，所述的重组腺病毒是复制缺陷型腺病毒，该病毒携带有上述表达人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的的优化DNA序列，并能表达人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白；优选地，所述重组腺病毒是由重组腺病毒穿梭质粒和腺病毒骨架质粒在人胚肾293细胞中发生同源重组后在人胚肾293细胞内包装形成的，其中所述腺病毒穿梭质粒选自pDC316、pDC311、pDC312和pDC315等，所述腺病毒骨架质粒为复制缺陷型载体，优选选自pBHGloxΔE1，3Cre。

[0023] 再一方面，本发明提供一种用于生产上述重组腺病毒的细胞，所述的细胞为上述重组腺病毒的包装细胞；优选地，所述的细胞选自人胚肾293细胞、人胚肾293T细胞、人胚肾293FT细胞和人胚肾293F细胞等。

[0024] 本发明还提供一种用于表达上述人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的哺乳动物细胞，所述细胞是由上述表达载体感染或转染得到的；优选地，所述表达载体为重组腺病毒；更优选地，所述哺乳动物细胞为人胚肾293细胞、人胚肾293T细胞、人胚肾293FT细胞和人胚肾293F细胞。

[0025] 还一方面，本发明提供一种表达上述人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的方法，所述方法包括构建含有上述编码人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列的表达载体，并使该表达载体在哺乳动物细胞中得到表达；优选地，所述表达载体为重组腺病毒；更优选地，所述细胞选自人胚肾293细胞、人胚肾293T细胞、人胚肾293FT细胞和人胚肾293F细胞等。

[0026] 本发明还提供了制备一种表达上述人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：1)将上述的人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列插入到腺病毒穿梭质粒，构建出重组腺病毒穿梭质粒载体；2)将步骤1)所构建的重组腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染人胚肾293细胞；3)将步骤2)所得到的细胞进行离心后，用无菌PBS重悬细胞沉淀，反复冻融后，再次离心，上清液即为含重组腺病毒的原代病毒液；4)将步骤3)中的原代病毒液进行单斑纯化，并通过鉴定筛选出正确的重组腺病毒；5)将步骤4)中重组腺病毒在人胚肾细胞中传代扩增。

[0027] 此外，本发明还提供了一种制备用于治疗人乳头瘤病毒(HPV)16型感染及相关疾病(如宫颈癌)药物的方法，所述方法包括将编码人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列、包含编码人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列的表达载体(包括重组腺病毒)、或者包含该重组腺病毒的包装细胞用于表达人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白。

[0028] 本发明还提供了上述人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白、编码人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列、包含编码人乳头瘤病毒(HPV)16型E7E6融合蛋白的优化DNA序列的表达载体(包括重组腺病毒)、或者包含该重组腺病毒的细胞在制备用于治疗人乳头瘤病毒(HPV)16型感染及相关疾病(如宫颈癌)药物中的应用；优选地，所述药物为疫苗。

[0029] 本发明还提供了一种用于治疗宫颈癌的疫苗，所述疫苗包括上述的融合蛋白、DNA序列、表达载体、重组腺病毒或细胞。

[0030] 由此可见，本发明采用基因工程技术方法，首先，将HPV16型早期蛋白E7、E6编码区基因融合，并将E7、E6编码区基因进行改造修饰去除其转化活性，保留抗原性，再根据哺乳细胞使用密码子的偏嗜性设计其相应的优势密码子核酸序列交给公司合成。众所周知，从多种密码子中选择特定的密码子以获得较高蛋白产量称为“密码子优化”，对于分子量较大，即组成的氨基酸数目较多的蛋白而言，寻找及确定密码子优化的核苷酸序列是具有相当难度的。然后，将合成的经密码子优化过的E7E6融合基因插入到腺病毒重组载体质粒pCD316中，与Ad5病毒载体骨架质粒共转染293细胞，经纯化并进行E7E6融合基因及蛋白的鉴定，筛选出表达人乳头瘤病毒HPV16型E7E6融合蛋白的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6，扩增重组病毒，经动物免疫实验评价，表明所制备出的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6具有免疫活性，其能够诱发免疫动物产生针对HPV16E7的特异性T细胞介导的细胞免疫应答，对肿瘤的生长有明显抑制作用。

附图说明

[0031] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0032] 图1显示插入了密码子优化的HPV16型E7E6融合基因的克隆质粒pUC18-HPV16smE7E6的结构图谱。

[0033] 图2显示腺病毒穿梭质粒pDC316的结构图谱。

[0034] 图3显示插入了密码子优化的HPV16型E7E6融合基因的重组腺病毒穿梭质粒pDC-HPV16smE7E6的结构图谱。

[0035] 图4显示插入了密码子优化的HPV16型E7E6融合基因的重组腺病毒穿梭质粒pDC-HPV16SmE7E6的酶切鉴定凝胶电泳结果，其中M1为λ-EcoT14I DNA Marker，M2为DNA Marer III，1为用Ava I酶切的pDC-HPV16SmE7E6质粒，2为Bgl II酶切的pDC-HPV16SmE7E6质粒，3为Nsi I酶切的pDC-HPV16SmE7E6质粒，4为未进行酶切的pDC-HPV16SmE7E6质粒。

[0036] 图5显示插入了密码子优化的HPV16型E7E6融合基因的重组腺病毒穿梭质粒pDC-HPV16SmE7E6的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的结构图谱。

[0037] 图6显示重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的PCR鉴定结果，其中M为λ-EcoT14I DNA Marker，1为空白对照，2为Ad5腺病毒阴性对照，3为重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6。

[0038] 图7显示重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6中的E7E6融合基因表达产物的Western-blot检测结果，其中M为宽分子量预染蛋白质Marker，1为Ad5腺病毒阴性对照，2为重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6，A图为用抗HPV16E6抗体检测的反应信号，B图为用抗HPV16E7抗体检测的反应信号。

[0039] 图8显示重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6免疫小鼠后ELISPOT酶联免疫斑点检测结果图。

[0040] 图9显示重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6免疫小鼠后，抗肿瘤移植实验的结果图。

[0041] 图10显示重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6对肿瘤生长抑制作用的结果图。

具体实施方式

[0042] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

[0043] 除非另外指明，本发明所使用的各种实验材料来源如下：常用限制性内切酶、T4连接酶、Taq酶、碱性磷酸酶均为Biolabs公司产品，购自北京北方仪涛商贸有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品；脂质体转染试剂TMLipofectamine 2000为Invitrogen公司产品，购自北京茂健联星科技有限公司；鼠ELISPOT试剂盒为荷兰U-Cytech公司，购自达科为生物技术有限公司；鼠抗HPV16E7单克隆抗体为英国SantaCruz公司产品；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术公司；硝酸纤维素膜购自英国Whatman公司；低分子量标准蛋白质购自北京华美转导科技有限公司；重组腺病毒穿梭质粒pDC316、重组腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1，
3Cre以及腺病毒包装细胞人肾上293细胞均购自加拿大Microbix Bixosystems公司。

[0044] 除非另外指明，本发明所使用的引物来源如下：检测引物由上海生工生物工程基因技术有限公司合成，其中上游引物pDC316F：5′acg tgg gta taagag gcg 3′，下游引物pDC316R：5′cga tgc tag acg atc cag 3′；针对HPV16E7CD8+T cell特异性的表位肽(氨基酸第49-57位：RAHYNIVTF)由北京中科亚光生物科技有限公司合成。

[0045] 除非另外指明，本发明所使用的实验动物来源如下：C57BL/6小鼠购自中国医学科学院动物所。

[0046] 除非另外指明，本发明所涉及的生物基因工程操作技术(如质粒提取、酶切消化、片段回收、核酸片段与质粒载体连接反应及克隆和筛选等)，请参见《分子生物克隆指南》，萨姆布鲁克J等，第二版(北京)：科学出版社，1992。

[0047] 实施例1：设计并合成人乳头瘤病毒16型E7E6融合蛋白及适于哺乳细胞表达的密码子优化融合基因

[0048] 本实施例为设计并合成人乳头瘤病毒16型E7E6融合蛋白，以及设计适于哺乳细胞表达的密码子优化的融合基因，具体过程如下。

[0049] 根据HPV16型E7、E6的基因编码区序列(Genebank号NC 001526)获得HPV16型E7、E6基因编码的氨基酸序列，将E7蛋白与pRB结合位点的两个关键氨基酸第24位半胱氨酸和第26位谷氨酸变为甘氨酸，E6蛋白的P53降解活性位点的关键氨基酸第57位的亮氨酸变为甘氨酸，以消除其肿瘤转化活性。再将HPV16的E7蛋白氨基酸序列C末端与HPV16E6蛋白序列的N端相连，组合设计为如下的融合蛋白，氨基酸序列如SQE.ID.NO.1所示，共255个氨基酸(不含终止密码子)。

[0050] 利用基因简并性，在其编码的产物蛋白氨基酸序列保持不变的前提下设计出适于哺乳细胞表达的优势密码子优化核苷酸序列，发明人将该序列命名为SmE7E6，经实验检测证明，该序列适于在哺乳细胞中表达HPV16SmE7E6融合蛋白，其序列如SQE.ID.NO.2所示，共771bp(含两个终止密码子序列)。

[0051] 实施例2：克隆质粒pUC18-HPV16smE7E6的构建

[0052] 本实施例为构建克隆质粒pUC18-HPV16smE7E6。

[0053] 将实施例1所设计的HPV16SmE7E6融合基因核苷酸序列送北京擎科生物技术有限公司合成，并由公司将其克隆于pUC18中，获得合成基因的克隆质粒pUC18-HPV16smE7E6，经序列测定表明合成序列与设计一致。插入了密码子优化的HPV16型E7E6融合基因的克隆质粒pUC18-HPV16smE7E6结构图谱如图1所示，其序列如SQE.ID.NO.3所示，共3475bp。

[0054] 本实施例中所使用的pUC18为可商购获得的质粒载体，购自北京六合通经贸有限公司，其具体结构见文献《分子生物克隆指南》，萨姆布鲁克J等，第二版(北京)：科学出版社，第9页，1992。

[0055] 实施例3：重组腺病毒5型穿梭质粒pDC-HPV16smE7E6的构建

[0056] 本实施例为构建重组腺病毒5型穿梭质粒pDC-HPV16smE7E6，具体过程如下。

[0057] 首先，将实施例2中合成并克隆至pUC18上的SmE7E6优化基因用BglII酶37℃水浴消化2小时，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收SmE7E6融合基因片段。

[0058] 其次，将该SmE7E6融合基因片段插入用相同内切酶(Bgl II)消化处理，并用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理过的腺病毒穿梭质粒pDC316(其具体结构图谱见图2)中，经Ava I、BglII和NsiI酶切鉴定(电泳结果如图4所示)并测序筛选，获得有正确插入的重组腺病毒穿梭质粒pDC-HPV16SmE7E6，其结构图谱如图3所示，其序列如SQE.ID.NO.4所示，共4690bp。

[0059] 实施例4：重组腺病毒rAd5HPV16SmE的构建

[0060] 本实施例为构建表达HPV16型E7E6融合蛋白的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E，其结构图谱见图5，其序列如SQE.ID.NO.5所示，共31762bp。具体的构建过程包括：

[0061] (1)腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1，3Cre和重组腺病毒穿梭质粒pDC-HPV16SmE7E6的制备：

[0062] 使用QIAGEN质粒大提试剂盒(购自北京北方仪涛商贸有限公司)分别提取pBHGloxΔE1，3Cre和实施例3所构建的pDC-HPV16SmE7E6，操作步骤见QIAGEN Plasmid Midi Kits使用手册。

[0063] (2)重组腺病毒的包装：

[0064] 转染前一天传293细胞于25cm2细胞培养瓶，培养基用不含抗生素的5％FCS的DMEM，第二天选60％～80％铺满的细胞备用。配制转染液如下：

[0065] A液：重组腺病毒穿梭质粒pDC-HPV16SmE7E6和骨架质粒pBHGloxΔE1，3Cre各5μl(各4μg)加入245μl Opti-MEM培养基中混匀；

[0066] B液：5μl LipofectamineTM2000加入245μl Opti-MEM培养基中混匀。

[0067] A液和B液室温放置5分钟后，将A加入B液中轻轻混匀，室温放置20分钟。吸弃旧细胞培养液，换2ml新鲜的不含抗生素、含5％FCS的DMEM，然后将A+B混合液加入培养细胞上，于37℃、5％CO2孵育8h，补充新鲜的培养基2.5ml。24h后换含2％FCS的DMEM维持。转染后7～10天，用细胞刮将细胞刮擦下来，800rpm离心5分钟，弃上清，用2ml的无菌PBS重悬细胞沉淀；-70℃和37℃反复冻融4次；2000rpm离心10分钟，吸取上清即为原代病毒液，所得重组腺病毒命名为rAd5HPV 16SmE7E6，-70℃保存备用。

[0068] 实施例5：重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E的纯化和PCR鉴定

[0069] 本实施例为纯化重组腺病毒并通过PCR鉴定该重组腺病毒，具体的实验操作如下：

[0070] 将实施例4中的原代病毒液以10倍系列稀释，感染293细胞，培养2-4小时后铺斑，37℃培养4-6天后，经单斑纯化后进行鉴定。

[0071] 将单斑病毒冻融三次后，感染在24孔板中长至90％的293细胞。病毒在37℃吸附1-2小时后补液，放入37℃培养24-48小时后，吸取感染细胞的上清液50μl，加入1μl蛋白酶K(10mg/ml)，37℃消化1.5小时后煮沸10分钟，迅速放在冰上5分钟，做为PCR检测的模板。在染毒时同时做一个感染Ad5腺病毒的孔进行相同处理后作为检测用的阴性对照。

[0072] 取0.01μl-1μl上述样品进行PCR反应。样品包括待测重组腺病毒毒株和Ad5腺病毒对照，同时做不加DNA模板做为试剂空白对照。

[0073] PCR反应体系

[0074] 样品 0.2μl

[0075] 10×PCR Buffer 2μl

[0076] 引物pDC316F 1μl

[0077] 引物pDC316R 1μl

[0078] dNTP 1.6μl

[0079] Taq酶 0.2μl

[0080] H2O 14μl

[0081] 总计 20μl

[0082] 循环参数：94℃预变性10分钟；94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，三十个循环；72℃延伸10分钟。取5μl PCR反应溶液上1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物的大小，结果见图6。待测样品扩增出1039bp左右的条带，与预期结果相符，而腺病毒对照和空白对照在相应位置未见扩增条带，将扩增出的PCR产物送北京擎科生物技术有限公司测序，序列正确与设计相符，表明目的基因正确插入腺病毒中。

[0083] 实施例6：重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的传代扩增

[0084] 本实施例为重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的传代扩增，具体操作如下：

[0085] 取实施例5中经PCR鉴定正确的重组病毒且已纯化好的单斑冻存液约0.2ml与1ml含2％胎牛血清的DMEM混合后感染长至60％～70％的293细胞，37℃孵育2小时，补加2％胎牛血清的DMEM维持液5ml，至绝大部分293细胞出现细胞肿胀、圆缩等典型的病变后，收集病变细胞，细胞沉淀在PBS中重悬，在-70℃冻化三次后，按1∶10接种病毒进行扩
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增。在293细胞中传代扩增5-6代，直到获得所需滴度的重组病毒(＞10pfu/ml)。

[0086] 实施例7：重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6感染的293细胞中E7E6融合蛋白的表达检测

[0087] 本实施例为重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6感染的293细胞中E7E6融合蛋白的表达检测，具体操作如下：

[0088] 在25cm2细胞培养瓶中293细胞长成90％左右，用1pfu/cel滴度染毒，病毒在37℃吸附1-2小时后补液，放入37℃培养24-48小时至细胞全病变。倒掉病毒液，用PBS轻轻洗两遍，用细胞刮子将细胞刮下，1000-2000转/分，离心5分钟，收集细胞。往细胞内加入50μl 1×SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃加热3分钟。取5-10μl上样(样品包括待测重组腺病毒毒株、Ad5腺病毒做阴性对照)于10％的SDS-PAGE胶进行电泳，然后电转样品于硝酸纤维素膜。分别使用抗HPV16E7鼠单克隆抗体和抗HPV16E6山羊多克隆抗体(为Santa Cruz公司产品，购自北京北方仪涛商贸有限公司作为第一抗体，然后用相应的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和兔抗羊IgG作为第二抗体，用化学发光试剂盒(为Pierce产品，购自北京北方同正生物技术发展有限公司)进行曝光检测信号。结果表明，重组腺病毒约在蛋白质预染Marker 40KD处，相当于蛋白质非预染Marker约35KD位置处与HPV16E7鼠单克隆抗体和抗HPV16E6山羊多克隆抗体均有一反应条带，而腺病毒对照在相应位置无反应条带，与E7E6融合蛋白预计分子量相符，结果如图7A和B所示。

[0089] 实施例8：重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的动物免疫实验

[0090] 本实施例为使用本发明的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6对小鼠进行免疫后，检测血清特异性抗体和细胞免疫反应，并进行了抗肿瘤移植和抑制肿瘤生长实验，具体如下。

[0091] (1)重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6免疫小鼠后血清特异性抗体和细胞免疫反应检测

[0092] 使用由前述实施例6制备得到的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E61×107pfu肌肉注射免疫C57BL/6小鼠，二周后相同方式加强免疫一针，免疫结束后14天进行血清特异性抗体检测和细胞免疫检测。

[0093] a.特异性抗体检测：取血清，用酶联免疫法(ELISA)进行E7抗体和E6抗体的检测，以试剂组PBS为阴性对照。

[0094] 结果重组腺病毒诱发的E7抗体水平较低，滴度为1∶20，E6抗体未检测到。

[0095] b.细胞免疫反应检测：取脾细胞，用酶联免疫斑点(ELISPOT)方法进行E7蛋白第49-57位肽刺激产生的特异性分泌IFN-γ的效应T细胞的数目检测。

[0096] 结果如图8所示，HPV16E749-57肽刺激免疫重组腺病毒的小鼠后产生分泌IFN-γ的效应T细胞数斑点数为329，而PBS和对照组则没有检测到相应的斑点数。两者具有明显的差别，说明重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6能够诱发小鼠产生针对HPV16E7的特异性T细胞介导的细胞免疫应答。

[0097] ELISPOT 检 测 方 法 请 参 见 Miyahira Y，et al.Quantification of antigenspecific CD8+T cell using an ELISPOT assay.J Immunol Methods，1995，181(1)：45-54.以及Murali-Krishna K，et al.Counting antigen-speific CD8 Tcells：
a reevaluation of bystander activation during viral infection.Immunity，1998，
8(2)：1771-87)。具体操作步骤请参见ELISPOT试剂盒说明书(ELISPOT试剂盒为U-CyTech公司产品，购自深圳达科维生物技术有限公司)。

[0098] (2)重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6的抗肿瘤移植实验

[0099] 用前述实施例6制备得到的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6 1×107pfu肌肉注射4
免疫C57BL/6小鼠，两周后相同方式加强免疫，免疫结束后两周，用5×10 TC-1肿瘤细胞(TC-1肿瘤细胞系HPV16-E6、E7和ras基因转化的C57BL/6小鼠肺上皮细胞，可稳定表达和递呈E6、E7蛋白，由John Hopkins大学T.C.Wu教授馈赠，见参考文献：Lin K Y，Guarnieri FG，Stavelev-o’Canrroll KF，et al.Treatment of established tumor with a novelvaccine that enhance major histocompatibility class II presentation of tumorantigen.Cancer Res，1996，56(1)：21～26)皮下接种小鼠腹股沟处，观察肿瘤生长情况每周两次。

[0100] 结果如图9所示，表明经重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6免疫后的小鼠对肿瘤的生长有明显抑制作用，可完全保护小鼠免受TC-1肿瘤细胞生长攻击。

[0101] (3)重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6对肿瘤生长的抑制作用

[0102] 先用5×104 TC-1肿瘤细胞注射C57BL/6小鼠腹股沟处，制备出荷瘤小鼠。第二7
天用实施例6制备得到的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E61×10pfu肌肉注射免疫上述荷瘤小鼠，10天后相同剂量加强免疫，观察肿瘤生长情况，每周2次。

[0103] 结果如图10所示，表明重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6明显抑制肿瘤细胞的生长，小鼠TC-1肿瘤细胞生长完全抑制，保护率为100％。

[0104] 序列表

[0105] <110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

[0106] <120>HPV 16型E7E6融合蛋白基因、表达载体、方法、细胞和用途[0107] <130>DIC09110130

[0108] <160>5

[0109] <170>PatentIn version 3.3

[0110] <210>1

[0111] <211>255

[0112] <212>PRT

[0113] <213>HPV16SmE7E6融合蛋白

[0114] <400>1

[0115] Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln[0116] 1 5 10 15[0117] Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser[0118] 20 25 30

[0119] Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp[0120] 35 40 45

[0121] Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr[0122] 50 55 60

[0123] Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu[0124] 65 70 75 80[0125] Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln[0126] 85 90 95 [0127] Lys Pro His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg[0128] 100 105 110

[0129] Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His[0130] 115 120 125

[0131] Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg[0132] 130 135 140

[0133] Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Gly Cys Ile Val Tyr Arg Asp[0134] 145 150 155 160[0135] Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys[0136] 165 170 175

[0137] Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu[0138] 180 185 190

[0139] Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile[0140] 195 200 205

[0141] Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp[0142] 210 215 220

[0143] Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys[0144] 225 230 235 240[0145] Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu[0146] 245 250 255

[0147] <210>2

[0148] <211>771

[0149] <212>DNA

[0150] <213>人工序列

[0151] <400>2

[0152] atgcacggcg acacccccac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc cgagaccacc 60[0153] gacctgtacg gctacggcca gctgaacgac agcagcgagg aggaggacga gatcgacggc 120[0154] cccgccggcc aggccgagcc cgacagagcc cactacaaca tcgtgacctt ctgctgcaag 180[0155] tgcgacagca ccctgagact gtgcgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggag 240[0156] gacctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccccatct gcagccagaa gccccaccag 300[0157] aagagaaccg ccatgttcca ggacccccag gagagaccca gaaagctgcc ccagctgtgc 360[0158] accgagctgc agaccaccat ccacgacatc atcctggagt gcgtgtactg caagcagcag 420[0159] ctgctgagaa gagaggtgta cgacttcgcc ttcagagacg gctgcatcgt gtacagagac 480[0160] ggcaacccct acgccgtgtg cgacaagtgc ctgaagttct acagcaagat cagcgagtac 540[0161] agacactact gctacagcct gtacggcacc accctggagc agcagtacaa caagcccctg 600[0162] tgcgacctgc tgatcagatg catcaactgc cagaagcccc tgtgccccga ggagaagcag 660[0163] agacacctgg acaagaagca gagattccac aacatcagag gcagatggac cggcagatgc 720[0164] atgagctgct gcagaagcag cagaaccaga agagagaccc agctgtgata a 771[0165] <210>3

[0166] <211>3475

[0167] <212>DNA

[0168] <213>人工序列

[0169] <400>3

[0170] tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60[0171] cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120[0172] ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180[0173] accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240[0174] attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300[0175] tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360[0176] tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420[0177] actctagagg atccccggaa gatctatgca cggcgacacc cccaccctgc acgagtacat 480[0178] gctggacctg cagcccgaga ccaccgacct gtacggctac ggccagctga acgacagcag 540[0179] cgaggaggag gacgagatcg acggccccgc cggccaggcc gagcccgaca gagcccacta 600[0180] caacatcgtg accttctgct gcaagtgcga cagcaccctg agactgtgcg tgcagagcac 660[0181] ccacgtggac atcagaaccc tggaggacct gctgatgggc accctgggca tcgtgtgccc 720[0182] catctgcagc cagaagcccc accagaagag aaccgccatg ttccaggacc cccaggagag 780[0183] acccagaaag ctgccccagc tgtgcaccga gctgcagacc accatccacg acatcatcct 840[0184] ggagtgcgtg tactgcaagc agcagctgct gagaagagag gtgtacgact tcgccttcag 900[0185] agacggctgc atcgtgtaca gagacggcaa cccctacgcc gtgtgcgaca agtgcctgaa 960[0186] gttctacagc aagatcagcg agtacagaca ctactgctac agcctgtacg gcaccaccct 1020[0187] ggagcagcag tacaacaagc ccctgtgcga cctgctgatc agatgcatca actgccagaa 1080[0188] gcccctgtgc cccgaggaga agcagagaca cctggacaag aagcagagat tccacaacat 1140[0189] cagaggcaga tggaccggca gatgcatgag ctgctgcaga agcagcagaa ccagaagaga 1200[0190] gacccagctg tgataaagat cttccgggta ccgagctcga attcgtaatc atggtcatag 1260[0191] ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 1320[0192] ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 1380[0193] tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 1440[0194] cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 1500[0195] ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 1560[0196] ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 1620[0197] gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1680[0198] gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1740[0199] taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1800[0200] accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1860[0201] tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 1920[0202] cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 1980[0203] agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2040[0204] gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 2100[0205] gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 2160[0206] tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 2220[0207] acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 2280[0208] cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 2340[0209] acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 2400[0210] acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 2460[0211] tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 2520[0212] ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 2580[0213] ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 2640[0214] tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 2700[0215] aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 2760[0216] ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 2820[0217] ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 2880[0218] gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 2940[0219] gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 3000[0220] cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 3060[0221] actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 3120[0222] ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 3180[0223] tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 3240[0224] ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 3300[0225] agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 3360[0226] aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 3420[0227] attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3475[0228] <210>4

[0229] <211>4690

[0230] <212>DNA

[0231] <213>人工序列

[0232] <220>

[0233] <221>misc_ftature

[0234] <222>(454)..(454)

[0235] <223>nis a，c，g，or t

[0236] <400>4

[0237] ttcatcaata atatacctta ttttggattg aagccaatat gataatgagg gggtggagtt 60[0238] tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg cggaagtgtg 120[0239] atgttgcaag tgtggcggaa cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg acgtttttgg 180[0240] tgtgcgccgg tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg atgttgtagt 240[0241] aaatttgggc gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga ataagaggaa 300[0242] gtgaaatctg aataattttg tgttactcat agcgcgtaat atttgtctag ggccgcgggg 360[0243] actttgaccg tttacgtgga gactcgccca ggtgtttttc tcaggtgttt tccgcgttcc 420[0244] gggtcaaagt tggcgtttta ttattatagt cagntctaga gatatactga gtcattaggg 480[0245] actttccaat gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg ggtgaatcaa caggaaagtc 540[0246] ccattggagc caagtacact gagtcaatag ggactttcca ttgggttttg cccagtacaa 600[0247] aaggtcaata gggggtgagt caatgggttt ttcccattat tggcacgtac ataaggtcaa 660[0248] taggggtgag tcattgggtt tttccagcca tttaattaaa acgccatgta ctttcccacc 720[0249] attgacgtca atgggctatt gaaactaatg caacgtgacc tttaaacggt actttcccat 780[0250] agctgattaa tgggaaagta ccgttctcga gccaatacac gtcaatggga agtgaaaggg 840[0251] cagccaaaac gtaacaccgc cccggttttc ccctggaaat tccatattgg cactcattct 900[0252] attggctgag ctgcgttcta cgtgggtata agaggcgcga ccagcgtcgg taccgtcgca 960[0253] gtcttcggtc tgaccaccgt agaacgcaga tcgaattccc cgggagatct atgcacggcg 1020[0254] acacccccac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc cgagaccacc gacctgtacg 1080[0255] gctacggcca gctgaacgac agcagcgagg aggaggacga gatcgacggc cccgccggcc 1140[0256] aggccgagcc cgacagagcc cactacaaca tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca 1200[0257] ccctgagact gtgcgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggag gacctgctga 1260[0258] tgggcaccct gggcatcgtg tgccccatct gcagccagaa gccccaccag aagagaaccg 1320[0259] ccatgttcca ggacccccag gagagaccca gaaagctgcc ccagctgtgc accgagctgc 1380[0260] agaccaccat ccacgacatc atcctggagt gcgtgtactg caagcagcag ctgctgagaa 1440[0261] gagaggtgta cgacttcgcc ttcagagacg gctgcatcgt gtacagagac ggcaacccct 1500[0262] acgccgtgtg cgacaagtgc ctgaagttct acagcaagat cagcgagtac agacactact 1560[0263] gctacagcct gtacggcacc accctggagc agcagtacaa caagcccctg tgcgacctgc 1620[0264] tgatcagatg catcaactgc cagaagcccc tgtgccccga ggagaagcag agacacctgg 1680[0265] acaagaagca gagattccac aacatcagag gcagatggac cggcagatgc atgagctgct 1740[0266] gcagaagcag cagaaccaga agagagaccc agctgtgata aagatctaag cttgagctcg 1800[0267] tcgacttcga gcaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc 1860[0268] acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 1920[0269] atcaatgtat cttatcatgt ctggatcgtc tagcatcgaa gatccaataa cttcgtatag 1980[0270] catacattat acgaagttat aagtagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 2040[0271] tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 2100[0272] gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 2160[0273] ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 2220[0274] ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 2280[0275] gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 2340[0276] tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 2400[0277] aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 2460[0278] aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 2520[0279] ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 2580[0280] tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 2640[0281] agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 2700[0282] gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 2760[0283] tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 2820[0284] acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 2880[0285] tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 2940[0286] caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 3000[0287] aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 3060[0288] aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 3120[0289] ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 3180[0290] agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 3240[0291] atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 3300[0292] cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 3360[0293] aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 3420[0294] cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 3480[0295] aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 3540[0296] ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 3600[0297] gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 3660[0298] ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 3720[0299] tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 3780[0300] tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 3840[0301] ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 3900[0302] 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