一种植物耐高pH盐碱基因SucHP及应用

摘要

本发明公开了一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，它是利用抑制差减杂交和高密度点阵膜技术研究碱蓬苗期高pH盐碱胁迫诱导基因的表达，从碱蓬中首次分离出编码液泡膜质子泵的基因，将该基因构建正义表达载体，转化拟南芥，转基因植株具从有较高的耐高pH盐碱性，在100mM NaHCO3+200mM NaCl，pH8.5条件下，能正常生长，该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐碱能力。

权利要求

1.一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种植物耐高pH盐碱基因SucHP表达的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，其特征在于，它是从碱蓬中分离出来的cDNA。

4.一种植物耐高pH盐碱基因SucHP 的制备方法:

1)提取碱蓬总RNA，采用磁珠法分离纯化mRNA，反转录为cDNA，人工合成下述引物： 引物1：5′-AAAAAGCAGGCTATGGGTGTTGTTCTTCTTC-3′ 引物2：5′-AGAAAGCTGGGTTTAGAAGATCTTGAAGAGCA-3′ 引物3：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3′ 引物4：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3′

2)利用引物1和引物2, 以碱蓬的总RNA反转录的cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增,得到SucHP 基因片段;

3）以第一轮的PCR产物稀释100倍为模板，使用引物3、引物4，进行第二轮PCR扩增，PCR产物利用PEG沉降技术进行纯化，得到纯化的SucHP 基因片段； 所述的碱蓬为Suaeda corniculata。

5.一种植物表达载体，其特征在于，它含有权利要求4所述方法得到的纯化的SucHP基因片段。

6.权利要求1所述的植物耐高pH盐碱基因SucHP 在生产转基因植物中的应用。

说明书

一种植物耐高pH盐碱基因SucHP及应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，确切地说一种植物耐高pH盐碱基因SucHP及应用。 背景技术

[0002] 由于自然因素及人为因素的长期影响，全球范围内的土壤盐碱化日趋严重。目前，全球约有10亿公顷盐碱地，而我国盐碱地面积为9913万公顷(约占世界总面积的10％)。这些盐碱地主要包括以NaCl、Na2SO4等中性盐为主的盐土，以及以NaHCO3、Na2CO3等碱性盐为主的苏打盐碱土。在我国日益扩大的内陆盐碱地中，很大部分是苏打盐碱土。这类土壤中，由于大量碳酸盐(NaHCO3、Na2CO3)的水解作用，土壤pH高达8.0以上。因此，苏打盐碱土中NaHCO3、Na2CO3对植物的胁迫因素除了和NaCl、Na2SO4共有的离子毒害、渗透胁迫之外，还有高pH值及其造成的矿质元素可利用性明显降低等因素。在我国东北西部较严重的盐碱地区仅限几个种类的植物零星地分布于这种土壤，其他植物几乎不能生存，给当地的农业生产、经济以及生态环境的发展带来了巨大的影响。因此，提高作物的耐盐碱能力，尤其是耐高pH盐碱胁迫的能力，培育耐高盐碱作物新品种具有重要意义。因此，对植物耐盐碱分子机制的研究，以及通过基因工程技术培育耐盐碱作物新品种已成为近年来国际植物分子生物学研究领域的一个前沿内容。

[0003] 在高盐碱下，植物通过产生胁迫蛋白和可溶性渗透调节物质来减轻盐碱胁迫造成的毒害。但是，目前国内外有关植物耐盐碱分子机制与基因工程的研究，主要以NaCl为研究对象(Sahuet al，2009；Qudeimat et al，2008；Rapala-Kozik et al.，2008；Wu et al.，2004)，而对苏打盐碱土中NaHCO3、Na2CO3等胁迫作用的机理研究较少(Zhang et al.，2006)。最近，定位在液泡膜上的质子泵基因从许多植物中分离出来。研究结果表明液泡+
膜质子泵将细胞质中的H 泵入液泡中，一方面，建立跨液泡膜电化学梯度，为无机离子及其他溶质进出液泡提供驱动力，既能维持细胞离子平衡和渗透平衡，又能减轻一些无机离+ -
子(比如Na 和Cl)对细胞质的毒害及pH值的作用(Queirós et al.，2009；Shi et al.，
2003；Blumwald et al.，2000)，有利于细胞质中生理生化反应的顺利进行。这大大促进了耐盐碱基因工程方面的研究工作并取得突破性进展。2001年，Gaxiola等将带有35S启动子的AVP1基因转入拟南芥，与同基因型的野生型相比，AVP1超表达的转基因植株耐盐性和耐旱性显著提高。Park等将AVP1基因转入番茄(Lycopersicon esculentum)的一个商业栽培品种(money maker)中，转基因植株表现出下列特点：根系生长较为强壮，生物量显著+
增加；根系液泡中积累大量依赖于H-PPase驱动而运输的阳离子，因而转基因植株耐旱性明显增强(Park et al，2005，Proc Natl Acad Sci USA，102(52)：18830-18835)。但是，国内外学 者对于耐高pH盐碱的研究还未见报道。

[0004] 碱蓬(Suaeda corniculate)是一年生藜科植物，营养丰富，是一种优质蔬菜和油料作物。碱蓬又是一种盐生植物，俗称“盐蒿”、“海鲜菜”，喜高湿、耐盐碱、耐贫瘠、少病虫害，是种天然的无公害绿色食品，适于沿海地区沙土或沙壤土种植。碱蓬是一种高耐盐碱的野生植物，它在生长的过程中能够从盐碱地里吸取盐碱，改良土壤，进而引来其它草生长，使盐碱地转化成新草原。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种植物耐高pH盐碱基因SucHP。

[0006] 一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，其碱基序列如：SEQ ID No，1所示； [0007] 所述的SucHP，由此推得蛋白的氨基酸序列如：SEQ ID No.2所示； [0008] 它是从碱蓬中分离出编码液泡膜质子泵的全长cDNA；

[0009] 一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，是由下述的方法获得：

[0010] 1)将碱蓬种子用升汞消毒后，插种于MS培养基中，3周后将幼苗转移至水培系统，在水培系统中培养4周后用100mM NaHCO3 200mM NaCl进行处理，处理24h后，采取整株植株，分离碱蓬总RNA；

[0011] 2)采用磁珠法分离纯化mRNA、利用Library Construction Kit试剂盒反转录，建TM立碱蓬cDNA文库；利用PCR-Select cDNA Subt raction Kit试剂盒抑制消减杂交构建+
SSH文库；然后用在SSH文库中已鉴定的碱蓬耐盐碱关键基因，即质膜型H-Ppase基因片段为探针，筛选碱蓬cDNA文库，从而获得上述基因的全长cDNA片段。

[0012] 本发明又一个目的是提供一种植物耐高pH盐碱基因SucHP的制备方法： [0013] 1)提取碱蓬总RNA，采用磁珠法分离纯化mRNA，反转录为cDNA，人工合成下述引物：

[0014] 引物1：5′-AAAAAGCAGGCTATGAGTGGCATTCTTCTTC-3′

[0015] 引物2：5′-AGAAAGCTGGGTTTAGAAGATCTTCAAGAGCA-3′

[0016] 引物3：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3′

[0017] 引物4：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3′

[0018] 2)利用引物1和引物2，以碱蓬的总RNA反转录的cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，得到2295bp SucHP基因片段；

[0019] 3)以第一轮的PCR产物稀释100倍为模板，使用引物3、引物4，进行第二轮PCR扩增，得到纯化的2295bp SucHP基因片段。

[0020] 本发明的另一个目的是，提供一种植物表达载体，其特征在于，它含有上述纯化的SucHP 基因片段。

[0021] 本发明的又一个目的是，一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，在转基因植物中的应用。

[0022] 本发明一种植物耐高pH盐碱基因SucHP，是利用抑制差减杂交和高密度点阵膜技术研究碱蓬苗期高pH盐碱胁迫诱导基因的表达，从碱蓬中首次分离出编码液泡膜质子泵的基因，将该基因构建正义表达载体，转化拟南芥，转基因植株具从有较高的耐高pH盐碱性，在100mMNaHCO3+200mM NaCl，pH8.5条件下，能正常生长，该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐碱能力。

附图说明

[0023] 图1是盐碱胁迫处理碱蓬的RT-PCR检测结果。

[0024] 图2是酶切载体pCB35S-SucHP-GFP后1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的基因2295bp片段产物。

[0025] 图3是不同浓度的盐和盐碱处理转基因拟南芥植株图片。

[0026] 图4是不同浓度的盐和盐碱处理转基因拟南芥种子图片。

[0027] 具体发明实施方式

[0028] 实施例1：碱蓬液泡膜质子泵基因SucHP的克隆

[0029] 1)总RNA的提取：碱蓬种子采自吉林省白城地区。将碱蓬种子用升汞消毒后，播种于MS培养基中，3周后将幼苗转移至水培系统，在水培系统中培养4周后用100mMNaHCO3+200mM NaCl进行处理；处理24h后，采取整株植株(包括根系和叶片)，液氮固定后，贮于-80℃冰柜备用；

[0030] 采用RNAeasy mini kit(promoga公司产品)提取碱蓬总RNA；

[0031] 2)分离上述盐碱处理的碱蓬总RNA，采用磁珠法(Promega公司)分离纯化mRNA、利用Library Construction Kit(Clontech)试剂盒反转录，建立碱蓬cDNA文库；利用TMPCR-Selecl cDNA Subt raction Kit(Clontech)试剂盒抑制消减杂交构建SSH文库： [0032] 3)通过筛选克隆的SSH文库，获得多个阳性克隆。用ABI377测序仪对阳性克隆测序，共获得质量较好的EST(Expressed Sequence Tag)序列，对位比较后获得不重复EST；
将不重复EST序列在NCBI上与Genbank中的dbEST库进行同源性比较，发现其中一些EST可以找到序列同源性较高的cDNA；这些基因都是在生物体中直接或间接对细胞遭受逆境胁迫起保护作用的基因；

[0033] 4)利用液泡膜质子泵基因H+-Ppase基因片段为探针，筛选碱蓬cDNA文库，从而获得碱蓬液泡膜质子泵基因SucHP的全长cDNA片段；

[0034] 5)基因克隆：取2μl PCR与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pMD 18-T Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株(本实验室保存)，在表面涂有5-溴-4-氯-3-吲哚-(-D-半乳糖苷)和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜； [0035] 6)质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA；

[0036] 7)序列测定：本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行，测定结果，其DNA序列测定，得到全长为2295bp的cDNA片段，包括起始密码子和终止密码子；由此推得具764个氨基酸的一段序列，其碱基序列如：SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如：SEQ ID No.2所示。

[0037] 实施例2RT-PCR检测盐碱胁迫的碱蓬

[0038] RT-PCR检测引物：

[0039] 引物5(上游序列)：5’-CTgCTggAAACACTACCgCT-3’

[0040] 引物6(下游序列)：5’-CATTgTCCCAAgCACCTCCT-3’

[0041] 引物7(上游序列)：5’-TACCACATCCAAggAAggCA-3’

[0042] 引物8(下游序列)：5’-ACCCAAAgTCCAACTACgAg-3’

[0043] 引物5和引物6是载体中SucHP基因的引物，扩增片段为569bp；引物7和引物8为内参基因Actin的引物，扩增片段为438bp；碱蓬分别经250mM NaCl和200mM NaCl+100mMNaHCO3处理0h、6h、12h、24h、48h。以碱蓬根，茎和叶的cDNA为模板，检测基因的表达；PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，结果显示SucHP基因的表达具有一定的盐碱诱导性。

[0044] 实施例3植物表达载体pCB35S-SucHP的构建

[0045] 根据SEQ ID No.1序列，设计构建表达载体的加ATTB1和ATTB2接头引物： [0046] 引物1：5′-AAAAAGCAGGCTATGGGTGTTGTTCTTCTTC-3′

[0047] 引物2：5′-AGAAAGCTGGGTTTAGAAGATCTTGAAGAGCA-3′

[0048] 引物3：5′-ggggACAAgTTTgTACAAAAAAgCAggCT-3′

[0049] 引物4：5′-ggggACCACTTTgTACAAgAAAgCTgggT-3′

[0050] 1)以碱蓬总cDNA为模板，利用加ATTB1和ATTB2接头的引物1、引物2进行第一轮PCR扩增，扩增体系如下：

[0051] 扩增体系和程序为：

[0052] 2×Taq Mix 12.5μl

[0053] 引物1 1.0μl

[0054] 引物2 1.0μl

[0055] 模板DNA 1.0μl

[0056] ddH2O 9.5μl

[0057] PCR反应条件为：

[0058] PCR反应结束后，取5μl产物于2μl的6×Loading Buffer混合，进行浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到2295bp的目的片段；

[0059] 2)以第一轮的PCR产物稀释100倍为模板，使用引物3，引物4为引物，进行第二轮PCR其PCR反应体系和反应条件同上，退火温度为58℃；PCR产物利用PEG沉降技术进行目的片段的纯化，得到纯化的2295bp的目的片段。

[0060] 3)利用Gateway技术将目的片段构建到pCB35SR1R2GFP载体上，通过BP反应创建入门克隆，将目的基因克隆进入门载体；LR反应混合包含目的基因的入门克隆和pCB35SR1R2GFP载体以及Gateway LR Clonase酶，构建质粒；

[0061] 4)将构建好的质粒转化大肠杆菌，涂至50mg/L的卡那霉素LB平板上，然后选取阳性克隆进行PCR检测，检测正确的进行测序，并提取相应阳性克隆质粒，命名pCB35S-SucHP；

[0062] 5)酶切载体pCB35S-SucHP，反应结束后酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，见图2，其中左侧为DNA marker 2000，箭头表示出目的片段2295bp的大小，证明表达载体构建成功。

[0063] 实施例4转基因拟南芥的耐盐碱性分析

[0064] 1)花絮侵染法：

[0065] 利用CaCl2法将质粒pCB35S-SucHP转入农杆菌EHA105中，利用花絮侵染法转化拟南芥；

[0066] 2)转基因拟南芥的筛选：

[0067] 将转基因和野生拟南芥种子种在MS培养基上，当幼苗长出第2-3对真叶时，把拟-1 -1 -1 -1南芥幼苗转移到含有0mmolL ，100mmolL ，150mmolL 和200mmolL NaCl的MS培养基及含有100mM NaCl+7.5mM NaHCO3(pH 8.0)，100mM NaCl+10.0mM NaHCO3(pH 8.5)的MS培养基上，10天后观察。如图3所示，转基因植株生长状况良好，非转基因植株叶片脱水变-1 -1 -1
黄萎蔫。同样，将转基因和野生拟南芥种子种在含有0mmolL ，100mmolL ，150mmolL 和-1
200mmolL NaCl的MS培养基及含有100mMNaCl+7.5mM NaHCO3(pH 8.0).100mMNaCl+10.0mM NaHCO3(pH 8.5)的MS培养基上，15天后观察。如图4所示，转基因植株发芽率比野生型的高。证明该基因具有抗盐碱的能力从而增强转基因植株的耐盐碱性。