抑制草盲蝽属的靶多核苷酸的组合物和方法转让专利
申请号 : CN200980106189.X
文献号 : CN102007215B
文献日 : 2013-10-23
发明人 : 拉斐尔·赫尔曼 , 迈克尔·拉斯纳尔 , 卢韦柏 , 马克·纳尔桑 , 詹姆士·K·普莱斯奈尔 , 珍妮特·A·赖斯
申请人 : 先锋国际良种公司 , 纳幕尔杜邦公司
摘要 :
提供了使用沉默元件的方法和组合物，当该组合物被害虫例如草盲蝽属害虫摄食后，它们能降低该害虫内靶序列的表达。在具体实施方案中，降低靶序列的表达可以控制害虫，因此，该方法和组合物能限制对植物的损害。本发明提供了来自本文所公开的具体多肽家族的各种靶多核苷酸，还提供了SEQ ID NOS：1-21所示的靶多核苷酸或其活性变体，其中降低靶害虫内一种或多种序列的表达可以控制害虫(即具有杀虫活性)。还提供了沉默元件，当被害虫摄食后，该沉默元件降低靶多肽的水平，从而控制虫害。在具体实施方案中，害虫为豆荚草盲蝽。亦提供了包含沉默元件或者其活性变体或片段的植物、植物部分、细菌及其他宿主细胞。
权利要求 :
1.植物细胞，具有稳定并入其基因组的异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含沉默元件，其中，当被草盲蝽属的害虫摄食后，所述沉默元件降低所述害虫中靶序列的水平，由此控制来自草盲蝽家族的害虫，所述沉默元件选自：a)包含SEQ ID NO：325所示序列的有义或反义序列的多核苷酸；和b)包含SEQ ID No：326或327所示序列的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的植物细胞，其中所述害虫包括豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)。
3.如权利要求1所述的植物细胞，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
4.如权利要求1所述的植物细胞，其中所述沉默元件可操作地连接于异源启动子。
5.如权利要求1所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
6.如权利要求5所述的植物细胞，其中所述单子叶植物是玉米、大麦、稷、小麦或水稻。
7.如权利要求1所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
8.如权利要求7所述的植物细胞，其中所述植物细胞是大豆、卡诺拉(canola)、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis)或棉花。
9.制备植物或植物部分的方法，其包括培养权利要求1-8中任一项所述的植物细胞。
10.制备转基因种子的方法，其包括按照权利要求9中所述的方法培养植物，并获得其转基因种子。
11.控制草盲蝽的方法，包括给草盲蝽喂食包含沉默元件的组合物，其中，当被所述草盲蝽摄食后，所述沉默元件降低靶草盲蝽序列的水平，由此控制所述草盲蝽，所述沉默元件包含：a)包含SEQ ID NO：325所示序列的有义或反义序列的多核苷酸；和b)包含SEQ ID NO：326或327所示序列的多核苷酸。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述组合物包含植物或植物部分，所述植物或植物部分具有稳定并入其基因组的包含所述沉默元件的多核苷酸。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述害虫包括豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述沉默元件可操作地连接于异源启动子。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、大麦、稷、小麦或水稻。
18.如权利要求11所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述植物是大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis)或棉花。
说明书 :
抑制草盲蝽属的靶多核苷酸的组合物和方法
发明领域
[0001] 本发明通常涉及控制害虫的分子生物学方法和基因沉默方法。
[0002] 发明背景
[0003] 虫害是农业生产的重要问题。它们破坏数百万英亩的主要农作物，如玉米、大豆、豌豆和棉花。每年仅在美国，这些害虫造成的农作物损害就超过1000亿美元。在持续的季节性斗争中，农作业者必须使用数十亿加仑的合成杀虫剂来抵御这些害虫。过去所用的其他方法通过微生物或者在转基因植物中表达的来自微生物的基因送递杀虫活性。例如，已知芽孢杆菌属(Bacillus)的某些微生物种类就对范围较宽的虫害具有杀虫活性，包括
鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等。
事实上，微生物杀虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株所获得的杀虫剂，作为化学害虫控制的替代品，在农业生产中发挥了重要作用。通过对农作物进行基因工程产生来自芽孢杆菌属的杀虫蛋白，农业科研人员已经研究出害虫抗性增强的农作物。例如，经基因工程产生Cry毒素的玉米和棉花植物(参阅例如Aronson(2002)Cell MoI.Life Sci.59(3)：417-425；
Schnepf et al.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(3)：775-806)已经广泛应用于美国的农业生产中，并且为农作业者提供了传统害虫控制方法的可选方案。但是，这些Bt杀虫蛋白只能保护植物免遭相对狭窄范围害虫的危害。而且，这些杀虫活性模式提供了不同水平的特异性，且在有些情况中，会对环境造成严重影响。因此，现在急需控制害虫的替代方法。
鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等。
事实上，微生物杀虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株所获得的杀虫剂，作为化学害虫控制的替代品，在农业生产中发挥了重要作用。通过对农作物进行基因工程产生来自芽孢杆菌属的杀虫蛋白，农业科研人员已经研究出害虫抗性增强的农作物。例如，经基因工程产生Cry毒素的玉米和棉花植物(参阅例如Aronson(2002)Cell MoI.Life Sci.59(3)：417-425；
Schnepf et al.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(3)：775-806)已经广泛应用于美国的农业生产中，并且为农作业者提供了传统害虫控制方法的可选方案。但是，这些Bt杀虫蛋白只能保护植物免遭相对狭窄范围害虫的危害。而且，这些杀虫活性模式提供了不同水平的特异性，且在有些情况中，会对环境造成严重影响。因此，现在急需控制害虫的替代方法。
[0004] 发明概述
[0005] 提供了使用沉默元件的方法和组合物，当被害虫例如草盲蝽属(Lygus)的害虫摄食后，该沉默元件能降低该害虫内靶序列的表达。在具体实施方案中，降低靶序列的表达可以控制虫害，因此，该方法和组合物能限制对植物的损害。本发明提供了来自本文所公开的具体多肽家族的各种靶多核苷酸，还提供了SEQ ID NOS：1-21所示的各种靶多核苷酸或其活性变体或片段，其中降低靶害虫内一种或多种序列的表达可以控制害虫(即具有杀虫活性)。还提供了沉默元件，当被害虫摄食后，该沉默元件降低一种或多种靶多核苷酸的表达水平。在具体实施方案中，控制的害虫为豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)。亦提供了包含沉默元件或其活性变体或片段的植物、植物部分、细菌及其他宿主细胞。
[0006] 在另一实施方案中，提供了控制草盲蝽属害虫的方法。该方法包括喂食草盲蝽属害虫包含沉默元件的组合物，其中当被所述草盲蝽摄食后，所述沉默元件降低草盲蝽内靶序列的水平，从而控制草盲蝽。还提供了保护植物免受草盲蝽危害的方法。此类方法包括将本发明的沉默元件引入植物或植物部分。当表达沉默元件的植物被害虫摄食后，靶序列的水平得以降低，进而害虫受到控制。
[0007] 发明的详细描述
[0008] 下文将结合附图对本发明进行更详细的说明，其中，展示了本发明的某些但不是所有的实施方案。实际上，这些发明可以以不同的形式实施，并不应解释为局限于本文所示的实施方案；确切地说，为使本文公开满足应用的合法要求，提供了这些实施方案。在本说明书中，相同的符号表示相同的元件。
[0009] 根据以上描述和相关附图所提供的教导，这些发明所属领域的技术人员会想到本文所示的本发明的许多修饰和其他实施方案。因此，可以理解的是，本发明并不限于所公开的具体实施方案，规定修饰和其他实施方案包括于所附权利要求的范围内。尽管本文使用了具体术语，但是它们仅采用通用且描述的意义，并非出于限制目的。
[0010] I.概述
[0011] 提供了使用沉默元件的方法和组合物，当被害虫例如草盲蝽属害虫摄食后，该沉默元件能降低该害虫内靶序列的表达。在具体实施方案中，降低靶序列的表达可以控制害虫，由此，该方法和组合物能限制对植物或植物部分的损害。在具体实施方案中，本发明提供编码钾通道多肽、表皮多肽、内表皮多肽、壳多糖结合多肽、壳多糖酶多肽、激素诱导性多肽、翻译起始因子、电压依赖性通道、EIF相关多肽、具有卷曲的螺旋型螺旋结构域的多肽、具有锌指结构域的多肽、受体相关指多肽(receptor associated finger polypeptide)、致死性易受惊成虫盘多肽(lethal timorous imaginal disc polypeptide)、核糖核蛋白、组织蛋白酶多肽、多聚蛋白畸形破坏蛋白(polyprotein deformed destructor)和死亡相关亮氨酸富集多肽的靶多核苷酸。本发明提供了SEQ IDNOS：1-21所示的靶多核苷酸或者其活性变体和片段。提供了根据这些靶多核苷酸设计的沉默元件，当被害虫摄食后，该沉默元件降低一种或多种靶序列的表达，进而控制害虫(即具有杀虫剂活性)。这些结果提供了针对豆荚草盲蝽dsRNA的杀虫活性的首次报道。
[0012] 本文中所用“控制害虫(controlling a害虫)”或“控制害虫(controls a害虫)”意指能导致害虫引起的损害受到限制的作用于害虫的任何作用。控制害虫包括但不限于杀死害虫，抑制害虫发育，以害虫对植物提供较少损害的方式改变害虫的繁殖力或生长，减少所产生的后代的数量，产生的健康害虫更少，产生更易受捕食者攻击的害虫，或者阻止害虫啃食植物。
[0013] “抗病性”是指植物避免植物-病原体相互作用结果的疾病症状。也就是说，防止病原体引起植物疾病及其相关疾病症状，或者可选地，使病原体所引起的疾病症状最小化或减少。
[0014] 降低害虫内靶多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平，导致抑制、控制和/或杀死入侵的病原生物。降低害虫靶序列的表达水平会使病原体激发所导致的疾病症状降低至少约2％到至少约6％、至少约5％到约50％、至少约10％到约60％、至少约30％到约70％、至少约40％到约80％或至少约50％到约90％或更多。因此，本发明的方法可以应用于保护植物免受疾病特别是由草盲蝽属害虫引起的疾病的危害。
[0015] 测量害虫控制的测定在本技术领域是共知的，如同对病原体感染后植物的抗病性进行定量的方法。参阅，例如，美国专利第5,614,395号，在此通过引用并入。此类技术包括随着时间测量损伤的平均直径、病原体生物量和腐烂植物组织的总百分比。参阅，例如，Thomma et al.(1998)Plant Biology 95：15107-15111，在此通过引用并入。还请参阅下文的实施例。
[0016] 本发明涉及，用于保护植物免受植物害虫例如半翅目害虫的危害，或在植物内诱导对植物害虫例如半翅目害虫的抗性的组合物和方法。半翅目包括四个亚目，胸喙
亚目(Sternorrhyncha)(例如蚜虫、粉虱)、头喙亚目(Auchenorrhyncha)(例如蝉、叶
蝉)、鞘喙亚目(Coleorrhyncha)和异翅亚目(Heteroptera)(例如蝽象)和约67,500个
种。因此，本组合物和方法可用于保护植物免受半翅目任何成员的危害，包括大叶蝉科
(Cicadellidae)、角蝉科(Membracidae)、蜡蝉科(Fulgoridae)、蜡蚧科(Coccidae)、蚜科(Aphididae)、长蝽科(Lygaeidae)、蝽象科(Pentatomidae)和盲口科(Miridae)的成员。
亚目(Sternorrhyncha)(例如蚜虫、粉虱)、头喙亚目(Auchenorrhyncha)(例如蝉、叶
蝉)、鞘喙亚目(Coleorrhyncha)和异翅亚目(Heteroptera)(例如蝽象)和约67,500个
种。因此，本组合物和方法可用于保护植物免受半翅目任何成员的危害，包括大叶蝉科
(Cicadellidae)、角蝉科(Membracidae)、蜡蝉科(Fulgoridae)、蜡蚧科(Coccidae)、蚜科(Aphididae)、长蝽科(Lygaeidae)、蝽象科(Pentatomidae)和盲口科(Miridae)的成员。
[0017] 在具体实施方案中，本发明涉及用于保护植物免受植物害虫例如草盲蝽属害虫的危害，或在植物内诱导对植物害虫例如草盲蝽属害虫的抗性的组合物和方法。草盲蝽属包括盲口科家族超过40种的植食性昆虫。本文所用的“草盲蝽(Lygus)”或“草盲蝽(Lygus Bug)”是指草盲蝽属的任意成员。因此，本组合物和方法也用于保护植物免受任何草盲蝽的危害，包括，例如光翅草盲蝽(Lygus adspersus)、阿拉善草盲蝽(Lygusalashanensis)、Lygus borealis、Lygus elisus、青绿草盲蝽(Lygus gemellatus)、豆荚草盲蝽、美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)或长毛草盲蝽(Lygusrugulipennis)。在具体实施方案中，方法控制豆荚草盲蝽。
[0018] 在其他实施方案中，害虫是吸食植物树液的昆虫(plant sap-suckinginsects)。本文所用的“吸食植物树液的昆虫”是指，使用可以插入植物的尖利嘴部来从植物脉管系统中吸食液体的以植物为食的昆虫。在一个实施方案中，这些昆虫直接以植物脉管系统中的液体为食。在插入位置，可能是也可能不是吸食植物树液的昆虫的食物来源的植物细胞，也可以遭受损害。这些昆虫是植物害虫，因为它们的进食降低了它们所食作物的活力，并且它们可以传播病毒疾病。此外，这些吸液昆虫可以产生名为蜜露的富糖液体，其可以在较低的植物部分蓄积，并且这些部分很快就被称作烟霉的某些黑色或棕色真菌覆盖，因此干扰光合作用。
[0019] 这些吸食植物树液的昆虫包括常蚜科的蚜虫或同翅类(Homopteran)昆虫，并且本文所用的吸食植物树液的昆虫包括但不限于桃蚜(Myzuspersicae)、豆蚜
(Aphis fabae)、豆长管蚜(Acyrthosiphumpisun)、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、
麦长管蚜(Sitobion avenae)、麦无网长管蚜(Metopolophium dirhodum)、俄罗斯麦
双尾蚜(Diuraphis noxia(Mordvilko))、麦长管蚜(Macrosiphum avenae)、麦二叉蚜
(Schizaphisgraminum(Rondani))、埃二尾蚜(Cavariella aegopodii)、马铃薯长管蚜
(Macrosiphum euphorbiae)、花生蚜(Aphiscraccivora)、棉蚜(Aphis gossypii)、桔
二岔蚜(Toxoptera aurantii)、橘蚜(Toxoptera ciidius)、柳蚜(Cavariellaspp.)、
玉米叶蚜(Rhopalosiphum maidis)、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)、杨柳 毛
蚜(Chaitophorus spp.)、黑 松 蚜 (Cinara spp.)、枫 长 镰 管 蚜 (Drepanosiphum platanoides)、云杉蚜(Elatobium spp.)、橘卷叶蚜(Aphiscitricola)、菜蚜，如灰飞虱(Laodelphax striatellus)(小褐飞虱)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)(稻褐飞虱)和
白背飞虱(Sogatella furcifer)(白背稻飞虱)和叶蝉科(Deltocephalidae)(或叶蝉)
例如Flexamia DeLong spp.、水稻黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)和二点黑尾叶
蝉(Nephotettix virescens)、Amrasca bigutulla和马铃薯叶蝉小绿叶蝉丝(potato
leafhopper Empoascafilament)。也包括介壳虫(也叫做介壳虫)，例如红肾圆盾蚧
(Aonidiellaaurantii)、梨圆蚧(Comstockaspis perniciosa)、桔盾蚧(Unaspis citri)(柑橘白色介壳虫)、桑白蚧(Pseudaulacaspis pentagona)(桃介壳虫)、油橄榄蜡蚧
(Saissetia oleae)(褐色橄榄介壳虫)、紫牡蛎蚧(Lepidosaphes beckii)(紫介壳虫)、红蜡蚧(Ceroplastes rubens)(红蜡介壳虫)和吹绵蚧(Icerya purchasi)(棉垫介壳虫)、还有网蝽科(Tingidae或网蝽(lace bugs))和木虱科(Psyllidae)昆虫和吹沫蝉(spittle
bugs)。
(Aphis fabae)、豆长管蚜(Acyrthosiphumpisun)、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、
麦长管蚜(Sitobion avenae)、麦无网长管蚜(Metopolophium dirhodum)、俄罗斯麦
双尾蚜(Diuraphis noxia(Mordvilko))、麦长管蚜(Macrosiphum avenae)、麦二叉蚜
(Schizaphisgraminum(Rondani))、埃二尾蚜(Cavariella aegopodii)、马铃薯长管蚜
(Macrosiphum euphorbiae)、花生蚜(Aphiscraccivora)、棉蚜(Aphis gossypii)、桔
二岔蚜(Toxoptera aurantii)、橘蚜(Toxoptera ciidius)、柳蚜(Cavariellaspp.)、
玉米叶蚜(Rhopalosiphum maidis)、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)、杨柳 毛
蚜(Chaitophorus spp.)、黑 松 蚜 (Cinara spp.)、枫 长 镰 管 蚜 (Drepanosiphum platanoides)、云杉蚜(Elatobium spp.)、橘卷叶蚜(Aphiscitricola)、菜蚜，如灰飞虱(Laodelphax striatellus)(小褐飞虱)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)(稻褐飞虱)和
白背飞虱(Sogatella furcifer)(白背稻飞虱)和叶蝉科(Deltocephalidae)(或叶蝉)
例如Flexamia DeLong spp.、水稻黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)和二点黑尾叶
蝉(Nephotettix virescens)、Amrasca bigutulla和马铃薯叶蝉小绿叶蝉丝(potato
leafhopper Empoascafilament)。也包括介壳虫(也叫做介壳虫)，例如红肾圆盾蚧
(Aonidiellaaurantii)、梨圆蚧(Comstockaspis perniciosa)、桔盾蚧(Unaspis citri)(柑橘白色介壳虫)、桑白蚧(Pseudaulacaspis pentagona)(桃介壳虫)、油橄榄蜡蚧
(Saissetia oleae)(褐色橄榄介壳虫)、紫牡蛎蚧(Lepidosaphes beckii)(紫介壳虫)、红蜡蚧(Ceroplastes rubens)(红蜡介壳虫)和吹绵蚧(Icerya purchasi)(棉垫介壳虫)、还有网蝽科(Tingidae或网蝽(lace bugs))和木虱科(Psyllidae)昆虫和吹沫蝉(spittle
bugs)。
[0020] 还包括的吸食植物树液的昆虫是从植物的脉管系统取食的异翅亚目昆虫和头喙亚目的半翅类昆虫，例如蝉总科(Cicadoidea)(例如蝉)、沫蝉总科(Cercopoidea)(吹
沫蝉)、角蝉总科(Membracoidea)(叶蝉和角蝉)和蜡蝉总科(Fulgoroidea)(飞虱)的
吸食植物树液的昆虫，例如，棉籽吸食虫秘鲁红蝽(Dysdercus peruvianus)(异翅亚目：
红蝽科(Pyrrhocoridae))、苹果酒窝盲蜷(Campylomma liebknechti)(半翅目：盲蝽科
(Miridae))和吸食棉花的虫害绿盲蝽(Creontiades dilutus)和草盲蝽(半翅目：盲蝽科，例如，豆荚草盲蝽))。
沫蝉)、角蝉总科(Membracoidea)(叶蝉和角蝉)和蜡蝉总科(Fulgoroidea)(飞虱)的
吸食植物树液的昆虫，例如，棉籽吸食虫秘鲁红蝽(Dysdercus peruvianus)(异翅亚目：
红蝽科(Pyrrhocoridae))、苹果酒窝盲蜷(Campylomma liebknechti)(半翅目：盲蝽科
(Miridae))和吸食棉花的虫害绿盲蝽(Creontiades dilutus)和草盲蝽(半翅目：盲蝽科，例如，豆荚草盲蝽))。
[0021] II.靶序列
[0022] 本文所用“靶序列”包含期望减少表达水平的害虫内的任何序列。在具体实施方案中，降低害虫内靶序列的水平控制害虫。例如，靶序列可以是生长和发育所必需的。尽管靶序列可以在害虫的任何组织中表达，但在本发明的具体实施方案中，在害虫内靶向抑制作用的序列表达在害虫肠组织细胞、害虫中肠细胞和沿着肠腔或中肠排列的细胞中。这类靶序列与肠细胞的代谢、生长和分化有关。
[0023] 本发明靶序列的非限制性实例包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21所示的多核苷酸。在具体实施方案中，沉默元件包含以下所示序列中任一序列的至少15、20、22、25或更多的连续核苷酸，或者由以下所示序列中任一序列的至少15、20、22、25或更多的连续核苷酸组成：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21。在其他实施方案中，沉默元件包含或组成为SEQ IDNO：22-408所示序列中的至少一条序列。应当认识到，此类沉默元件还可以在3’末端包含一个或多个胸腺嘧啶残基。此类残基有助于稳定。该元件在其3’末端可以具有例如1、2、3、4、5、6或更多个胸腺嘧啶残基。在其他实施方案中，沉默元件包含SEQ ID NO：23和24、26和27、29和30、32和33、35和36、38和39、41和42、44和45、47和48、50和51、
53和54、56和57、59和60、62和63、65和66、68和69、71和72、74和75、77和78、80和
81、83和84、86和87、89和90、92和93、95和96、98和99、101和102、104和105、107和
108、110和111、113和114、116和117、119和120、122和123、125和126、128和129、131和132、134和135、137和138、140和141、143和144、146和147、149和150、152和153、
155和156、158和159、161和162、164和165、167和168、170和171、173和174、176和
177、179和180、182和183、185和186、188和189、191和192、194和195、197和198、200和201、203和204、206和207、209和210、212和213、215和216、218和219和/或221和
222。如本文中其他地方所示例的，降低草盲蝽内这些靶序列的表达水平，控制害虫。
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21。在其他实施方案中，沉默元件包含或组成为SEQ IDNO：22-408所示序列中的至少一条序列。应当认识到，此类沉默元件还可以在3’末端包含一个或多个胸腺嘧啶残基。此类残基有助于稳定。该元件在其3’末端可以具有例如1、2、3、4、5、6或更多个胸腺嘧啶残基。在其他实施方案中，沉默元件包含SEQ ID NO：23和24、26和27、29和30、32和33、35和36、38和39、41和42、44和45、47和48、50和51、
53和54、56和57、59和60、62和63、65和66、68和69、71和72、74和75、77和78、80和
81、83和84、86和87、89和90、92和93、95和96、98和99、101和102、104和105、107和
108、110和111、113和114、116和117、119和120、122和123、125和126、128和129、131和132、134和135、137和138、140和141、143和144、146和147、149和150、152和153、
155和156、158和159、161和162、164和165、167和168、170和171、173和174、176和
177、179和180、182和183、185和186、188和189、191和192、194和195、197和198、200和201、203和204、206和207、209和210、212和213、215和216、218和219和/或221和
222。如本文中其他地方所示例的，降低草盲蝽内这些靶序列的表达水平，控制害虫。
[0024] 在具体实施方案中，靶序列包含SEQ ID NO：7、8、9、11、12或14。在其他实施方案中，沉默元件包含或者组成为以下所示序列中的至少一条序列：SEQ ID NOS：283、284、285、289、290、291、292、293、294、304、305、306、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、
326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、
345、346、347或348。仍然在其他实施方案中，沉默元件包含或组成为SEQ ID NOS：284和
285、290和291、293和294、305和306、317和318、320和321、323和324、326和327、329和330、332和333、335和336、338和339、341和342、344和345或347和348。如本文中
其他地方所示例的，这些序列的表达控制草盲蝽。
326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、
345、346、347或348。仍然在其他实施方案中，沉默元件包含或组成为SEQ ID NOS：284和
285、290和291、293和294、305和306、317和318、320和321、323和324、326和327、329和330、332和333、335和336、338和339、341和342、344和345或347和348。如本文中
其他地方所示例的，这些序列的表达控制草盲蝽。
[0025] III.沉默元件
[0026] “沉默元件”是指多核苷酸，当被害虫摄食后，其能降低或者消除靶多核苷酸或者由其编码的多肽的水平或表达。所用的沉默元件通过影响靶RNA转录物的水平或者可选地通过影响翻译进而影响所编码的多肽的表达，来降低或消除靶序列的表达水平。测定能降低或消除目的序列水平的功能性沉默元件的方法，公开于本文的其他地方。本发明方法所用的单个多核苷酸可以包含相同或不同靶多核苷酸的一个或多个沉默元件。
[0027] 在具体实施方案中，靶序列不是植物内源基因。在其他实施方案中，尽管沉默元件控制害虫，但是优选，沉默元件对正常的植物或植物部分没有影响。
[0028] 如下文进一步详细讨论的，沉默元件可以包括但不限于有义抑制元件、反义抑制元件、双链RNA、miRNA或发夹抑制元件。可用于降低这些靶草盲蝽序列表达的沉默元件的非限制性实例包含或组成为以下所示序列或其生物活性变体或片段的有义或反义序列的片段和变体：SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21或SEQ ID NOS：22-408。
[0029] 在具体实施方案中，沉默元件包含SEQ ID NOS：21-408所示序列中的至少一条序列，或由其组成。应当认识到，这些沉默元件在3’末端还可以包含一个或多个胸腺嘧啶残基。这些残基有助于稳定。所述的元件在其3’末端可以具有，例如，1、2、3、4、5、6或者更多个胸腺嘧啶残基。在其他实施方案中，沉默元件包含SEQ ID NO：23和24、26和27、29和30、32和33、35和36、38和39、41和42、44和45、47和48、50和51、53和54、56和57、59和60、62和63、65和66、68和69、71和72、74和75、77和78、80和81、83和84、86和87、
89和90、92和93、95和96、98和99、101和102、104和105、107和108、110和111、113和
114、116和117、119和120、122和123、125和126、128和129、131和132、134和135、137和138、140和141、143和144、146和147、149和150、152和153、155和156、158和159、
161和162、164和165、167和168、170和171、173和174、176和177、179和180、182和
183、185和186、188和189、191和192、194和195、197和198、200和201、203和204、206和207、209和210、212和213、215和216、218和219和/或221和222。
89和90、92和93、95和96、98和99、101和102、104和105、107和108、110和111、113和
114、116和117、119和120、122和123、125和126、128和129、131和132、134和135、137和138、140和141、143和144、146和147、149和150、152和153、155和156、158和159、
161和162、164和165、167和168、170和171、173和174、176和177、179和180、182和
183、185和186、188和189、191和192、194和195、197和198、200和201、203和204、206和207、209和210、212和213、215和216、218和219和/或221和222。
[0030] 在其他实施方案中，沉默元件包含以下所示序列中的至少一个或者由以下所示序列中的至少一个组成：SEQ ID NOS：283、284、285、289、290、291、292、293、294、304、305、
306、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、
334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347或348。其他实施方案中，沉默元件包含或组成为SEQ ID NOS：284和285、290和291、293和294、305和306、317和
318、320和321、323和324、326和327、329和330、332和333、335和336、338和339、341和342、344和345或347和348。如本文中其他地方所示例的，这些序列的表达控制草盲
蝽。
306、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、
334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347或348。其他实施方案中，沉默元件包含或组成为SEQ ID NOS：284和285、290和291、293和294、305和306、317和
318、320和321、323和324、326和327、329和330、332和333、335和336、338和339、341和342、344和345或347和348。如本文中其他地方所示例的，这些序列的表达控制草盲
蝽。
[0031] “降低(reduces)”或“降低(reducing)”多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平意图表示，靶序列的多核苷酸或多肽的水平在统计上低于未暴露于(即未摄食)沉默元件的适当的对照害虫中相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在本发明的具体实施方案
中，根据本发明，降低害虫内靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平，导致少于95％、少于
90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于
10％或者少于5％的适当对照害虫内相同靶序列的多核苷酸水平或其编码的多肽水平。测定RNA转录物的水平、所编码的多肽的水平或者多核苷酸或多肽活性的方法，在本文其它地方做了讨论。
中，根据本发明，降低害虫内靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平，导致少于95％、少于
90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于
10％或者少于5％的适当对照害虫内相同靶序列的多核苷酸水平或其编码的多肽水平。测定RNA转录物的水平、所编码的多肽的水平或者多核苷酸或多肽活性的方法，在本文其它地方做了讨论。
[0032] i.有义沉默元件
[0033] 本文所用“有义沉默元件”包含经设计表达在“有义”方向上对应于至少部分靶信使RNA的RNA分子的多核苷酸。包含有义抑制元件的RNA分子的表达降低或者消除靶多核苷酸或其编码的多肽的水平。包含有义抑制元件的多核苷酸可以对应于靶多核苷酸的全部或部分序列、靶多核苷酸的全部或部分5’和/或3’非翻译区、靶多核苷酸的全部或部分编码序列或者靶多核苷酸的全部或部分编码序列和非翻译区两者。
[0034] 通常，有义抑制元件与靶多核苷酸具有实质性序列同一性，理想情况下大于约65％的同一性、更理想情况下大于约85％的同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％的同一性。参阅美国专利第5,283,184和5,034,323号，在此通过引用并入。有义抑制元件可以是任何长度，只要其不妨碍内含子剪接和允许抑制靶向序列即可。有义抑制元件可以为例如15、20、22、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、
500、600、700、900或更长。
96％、97％、98％或99％的同一性。参阅美国专利第5,283,184和5,034,323号，在此通过引用并入。有义抑制元件可以是任何长度，只要其不妨碍内含子剪接和允许抑制靶向序列即可。有义抑制元件可以为例如15、20、22、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、
500、600、700、900或更长。
[0035] ii.反义沉默元件
[0036] 本文所用“反义沉默元件”包含经设计表达与全部或部分靶信使RNA互补的RNA分子的多核苷酸。反义RNA抑制元件的表达降低或者消除靶多核苷酸的水平。反义抑制所用的多核苷酸对应于编码靶多核苷酸的序列的全部或部分互补物，靶多核苷酸5’和/或3’非翻译区的全部或部分互补物，靶多核苷酸编码序列的全部或部分互补物，或者靶多核苷酸编码序列和非翻译区两者的全部或部分互补物。此外，反义抑制元件可以与靶多核苷酸完全互补(即与靶多核苷酸的互补物100％相同)或者部分互补(即与靶多核苷酸互补物的同一性性小于100％)。在具体实施方案中，反义抑制元件包含与靶多核苷酸的至少85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。反义抑制可以用于抑制同一植物中多种蛋白的表达。参阅，例如美国专利第5,942,657号。此外，反义抑制元件可以与靶多核苷酸的一部分互补。通常，可以使用至少25、50、100、200、300、400、450个核苷酸甚至更多的序列。使用反义抑制来抑制植物内源基因表达的方法，描述于例如Liu et al(2002)Plant Physiol.129：1732-1743和美国专利第5,759,829号和第5,942,657号中，在此将其中的每一项都通过引用并入。
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。反义抑制可以用于抑制同一植物中多种蛋白的表达。参阅，例如美国专利第5,942,657号。此外，反义抑制元件可以与靶多核苷酸的一部分互补。通常，可以使用至少25、50、100、200、300、400、450个核苷酸甚至更多的序列。使用反义抑制来抑制植物内源基因表达的方法，描述于例如Liu et al(2002)Plant Physiol.129：1732-1743和美国专利第5,759,829号和第5,942,657号中，在此将其中的每一项都通过引用并入。
[0037] iii.双链RNA沉默元件
[0038] “双链RNA沉默元件”或“dsRNA”包含至少一个在被害虫摄食前或摄食后能形成dsRNA的转录物。因此，“dsRNA沉默元件”包括dsRNA、能形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸，或者多于一个能形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸。“双链RNA”或“dsRNA”指由单个自身互补的RNA分子形成的多核糖核苷酸结构或由至少两个不同的RNA链的表达形成的多核糖核苷酸结构。本发明的组合物与方法所用的dsRNA分子通过例如以序列特异性的方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默，来介导靶序列表达的降低。在本发明中，dsRNA能降低或消除害虫内靶多核苷酸或由其编码的多肽的水平或表达。
[0039] dsRNA可以通过以下方式降低或消除靶序列的表达水平：通过影响靶RNA转录物的水平，通过影响翻译进而影响所编码的多肽的水平，或者通过在转录前水平影响
表达(即通过调节染色质结构、甲基化模式等改变基因表达)。参阅，例如，Verdel et
al.(2004)Science 303：672-676；Pal-Bhadra et al.(2004)Science 303：669-672；
Allshire(2002)Science297：1818-1819；Volpe et al.(2002)Science 297：1833-1837；
Jenuwein(2002)Science 297：2215-2218； 和 Hall et al.(2002)Science 297：
2232-2237。测定能降低或者消除目的序列水平的功能性iRNA的方法，公开在本文其他
地方。因此，本文所用的“dsRNA”意图包括用于描述能介导RNA干扰或基因沉默的核酸
分子的其他术语，包括，例如短的干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、小RNA(miRNA)、发夹RNA(hairpin RNA)、短发夹RNA(shRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。
表达(即通过调节染色质结构、甲基化模式等改变基因表达)。参阅，例如，Verdel et
al.(2004)Science 303：672-676；Pal-Bhadra et al.(2004)Science 303：669-672；
Allshire(2002)Science297：1818-1819；Volpe et al.(2002)Science 297：1833-1837；
Jenuwein(2002)Science 297：2215-2218； 和 Hall et al.(2002)Science 297：
2232-2237。测定能降低或者消除目的序列水平的功能性iRNA的方法，公开在本文其他
地方。因此，本文所用的“dsRNA”意图包括用于描述能介导RNA干扰或基因沉默的核酸
分子的其他术语，包括，例如短的干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、小RNA(miRNA)、发夹RNA(hairpin RNA)、短发夹RNA(shRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。
[0040] 在具体实施方案中，dsRNA的双链体或双链区的至少一条链与靶多核苷酸享有足够的序列同一性或者序列互补性，以便允许dsRNA降低靶序列的表达水平。如本文所用，与靶多核苷酸互补的链为“反义链”，与靶多核苷酸同源的链为“有义链”。
[0041] 在一个实施方案中，dsRNA包含发夹RNA。发夹RNA包含的RNA分子能折叠回其自身形成双链结构。可使用多重结构作为发夹元件。在具体实施方案中，dsRNA抑制元件包含发夹元件，该发夹元件按下述顺序包含：第一节段、第二节段和第三节段，其中第一和第三节段共享充足的互补性，以便允许转录的RNA形成双链茎环结构。
[0042] 发夹的“第二节段”包含“环”或“环状区(loop region)”。这些术语在本文中以同义词使用，泛指包含赋予足够柔性从而允许自身配对发生于多核苷酸的互补区域(即形成了发夹的茎的第一节段和第二节段)之间的任何核酸序列。例如，在某些实施方案中，环状区可以基本上是单链的，并作为发夹茎环中自身互补区域间的间隔区。在某些实施方案中，环状区可以包含随机序列或无义核苷酸序列，因此不与靶多核苷酸共享序列同一性。在其他实施方案中，环状区包含与靶多核苷酸共享同一性的有义或者反义RNA序列或片段。参阅，例如，国际专利公开WO02/00904，在此通过引用并入。在具体实施方案中，可以环状区优化得尽可能的短，同时能提供足够的分子内柔性从而允许形成碱基配对的茎区。因此，环状序列通常小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、25、20、15、10个核苷酸或更短。
[0043] 发夹RNA分子的“第一节段”和“第三节段”包含发夹结构的碱基配对的茎。第一节段和第三节段彼此是反向重复并共享充足的互补性，从而允许形成碱基配对的茎区。在具体实施方案中，第一节段和第三节段彼此完全互补。可选地，第一节段和第三节段可以彼此部分互补，只要它们能彼此杂交形成碱基配对的茎区。第一节段和第三节段间互补性的量可以计算为全部节段的百分比。因此，发夹RNA的第一节段和第三节段一般共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、直到并包括100％的互补性。
[0044] 第一节段和/或第三节段的长度为至少约1000、500、400、300、200、100、50、40、30、25、22、20、15或10个核苷酸。在具体实施方案中，第一节段和/或第三节段为约10-100个核苷酸、约10-约75个核苷酸、约10-约50个核苷酸、约10-约40个核苷酸、约10-约
35个核苷酸、约10-约30个核苷酸、约10-约25个核苷酸、约10-约20个核苷酸。在其他
实施方案中，第一节段和/或第三节段的长度包含至少10-20个核苷酸、20-35个核苷酸、
30-45个核苷酸、40-50个核苷酸、50-100个核苷酸或者100-300个核苷酸。参阅，例如国际公开WO 0200904。在具体实施方案中，第一节段和第三节段包含与第一节段具有至少85％互补性的至少20个核苷酸。仍然在其他实施方案中，形成发夹的茎环结构的第一节段和第三节段包含具有未配对的核苷酸残基的3’或者5’的突出端区域。
35个核苷酸、约10-约30个核苷酸、约10-约25个核苷酸、约10-约20个核苷酸。在其他
实施方案中，第一节段和/或第三节段的长度包含至少10-20个核苷酸、20-35个核苷酸、
30-45个核苷酸、40-50个核苷酸、50-100个核苷酸或者100-300个核苷酸。参阅，例如国际公开WO 0200904。在具体实施方案中，第一节段和第三节段包含与第一节段具有至少85％互补性的至少20个核苷酸。仍然在其他实施方案中，形成发夹的茎环结构的第一节段和第三节段包含具有未配对的核苷酸残基的3’或者5’的突出端区域。
[0045] 在具体实施方案中，第一、第二和/或第三节段所用的序列包含，经设计与目的靶多核苷酸序列具有充足的序列同一性的结构域，从而能降低靶多核苷酸表达水平。因此抑制性RNA转录物的特异性，通常由沉默元件的这些结构域赋予。因此，在本发明的一些实施方案中，沉默元件的第一、第二和/或第三节段包含具有至少10、至少15、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少500、至少1000或多于1000个核苷酸的结构域，所述结构域的核苷酸与靶多核苷酸共享充足的序列同一性，以便当在合适的细胞中表达时，允许降低靶多核苷酸的表达水平。在其他实施方案中，结构域为约15-50个核苷酸、约20-35个核苷酸、约25-50个核苷酸、约20-75个核苷酸、约40-90个核苷酸、约15-100个核苷酸之间。
[0046] 在具体实施方案中，第一、第二和/或第三节段中的结构域与靶多核苷酸具有100％的序列同一性。在其他实施方案中，与靶多核苷酸具有同源性的第一、第二和/或
第三节段的结构域，与靶多核苷酸的区域具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。第一、第二和/或第三节段的结构域与靶多核苷酸的序列同一性，仅需要足以降低目的靶多核苷
酸的表达。参阅，例如，Chuang and Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：
4985-4990；Stoutjesdijk et al.(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse and Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfmi et al.BMC Biotechnology 3：7；和美国专利公开20030175965；在此将上述每一篇文献通过引用并入。hpRNA构建体体内沉默基因表达的效率的瞬时测定，描述于Panstruga et al.(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140中，在此通过引用并入。
第三节段的结构域，与靶多核苷酸的区域具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。第一、第二和/或第三节段的结构域与靶多核苷酸的序列同一性，仅需要足以降低目的靶多核苷
酸的表达。参阅，例如，Chuang and Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：
4985-4990；Stoutjesdijk et al.(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse and Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfmi et al.BMC Biotechnology 3：7；和美国专利公开20030175965；在此将上述每一篇文献通过引用并入。hpRNA构建体体内沉默基因表达的效率的瞬时测定，描述于Panstruga et al.(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140中，在此通过引用并入。
[0047] 第一、第二和/或第三节段与靶多核苷酸序列间共享的互补性的量，或第一节段与第三节段(即发夹结构的茎)间共享的互补性的量，可以变化，这取决于待控制基因表达的生物。有些生物或细胞类型需要精确配对或100％的同一性，而其它生物或细胞类型则容忍一些错配。在某些细胞中，例如，导向序列中单个核苷酸错配废除了抑制基因表达的能力。在这些细胞中，本发明的抑制盒(suppression cassette)可以用来靶向突变基因的抑制，例如，转录物包含点突变的癌基因，因此利用本发明的方法和组合物可以特异性地靶向突变基因，而无需改变剩余野生型等位基因的表达。
[0048] 靶多核苷酸的任何区域都可以用于设计沉默元件的结构域，其共享充分的序列同一性，以便允许发夹转录物表达来降低靶多核苷酸的水平。例如，结构域经设计，可以与靶多核苷酸的5’非翻译区、靶多核苷酸的3’非翻译区、靶多核苷酸的外显子区、靶多核苷酸的内含子区和其任何组合共享序列同一性。在具体实施方案中，沉默元件的结构域与来自靶序列的核苷酸约1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、550-600、600-650、650-700、750-800、850-900、950-1000、1000-1050、
1050-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、
1700-1800、1800-1900、1900-2000中的至少约15个连续核苷酸具有充足的同源性。在优化发夹所用的siRNA序列某些情况中，合成的寡聚脱氧核苷酸/核糖核酸酶H法可用来确
定靶mRNA上处于易受RNA沉默的构象的位点。参阅，例如，Vickers et al.(2003)J.Biol.Chem 278：7108-7118和Yang et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：9442-9447，在此通过引用并入。这些研究表明，核糖核酸酶-H敏感位点与促进高效的siRNA指导的mRNA降解的位点间存在显著的相关性。
1050-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、
1700-1800、1800-1900、1900-2000中的至少约15个连续核苷酸具有充足的同源性。在优化发夹所用的siRNA序列某些情况中，合成的寡聚脱氧核苷酸/核糖核酸酶H法可用来确
定靶mRNA上处于易受RNA沉默的构象的位点。参阅，例如，Vickers et al.(2003)J.Biol.Chem 278：7108-7118和Yang et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：9442-9447，在此通过引用并入。这些研究表明，核糖核酸酶-H敏感位点与促进高效的siRNA指导的mRNA降解的位点间存在显著的相关性。
[0049] 发夹沉默元件也可以如此设计，即，使有义序列或反义序列不对应于靶多核苷酸。在这个实施方案中，有义和反义序列位于环状序列的侧翼，该环状序列包含对应于全部或部分靶多核苷酸的核苷酸序列。因此，是环状区决定了RNA干扰的特异性。参阅例如，WO
02/00904，在此通过引用并入。
02/00904，在此通过引用并入。
[0050] 在具体实施方案中，包含发夹的沉默元件包含从多核苷酸组成的组中挑选出来的序列，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：22-408所示序列中的至少一个或者由SEQ ID NO：
22-408所示序列中的至少一个组成。在其他实施方案中，发夹包含选自以下的序列：SEQ ID NO：23和24、26和27、29和30、32和33、35和36、38和39、41和42、44和45、47和48、50和51、53和54、56和57、59和60、62和63、65和66、68和69、71和72、74和75、77和78、
80和81、83和84、86和87、89和90、92和93、95和96、98和99、101和102、104和105、107和108、110和111、113和114、116和117、119和120、122和123、125和126、128和129、
131和132、134和135、137和138、140和141、143和144、146和147、149和150、152和
153、155和156、158和159、161和162、164和165、167和168、170和171、173和174、176和177、179和180、182和183、185和186、188和189、191和192、194和195、197和198、
200和201、203和204、206和207、209和210、212和213、215和216、218和219、和/或
221和222。
22-408所示序列中的至少一个组成。在其他实施方案中，发夹包含选自以下的序列：SEQ ID NO：23和24、26和27、29和30、32和33、35和36、38和39、41和42、44和45、47和48、50和51、53和54、56和57、59和60、62和63、65和66、68和69、71和72、74和75、77和78、
80和81、83和84、86和87、89和90、92和93、95和96、98和99、101和102、104和105、107和108、110和111、113和114、116和117、119和120、122和123、125和126、128和129、
131和132、134和135、137和138、140和141、143和144、146和147、149和150、152和
153、155和156、158和159、161和162、164和165、167和168、170和171、173和174、176和177、179和180、182和183、185和186、188和189、191和192、194和195、197和198、
200和201、203和204、206和207、209和210、212和213、215和216、218和219、和/或
221和222。
[0051] 在其他实施方案中，发夹包含或组成为选自以下的序列：至少一条SEQ ID NOS：284和285、290和291、293和294、305和306、317和318、320和321、323和324、326和
327、329和330、332和333、335和336、338和339、341和342、344和345或347和348所
示的序列。如本文中其他地方所示例的，这些序列的表达控制草盲蝽。
327、329和330、332和333、335和336、338和339、341和342、344和345或347和348所
示的序列。如本文中其他地方所示例的，这些序列的表达控制草盲蝽。
[0052] 此外，转录基因沉默(TGS)可以通过使用发夹抑制元件完成，其中发夹的反向重复与待沉默的靶多核苷酸的启动子区共享序列同一性。参阅例如，Aufsatz et al.(2002)PNAS 99(Suppl.4)：16499-16506和Mette et al.(2000)EMBO J 19(19)：5194-5201。
[0053] 在其他实施方案中，dsRNA可以包含小RNA(sRNA)。sRNAs可以包含小RNA(miRNA)和短的干扰RNA(siRNA)(Meister and Tuschl(2004)Nature 431：343-349和Bonetta et al.(2004)Nature Methods 1：79-86)。miRNA是包含约19个核糖核苷酸的调节剂，其高效抑制靶多核苷酸的表达。参阅例如，Javier et al.(2003)Nature 425：257-263，在此通过引用并入。对miRNA干扰来说，沉默元件经设计，可以表达形成发夹结构的dsRNA分子，所述发夹结构含有与目的靶多核苷酸互补的19个核苷酸的序列。所述的miRNA可以合成产生，或转录为更长的RNA，其随后经切割产生活性miRNA。特别是，miRNA可以包含在其有义方向上与靶多核苷酸具有同源性的序列的19个核苷酸，和与有义序列互补的相应反义序
列的19个核苷酸。
列的19个核苷酸。
[0054] 当表达miRNA时，应当认识到可以转录各种形式的miRNA，包括例如，初级转录物(术语称为pri-miRNA(初级miRNA))，pri-miRNA经过各种核酸水解步骤，加工成更短的前体miRNA(术语称为pre-miRNA(前miRNA))；pre-miRNA；或最终(成熟)的miRNA以双链体的形式存在，两条链称为miRNA(最终与靶标形成碱基配对的链)和miRNA*。pre-miRNA
是一类从前体中去除miRNA/miRNA*双链体的切割体(dicer)的底物，切割后，与siRNAs
类似，双链体可以进入RISC复合体。有研究表明，miRNAs可以以转基因的方式表达，并
通过前体形式而不是完全的初级形式的表达而有效(Parizotto et al.(2004)Genes &
Development18：2237-2242和Guo et al.(2005)Plant Cell 17：1376-1386)。
是一类从前体中去除miRNA/miRNA*双链体的切割体(dicer)的底物，切割后，与siRNAs
类似，双链体可以进入RISC复合体。有研究表明，miRNAs可以以转基因的方式表达，并
通过前体形式而不是完全的初级形式的表达而有效(Parizotto et al.(2004)Genes &
Development18：2237-2242和Guo et al.(2005)Plant Cell 17：1376-1386)。
[0055] 本发明的方法和复合物使用转录时形成dsRNA分子的沉默元件。因此，表达的异源多核苷酸不需要自身形成dsRNA，而可以在摄食后与植物细胞或害虫肠中的其它序列相互作用，以便允许形成dsRNA。例如，可以选择性沉默靶多核苷酸的嵌合多核苷酸，可以通过将包含miRNA或者siRNA的靶序列的嵌合构建体表达为对应于全部或部分待沉默的一个基因或多个基因的序列而生成。在这个实施方案中，当miRNA或者siRNA的靶标与存在于细
胞中的miRNA相互作用时，形成dsRNA。因此发生的dsRNA可随后降低待沉默的一个基因或多个基因的表达水平。参阅例如，美国临时申请第60/691613号，其是2005年6月17日提
交的，题目为“Methods and Compositions for Gene Silencing(基因沉默的方法和组合物)”，在此通过引用并入。构建体经设计，可以具有内源miRNA的靶标，或者可选地，异源和/或合成的miRNA的靶标，可用于构建体中。如果使用异源和/或合成的miRNA，它可以作
为嵌合多核苷酸在同一核苷酸构建体中，或在单独构建体中，被引入细胞。如本文其它部分所讨论的，可用任何方法引入包含异源miRNA的构建体。
胞中的miRNA相互作用时，形成dsRNA。因此发生的dsRNA可随后降低待沉默的一个基因或多个基因的表达水平。参阅例如，美国临时申请第60/691613号，其是2005年6月17日提
交的，题目为“Methods and Compositions for Gene Silencing(基因沉默的方法和组合物)”，在此通过引用并入。构建体经设计，可以具有内源miRNA的靶标，或者可选地，异源和/或合成的miRNA的靶标，可用于构建体中。如果使用异源和/或合成的miRNA，它可以作
为嵌合多核苷酸在同一核苷酸构建体中，或在单独构建体中，被引入细胞。如本文其它部分所讨论的，可用任何方法引入包含异源miRNA的构建体。
[0056] IV.变体和片段
[0057] “片段”是指多核苷酸的一部分或其编码的氨基酸序列及蛋白的一部分。多核苷酸片段可以编码保留天然蛋白的生物活性的蛋白片段。可选地，可用作沉默元件或抑制增强元件的多核苷酸片段不必编码保留生物活性的蛋白片段或蛋白变体。因此，核苷酸序列片段的变化范围可以从至少约10、约15、20个核苷酸、约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、200个核苷酸、300个核苷酸、400个核苷酸、500个核苷酸、600个核苷酸、700个核苷酸，直到本发明所用的全长多核苷酸。测定所需的沉默元件活性的方法在本文其它位置进行了描述。
[0058] “变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸来说，变体包含在天然多核苷酸序列内的一个或多个内部位点上的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或天然多核苷酸内一个或多个位点上的一个或多个核苷酸的取代。如本文所用的，“天然”多核苷酸或者多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸来说，保守性变体包括这样的序列，其由于遗传密码的简并性而编码本发明所用的多肽之一的氨基酸序列。多核苷酸变体也包括以合成的方式衍生的多核苷酸，例如通过位点诱变产生的多核苷酸，但继续维持所需的活性。一般来说，本发明的具体多核苷酸(即沉默元件)的变体与该具体
多核苷酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数所测定的。靶序列变体的沉默元件和或沉默增强元件不需要编码蛋白，相反地能够降低靶序列的表达水平。
多核苷酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数所测定的。靶序列变体的沉默元件和或沉默增强元件不需要编码蛋白，相反地能够降低靶序列的表达水平。
[0059] 本发明的具体多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体可以通过比较多核苷酸变体所编码的多肽和和参考多核苷酸所编码的多肽间的序列同一性百分比来进行评估。任何
两条多肽间的序列同一性百分比可以利用本文其他地方所述的序列比对程序和参数进行
计算。如果任何给定的本发明所用的多核苷酸对都通过比较由它们所编码的多肽共享的序列同一性百分比进行评估，则两条编码的多肽间的序列同一性百分比为至少约40％、45％、
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多的序列同一性。
两条多肽间的序列同一性百分比可以利用本文其他地方所述的序列比对程序和参数进行
计算。如果任何给定的本发明所用的多核苷酸对都通过比较由它们所编码的多肽共享的序列同一性百分比进行评估，则两条编码的多肽间的序列同一性百分比为至少约40％、45％、
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多的序列同一性。
[0060] 蛋白“变体”意指通过天然蛋白一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失和/或添加，和/或该天然蛋白内一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代，由该天然蛋白衍生的蛋白。本发明所包括的蛋白变体具有生物活性，换言之，正如本文其他地方所讨论的，它们继续拥有所需的天然蛋白的生物活性。此类变体可以由例如遗传多态性或人类操控来产生。天然蛋白的生物活性变体与该天然蛋白的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如本文其他地方所述的序列比对程序和参数所测定的。本发明蛋白的生物活性变体与该蛋白的差异可以为少至1-15个氨基酸残基，少至1-10，如6-10，少至5、少至4、3、2，甚至1个氨基酸残基。
96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如本文其他地方所述的序列比对程序和参数所测定的。本发明蛋白的生物活性变体与该蛋白的差异可以为少至1-15个氨基酸残基，少至1-10，如6-10，少至5、少至4、3、2，甚至1个氨基酸残基。
[0061] 以下术语用来描述两个或更多多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”(reference sequence)(b)“比较窗”(comparison window)，(c)“序列同一性”(sequence identity)和(d)“序列同一性百分比”(percentage of sequence identity)
[0062] (a)本文所用“参考序列”是作为序列比较基准的限定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部，例如是全长cDNA或基因序列的节段，或者完整的cDNA或基因序列。
[0063] (b)本文所用“比较窗”涉及多核苷酸序列的连续且指定的节段，其中，为了两个多核苷酸的最佳比对，比较窗内的多核苷酸序列与参考序列(不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(即空位)。一般来说，比较窗的长度为至少20个连续的核苷酸，且任选地可以是30、40、50、100个连续的核苷酸或更长。本领域技术人员可以理解，为了避免由于多核苷酸序列中包括空位而导致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分，将其从匹配数值中减去。
[0064] 除非另作说明，本文所提供的序列同一性/相似性的值指用GAPVersion 10软件得出的值，使用参数如下：核苷酸序列的％同一性和％相似性所用的空位权重(GAP
Weight)为50，长度权重(length Weight)为3，并利用nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸
序列的％同一性和％相似性使用的GAP权重为8、长度权重为2，利用BLOSUM62评分矩阵；
或其任何等同程序。“等同程序”是指任何序列比对程序，对所讨论的任何两个序列而言，当与GAP Version 10所产生的相应比对结果相比时，该任何序列比对程序产生具有相同的核苷酸或者氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对结果。
Weight)为50，长度权重(length Weight)为3，并利用nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸
序列的％同一性和％相似性使用的GAP权重为8、长度权重为2，利用BLOSUM62评分矩阵；
或其任何等同程序。“等同程序”是指任何序列比对程序，对所讨论的任何两个序列而言，当与GAP Version 10所产生的相应比对结果相比时，该任何序列比对程序产生具有相同的核苷酸或者氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对结果。
[0065] (c)在两个多核苷酸序列或多肽序列的情况下，本文所用“序列同一性”或者“同一性”涉及两个序列中的残基，所述残基在指定的比较窗内为最大相符性而进行比对时，是相同的。当序列同一性百分比的使用涉及到蛋白质时，应当认识到，不同的残基位置经常由于保守性氨基酸的取代而不同，其中氨基酸残基被被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，且因此，并不改变该分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调整序列同一性百分比，以便矫正取代的保守特性。认为由于此类保守性取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。进行此类调整的方式，是本领域的技术人员所熟知的。通常这涉及将保守取代作为部分而并非全部错配来评分，由此增加序列同一性百分比。因此，例如，如果给出的相同氨基酸的得分为1，给出的非保守取代的得分为0，则给出的保守取代的得分介于0和1之间。保守取代的评分，例如按PC/GENE程序(Intelligenetics，Mountain View，California)所执行的，进行计算。
[0066] (d)如本文所用的“序列同一性百分比”是指通过在比较窗对两个最佳比对的序列进行比较所测定的值，其中，为了两个序列的最佳比对，比较窗内的一部分多核苷酸序列与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即空位)。百分比的计算按如下进行，测定两个序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，以便获得匹配位置的数量，然后用匹配位置的数量除以比较窗中的位置总数，再将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
[0067] V.DNA构建体
[0068] 术语“多核苷酸”的使用并非意图将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域所属技术人员应当认识到，多核苷酸可以包括核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸与核糖核苷包括天然存在的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸还包括序列的所有形式，包括但不局限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
[0069] 本发明的方法和组合物所用的编码沉默元件的多核苷酸可以以表达盒的形式提供，用于在目的植物或生物中表达。已认识到，可以使用多重沉默元件，包括多重相同的沉默元件、靶向靶序列的不同区域的多重沉默元件或者来自不同靶序列的多重沉默元件。在本实施方案中，应当认识到，可将每个沉默元件包含在单个或单独的盒、DNA构建体或者载体中。正如所讨论的，提供沉默元件的任何方式都是经过仔细考虑的。植物或植物细胞可以用包含编码一个或多个沉默元件的DNA盒转化，或包含每个沉默元件的单独的盒可以用来转化植物、植物细胞或宿主细胞。同样，经过一种组分转化的植物可以随后用第二种组分转化。一个或多个沉默元件可以通过有性杂交集合在一起。也就是说，使包含一组分的第一植物与包含第二组分的第二植物杂交。杂交后的后代植株将包含两种组分。
[0070] 所述的表达盒可以包括可操作地连接于本发明的多核苷酸的5’和3’调节序列。“可操作地连接”意图表示两个或多个元件之间的功能性连接。例如，本发明的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作的连接是允许本发明的多核苷酸表达的功能性连接。
可操作地连接的元件可以是相邻的或不相邻的。当涉及两个蛋白编码区的结合时，可操作地连接表示编码区域位于同一读框内。盒可以另外含有至少一个待共转化于生物的其他核苷酸。可选地，将其他多肽提供于多重表达盒中。表达盒可以提供有多个限制位点和/或重组位点，用于插入处于调节区的转录调节控制下的核苷酸。表达盒可以另外含有选择标记基因(selectable marker gene)。
可操作地连接的元件可以是相邻的或不相邻的。当涉及两个蛋白编码区的结合时，可操作地连接表示编码区域位于同一读框内。盒可以另外含有至少一个待共转化于生物的其他核苷酸。可选地，将其他多肽提供于多重表达盒中。表达盒可以提供有多个限制位点和/或重组位点，用于插入处于调节区的转录调节控制下的核苷酸。表达盒可以另外含有选择标记基因(selectable marker gene)。
[0071] 在转录的5’-3’方向上，表达盒包括在植物中有功能的转录和翻译起始区(即启动子)、包含本发明的方法和组合物所用的沉默元件的多核苷酸以及转录和翻译终止区(即终止区)。本发明所用的调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或多核苷
酸对宿主细胞或彼此之间来说可以是天然的/相似的。可选地，本发明所用的调节区和/
或多核苷酸对宿主细胞或彼此之间可以是异源的。涉及到序列时，本文所用的“异源”是指外来物种来源的序列，或者是如果来自相同物种，通过有意的人为干预在组成和/基因组基因座中对其天然形式进行了实质性修饰的序列。例如，可操作地连接于异源多核苷酸的启动子来自与衍生所述多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来源于相同/相似物种，其中之一或两者由其最初形式和/或基因组基因座进行了实质性修饰，或者该启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用的，嵌合基因包含编码序列，该编码序列可操作地连接于该编码序列的异源转录起始区。
酸对宿主细胞或彼此之间来说可以是天然的/相似的。可选地，本发明所用的调节区和/
或多核苷酸对宿主细胞或彼此之间可以是异源的。涉及到序列时，本文所用的“异源”是指外来物种来源的序列，或者是如果来自相同物种，通过有意的人为干预在组成和/基因组基因座中对其天然形式进行了实质性修饰的序列。例如，可操作地连接于异源多核苷酸的启动子来自与衍生所述多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来源于相同/相似物种，其中之一或两者由其最初形式和/或基因组基因座进行了实质性修饰，或者该启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用的，嵌合基因包含编码序列，该编码序列可操作地连接于该编码序列的异源转录起始区。
[0072] 终止区可以与转录起始区是天然的，可以与可操作地连接的编码沉默元件的多核苷酸是天然的，可以与植物宿主是天然的，或者可以来源于启动子、包含沉默元件的多核苷酸、植物宿主的另一来源(即外来的或异源的)，或者其任意组合。合适的终止区可以从根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒中获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也可以参阅Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell
64：671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene91：151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903和Joshi etal.(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。
64：671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene91：151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903和Joshi etal.(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。
[0073] 已知其他序列修饰可以增强细胞宿主内的基因表达。这些修饰包括去除编码假的聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号，转座子样重复的序列和不利于基因表达的其他此类充分表征的序列。可以将序列的G-C含量调整至给定的细胞宿主的平均水平，这可通过参考宿主细胞内表达的已知基因计算。可能的话，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。
[0074] 在制备表达盒时，可操作各种DNA片段，以便将DNA序列提供于正确的定位，如有必要，在合适的读框内。为此，连接物(adapters)和接头(linkers)可以用于连接DNA片段，或者涉及提供方便的限制位点、移除过剩的DNA、移除限制位点等的其他操作。为此，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，例如转换和颠换。
[0075] 很多的启动子可以在本发明的实践中使用。编码沉默元件的多核苷酸可以与组成型启动子、组织优选启动子或其他启动子组合，供在植物中表达。
[0076] 此类组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子以及WO99/43838和美国专利第6,072,050号所公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell et
al.(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：
163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.
Genet.81：581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)等。其他组成型启动子包括，例如，美国专利第5,608,149号、
第5,608,144号、第5,604,121号、第5,569,597号、第5,466,785号、第5,399,680号、第
5,268,463号、第5,608,142号和第6,177,611号。
al.(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：
163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.
Genet.81：581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)等。其他组成型启动子包括，例如，美国专利第5,608,149号、
第5,608,144号、第5,604,121号、第5,569,597号、第5,466,785号、第5,399,680号、第
5,268,463号、第5,608,142号和第6,177,611号。
[0077] 也可以使用诱导型启动子，例如病原体诱导的启动子。此类启动子包括那些来自发病机理相关蛋白(PR蛋白)的启动子，其在病原体感染后受到诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。参阅，例如，Redolfi et al.(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes etal.(1992)Plant Cell 4：645-656；Van Loon(1985)Plant MoI.Virol.4：111-116。还可参阅WO 99/43819，在此通过引用并入。
[0078] 感兴趣的是在病原体感染位点或在该位点附近局部表达的启动子。参阅，例如，Marineau et al.(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342；Matton et al.(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331；Somsisch et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch et al.(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98； 和 Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14972-14977。还可参阅Chen et al.(1996)Plant J.10：955-966；Zhang etal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511；Warner et
al.(1993)Plant J.3：191-201；Siebevtz et al.(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利第5,750,386号(线虫诱导型)以及其中引用的文献。特别感兴趣的是玉米PRms基因的
诱导型启动子，其表达受病原体串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)的诱导。(参阅，例如，Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.PlantPath.41：189-200)。
al.(1993)Plant J.3：191-201；Siebevtz et al.(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利第5,750,386号(线虫诱导型)以及其中引用的文献。特别感兴趣的是玉米PRms基因的
诱导型启动子，其表达受病原体串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)的诱导。(参阅，例如，Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.PlantPath.41：189-200)。
[0079] 此外，因为病原体进入植物是通过创伤或昆虫损伤，所以创伤诱导型启动子可以在本发明的构成中使用。此类创伤诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pinII)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan et al.(1996)Nature Biotechnology
14：494-498)、wun1和wun2(美国专利第5,428,148号)、win1和win2(Stanford et
al.(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)、系统素(McGurl et al.(1992)Science 225：
1570-1573)、WIP1(Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Letters 323：73-76)、MPI基因(Corderok et al.(1994)Plant J.6(2)：
141-150)等，在此通过引用并入。
14：494-498)、wun1和wun2(美国专利第5,428,148号)、win1和win2(Stanford et
al.(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)、系统素(McGurl et al.(1992)Science 225：
1570-1573)、WIP1(Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Letters 323：73-76)、MPI基因(Corderok et al.(1994)Plant J.6(2)：
141-150)等，在此通过引用并入。
[0080] 化学品调节的启动子可以用来通过外源化学调节剂的应用来调节植物内基因的表达。视具体情况而定，启动子可以是化学品诱导型启动子，其中化学品的应用诱导基因表达；或者是化学品抑制型启动子，其中化学品的应用抑制基因表达。化学品诱导型启动子在本领域内是已知的，包括但不限于玉米In2-2启动子，其被苯磺酰胺除草剂安全剂激活；玉米GST启动子，其被用作在萌发前施用的除草剂(pre-emergent herbicide)的疏水亲电的化合物激活，以及烟草PR-1a启动子，其被水杨酸激活。其他感兴趣的化学品调节的启动子包括类固醇应答启动子(参阅，例如，Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：
10421-10425和McNelliset al.(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)和四环素诱导型启动及四环素抑制型启动子(参阅，例如，Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利第5,814,618号和第5,789,156号)，在此通过引用并入。
10421-10425和McNelliset al.(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)和四环素诱导型启动及四环素抑制型启动子(参阅，例如，Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利第5,814,618号和第5,789,156号)，在此通过引用并入。
[0081] 组织优选启动子可以用于在特定植物组织中靶向增强表达。组织优选启动子包 括 Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata etal.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen et al.(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343；
Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；
Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto et al.(1994)
Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：
181-196；Orozco et al.(1993)PlantMol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka et
al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要的话，可以修饰此类启动子，用于弱表达。
Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；
Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto et al.(1994)
Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：
181-196；Orozco et al.(1993)PlantMol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka et
al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要的话，可以修饰此类启动子，用于弱表达。
[0082] 叶片优选启动子在本领域内是已知的。参阅，例如，Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon et al.(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor et al.(1993)Plant J.3：509-18；
Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138和Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。
Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138和Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。
[0083] 根部优选启动子已知的，可以选自从文献获得的许多根部优选启动子，或者从各种兼容物种中重新分离。参阅，例如，Hire et al.(1992)PlantMol.Biol.20(2)：
207-218(大豆根部特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant
Cell 3(10)：1051-1061(菜豆(French bean)GRP1.8基因的根部特异性控制元件)；
Sanger et al.(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根瘤农杆菌的甘露碱合酶(MAS)
基因的根部特异性启动子)；以及Miao et al.(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码
在大豆根部和根瘤部表达的胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的cDNA全长克隆)。也可参阅
Boguszet al.(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，该文献描述了从固氮非豆类Parasponia andersonii和相关的非固氮非豆类山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因中分离的
两个根部特异性启动子。将这些基因的启动子连接于β-匍糖醛酸糖苷酶报告基因，并引入非豆类烟草(Nicotiana tabacum)和豆类百脉根(Lotus corniculatus)中，在两个例子中都保留根部特异性启动子的活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对于发根农杆菌
(Agrobacterium rhizogenes)的高表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参
阅Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们得出的结论是，在那些启动子中增强子和组织优选DNA决定子是分离的。Teeri et al.(1989)使用基因与lacZ融合物表明，编
码章鱼碱合酶的农杆菌T-DNA在根尖的表皮中活性特别高，并且TR2’基因在完整的植物中是根部特异性的，被叶片组织中的创伤刺激，对于与杀虫基因或杀幼虫基因一起使用而言，其是特别理想的特征组合(参阅EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶
II)融合的TR1’基因展现出相似的特征。其他的根部优选启动子包括VfENOD-GRP3基因
启动子(Kuster et al.(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)和rolB启动子(Capana
et al.(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691)。也可参阅美国专利第5,837,876号、第
5,750,386号、第5,633,363号、第5,459,252号、第5,401,836号、第5,110,732号和第
5,023,179号。
207-218(大豆根部特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant
Cell 3(10)：1051-1061(菜豆(French bean)GRP1.8基因的根部特异性控制元件)；
Sanger et al.(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根瘤农杆菌的甘露碱合酶(MAS)
基因的根部特异性启动子)；以及Miao et al.(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码
在大豆根部和根瘤部表达的胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的cDNA全长克隆)。也可参阅
Boguszet al.(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，该文献描述了从固氮非豆类Parasponia andersonii和相关的非固氮非豆类山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因中分离的
两个根部特异性启动子。将这些基因的启动子连接于β-匍糖醛酸糖苷酶报告基因，并引入非豆类烟草(Nicotiana tabacum)和豆类百脉根(Lotus corniculatus)中，在两个例子中都保留根部特异性启动子的活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对于发根农杆菌
(Agrobacterium rhizogenes)的高表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参
阅Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们得出的结论是，在那些启动子中增强子和组织优选DNA决定子是分离的。Teeri et al.(1989)使用基因与lacZ融合物表明，编
码章鱼碱合酶的农杆菌T-DNA在根尖的表皮中活性特别高，并且TR2’基因在完整的植物中是根部特异性的，被叶片组织中的创伤刺激，对于与杀虫基因或杀幼虫基因一起使用而言，其是特别理想的特征组合(参阅EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶
II)融合的TR1’基因展现出相似的特征。其他的根部优选启动子包括VfENOD-GRP3基因
启动子(Kuster et al.(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)和rolB启动子(Capana
et al.(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691)。也可参阅美国专利第5,837,876号、第
5,750,386号、第5,633,363号、第5,459,252号、第5,401,836号、第5,110,732号和第
5,023,179号。
[0084] 在本发明的一个实施方案中，植物表达的启动子是维管特异性启动子，例如韧皮部特异性启动子。本文所用“维管特异性”启动子是至少在维管细胞中表达的启动子或优选在维管细胞中表达的启动子。维管特异性启动子的表达不必是维管细胞中专有的，在其他细胞类型或组织中也可能表达。本文所用“韧皮部特异性启动子”是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达的启动子，或优选在韧皮部细胞中表达的启动子。
[0085] 韧皮部特异性启动子的表达不必是韧皮部细胞中专有的，在其他细胞类型或组织例如木质部组织中，也可能表达。在本发明的一个实施方案中，韧皮部特异性启动
子是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达的启动子，其中在非韧皮部细胞中的表达
与在韧皮部细胞中的表达相比，更受到限制(或者缺失)。依照本发明的适合的维管
特异性启动子或韧皮部特异性启动子的实例包括但不限于选自以下的启动子：SCSV3、
SCSV4、SCSV5和SCSV7启动子(Schunmann et al.(2003)Plant Functional Biology30：
453-60)；发根农杆菌的rolC基因启动子(Kiyokawa et al.(1994)PlantPhysiology
104：801-02；Pandolfini et al.(2003)BioMedCentral(BMC)Biotechnology 3：7，(www.biomedcentral.com/1472-6750/3/7)；Graham et al.(1997)Plant Mol.Biol.33：729-35；
Guivarc′h et al.(1996)；Almon et al.(1997)Plant Physiol.115：1599-607；发根
农杆菌的rolA基因启动子(Dehioet al.(1993)Plant Mol.Biol.23：1199-210)；根瘤农
杆菌T-DNA基因5的启动子(Korber et al.(1991)EMBO J.10：3983-91)；水稻蔗糖合酶
(RSs1)基因启动子(Shi et al.(1994)J.Exp.Bot.45：623-31)；CoYMV或鸭跖草黄化斑驳杆状DNA病毒启动子(Medberry et al.(1992)Plant Cell 4：185-92；Zhouet al.(1998)Chin.J.Biotechnol.14：9-16)；CFDV或椰子叶衰败病毒启动子(Rohde et al.(1994)
Plant Mol.Biol.27：623-28；Hehn和Rhode(1998)J.Gen.Virol.79：1495-99)；RTBV或水稻东格鲁杆状病毒启动子(Yin andBeachy(1995)Plant J.7：969-80；Yin et al.(1997)Plant J.12：1179-80)；豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因(Edwards et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3459-63；Brears et al.(1991)Plant J.1：235-44)；马铃薯蔗糖酶基因的inv CD111和inv CD141启动子(Hedley et al.(2000)J.Exp.Botany51：817-21)；从拟南芥中分离的启动子，Kertbundit et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5212-16)证明，其在烟草中具有韧皮部特异性表达；VAHOX1启动子区(Tornero et al.(1996)Plant J.9：639-48)；豌豆细胞壁蔗糖酶基因启动子(Zhang et al.(1996)Plant Physiol.112：
1111-17)；美国公布的专利申请第20030106097号中，与壳多糖酶相关的内源棉花蛋白的启动子，其是胡萝卜来源的酸性转化酶基因启动子(Ramloch-Lorenz et al.(1993)The
Plant J.4：545-54)；硫酸盐转运蛋白基因Sultrl；3的启动子(Yoshimoto et al.(2003)Plant Physiol.131：1511-17)；蔗糖合酶基因的启动子(Nolte和Koch(1993)Plant
Physiol.101：899-905)；烟草蔗糖转运蛋白基因的启动子(Kuhn et al.(1997)Science
275-1298-1300)。
子是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达的启动子，其中在非韧皮部细胞中的表达
与在韧皮部细胞中的表达相比，更受到限制(或者缺失)。依照本发明的适合的维管
特异性启动子或韧皮部特异性启动子的实例包括但不限于选自以下的启动子：SCSV3、
SCSV4、SCSV5和SCSV7启动子(Schunmann et al.(2003)Plant Functional Biology30：
453-60)；发根农杆菌的rolC基因启动子(Kiyokawa et al.(1994)PlantPhysiology
104：801-02；Pandolfini et al.(2003)BioMedCentral(BMC)Biotechnology 3：7，(www.biomedcentral.com/1472-6750/3/7)；Graham et al.(1997)Plant Mol.Biol.33：729-35；
Guivarc′h et al.(1996)；Almon et al.(1997)Plant Physiol.115：1599-607；发根
农杆菌的rolA基因启动子(Dehioet al.(1993)Plant Mol.Biol.23：1199-210)；根瘤农
杆菌T-DNA基因5的启动子(Korber et al.(1991)EMBO J.10：3983-91)；水稻蔗糖合酶
(RSs1)基因启动子(Shi et al.(1994)J.Exp.Bot.45：623-31)；CoYMV或鸭跖草黄化斑驳杆状DNA病毒启动子(Medberry et al.(1992)Plant Cell 4：185-92；Zhouet al.(1998)Chin.J.Biotechnol.14：9-16)；CFDV或椰子叶衰败病毒启动子(Rohde et al.(1994)
Plant Mol.Biol.27：623-28；Hehn和Rhode(1998)J.Gen.Virol.79：1495-99)；RTBV或水稻东格鲁杆状病毒启动子(Yin andBeachy(1995)Plant J.7：969-80；Yin et al.(1997)Plant J.12：1179-80)；豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因(Edwards et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3459-63；Brears et al.(1991)Plant J.1：235-44)；马铃薯蔗糖酶基因的inv CD111和inv CD141启动子(Hedley et al.(2000)J.Exp.Botany51：817-21)；从拟南芥中分离的启动子，Kertbundit et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5212-16)证明，其在烟草中具有韧皮部特异性表达；VAHOX1启动子区(Tornero et al.(1996)Plant J.9：639-48)；豌豆细胞壁蔗糖酶基因启动子(Zhang et al.(1996)Plant Physiol.112：
1111-17)；美国公布的专利申请第20030106097号中，与壳多糖酶相关的内源棉花蛋白的启动子，其是胡萝卜来源的酸性转化酶基因启动子(Ramloch-Lorenz et al.(1993)The
Plant J.4：545-54)；硫酸盐转运蛋白基因Sultrl；3的启动子(Yoshimoto et al.(2003)Plant Physiol.131：1511-17)；蔗糖合酶基因的启动子(Nolte和Koch(1993)Plant
Physiol.101：899-905)；烟草蔗糖转运蛋白基因的启动子(Kuhn et al.(1997)Science
275-1298-1300)。
[0086] 可能的启动子也包括李苷水解酶(PH DL 1.4PRO)的黑莓启动子(Black Cherrypromoter，美国专利6,797,859号)；黄瓜和水稻来源的硫氧还蛋白H启动子(Fukuda
A et al.(2005).Plant Cell Physiol.46(11)：1779-86)；水 稻 (RSs1)(Shi，T.Wang et al.(1994).J.Exp.Bot.45(274)：623-631)和玉米蔗糖合酶-1启动子(Yang.，N-S.
et al.(1990)PNAS87：4144-4148)；南 瓜 来 源 的PP2 启动 子 (Guo，H.et al.(2004)TransgenicResearch 13：559-566)；At SUC2 启 动 子 (Truernit，E.et al.(1995)
Planta196(3)：564-70.)；At SAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(Mijnsbrugge KV.etal.
(1996)Planr.Cell.Physiol 37(8)：1108-1115)和水稻东格鲁杆状病毒启动子(RTBV)启
动子(Bhattacharyya-Pakrasi et al.(1993)Plant J.4(1)：71-79)。
A et al.(2005).Plant Cell Physiol.46(11)：1779-86)；水 稻 (RSs1)(Shi，T.Wang et al.(1994).J.Exp.Bot.45(274)：623-631)和玉米蔗糖合酶-1启动子(Yang.，N-S.
et al.(1990)PNAS87：4144-4148)；南 瓜 来 源 的PP2 启动 子 (Guo，H.et al.(2004)TransgenicResearch 13：559-566)；At SUC2 启 动 子 (Truernit，E.et al.(1995)
Planta196(3)：564-70.)；At SAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(Mijnsbrugge KV.etal.
(1996)Planr.Cell.Physiol 37(8)：1108-1115)和水稻东格鲁杆状病毒启动子(RTBV)启
动子(Bhattacharyya-Pakrasi et al.(1993)Plant J.4(1)：71-79)。
[0087] 表达盒也可以包含选择标记基因，用于选择转化的细胞。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新霉素磷
酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草化合物抗性的基
因，例如草铵膦(glufosinateammonium)、溴苯腈、咪唑啉酮、2，4-二氯苯氧乙酸(盐2，
4-dichlorophenoxyacetate，2，4-D)。其他的选择标记包括表型标记，例如β-半乳糖
苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su et al.(2004)Biotechnol Bioeng 85：
610-9和Fetter et al.(2004)Plant Cell 16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte
et al.(2004)J.Cell Science 117：943-54 和 Kato etal.(2002)Plant Physiol 129：
913-42)和黄色荧光蛋白(Evrogen的PhiyFPTM，参阅，Bolte et al.(2004)J.Cell
Science 117：943-54)。对于其他的选择标记，通常参阅，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
6314-6318；Yao etal.(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：
2419-2422；Barkley et al.(1980)in The Operon，pp.177-220；Hu et al.(1987)
Cell48：555-566；Brown et al.(1987)Cell 49：603-612；Figge et al.(1988)Cell52：
713-722；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle et al.(1990)Science
248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis(博 士 论 文 )，University of Heidelberg；
Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921；Labow et al.(1990)
Mol Cell.Biol.10：3343-3356；Zambrettiet al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
3952-3956；Bairn et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski
et al.(1991)NucleicAcids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：
1591-1595；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)
Ph.D.Thesis( 博 士 论 文 )，University of Heidelberg；Gossen et al.(1992)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents
Chemother.36：913-919；Hlavka et al.(1985)Handbookof Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill et al.(1988)Nature 334：721-724。这些公开在此通过引用并入。以上选择标记基因的名录不是意图限制。任何选择标记基因可以用于本发明中。
酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草化合物抗性的基
因，例如草铵膦(glufosinateammonium)、溴苯腈、咪唑啉酮、2，4-二氯苯氧乙酸(盐2，
4-dichlorophenoxyacetate，2，4-D)。其他的选择标记包括表型标记，例如β-半乳糖
苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su et al.(2004)Biotechnol Bioeng 85：
610-9和Fetter et al.(2004)Plant Cell 16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte
et al.(2004)J.Cell Science 117：943-54 和 Kato etal.(2002)Plant Physiol 129：
913-42)和黄色荧光蛋白(Evrogen的PhiyFPTM，参阅，Bolte et al.(2004)J.Cell
Science 117：943-54)。对于其他的选择标记，通常参阅，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
6314-6318；Yao etal.(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：
2419-2422；Barkley et al.(1980)in The Operon，pp.177-220；Hu et al.(1987)
Cell48：555-566；Brown et al.(1987)Cell 49：603-612；Figge et al.(1988)Cell52：
713-722；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle et al.(1990)Science
248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis(博 士 论 文 )，University of Heidelberg；
Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921；Labow et al.(1990)
Mol Cell.Biol.10：3343-3356；Zambrettiet al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
3952-3956；Bairn et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski
et al.(1991)NucleicAcids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：
1591-1595；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)
Ph.D.Thesis( 博 士 论 文 )，University of Heidelberg；Gossen et al.(1992)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents
Chemother.36：913-919；Hlavka et al.(1985)Handbookof Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill et al.(1988)Nature 334：721-724。这些公开在此通过引用并入。以上选择标记基因的名录不是意图限制。任何选择标记基因可以用于本发明中。
[0088] VI.包含沉默元件的组合物
[0089] 包含沉默元件的一种或多种多核苷酸可以作为外部组合物，例如喷雾或粉末，提供给植物、植物部分、种子、害虫或耕种区域。在另一个实例中，植物用DNA构建体或表达盒进行转化，用于表达至少一种沉默元件。在任一组合物中，当被昆虫摄食后，沉默元件可以降低靶害虫序列的水平，由此控制害虫(即草盲蝽属的任何害虫，例如豆荚草盲蝽)。应当认识到，组合物可以包含细胞(例如植物细胞或细菌细胞)，在该细胞中，编码沉默元件的多核苷酸稳定地并入基因组中并可操作地连接于在细胞中有活性的启动子。也包括包含细胞混合物的组合物，一些细胞表达至少一种沉默元件。在其他实施方案中，包含沉默元件的组合物不包含在细胞内。在这些实施方案中，组合物可以应用到害虫栖息的区域。在一个实施方案中，组合物被应用到植物外部(即喷洒田地或耕作区)，保护植物免受害虫的危害。
[0090] 本发明的组合物还可配制为饵食。在这个实施方案中，所述组合物包含食物或者可以增强该组合物对害虫吸引力的引诱剂。
[0091] 包含沉默元件的组合物可以配制在适合于农业和/或环境可接受的载体(carrier)中。此类载体可以是待处理的动物、植物和环境能忍受的任何材料。此外，所述载体必须能使组合物维持有效控制害虫。此类载体的实例包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖或其他糖溶液、Hank液(Hank′ssolution)和其他水性生理平衡盐溶液、磷酸缓冲液、重碳酸盐缓冲液和Tris缓冲液。另外，组合物可以包括能够增加组合物半寿期的化合物。
[0092] 应当认识到，包含编码沉默元件的序列的多核苷酸可以用于转化生物，为宿主生物提供这些组分的产生，并随后将这些宿主生物应用到靶害虫的环境中。此类宿主生物包括杆状病毒、细菌等。以此方式，可将编码沉默元件的多核苷酸的组合通过合适的载体(vector)引入微生物宿主，并将所述宿主应用于环境、植物或动物中。
[0093] 在将核酸插入细胞的情况下，术语“引入(introduced)”表示“转染(transfection)”或“转化(transformation)”或“转导(transduction)”，而且包括提及将核酸引入真核细胞或原核细胞中，其中，核酸可以稳定地并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转变成自主复制子，或者瞬时表达(例如转染的mRNA)。
[0094] 可以选择已知占据一种或多种目的农作物的“植物圈”(叶面、叶围、根围和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物是为了能够在特定的环境中与野生型微生物成功竞争，提供编码沉默元件的多核苷酸的稳定保持和表达，并且理想的是，改善组分的保护作用，免遭环境退化和失活的危害。
[0095] 此类微生物包括细菌、藻类和真菌。特别感兴趣的是微生物，例如细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏
菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xant人类nas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属
(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、Methylius、农杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固
氮细菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)，
真菌，特别是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和
短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈的细菌物种，例如丁香假单胞菌
(Pseudomonassyringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fiuorescens)、粘质沙雷氏菌
(Serratiamarcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌(Agrobacteria)、球红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄假单胞菌(Xant人类nas cam害
虫ris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱杆菌(Alcaligenes entrophus)、
木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)、棕色固氮菌(Azotobacter vinlandir)和植物圈
酵母种类，例如深红酵母(Rhodotorularubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母
(R.marina)、橙红酵母(R.aurantiaca)、白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、酿酒酵母(S.cerevisiae)、Sporobolomyces rosues、香气掷胞酵母
(S.odorus)、Kluyveromyces veronae和出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpollulans)。特别感兴趣的是有色微生物。
菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xant人类nas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属
(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、Methylius、农杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固
氮细菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)，
真菌，特别是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和
短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是植物圈的细菌物种，例如丁香假单胞菌
(Pseudomonassyringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fiuorescens)、粘质沙雷氏菌
(Serratiamarcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌(Agrobacteria)、球红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄假单胞菌(Xant人类nas cam害
虫ris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱杆菌(Alcaligenes entrophus)、
木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)、棕色固氮菌(Azotobacter vinlandir)和植物圈
酵母种类，例如深红酵母(Rhodotorularubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母
(R.marina)、橙红酵母(R.aurantiaca)、白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、酿酒酵母(S.cerevisiae)、Sporobolomyces rosues、香气掷胞酵母
(S.odorus)、Kluyveromyces veronae和出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpollulans)。特别感兴趣的是有色微生物。
[0096] 在允许稳定维持和表达编码序列的多核苷酸的条件下，可用很多方法将包含沉默元件的多核苷酸引入微生物宿主。例如，可以构建表达盒，其包括目的核苷酸构建体，其可操作地与表达该核苷酸构建体的转录调节信号和翻译调节信号连接，与宿主生物内序列同源的核苷酸序列，借以实现整合，和/或在宿主内是有功能的复制系统，借以实现整合或稳定维持。
[0097] 转录调节信号和翻译调节信号包括但不局限于：启动子、转录起始开始位点、操纵基因、激活剂、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。
参阅，例如，美国专利第5,039,523号和第4,853,331号；EPO 0480762A2；Sambrook
rd
et al.(2000)；MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)(3
ed.；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，NY)；Davis et al.(1980)
AdvancedBacterial Genetics(高级细菌遗传学)(Cold Spring Harbor Laboratory，
ColdSpring Harbor，NY)；以及其中引用的文献。
参阅，例如，美国专利第5,039,523号和第4,853,331号；EPO 0480762A2；Sambrook
rd
et al.(2000)；MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)(3
ed.；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，NY)；Davis et al.(1980)
AdvancedBacterial Genetics(高级细菌遗传学)(Cold Spring Harbor Laboratory，
ColdSpring Harbor，NY)；以及其中引用的文献。
[0098] 合适的宿主细胞包括原核细胞和低等的真核细胞，例如真菌。作为例证的原核生物，即革兰氏阴性和革兰氏阳性，包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌(Escherichia)、欧文氏菌、志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形杆菌属(Proteus)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiceae)，例如根瘤菌属；螺菌科(Spirillaceae)，例如发光细菌(photobacterium)、发酵单孢菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺旋状菌属(Spirillum)；乳酸细菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，例如假单胞菌属和醋杆菌属；固氮菌科和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真核细胞中是真菌，例如藻状菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，其包括酵母，例如酵母属和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；和担子菌纲(Basidiomycetes)酵母，例如红酵母属、短梗霉属、掷孢酵母属等。
[0099] 为本发明目的选择宿主细胞时，特别感兴趣的特征包括将编码序列引入宿主的便利性、表达系统的可利用性、表达的效率、在宿主中的稳定性和辅助遗传性能的存在。作为杀虫剂微胶囊使用时，感兴趣的特征包括防护性，例如厚细胞壁，色素作用和包涵体的细胞内包装或形成；叶片亲和力；缺乏哺乳动物毒性；对害虫摄食的吸引力等。其他的考虑包括方便配置和处理、经济情况、储存稳定性等。
[0100] 特别感兴趣的宿主生物包括酵母，例如红酵母(Rhodotorula spp.)、短梗霉(Aureobasidium spp.)、酵 母(Saccharomyces spp.)和 掷 孢 酵母 (Sporobolomyces spp.)，叶面生物，例如，假单胞菌(Pseudomonas spp.)、欧文氏菌(Erwinia spp.)和
黄质菌(Flavobacterium spp.)，及其它此类生物，包括绿脓假单胞菌(Pseudomonas
aeruginosa)、荧光假单胞菌、酿酒酵母、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
黄质菌(Flavobacterium spp.)，及其它此类生物，包括绿脓假单胞菌(Pseudomonas
aeruginosa)、荧光假单胞菌、酿酒酵母、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
[0101] 可以将本发明所包括的编码沉默元件的序列引入在植物上繁殖的微生物(体表寄生菌)，以便将这些组分送递到潜在的靶害虫。体表寄生菌，例如，可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
[0102] 沉默元件可以在细菌宿主中产生，所得的细菌以与苏云金杆菌属被用作杀虫喷雾剂的相同方式用作微生物喷雾剂。任何合适的微生物可以用于此目的。假单胞菌属
被用来表达作为装入胶囊的蛋白的苏云金杆菌属内毒素，处理所得细胞并作为杀虫剂喷
雾 (Gaertner et al.(1993)，inAdvanced Engineered Pesticides，ed.L.Kim(Marcel Decker，Inc.))。
被用来表达作为装入胶囊的蛋白的苏云金杆菌属内毒素，处理所得细胞并作为杀虫剂喷
雾 (Gaertner et al.(1993)，inAdvanced Engineered Pesticides，ed.L.Kim(Marcel Decker，Inc.))。
[0103] 可选地，本发明的组分通过将异源基因引入细胞宿主来产生。异源序列的表达直接或间接地导致细胞内沉默元件的产生。然后，根据常规技术配制应用于靶害虫所寄生的环境的这些组合物，例如，土壤、水和植物的叶子。参阅，例如，EPA0192319和其中引用的文献。
[0104] 在本发明中，转化的微生物可以用可接受的载体配制成单独的或混合的组合物，该组合物是，例如，悬液、溶液、乳剂、隔离剂(dusting powder)、可分散颗粒、可湿性粉剂和可乳化浓缩物、气雾剂、浸渍颗粒、佐剂、涂膏(coatable paste)和在例如多聚物中的胶囊密封物(encapsulations)。
[0105] 以上所公开的此类组合物可以添加以下物质获得：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、取食刺激剂、引诱剂、包裹剂(encapsulatingagent)、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线防护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养供体或其他能影响植物生长的制剂。一种或多种农用化学品，其包括但不限于除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、软体动物杀灭剂、杀螨剂、植物生长调节剂、落叶剂和肥料，可以与配制领域通常使用的载体、表明活性剂或佐剂，或便于产品对特定靶害虫的处理和应用的其他组分进行组合。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且与配置技术中通常使用的物质一致，例如，天然或再生矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。本发明的活性成分(即至少一种沉默元件)通常以组合物的形式应用，并且可以应用于需要处理的农作物区域、植物或种子。例如，该组合物可以应用于准备储存或正储存在粮仓或地窖中的谷类等。该组合物可以与其他化合物同时或相继应用。应用活性有效成分或包含至少一种沉默元件的组合物的方法包括叶面应用、种子包被和土壤应用，但不限于此。应用的数量和应用的速率取决于相应害虫的侵袭强度。
[0106] 合适的表面活性剂包括但不限于，阴离子化合物，例如金属羧酸盐；长链脂肪酸羧酸酯；N-酰基肌氨酸酯；磷酸与脂肪醇聚氧乙烯醚形成的单酯或二酯及这些酯的盐；脂肪醇硫酸酯，例如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；脂肪醇醚硫酸盐；乙氧基烷基苯酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐例如烷基苯磺酸盐或低烷基萘磺酸盐，例如萘磺酸丁酯；萘磺酸甲醛缩合物的盐；磺化苯酚甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐，例如酰胺磺酸盐，例如油酸与N-甲基牛磺酸的磺酸化缩合产物；或者二烷基磺化琥珀酸盐，例如，磺酸钠或琥珀酸二辛合成酯。非离子剂包括：脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪族烷基或链烯基取代的酚类与环氧乙烷、多元醇酯的脂肪酯例如山梨糖醇酐脂肪酸酯的缩合产物，此类酯与环氧乙烷的缩合物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物，炔属乙二醇，例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇或乙氧化乙炔乙二醇。阳离子表面活性剂的实例包括，例如脂肪族单胺、二胺或多胺，例如醋酸酯、环烷酸酯或油酸酯；或含氧胺，例如氧乙烯烷基胺的氧化胺；连有酰胺的胺，由羧酸与二胺或多胺缩合制备；或者季铵盐。
[0107] 惰性材料的实例包括但不限于，无机矿物，例如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或植物材料，例如软木、粉碎的玉米穗轴、花生壳、水稻壳和胡桃壳。
[0108] 包含沉默元件的组合物可以是适合直接应用的形式，或作为应用前需要用适量的水或其他稀释剂稀释的原始组合物的浓缩物。
[0109] 组合物(包括转化的微生物)可以通过以下应用到虫害(例如草盲蝽属害虫)的环境中，例如喷雾、雾化、喷粉、散射、包被或灌注、引入土壤内部或表面、引入灌溉水内、种子处理或者作为防护措施在害虫开始出现时或害虫出现以前进行常规应用或喷粉。例如，组合物和/或转化的微生物可以与谷类混合，在储存过程中保护谷类。通常重要的是，在植物生长的早期获得良好的害虫控制，因为此时植物受到的损伤是最严重的。如果认为必要的话，本组合物可以方便地含有另一杀虫剂。在本发明的一个实施方案中，组合物在种植期直接应用于土壤，其形式为载体、芽孢杆菌菌株或本发明转化的微生物的死细胞的组合物的颗粒。另一个实施方案是颗粒形式的组合物，其包含芽孢杆菌或本发明的转化后微生物的死细胞和在惰性载体内的农用化学品，例如除草剂、杀虫剂、肥料。
[0110] VII.植物、植物部分和将序列引入植物的方法
[0111] 在一个实施方案中，本发明的方法包括将多肽或多核苷酸引入植物。“引入(introducing)”意图表示以序列进入植物细胞内部的方式将多核苷酸或多肽呈现给植物。
本发明的方法不依靠将序列引入植物的特殊方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞内部。将多核苷酸或多肽引入植物的方法在本领域内是已知的，包括稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导方法，但并不局限于此。
本发明的方法不依靠将序列引入植物的特殊方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞内部。将多核苷酸或多肽引入植物的方法在本领域内是已知的，包括稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导方法，但并不局限于此。
[0112] “稳定转化”意图表示引入植物的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代继承。“瞬时转化”意图表示多核苷酸被引入植物并且没有整合到植物的基因组内或多肽被引入植物内。
[0113] 转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物的方案根据靶向转化的植物或植物细胞的类型即单子叶植物或双子叶植物的不同而不同。将多肽和多核苷酸引入植物细
胞的合适方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334)，电穿孔(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606，农杆菌属介导的转化(美国专利第5,563,055号和美国专利第5,981,840号)，直接基因转移(Paszkowski et
al.(1984)EMBO J.3：2717-2722)，弹道粒子加速(参阅，例如，美国专利第4,945,050号、美国专利第5,879,918号、美国专利第5,886,244号和第5,932,782号；Tomes et al.(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：FundamentalMethods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926)；
和Lecl转化(WO 00/28058)。也可参阅Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：
421-477；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；
Christou et al.(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology6：923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：
175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉 米)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6：559-563( 玉米 )；
美国专利第5,240,855号、美国专利第5,322,783号、美国专利第5,324,646；Klein et
al.(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8：
833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311：763-764；
美国专利第5,736,369号(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：
5345-5349( 百 合 类 )；De Wet et al.(1985)in The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.
Genet.84：560-566(噬菌体颈须介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell 4：
1495-1505(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou
and Ford(1995)Annals of Botany75：407-413( 水 稻 )；Osjoda et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米通过根癌农杆菌)；以上均在此通过引用并入。
胞的合适方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334)，电穿孔(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606，农杆菌属介导的转化(美国专利第5,563,055号和美国专利第5,981,840号)，直接基因转移(Paszkowski et
al.(1984)EMBO J.3：2717-2722)，弹道粒子加速(参阅，例如，美国专利第4,945,050号、美国专利第5,879,918号、美国专利第5,886,244号和第5,932,782号；Tomes et al.(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：FundamentalMethods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926)；
和Lecl转化(WO 00/28058)。也可参阅Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：
421-477；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；
Christou et al.(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology6：923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：
175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉 米)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6：559-563( 玉米 )；
美国专利第5,240,855号、美国专利第5,322,783号、美国专利第5,324,646；Klein et
al.(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8：
833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311：763-764；
美国专利第5,736,369号(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：
5345-5349( 百 合 类 )；De Wet et al.(1985)in The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.
Genet.84：560-566(噬菌体颈须介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell 4：
1495-1505(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou
and Ford(1995)Annals of Botany75：407-413( 水 稻 )；Osjoda et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米通过根癌农杆菌)；以上均在此通过引用并入。
[0114] 在具体的实施方案中，本发明的沉默元件序列可以使用很多瞬时转化方法提供给植物。此类瞬时转化方法包括但不限于将蛋白或其变体和片段直接引入植物或者将转录物引入植物。此类方法包括，例如，显微注射和粒子轰击。参阅，例如，Crossway et al.(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185；Nomura et al.(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180和Hush et al.(1994)The Journal ofCell Science 107：775-784；以上均在此通过引用并入。可选地，可以使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化进入植物。在阻止DNA随后释放的意义上，此类技术包括病毒载体系统和多核酸沉淀。因此，来自颗粒结合的DNA的转录可以发生，但是其释放出来整合到基因组中的频率大大降低。此类技术包括使用包被有聚乙基亚胺的颗粒(PEI；Sigma#P3143)。
[0115] 在其他实施方案中，本发明的多核苷酸可以通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入植物。通常，此类方法包括将本发明的核酸构建体并入病毒DNA或RNA分子。此外，应该认识到，本发明的启动子也包括病毒RNA聚合酶转录所用的启动子。将多核苷酸引入植物和在其中表达编码的蛋白的方法，包括病毒DNA或RNA分子，在本领域内是已知的。参阅，例如，美国专利第5,889,191号、美国专利第5,889,190、第5,866,785号、第5,589,367号、第5,316,931号和Porta et al.(1996)MolecularBiotechnology 5：209-221；在此通过引用并入。
[0116] 在植物基因组的特定位置上靶向插入多核苷酸的方法，在本领域内是熟知的。在一个实施方案中，在希望的基因组位置插入多核苷酸使用位点特异性重组系统完成。参阅，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，以上均在此通过引用并入。简而言之，本发明的多核苷酸可以包含在侧翼为两个非重组发生的重组位点的转移盒内。将转移盒引入植物中，该植物具有稳定并入其基因组的靶位点，该靶位点的侧翼为对应于转移盒的位点的两个非重组发生的重组位点。提供了合适的重组酶，且转移盒在靶位点上整合。由此目的多核苷酸被整合到植物基因组中的特定染色体位置。
[0117] 可以根据常规方式使转化后的细胞可生长成植物。参阅，例如，McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。这些植物可以被种植，并且用相同的转化品系或不同品系授粉，从而得到的后代具有组成型表达的确定的所需的表型特征。可以种植两代或更多代，以确保所需的表型特征的表达稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需的表型特征已实现。如此，本发明提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，该种子具有稳定并入其基因组的本发明的多核苷酸，例如，本发明的表达盒。
[0118] 本文所用的术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈合组织、植物丛(plant clump)和在植物或植物部分中完好的植物细胞，所述植物部分如胚、花粉、胚珠、种子、叶片、花、枝条、果实、果仁、穗、穗轴、外皮、茎、根、根尖、花药等。谷类意图表示商业种植者除了种植和繁殖物种以外的的目的所生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包含引入的多核苷酸。
[0119] 本发明可以用于任何植物物种的转化，包括单子叶植物和双子叶植物，但并不局限于此。目的植物物种的实例包括但不限于，玉米(Zeamays)、芸苔(Brassica sp，例如油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))特别是那些用作种子油来源的芸苔、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghum vulgare)、稷(例如珍珠稷(Pennisetum
glaucum)、黍(prosomillet)(Panicum miliaceum)、狐尾稷(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉
(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属种类(Coffea spp.))、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(柑橘属种类(Citrus spp.))、可可豆(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(芭蕉属种类(Musa spp.))、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属种类(Saccharumspp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
glaucum)、黍(prosomillet)(Panicum miliaceum)、狐尾稷(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉
(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属种类(Coffea spp.))、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(柑橘属种类(Citrus spp.))、可可豆(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(芭蕉属种类(Musa spp.))、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属种类(Saccharumspp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
[0120] 蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如莴苣(Lactucasativa))、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)成员例如黄瓜(C.sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)、和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃属种类(Rhododendron spp.))、八仙花(Macrophylla
hydrangea)、芙蓉(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(蔷薇属种类(Rosa spp.))、郁金香
(郁金香属(Tulipaspp.)、水仙花(水仙属种类(Narcissus spp.))、矮牵牛花(Petunia
hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、猩猩木(Euphorbia pulcherrima)以及菊花。
hydrangea)、芙蓉(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(蔷薇属种类(Rosa spp.))、郁金香
(郁金香属(Tulipaspp.)、水仙花(水仙属种类(Narcissus spp.))、矮牵牛花(Petunia
hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、猩猩木(Euphorbia pulcherrima)以及菊花。
[0121] 可以用于实践本发明的针叶树包括，例如，松树例如火炬松(Pinustaeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；加拿大铁杉(Tsuga canadensis)；
西加云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；冷杉例如银冷杉(Abies
amabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；和雪松例如北美乔柏(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparisnootkatensis)。在具体实施方案中，本发明的植物为农作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、大麦、稷、烟草等)。在其他实施方案中，玉米和大豆植物是最优的，仍然在其他实施方案中，玉米植物是最优的。
西加云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；冷杉例如银冷杉(Abies
amabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；和雪松例如北美乔柏(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparisnootkatensis)。在具体实施方案中，本发明的植物为农作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、大麦、稷、烟草等)。在其他实施方案中，玉米和大豆植物是最优的，仍然在其他实施方案中，玉米植物是最优的。
[0122] 其他目的的植物包括提供目的的种子的谷类植物，含油种子植物和豆科植物。目的的种子包括谷类种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。含油种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆和豌豆。豆包括瓜尔豆、槐豆(locust bean)、胡芦巴、大豆、青刀豆(garden beans)、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
[0123] VIII.使用方法
[0124] 本发明的方法包括控制害虫(即草盲蝽属害虫，例如，豆荚草盲蝽)的方法，所述方法包括给害虫喂食包含本发明沉默元件的组合物，其中，当被害虫(即草盲蝽属害虫，例如，豆荚草盲蝽)摄食后，所述沉默元件降低害虫靶多核苷酸的水平，因此控制害虫。可以通过多种方法喂食害虫沉默元件。例如，在一个实施方案中，将包含沉默元件的多核苷酸引入植物。当草盲蝽进食表达这些序列的植物或其部分时，沉默元件被送递到害虫。当沉默元件以此方式送递给植物时，应当认识到，该沉默元件可以组成型表达，或可选地，它可以通过使用各种诱导型、组织优选或发育调节性启动子以阶段特异性的方式产生，上述启动子在本文其他部分讨论。例如，沉默元件表达在例如叶片、茎、花等气生植物组织。在其他实施方案中，沉默元件表达在根部。在这些实施方案中，可以靶向半翅目，例如葡萄根瘤蚜。
[0125] 在另一个方法中，将包含本发明的至少一种沉默元件的组合物应用于植物。在这些实施方案中，沉默元件可以被配制在适合农艺学的和/或环境可接受的载体中，所述载体优先适合在田地中分散。此外，载体也可以包括能增加组合物半寿期的化合物。在具体实施方案中，包含沉默元件的组合物如此配制，即其在环境中持续的时间长度足以允许它被送递到害虫。在此类实施方案中，组合物可以被应用到害虫栖息的区域。在一个实施方案中，组合物被应用到植物外部(即通过农田喷雾)来保护植物免受害虫的危害。
[0126] 在某些实施方案中，为了产生具有所需的性状的植物，本发明的构建体可以与目的多核苷酸序列的任意组合叠加。本文使用的性状，是指来自一个特定序列或序列组的表型。例如，本发明的多核苷酸可以与编码具有杀害虫和/或杀昆虫活性多肽的多核苷酸的任何其他多核苷酸叠加，例如其他苏云金芽孢杆菌毒蛋白(描述于美国专利第5,366,892号、第5,747,450号、第5,737,514号、第5,723,756号、第5,593,881号 和Geiseret
al.(1986)Gene 48：109中)、凝集素(Van Damme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24：825，pentin(描述于美国专利第5,981,722号中)等。所产生的组合可以包括任一目的多核
苷酸的多重拷贝。本发明的多核苷酸也可以与任何其他基因或基因组合叠加，来产生具有很多所需的性状组合的植物，所需的性状组合包括但不限于，动物饲料的理想性状，例如高油基因(例如美国专利第6,232,529号)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专
利第5,990,389号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,703,409号)；大麦高赖氨酸
(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO98/20122)和高甲硫氨酸蛋
白(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara et al.(1988)Gene 71：359和Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增强的消化性(例如修饰的贮藏蛋白(美国申请序列第10/053,410号，2001年11月7日提交)和硫氧还蛋白(美国申请序
列第10/005,429号，2001年12月3日提交))；以上公开在此通过引用并入。
al.(1986)Gene 48：109中)、凝集素(Van Damme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24：825，pentin(描述于美国专利第5,981,722号中)等。所产生的组合可以包括任一目的多核
苷酸的多重拷贝。本发明的多核苷酸也可以与任何其他基因或基因组合叠加，来产生具有很多所需的性状组合的植物，所需的性状组合包括但不限于，动物饲料的理想性状，例如高油基因(例如美国专利第6,232,529号)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专
利第5,990,389号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,703,409号)；大麦高赖氨酸
(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO98/20122)和高甲硫氨酸蛋
白(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara et al.(1988)Gene 71：359和Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增强的消化性(例如修饰的贮藏蛋白(美国申请序列第10/053,410号，2001年11月7日提交)和硫氧还蛋白(美国申请序
列第10/005,429号，2001年12月3日提交))；以上公开在此通过引用并入。
[0127] 本发明的多核苷酸还可以与以下叠加：抗病性或除草剂抗性所需的性状(例如伏马毒素解毒基因(美国专利第5,792,931号)；无毒性和抗病性基因(Jones et al.(1994)Science 266：789；Martin et al.(1993)Science262：1432；Mindrinos et al.(1994)Cell
78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变；谷氨酰
胺合酶的抑制剂例如草胺磷或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；和
加工或工艺产品所需的性状，例如高油(例如美国专利第6,232,529号)；改良的油(例
如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利第5,952,544号；WO 94/11516))；改良的淀粉(例如
ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；和
多聚体或生物塑料(例如美国专利第5,602,321号；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和
乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟
基脂肪酸酯的表达(PHAs))；以上公布在此通过引用并入。也可以将本发明的多核苷酸与提供农艺学性状的多核苷酸组合，所述农艺学性状例如雄性不育(例如，参阅美国专利第
5.583,210号)、茎强度、开花时间或转化技术性状，例如细胞周期调节或基因打靶(例如WO
99/61619、WO 00/17364和WO99/25821)；以上公开在此通过引用并入。
78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变；谷氨酰
胺合酶的抑制剂例如草胺磷或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；和
加工或工艺产品所需的性状，例如高油(例如美国专利第6,232,529号)；改良的油(例
如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利第5,952,544号；WO 94/11516))；改良的淀粉(例如
ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；和
多聚体或生物塑料(例如美国专利第5,602,321号；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和
乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟
基脂肪酸酯的表达(PHAs))；以上公布在此通过引用并入。也可以将本发明的多核苷酸与提供农艺学性状的多核苷酸组合，所述农艺学性状例如雄性不育(例如，参阅美国专利第
5.583,210号)、茎强度、开花时间或转化技术性状，例如细胞周期调节或基因打靶(例如WO
99/61619、WO 00/17364和WO99/25821)；以上公开在此通过引用并入。
[0128] 这些叠加的组合可以通过任何方法产生，包括但不限于通过任何常规或TopCross(顶交)方法学对植物进行杂交育种，或基因转化。如果序列通过基因转化植物来叠加，那么目的多核苷酸序列可以在任何时间、以任何顺序进行组合。例如，包含一个或多个所需的性状的转基因植物可以作为靶标，通过随后转化引入其他性状。在共转化的方案中，性状可以用转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸同时引入。例如，如果要引入两个序列，那么这两个序列可以包含在不同的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)
中。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能希望引入可以抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以通过与其他抑制盒或超表达盒的任意组合进行组合来在植物中产生所需的性状的组合。还应当认识到，多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统在希望的染色体位置叠加。参阅，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，以上在此通过引用并入。
中。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能希望引入可以抑制目的多核苷酸表达的转化盒。这可以通过与其他抑制盒或超表达盒的任意组合进行组合来在植物中产生所需的性状的组合。还应当认识到，多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统在希望的染色体位置叠加。参阅，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，以上在此通过引用并入。
[0129] 还提供了允许增加沉默元件所产生的RNAi的方法和组合物。在这些实施方案中，该方法和组合物使用包含靶害虫序列的沉默元件的第一多核苷酸，所述沉默元件可操作地连接于在植物细胞中有活性的启动子；和包含抑制增强元件的第二多核苷酸，所述抑制增强元件包含靶害虫序列或者其活性变体或片段，并可操作地连接于在植物细胞中有活性的启动子。与只有沉默元件单独表达所达到的相比，沉默元件和抑制增强元件的联合表达导致了沉默元件所产生的抑制性RNA的扩增增强。除了增加具体RNAi种类自身的扩增以外，该方法和组合物还允许能增强干扰靶基因表达效率的RNAi种类的不同群体的产生。正如，当抑制增强元件在植物细胞中与沉默元件联合表达时，该方法和组合物允许在整个植物内系统地产生RNAi；与只有沉默元件构建体相比，可以观察到更大量的RNAi的产生；和改善RNAi进入植物韧皮部的载入，因此，通过RNAi途径，对以韧皮部为食的昆虫，提供更好的控制。因此，提供的各种方法和组合物改善了将抑制性RNA送递到靶生物的方法。参阅，例如，2008年1月17日提交的美国临时申请第61/021,676号，名称″Compositions
andMethods for the Suppression of Target Polynucleotides(抑制靶多核苷酸的组合物和方法)″，在此通过引用整体地并入。
andMethods for the Suppression of Target Polynucleotides(抑制靶多核苷酸的组合物和方法)″，在此通过引用整体地并入。
[0130] 本文所用的“抑制增强元件”包含多核苷酸，该多核苷酸包含待抑制的靶序列或者其活性片段或变体。应当认识到，抑制增强元件不需要与靶序列相同，相反地，抑制增强元件可以包含靶序列的变体，只要抑制增强元件与靶序列具有足够的序列同一性，从而允许与只有沉默元件的表达所达到的相比，沉默元件所产生的RNAi的水平增加。相似地，抑制增强元件可以包含靶序列的片段，其中该片段具有足够长度，从而允许与只有沉默元件的表达所达到的相比，沉默元件所产生的RNAi的水平增加。因此，在具体实施方案中，抑制增强元件包含可以编码以下的多核苷酸的片段或变体：钾通道多肽、表皮多肽、内表皮多肽、壳多糖结合多肽、壳多糖酶多肽、激素诱导性多肽、翻译起始因子、电压依赖性通道、EIF相关多肽、具有卷曲螺旋型螺旋结构域的多肽、具有锌指结构域的多肽、受体相关指多肽、致死性易受惊成虫盘多肽、核糖核蛋白、组织蛋白酶多肽、多聚蛋白畸形破坏蛋白和死亡相关亮氨酸富集多肽的靶多核苷酸。仍然在其他实施方案中，抑制增强元件包含SEQ ID NO：1-42所示的多核苷酸或者其活性变体或片段。
[0131] 应当认识到，可以使用来自相同靶序列或不同靶序列或相同靶序列的不同区域的多重抑制增强元件。例如，所用的抑制增强元件可以包含来自靶序列的不同区域(即3’非编码区、编码区、内含子和/或5’非编码区)的靶序列片段。此外，抑制增强元件可以如本文其他部分所述包含在表达盒内，在具体实施方案中，抑制增强元件是在相同或不同的DNA载体或构建体上作为沉默元件。抑制增强元件可以可操作地连接于本文公开的启动子。应当意识到，抑制增强元件可以组成型表达，或可选地，它可以通过使用各种诱导型、组织优选或发育调节性启动子，以阶段特异性的方式产生，上述启动子在本文其他部分做了讨论。
[0132] 在具体实施方案中，使用沉默元件和抑制增强元件两者时，RNAi的系统性产生发生在整个植物中。在其他实施方案中，与只有沉默元件构建体单独表达所观察到的相比，本发明的植物或植物部分改善RNAi进入植物韧皮部的载入，因此，通过RNAi途径，对以韧皮部为食的昆虫，提供更好的控制。在具体实施方案中，本发明的植物、植物部分和植物细胞的特征还可以是，允许能增强干扰靶基因表达效果的多样性的RNAi种类的产生。
[0133] 在具体实施方案中，与只有沉默元件单独表达时所达到的相比，沉默元件和抑制增强元件的联合表达增加了植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部的抑制性RNA的浓度。
[0134] 本文使用的“抑制性RNA水平增加(increased level of inhibitoryRNA)”包括，与与合适的对照植物相比，在具有联合表达的植物中所产生的RNAi的水平统计学上显著增加。例如，植物、植物部分或植物细胞中RNAi水平增加包括，与合适的对照相比，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平增加至少约1％、约1％-5％、约5％-10％、约10％-20％、约20％-30％、约30％-40％、约40％-50％、约50％-60％、约60-70％、约
70％-80％、约80％-90％、约90％-100％或更高。在其他实施方案中，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平增加包括，与合适的对照相比，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平增加至少约1倍、约1倍-5倍、约5倍-10倍、约10倍-20倍、约20倍-30
倍、约30倍-40倍、约40倍-50倍、约50倍-60倍、约60倍-70倍、约70倍-80倍、约80
倍-90倍、约90倍-100倍或更高。测定RNAi水平增加的方法在本文其他部分进行了讨论。
70％-80％、约80％-90％、约90％-100％或更高。在其他实施方案中，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平增加包括，与合适的对照相比，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平增加至少约1倍、约1倍-5倍、约5倍-10倍、约10倍-20倍、约20倍-30
倍、约30倍-40倍、约40倍-50倍、约50倍-60倍、约60倍-70倍、约70倍-80倍、约80
倍-90倍、约90倍-100倍或更高。测定RNAi水平增加的方法在本文其他部分进行了讨论。
[0135] 以举例说明而非限制的方式，提供下列实施例。实施例
[0136] 实施例1.特异性靶基因和导致对豆荚草盲蝽的杀虫活性的沉默元件
[0137] 通过RNAi干扰昆虫基因功能可以产生针对于靶昆虫的特异性活性。通过经由转基因植物送递dsRNA，该特异性得到增强。通过RNAi进行昆虫内基因功能的确定，很大程度上受到dsRNA注射的限制。事实上，过去的实验已经表明，在dsRNAs暴露的基础上，昆虫不能够产生系统性RNAi应答。
[0138] 正如下文描述，我们通过注射实验证实了很多dsRNA对的急性活性，此外通过dsRNAs摄食证实了昆虫拮抗作用。该证据鉴别出几个具有明确杀虫性质的基因/引物对组合。在转基因植物中dsRNAs的使用也指明了异源性蛋白表达的潜在并发症和过敏反应、非靶向活性、环境累积和生物累积的可能风险。下文展示的数据表示在整个生物内干扰这些具体基因导致杀虫活性的第一次测试，和dsRNAs针对豆荚草盲蝽的杀虫活性的第一次报
道。
道。
[0139] 本发明描述了具体的靶基因和dsRNA序列，该dsRNA序列通过对靶基因表达进行RNA干扰产生针对半翅类豆荚草盲蝽的杀虫活性。对dsRNA序列所靶向的基因进行干扰，可以在很多物种中具有广泛的杀虫活性。具体的dsRNA序列通过摄食展示杀虫活性，表明它们可以与转基因植物送递模型一起使用。表1提供了来自豆荚草盲蝽的每个靶序列的多核苷酸、靶序列编码的蛋白功能的简要描述和SEQ ID NO。表2提供了来自豆荚草盲蝽的每个靶序列的blastx和blastn序列同源性结果的总结。表3提供了用于抑制靶多核苷酸的引
物的总结。
物的总结。
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149] 表2.靶核苷酸的同源性总结
[0150] 草盲蝽属靶序列：同源性
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158]
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0165] 表3.最佳Blast片段(Top Blast Hit)总结
[0166] sid 数据库 登录号 得分
[0167] ilh1c.pk005.o10.f gb AAL28614.1 498
[0168] ilh1c.pk004.e6.f gb EAA04403.2 161
[0169] ilh1c.pk001.e23.f gb EAA04403.2 160
[0170] ilh1c.pk010.f11.f sp Q7M4F2 359
[0171] ilh1c.pk011.m15.f sp P83995 300
[0172] ilh1c.pk005.d21.f gb AAN62848.1 104
[0173] ilh1c.pk011.f4.f gb EAA06494.2 559
[0174] ilh1c.pk004.a13.f gb AAT09370.1 634
[0175] ilh1c.pk004.i18.f gb AAT09370.1 648
[0176] ilh1c.pk004.l22.f gb EAA03540.3 275
[0177] ilh1c.pk005.k23.f gb AAT09370.1 377
[0178] ilh1c.pk010.g16.f gb EAA08488.2 148
[0179] ilh1c.pk002.d16.f dbj BAA22791.1 567
[0180] ilh1c.pk001.f1.f dbj BAA22791.1 321
[0181] ilh1c.pk005.f15.f gb AAB72001.1 245
[0182] ilh1c.pk003.d10.f emb CAF92618.1 196
[0183] ilh1c.pk010.d2.f gb AAF56796.2 188
[0184] ilh1c.pk010.d2.f gb AAM50998.1 188
[0185] ilh1c.pk011.g22.f ref XP_625027.1 437
[0186] ilh1c.pk011.h12.f gb AAT01080.1 744
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[0191] ilh1c.pk001.m15.f gb AAV31410.1 583
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[0193] ilh1c.pk001.n23.f ref XP_790997.1 235
[0194] ilh1c.pk001.n6.f gb AAD09820.1 384
[0195] ilh1c.pk001.o17.f gb AAL90146.1 758
[0196] ilh1c.pk001.o17.f gb AAX52682.1 758
[0197] ilh1c.pk001.o4.f gb EAA04597.2 302
[0198] ilh1c.pk001.o4.f gb EAL32669.1 302
[0199] ilh1c.pk002.a11.f gb EAA05241.2 189
[0200] ilh1c.pk002.a24.f gb AAT01080.1 436
[0201] ilh1c.pk002.b12.f gb EAA01140.2 269
[0202] ilh1c.pk003.n7.f ref NP_788640.1 760
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[0204] ilh1c.pk004.c13.f gb EAL33114.1 538
[0205] ilh1c.pk004.i5.f ref XP_392968.2 323
[0206] ilh1c.pk001.d8.f gb EAA12913.3 565
[0207] ilh1c.pk001.e10.f ref NP_001007306.1 255
[0208] ilh1c.pk001.i10.f ref XP_635611.1 284
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[0211] ilh1c.pk004.a13.f gb AAT09370.1 634
[0212] ilh1c.pk001.b20.f gb AAF54512.1 741
[0213] ilh1c.pk004.i18.f gb AAT09370.1 648
[0214] ilh1c.pk004.o2.f gb AAC41580.1 502
[0215] ilh1c.pk004.o2.f ref XP_854245.1 502
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[0217] ilh1c.pk005.m3.f sp P55277 706
[0218] ilh1c.pk002.o3.f ref XP_392848.2 561
[0219] ilh1c.pk003.h22.f ref XP_393899.1 331
[0220] ilh1c.pk003.i6.f gb AAI08879.1 238
[0221] ilh1c.pk004.a13.f gb AAT09370.1 634
[0222] ilh1c.pk003.g17.f gb EAA14743.2 158
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[0229] ilh1c.pk007.p11.f gb ABA54998.1 231
[0230] ilh1c.pk003.d10.f emb CAF92618.1 196
[0231] ilh1c.pk002.d16.f dbj BAA22791.1 567
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[0234] ilh1c.pk002.j6.f ref NP_938017.1 120
[0235] ilh1c.pk002.k17.f gb EAA01750.2 528
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[0237] ilh1c.pk002.k5.f dbj BAD97072.1 239
[0238] ilh1c.pk002.k5.f dbj BAE01389.1 239
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[0241] ilh1c.pk002.k5.f ref NP_059122.2 239
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[0244] ilh1c.pk003.d10.f emb CAF92618.1 196
[0245] ilh1c.pk003.d17.f gb EAA06794.2 348
[0246] ilh1c.pk003.h22.f ref XP_393899.1 331
[0247] ilh1c.pk003.j5.f gb AAK31586.1 153
[0248] ilh1c.pk003.j7.f gb AAY51599.1 268
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[0250] ilh1c.pk003.l11.f emb CAG31191.1 245
[0251] ilh1c.pk003.l18.f ref NP_066289.2 321
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[0259] ilh1c.pk004.g2.f ref XP_531704.2 94
[0260] ilh1c.pk004.k13.f gb AAY45870.1 381
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[0264] ilh1c.pk005.i1.f gb EAL32477.1 120
[0265] ilh1c.pk005.i10.f pir UDBO 105
[0266] ilh1c.pk005.i10.f ref NP_776454.1 105
[0267] ilh1c.pk005.i12.f gb EAA03479.2 394
[0268] ilh1c.pk005.i15.f gb AAG31619.1 827
[0269] ilh1c.pk005.i16.f ref XP_395584.2 731
[0270] ilh1c.pk005.m3.f emb CAA46187.1 706
[0271] ilh1c.pk005.m3.f sp P55277 706
[0272] ilh1c.pk005.o17.f gb AAQ83887.1 461
[0273] ilh1c.pk006.c6.f gb EAA06671.2 201
[0274] ilh1c.pk006.f2.f emb CAF96101.1 180
[0275] ilh1c.pk007.a8.f gb EAL28755.1 343
[0276] ilh1c.pk007.b21.f ref XP_422806.1 140
[0277] ilh1c.pk007.g16.f ref YP_102734.1 129
[0278] ilh1c.pk007.j24.f gb AAB72001.1 168
[0279] ilh1c.pk007.o17.f ref NP_001015958.1 118
[0280] ilh1c.pk007.o17.f ref NP_001030215.1 118
[0281] ilh1c.pk007.p11.f gb ABA54998.1 231
[0282] ilh1c.pk007.p13.f dbj BAA91976.1 337
[0283] ilh1c.pk008.c24.f ref XP_624438.1 804
[0284] ilh1c.pk008.f16.f sp P04069 273
[0285] ilh1c.pk008.h14.f ref XP_391971.1 401
[0286] ilh1c.pk008.j3.f ref XP_397432.2 305
[0287] ilh1c.pk008.k6.f gb AAH85379.1 222
[0288] ilh1c.pk009.d7.f ref XP_392724.2 1062
[0289] ilh1c.pk009.d7.f ref XP_623058.1 1062
[0290] ilh1c.pk009.f20.f ref XP_394628.2 332
[0291] ilh1c.pk010.f11.f sp Q7M4F2 359
[0292] ilh1c.pk010.i24.f ref XP_397432.2 190
[0293] ilh1c.pk010.m17.f gb EAA12371.3 392
[0294] ilh1c.pk010.n4.f ref XP_624607.1 423
[0295] ilh1c.pk011.a8.f gb AAp49008.1 433
[0296] ilh1c.pk011.a8.f gb AAP49283.1 433
[0297] ilh1c.pk011.d10.f ref XP_623853.1 358
[0298] ilh1c.pk011.e16.f ref XP_393244.1 522
[0299] ilh1c.pk009.d7.f ref XP_392724.2 1062
[0300] ilh1c.pk009.d7.f ref XP_623058.1 1062
[0301] ilh1c.pk003.d10.f emb CAF92618.1 196
[0302] ilh1c.pk003.f22.f emb CAF92109.1 360
[0303] ilh1c.pk004.e16.f ref XP_397356.2 317
[0304] ilh1c.pk004.m22.f ref XP_541817.2 200
[0305] ilh1c.pk004.m22.f ref XP_848286.1 200
[0306] ilh1c.pk005.l24.f gb AAN71350.1 427
[0307] ilh1c.pk005.l24.f ref NP_733291.1 427
[0308] ilh1c.pk006.c15.f gb EAL38766.1 400
[0309] ilh1c.pk001.f20.f gb AAB71256.1 392
[0310] ilh1c.pk006.c6.f gb EAA06671.2 201
[0311] ilh1c.pk001.h3.f dbj BAA86911.1 967
[0312] ilh1c.pk007.c6.f ref XP_507719.1 126
[0313] ilh1c.pk007.m5.f ref XP_342400.2 234
[0314] ilh1c.pk008.c24.f ref XP_62443 8.1 804
[0315] ilh1c.pk008.d5.f ref XP_422297.1 244
[0316] ilh1c.pk008.f17.f gb AAT48984.1 386
[0317] ilh1c.pk008.g3.f emb CAG00772.1 267
[0318] ilh1c.pk008.g3.f ref XP_786904.1 267
[0319] ilh1c.pk002.o12.f gb AAL93243.1 142
[0320] ilh1c.pk003.d10.f emb CAF92618.1 196
[0321] ilh1c.pk004.o2.f gb AAC41580.1 502
[0322] ilh1c.pk004.o2.f ref XP_854245.1 502
[0323]
[0324]
[0325]
[0326] 实施例2.豆荚草盲蝽测定方法学
[0327] 豆荚草盲蝽的包装卵(egg pack)从密苏里大学(University of Missouri)得到，放置在 AD-1(AG含氟聚合物)处理过的容器中，该容器放在18℃的培养箱中，
RH(相对湿度)约40-60％，避光。卵通常6天后孵化，然后转移到25℃的培养箱中，RH
为约40-60％，22小时白天：2小时夜晚。喂食新生幼虫在石蜡封口膜包装中的人工饲料
(Bio-Serv F9644B)。1日龄的2龄期若虫用于生物测定。
RH(相对湿度)约40-60％，避光。卵通常6天后孵化，然后转移到25℃的培养箱中，RH
为约40-60％，22小时白天：2小时夜晚。喂食新生幼虫在石蜡封口膜包装中的人工饲料
(Bio-Serv F9644B)。1日龄的2龄期若虫用于生物测定。
[0328] 液体样品(20μl)分散到96孔微量滴定板中(Falcon Assay Plate353910)，与75μl人工饲料混合(Bio-Serv F9644B)。对每个样品而言，测定通常包括4-5次观察。然后，板子用轻微拉伸的石蜡封口膜覆盖。将若干(3-8只)1日龄的2龄期若虫放置在96孔
滤板的每个孔内(MilliporeMABVN1250)。饲料/样品板翻转放在寄生若虫的滤板顶部，这样孔能够对齐，从而使若虫能通过石蜡封口膜进食饲料/样品混合物。滤板和饲料板用橡皮圈压在一起。将板子放在25℃的培养箱中，RH约40-60％，避光，4天后对该测定评分。
对每孔单独评分，根据以下系统给出0、1或2的等级。
滤板的每个孔内(MilliporeMABVN1250)。饲料/样品板翻转放在寄生若虫的滤板顶部，这样孔能够对齐，从而使若虫能通过石蜡封口膜进食饲料/样品混合物。滤板和饲料板用橡皮圈压在一起。将板子放在25℃的培养箱中，RH约40-60％，避光，4天后对该测定评分。
对每孔单独评分，根据以下系统给出0、1或2的等级。
[0329] 0＝正常发育-蜕皮成3龄期若虫
[0330] 1＝受阻碍生长-与1日龄的2龄期若虫尺寸相同或稍大
[0331] 2＝死亡
[0332] 评分根据孔中受影响最小的若虫。例如，如果除了一只以外所有的若虫都死亡，且该若虫生长受阻，那么该孔的评分为1。如果4只若虫发育受阻且2只正常，那么该孔的评分为0。使用相同样品和剂量进行了一些重复。将所有观察的孔的值加在一起，使用以下公式计算百分比效果。
[0333]
[0334] 其中，N是对于该样品和剂量所进行的观察的数值。
[0335] 使用百分比效果值和相应剂量，可以通过概率值分析法程序(probitanalysisprogram，LdP Line)计算半效浓度(Effective Concentration(EC)50)。
[0336] 结果：
[0337] 以 以下 浓 度：35、17.5、8.25 和4.125ppm，测试 62个 合成 的 dsRNA样 品(Sigm-Genosys，The Woodlands，TX)。在测试的样品中，47个样品无活性，与此同时15个样品展现出不同级别的活性，包括发育迟缓和死亡(在表5中高亮显示)。
[0338]
[0339]
[0340] 表6.
[0341]
[0342]
[0343] 用14个活性最高的样品进行确认测试。活性得到确认。参阅表7。
[0344] 表7
[0345]
[0346] 新样品由7个活性最高的样品制得。这些脱盐的或来自同一供货商(Sigma-Genosys，the Woodlands，TX)的HPLC(高效液相色谱)纯化的dsRNAs。所测试的
样品为5C、5D、5E、5F、5G、5H和6A。其中只有一个样品，5C，在所测试的剂量下显示出活性，且只有较小的发育迟缓是明显的。参阅表8，同样，脱盐的引物也具有有限的活性。
样品为5C、5D、5E、5F、5G、5H和6A。其中只有一个样品，5C，在所测试的剂量下显示出活性，且只有较小的发育迟缓是明显的。参阅表8，同样，脱盐的引物也具有有限的活性。
[0347] 表8
[0348]
[0349] 无死亡率，在35ppm时仅较小的发育迟缓
[0350] 在更高浓度(70ppm)下再次测试样品，发现样品5C是唯一具有活性的样品。参阅表9。死亡在最高两个剂量(35和70ppm)时出现。
[0351] 表9
[0352]
[0353] 再次增加HPLC纯化样品的剂量，所有测试样品活性变得明显。死亡和发育迟缓在最高的三个剂量时出现。参阅表10。
[0354] 表10
[0355]
[0356] 实施例3.玉米的转化
[0357] 来自温室供体植物的未成熟的玉米胚用含有本发明沉默元件的质粒轰击，所述沉默元件可操作地连接于玉米Ubi1-5UTR-Ubi1内含子和能赋予除草剂双丙氨膦抗性的选择标记基因PAT(Wohlleben et al.(1988)Gene70：25-37)。在一个实施方案中，构建体在相反方向上具有靶基因的2个相同的2-300bp的节段，两节段中间有作为发夹环的“内含子”节段。在另外的实施方案中，该构建体可以由dMMV启动子上驱动。可选地，将选择标记基因提供于单个质粒上。转化按照以下进行，培养基配方在以下内容之后。
[0358] 靶组织的制备
[0359] 玉米穗去皮，在30％Clorox漂白剂外加0.5％微去垢剂中表面灭菌20分钟，然后用灭菌水漂洗2次。切除未成熟的胚，胚轴一侧向下放置(盾片一侧向上)，每个平板25个胚，在560Y培养基中4小时，然后在25cm的靶区域内排列好，为轰击做准备。
[0360] 制备包含目的沉默元件的质粒载体，所述沉默元件可操作地连接于玉米Ubi1-5UTR-Ubi1内含子。该质粒DNA加上含有PAT选择标记的质粒DNA通过使用CaCl2沉
淀法沉淀到1.1μM(平均直径)的钨珠上，CaCl2沉淀步骤如下：100μl制备的钨颗粒水
液；10μl(1μg)Tris EDTA缓冲液中的DNA(1μg总DNA)；100μl的2.5M CaCl2和10μl
的0.1M亚精胺。
淀法沉淀到1.1μM(平均直径)的钨珠上，CaCl2沉淀步骤如下：100μl制备的钨颗粒水
液；10μl(1μg)Tris EDTA缓冲液中的DNA(1μg总DNA)；100μl的2.5M CaCl2和10μl
的0.1M亚精胺。
[0361] 将每种试剂依次添加到钨颗粒悬液中，同时保持在多管漩涡器上。将最终混合物进行简单的超声波处理，允许在持续涡旋下孵育10分钟。沉淀期后，将管子简单离心，移除液体，用500ml 100％的乙醇洗涤，离心30秒。再次移除液体，向最终的钨颗粒沉淀中添加105μl 100％的乙醇。对于粒子枪轰击，将钨/DNA颗粒进行简单的超声波处理，取10μl点在每个大载体(macrocarrier)的中央，轰击前允许干燥2分钟。
[0362] 在粒子枪中，对样品平板进行4级轰击。所有的样品受到一次650PSI的轰击，总共10份取自每个制备的颗粒/DNA的管子的等分试样。
[0363] 轰击后，将胚在560Y培养基中保持2天，然后转移到含有3mg/l的双丙氨膦的560R选择培养基中，每2周进行传代培养。大约选择10周后，将选择抗性愈合组织克隆转移到288J培养基，开始植物再生。体细胞胚成熟后(2-4周)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中发芽，并转移到光照培养室。大约7-10天后，将发育的小植物转移到管子内272V无激素培养基7-10天，直到小植物苗彻底移植生长。然后将植物转移到含有盆栽土的浅箱(相当于2.5″罐)中的插入物，在生长室中生长1星期，后续在温室中再生长1-2星期，然后转移到classic 600罐中(1.6加仑)，生长至成熟。监控植物并对合适的标记进行评分。
[0364] 轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基本盐(basal salt，SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson′s维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调节到pH5.8后用D-I H2O补足体积)；2.0g/
l固化剂(Gelrite)(用D-I H2O补足体积后加入)；和8.5mg/l硝酸银(培养基灭菌并冷
却至室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基本盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/
l Eriksson′s维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖和
2.0mg/l 2，4-D(用KOH调节到pH5.8后用D-I H2O补足体积)；3.0g/l固化剂(用D-I H2O
补足体积后加入)；0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨膦(两者均是培养基灭菌并冷却至
室温后加入)。
l固化剂(Gelrite)(用D-I H2O补足体积后加入)；和8.5mg/l硝酸银(培养基灭菌并冷
却至室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基本盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/
l Eriksson′s维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖和
2.0mg/l 2，4-D(用KOH调节到pH5.8后用D-I H2O补足体积)；3.0g/l固化剂(用D-I H2O
补足体积后加入)；0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨膦(两者均是培养基灭菌并冷却至
室温后加入)。
[0365] 植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/lMS维生素储备液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用
精制的D-I H2O补足体积)(Murashige and Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(调节到pH5.6后用精制
的D-I H2O补足体积)；3.0g/l固化剂(用D-I H2O补足体积后加入)；和1.0mg/l吲哚乙
酸和3.0mg/l双丙氨膦(培养基灭菌并冷却至60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含
4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l维生素储备液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸(用精制的D-I H2O补足体积)、0.1g/l肌醇和
40.0g/l蔗糖(调节到pH5.6后用精制的D-I H2O补足体积)；和6g/l细菌琼脂粉(用精
制的D-I H2O补足体积)，灭菌并冷却至60℃。
精制的D-I H2O补足体积)(Murashige and Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(调节到pH5.6后用精制
的D-I H2O补足体积)；3.0g/l固化剂(用D-I H2O补足体积后加入)；和1.0mg/l吲哚乙
酸和3.0mg/l双丙氨膦(培养基灭菌并冷却至60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含
4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l维生素储备液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸(用精制的D-I H2O补足体积)、0.1g/l肌醇和
40.0g/l蔗糖(调节到pH5.6后用精制的D-I H2O补足体积)；和6g/l细菌琼脂粉(用精
制的D-I H2O补足体积)，灭菌并冷却至60℃。
[0366] 为测定杀虫活性，可以进行FAW进食测定。简而言之，使用1cm木塞穿孔器或叶打孔器(leaf puncth)，切除来自转基因植物的叶盘。对于每一植物，制备6个叶盘。将叶子置于24孔微量滴定板中，在500ul 0.8％的琼脂上面。每个叶盘上寄生有2只新生的草地贪夜蛾，然后用聚脂薄膜密封平板。为每个孔做一个小通风孔，然后将板子储存在28℃生长室内。在96小时对测定的死亡率、发育障碍和叶片消耗量进行评分。
[0367] 实施例4.农杆菌属介导的玉米的转化
[0368] 对于用本发明的沉默元件进行的农杆菌属介导的玉米的转化，使用Zhao的方法(美国专利第5,981,840号和PCT专利公开WO98/32326，以上内容在此通过引用并入)。简
单地说，从从玉米中分离未成熟的胚，并将胚与农杆菌的悬液接触，其中细菌能将包含沉默元件的多核苷酸转移到至少一个未成熟胚中的至少一个细胞内(步骤1：感染步骤)。在此步骤中，为了开始接种，将未成熟的胚浸泡在农杆菌悬液中。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。感染步骤后，将未成熟胚培养在固体培养基上。共培养期后，考虑可选的“休眠(resting)”步骤。在该休眠步骤中，在存在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素的情况下孵育胚，而无需加入植物转化体的选择剂(步骤3：休眠步骤)。将未成熟胚培养在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上，用于除去农杆菌属和给予感染的细胞休养期。接下来，将接种的胚培养在含有选择剂的培养基上，恢复生长转化的愈合组织(步骤
4：选择步骤)。将未成熟胚培养在含有选择剂的固体培养基上，从而导致转化的细胞的选择性生长。然后将愈合组织再生为植物(步骤5：再生步骤)，将生长在选择培养基上的愈合组织培养在固体培养基上，来再生植物。
单地说，从从玉米中分离未成熟的胚，并将胚与农杆菌的悬液接触，其中细菌能将包含沉默元件的多核苷酸转移到至少一个未成熟胚中的至少一个细胞内(步骤1：感染步骤)。在此步骤中，为了开始接种，将未成熟的胚浸泡在农杆菌悬液中。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。感染步骤后，将未成熟胚培养在固体培养基上。共培养期后，考虑可选的“休眠(resting)”步骤。在该休眠步骤中，在存在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素的情况下孵育胚，而无需加入植物转化体的选择剂(步骤3：休眠步骤)。将未成熟胚培养在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上，用于除去农杆菌属和给予感染的细胞休养期。接下来，将接种的胚培养在含有选择剂的培养基上，恢复生长转化的愈合组织(步骤
4：选择步骤)。将未成熟胚培养在含有选择剂的固体培养基上，从而导致转化的细胞的选择性生长。然后将愈合组织再生为植物(步骤5：再生步骤)，将生长在选择培养基上的愈合组织培养在固体培养基上，来再生植物。
[0369] 实施例5：大豆胚转化
[0370] 培养条件
[0371] 大豆胚发生悬浮培养物(cv.Jack)维持在150rpm的旋转振荡器上的35ml的SB196液体培养基中(参阅下文配方)，26℃，有冷白色荧光、白天/夜晚光周期为16小
2
时∶8小时、光密度为60-85μE/m/s。通过将大约35mg组织接种到35ml新鲜的SB196液
体中，每7天到2周，对培养物进行传代培养(优选的传代培养间隔为每7天)。
2
时∶8小时、光密度为60-85μE/m/s。通过将大约35mg组织接种到35ml新鲜的SB196液
体中，每7天到2周，对培养物进行传代培养(优选的传代培养间隔为每7天)。
[0372] 大豆胚发生悬浮培养物通过粒子枪轰击的方法，用以下实施例中描述的质粒和DNA片段进行转化(Klein et al.(1987)Nature，327：70)。
[0373] 开始大豆胚发生悬浮培养
[0374] 开始大豆培养，每月2次，每次开始之间间隔5-7天。
[0375] 种植后45-55天，从可用大豆植物摘取具有未成熟种子的豆荚，去掉壳，并放在无菌的品红盒(magenta box)内。将大豆种子在带有1滴象牙皂的5％Clorox溶液(Cloroxsolution，95ml高压灭菌蒸馏水加5ml Clorox和1滴肥皂)中摇动15分钟进行灭菌。充
分混合。用2瓶每瓶1L无菌蒸馏水漂洗种子，将小于4mm的种子放在单独的显微镜载玻
片上。切除种子的小的末端，并将子叶从种皮中挤出。将子叶转移到含有SB1培养基的平板中(每平板25-30个子叶)。用纤维带包裹平板并储存8周。这段时间后，切除次生胚
(secondary embryo)，并将其在SB196液体培养基中放置7天。
分混合。用2瓶每瓶1L无菌蒸馏水漂洗种子，将小于4mm的种子放在单独的显微镜载玻
片上。切除种子的小的末端，并将子叶从种皮中挤出。将子叶转移到含有SB1培养基的平板中(每平板25-30个子叶)。用纤维带包裹平板并储存8周。这段时间后，切除次生胚
(secondary embryo)，并将其在SB196液体培养基中放置7天。
[0376] 用于轰击的DNA的制备
[0377] 将含有诸如实施例3所述目的基因的完整质粒或DNA质粒片段和选择标记基因用TM TM
于轰击。用于轰击的质粒DNA使用Promega 实验方案和应用指南(Promega Protocols
and Applications Guide)，第二版(106页)中所述的方法来常规制备和纯化。携带目的
沉默元件的质粒片段通过双消化的质粒的凝胶分离得到。在每一情况下，将100μg的质粒DNA在0.5ml适合目的质粒的特异性酶混合物中消化。所得的DNA片段通过1％SeaPlaque
GTG琼脂糖(BioWhitaker Molecular Applications)凝胶电泳进行分离，并从从琼脂糖凝胶中切除包含目的沉默元件的DNA片段。按照生产商的实验方案，使用GELase消化酶，从琼脂糖中纯化DNA。
于轰击。用于轰击的质粒DNA使用Promega 实验方案和应用指南(Promega Protocols
and Applications Guide)，第二版(106页)中所述的方法来常规制备和纯化。携带目的
沉默元件的质粒片段通过双消化的质粒的凝胶分离得到。在每一情况下，将100μg的质粒DNA在0.5ml适合目的质粒的特异性酶混合物中消化。所得的DNA片段通过1％SeaPlaque
GTG琼脂糖(BioWhitaker Molecular Applications)凝胶电泳进行分离，并从从琼脂糖凝胶中切除包含目的沉默元件的DNA片段。按照生产商的实验方案，使用GELase消化酶，从琼脂糖中纯化DNA。
[0378] 将含有3mg金粒子(3mg的金)的50μl无菌蒸馏水的等分试样加入5μl 1μg/μl的DNA溶液(如上文描述制备的的完整质粒或DNA片段)、50μl的2.5MCaCl2和20μl
的0.1M亚精胺。将混合物在3级漩涡振荡器上振荡3分钟，在台式微量离心机中离心10
秒。用400μl的100％乙醇洗涤后，通过在40μl的100％乙醇中进行超声波处理，混悬颗粒状物。将5μlDNA悬液分配到Biolistic PDS1000/HE仪器盘中的每个飞盘。每一5μl
等分试样每次轰击(即每盘)含有约0.375mg的金。
的0.1M亚精胺。将混合物在3级漩涡振荡器上振荡3分钟，在台式微量离心机中离心10
秒。用400μl的100％乙醇洗涤后，通过在40μl的100％乙醇中进行超声波处理，混悬颗粒状物。将5μlDNA悬液分配到Biolistic PDS1000/HE仪器盘中的每个飞盘。每一5μl
等分试样每次轰击(即每盘)含有约0.375mg的金。
[0379] 组织制备和DNA轰击
[0380] 将约150-200mg 7日龄的胚发生悬浮培养物置于空的无菌的60×15的皮氏培养皿中，并将培养皿用塑料网盖住。在设定为1100PSI的膜破坏压力下，每板组织轰击1或2次，且将小室抽成27-28英寸汞柱的真空。距离保持屏/停止屏大约3.5英寸，放置组织。
[0381] 转化的胚的选择
[0382] 使用潮霉素(当潮霉素磷酸转移酶HPT基因作为选择标记使用时)或氯磺隆(当乙酰乳酸合酶ALS基因作为选择标记使用时)选择转化的胚。
[0383] 潮霉素(HPT)选择
[0384] 轰击后，将组织置于新鲜的SB196培养基中，并如上文描述进行培养。轰击后6天，将SB196培养基替换为含有30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196培养基。每周更新选择培养基。选择后4-6周，可以观察到绿色的转化组织从未转化的、坏死的胚发生簇中生长。分离后，移除绿色组织，并接种于多孔板中，产生成新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。
[0385] 氯磺隆(ALS)选择
[0386] 轰击后，在带有新鲜SB196培养基的2个烧瓶(flask)间分配组织，并如上文描述进行培养。轰击后6或7天，将SB196培养基替换为含有100ng/ml氯磺隆选择剂的新鲜SB196培养基。每周更新选择培养基。选择后4-6周，可以观察到绿色的、转化的组织从未转化的、坏死的胚发生簇中生长。分离后，移除绿色组织，并接种于含有SB196的多孔板中，来产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。
[0387] 大豆体细胞胚再生为植物
[0388] 为了从胚发生悬液培养物获得完整植物，必须再生组织。
[0389] 胚成熟
[0390] 将胚在以下条件下培养4-6周：26℃、SB196培养基中、冷白色荧光(cool white fluorescent，Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F402
Agro)灯泡(40瓦)、光周期为16小时∶8小时、光密度为90-120μE/m/s。这段时间后，
将胚簇(embryo cluster)移除到固体琼脂培养基SB166中，1-2周。然后，将簇传代培养到SB103培养基中，3周。在此期间，可以将单独的胚从簇中移除，筛选合适的标记或植物被草盲蝽属摄食时控制草盲蝽的能力。
Agro)灯泡(40瓦)、光周期为16小时∶8小时、光密度为90-120μE/m/s。这段时间后，
将胚簇(embryo cluster)移除到固体琼脂培养基SB166中，1-2周。然后，将簇传代培养到SB103培养基中，3周。在此期间，可以将单独的胚从簇中移除，筛选合适的标记或植物被草盲蝽属摄食时控制草盲蝽的能力。
[0391] 胚干燥和发芽
[0392] 将成熟的单独的胚置于空的小皮氏培养皿(35×10mm)中大约4-7天，将其干燥。皿用纤维带密封(产生小的潮湿室)。将干燥的胚种植于SB71-4培养基中，让它们在上文
描述的相同培养条件下发芽。将发芽的小植物从发芽培养基中移除，用水彻底漂洗，然后种植于24孔包装盘(pack tray)内的Redi-Earth中，该盘用透明的塑料圆顶覆盖。2周后，
移除圆顶，使植物耐寒一周。如果小植物看起来强健，将它们移植到Redi-Earth的10″罐中，每罐最多3株小植物。10至16周后，收获成熟种子，破碎并进行蛋白分析。
描述的相同培养条件下发芽。将发芽的小植物从发芽培养基中移除，用水彻底漂洗，然后种植于24孔包装盘(pack tray)内的Redi-Earth中，该盘用透明的塑料圆顶覆盖。2周后，
移除圆顶，使植物耐寒一周。如果小植物看起来强健，将它们移植到Redi-Earth的10″罐中，每罐最多3株小植物。10至16周后，收获成熟种子，破碎并进行蛋白分析。
[0393] 培养基配方
[0394] SB-196-FN低盐液体增殖培养基(每升)-
[0395] MS FeEDTA-100×储备液1 10ml
[0396] MS硫酸盐-100×储备液2 10ml
[0397] FN低盐卤化物-100×储备液3 10ml
[0398] FN低盐磷、硼、钼-100×储备液4 10ml
[0399] 维生素B5(1ml/L) 1.0ml
[0400] 2，4-D(终浓度10mg/L) 1.0ml
[0401] KNO3 2.83gm
[0402] (NH4)2SO4 0.463gm
[0403] 天冬酰胺 1.0gm
[0404] 蔗糖(1％) 10gm
[0405] pH 5.8
[0406] FN低盐储备液
[0407] 储备编号 1000ml 500ml
[0408] 1MS Fe EDTA 100×储备液
[0409] Na2EDTA* 3.724g 1.862g
[0410] FeSO4-7H2O 2.784g 1.392g
[0411] *先加入、溶解在暗瓶中，同时搅拌
[0412] 2MS硫酸盐100×储备液
[0413] MgSO4-7H2O 37.0g 18.5g
[0414] MnSO4-H2O 1.69g 0.845g
[0415] ZnSO4-7H2O 0.86g 0.43g
[0416] CuSO4-5H2O 0.0025g 0.00125g
[0417] 3FN低盐卤化物100×储备液
[0418] CaCl2-2H2O 30.0g 15.0g
[0419] KI 0.083g 0.0715g
[0420] CoCl2-6H2O 0.0025g 0.00125g
[0421] 4FN低盐磷、硼、钼100×储备液4
[0422] KH2PO4 18.5g 9.25g
[0423] H3BO3 0.62g 0.31g
[0424] Na2MoO4-2H2O 0.025g 0.0125g
[0425] SB 1固体培养基(每升)包含：1包MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-066)；1ml维生素B51000×储备液；31.5g蔗糖；2ml2，4-D(终浓度20mg/L)；pH 5.7；和8g TC琼脂。
[0426] SB166固体培养基(每升)包含：1包MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-066)；1ml维生素B51000×储备液；60g麦芽糖；750mg六水合MgCl2；5g活性炭；pH 5.7；和2g固化剂。
[0427] SB103固体培养基(每升)包含：1包MS盐(Gibco/BRL-Cat#11117-066)；1ml维生素B51000×储备液；60g麦芽糖；750mg六水合MgCl2；pH 5.7；和2g固化剂。
[0428] SB71-4固体培养基(每升)包含：1瓶Gamborg’s B5盐w/蔗糖(Gibco/BR-Cat#21153-036)；pH 5.7；和5g TC琼脂。
[0429] 2，4-D储备液是以预先定做的方式从Phytotech cat#D 295获得，浓度为1mg/ml。
[0430] 以等分试样储存在-20℃的维生素B5储备液(每100ml)包含：10g肌醇、100mg烟酸、100mg盐酸吡哆醇和1g硫胺。如果溶液溶解不够快，可用加热搅拌盘进行低度加热。
氯磺隆储备液包含1mg/ml在0.01N氢氧化铵中。
氯磺隆储备液包含1mg/ml在0.01N氢氧化铵中。
[0431] 冠词“a”和“an”在本文中用于表示冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。作为实例，“元件(an element)”表示一个或多个元件。
[0432] 说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域技术人员的水平。在此将所有出版物和专利申请通过引用并入的程度，如同专门和单独指出每一单独的出版物或专利申请通过引用并入。
[0433] 尽管为了清晰理解，通过示例和实例，描述了上述发明的某些细节，但很明显的是，可以在附加的权利要求的范围内，实施某些改动和修饰。