一种alpha螺旋状阳离子多肽分子及其制法和应用

摘要

本发明涉及一种alpha螺旋状阳离子多肽分子及其制法和应用。本发明多肽分子由alpha螺旋性主链与侧链构成。主链由赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、组氨酸构成；侧链主要由组氨酸、赖氨酸、精氨酸和靶向基团构成。组氨酸有利于内涵体释放基因，增加基因表达效果；赖氨酸或精氨酸可提供正电荷，与DNA结合形成稳定复合体；靶向基团有利于提高基因表达效率。利用本发明alpha螺旋状阳离子多肽分子得到的多肽/DNA复合物粒径大小在100-500nm之间，表面带正电荷。本发明具有多肽分子量分布窄、多肽与基因复合方法简单、稳定性和基因表达效率高、毒性低等特点。

权利要求

1.一种alpha螺旋状阳离子多肽分子，其特征在于，结构通式为：其中，n1=3~5，x=1~7，y=1~12，z=1~5，n2为1~4；

所述靶向基团为 ；所述B1是Ala或His；B2为Lys或Arg。

2.一种alpha螺旋状阳离子多肽分子，其特征在于，结构通式为：其中，n1=3~5，x=1~7，y=1~12，n2为1~4；所述B1是Ala或His；B2为Lys或Arg。

3.权利要求1所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）合成单体多肽分子，提纯；

（2）将单体多肽分子溶于水中，浓度为10~200 mg/mL；

（3）将偶氮二甲酰胺溶于二甲基亚砜中，偶氮二甲酰胺的浓度为0.1~2 mg/mL；

（4）将多肽的水溶液与偶氮二甲酰胺的二甲基亚砜溶液混合，其中多肽与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1:10~1:100，搅拌1~10天，得到溶液；

（5）将步骤（4）得到的溶液用去离子水透析1~5天后，收集透析袋中的产物并冷冻干燥，得到alpha螺旋状阳离子多肽分子粗产物；

（6）提纯粗产物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述透析袋的截断分子量为

500~10000。

5.根据权利要求1所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法，其特征在于，所述单体多肽分子的结构式为：其中n1=3~5，x=1~7，y=1~12，z=1~5；所述B1是Ala或His；B2为Lys或Arg。

6.权利要求2所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）合成单体多肽分子，提纯；

（2）将单体多肽分子溶于水中，浓度为10~200 mg/mL；

（3）将偶氮二甲酰胺溶于二甲基亚砜中，偶氮二甲酰胺的浓度为0.1~2 mg/mL；

（4）将多肽的水溶液与偶氮二甲酰胺的二甲基亚砜溶液混合，其中多肽与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1:10~1:100，搅拌1~10天，得到溶液；

（5）将步骤（4）得到的溶液用去离子水透析1~5天后，收集透析袋中的产物并冷冻干燥，得到alpha螺旋状阳离子多肽分子粗产物；

（6）提纯粗产物。

7.根据权利要求6所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法，其特征在于，所述单体多肽分子的结构式为：其中n1=3~5，x=1~7，y=1~12；所述B1是Ala或His；B2为Lys或Arg。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述透析袋的截断分子量为

500~10000。

9.权利要求1或2所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子在基因传输中的应用。

说明书

一种alpha螺旋状阳离子多肽分子及其制法和应用

技术领域

[0001] 本发明主要涉及生物医用高分子材料及其应用领域，具体涉及一种alpha螺旋状阳离子多肽分子及其制法和应用。

背景技术

[0002] 基因治疗自1989年首次进入临床试验，至今已有二十余年，它为很多疾病(尤其是癌症)提供了一种新的治疗方法。基因治疗必须要有一个能将目的基因导入机体细胞的载体系统。基因治疗在临床的成功应用与否，其技术瓶颈是能否开发出一个安全而高效的基因药物传递系统(International Journal of Pharmaceutics，2001，229：1-21；Nature Biotechnology，2000，18：33-37；Gene Therapy，2005，12：1734-1751)。目前，常用于基因传输的载体系统包括两类：病毒性载体和非病毒性载体。前者具有较高的基因表达效率，但存在安全性和免疫原性等风险，1999年，美国曾出现第一例采用病毒性载体基因治疗死亡的病例(Genetherapy，2003，10：1135-1141)。尽管非病毒性载体对基因的表达效率较病毒性载体低，但非病毒性基因载体具有毒性低、低免疫原性以及易于规模生产等优点，在基因治疗应用中备受瞩目。

[0003] 近年来，关于非病毒性基因载体，报道了阳离子聚合物、接枝共聚物、脂质体以及阳离子多肽等作为基因的载体，也具有较高的基因表达效率(Journal of Controlled Release，2004，94：1-14；Nature Materials，2006，5：439-451)。 如 聚 乙 烯 亚 胺(polyethylenimine，PEI)中的伯胺可用来与DNA结合，而仲胺和叔胺可用于内涵体释放DNA，因此，其基因表达效率高，被认为是目前非病毒基因载体的标准。但PEI毒性大，因此，难以推广应用。多肽作为基因载体，由于其生物相容性高，近年来备受关注。如组 氨 酸 (Biochimica EtBiophysica Acta-Biomembranes，2006，1758：301-307)、赖 氨酸 (Biochemical and BiophysicalResearch Communications，2007，357：511-516) 和精 氨 酸 (Bioconjugate Chemistry，2001，12：1005-1011；Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research，2003，1640：129-136)构成的多肽均可用作为基因的载体。在多肽作为基因载体的设计中，赖氨酸与组氨酸用来与DNA结合，而组氨酸可用来内涵体释放DNA。多肽序列中还可引入半胱氨酸，在多肽/DNA复合体中，半胱氨酸中的二硫键可发生发生交联反应，有效增加复合体稳定性。此外，Niidome等(Biomaterials，2000，21：1811-1819)设计了两亲性阳离子多肽KALA作基因载体，该多肽分子可以形成alpha螺旋结构，能有效穿过细胞膜提高基因表达效率。专利申请CN101235384A公布了一种新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法；专利申请CN1844170A公布了一种温敏聚异丙基丙烯酰胺-聚赖氨酸缀合物转基因载体的制备；专利申请CN1462763A公布了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒与制备方法及作为基因载体的应用；专利申请US7112442和US6387700公布了由色氨酸、半胱氨酸和赖氨酸组成的多肽作为基因的载体材料。尽管基因载体材料的研究备受关注，也取得一些进展，但仍有很多问题有待解决。迫切需要设计和开发出一种合成方法简单、基因表达效率高、毒性小的基因载体。

发明内容

[0004] 理想的基因传输系统应需满足以下条件：能有效与DNA结合，形成稳定的载体/DNA复合体；能有效与细胞膜相互作用，高效地穿透细胞膜，将基因传送到细胞内；内涵体中能高效地将DNA释放；载体材料对人体无毒或毒性很小。为达到上述目的，本发明提出一种新型alpha螺旋状阳离子多肽分子及其用于基因传输。

[0005] 本发明采用的技术方案是设计一种具有alpha螺旋状阳离子多肽分子作为基因载体材料。alpha螺旋结构的穿透细胞能力，组氨酸有利于内涵体释放基因，赖氨酸或精氨酸提供正电荷与DNA结合形成复合体，靶向基团则向肿瘤部位定向传输基因。 [0006] 一种alpha螺旋状阳离子多肽分子，结构通式为：

[0007] 靶向基团

[0008] 其中，n1＝3～5，x＝1～7，y＝1～12，z＝1～5，n2为1～4；

[0009] 所述靶向基团为Arg-Gly-Asp；所述B1是Ala或His；B2为Lys或Arg。 [0010] 所述的alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法，包括以下步骤： [0011] (1)合成单体多肽分子，提纯；

[0012] (2)将单体多肽分子溶于水中，浓度为10～200mg/mL；

[0013] (3)将偶氮二甲酰胺溶于二甲基亚砜中，偶氮二甲酰胺的浓度为0.1～2mg/ml； [0014] (4)将多肽的水溶液与偶氮二甲酰胺的二甲基亚砜溶液混合，其中多肽与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶10～1∶100，搅拌1～10天，得到溶液；

[0015] (5)将步骤(4)得到的溶液用去离子水透析1～5天后，收集透析袋中的产物并冷冻干燥，得到alpha螺旋状阳离子多肽分子粗产物；

[0016] (6)提纯粗产物。

[0017] 所述透析袋的截断分子量为500～10000。

[0018] 所述单体多肽分子的结构式为：

[0019]

[0020] 其中n1＝3～5，x＝1～7，y＝1～12，z＝1～5；所述B1是Ala或His；B2为Lys或Arg。

[0021] 所述的alpha螺旋状阳离子多肽分子，结构通式还可以为：

[0022]

[0023] 其中，n1＝3～5，x＝1～7，y＝1～12，n2为1～4；所述B1是Ala或His；B2为Lys或Arg。

[0024] 所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子的制备方法，包括以下步骤： [0025] (1)合成单体多肽分子，提纯；

[0026] (2)将单体多肽分子溶于水中，浓度为10～200mg/mL；

[0027] (3)将偶氮二甲酰胺溶于二甲基亚砜中，偶氮二甲酰胺的浓度为0.1～2mg/ml； [0028] (4)将多肽的水溶液与偶氮二甲酰胺的二甲基亚砜溶液混合，其中多肽与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶10～1∶100，搅拌1～10天，得到溶液；

[0029] (5)将步骤(4)得到的溶液用去离子水透析1～5天后，收集透析袋中的产物并冷冻干燥，得到alpha螺旋状阳离子多肽分子粗产物；

[0030] (6)提纯粗产物。

[0031] 所述单体多肽分子的结构式为：

[0032]

[0033] 其中n1＝3～5，x＝1～7，y＝1～12；所述B1是Ala或His；B2为Lys或Arg。

[0034] 所述透析袋的截断分子量为500～10000。

[0035] 所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子在基因传输中的应用。

[0036] 本发明所述的单体多肽分子可以运用现有技术中已有的固相合成法，在多肽合成仪中合成单体多肽分子，再用制备液相色谱进行提纯，即可制得单体多肽分子。 [0037] 所述透析袋的截断分子量为500～10000。

[0038] 本发明所述的一种alpha螺旋状阳离子多肽分子在基因传输中的应用。 [0039] 再将步骤1所制得的单体多肽分子进行交联，制备主链较长的大分子多肽，交联度为1～8。

[0040] 多肽/DNA复合体的制备方：首先，将一定量的多肽溶解于20mM的PBS缓冲液中(pH5.0)，配置多肽浓度为1mg/mL的溶液。按照一定的氮磷比(N/P)将一定量的多肽溶液与DNA混合，N/P值取0、1、5、10、20、30、40和50。将混合液室温下放置30min，使多肽与DNA充分结合，形成稳定的多肽/DNA复合体。最后，用该复合体对细胞进行表达实验。运用扫描电镜或原子力显微镜观察复合体的外观形貌；动态光散射法测量胶束/DNA复合体的平均粒径；微电泳仪测定胶束/DNA复合体的zeta电位；四唑盐比色法(MTT)对多肽载体材料和多肽/DNA复合体进行细胞毒性评价。

[0041] 多肽基因表达效率的检测：首先，将HepG2细胞接种于24孔板(8×104细胞/孔)，放入培养箱，待细胞汇合度为70％，移去培养基，PBS缓冲液冲洗细胞两次后，加入无血清培养基。分别取步骤3中不同N/P值下的多肽/DNA复合体加入各孔细胞中，继续培养4h，然后换上含10％血清培养基，继续培养68h之后，移去培养基，用PBS缓冲液冲洗两次，然后每个孔加入1倍报告基因裂解缓冲液(1×reporter lysis buffer)，并放置在-80℃冰箱中30min。最后通过超敏感管式发光仪检测基因表达效率。

[0042] 本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果：

[0043] (1)本发明所用的原材料为各种氨基酸，为天然的生物材料，毒性低，无副作用，是一种新型的基因载体材料。

[0044] (2)制备方法简单，合成条件温和，合成技术要求不高，易于操作。 [0045] (3)本方法制备的交联多肽分子，电荷密度高，与DNA结合力强，形成多肽/DNA复7
合体粒径小(100～500nm)，zeta电位较高(10～60mV)，基因表达效率高(1.0×10 ～
8
9.2×10RLU/mg蛋白质)。

[0046] 附图说明

[0047] 图1为实施例4中制备的多肽(简称RC29)的HPLC谱图。

[0048] 图2为di-RC29(RC29二聚体)和tri-RC29(RC29三聚体)的MALDI-TOF检测图。 [0049] 图3为di-RC29/DNA复合体的SEM照片。

[0050] 图4为di-RC29和tri-RC29在水中的圆二色谱图。

[0051] 图5di-RC29/DNA与tri-RC29/DNA复合体在不同N/P值下的电子迁移凝胶色谱图。

[0052] 图6为HepG2细胞中di-RC29与tri-RC29多肽对荧光素酶基因的表达效率。 [0053] 图7为di-RC29/DNA与tri-RC29/DNA复合体在HepG2细胞中的毒性测试。 [0054] 具体实施方式

[0055] 实施例1

[0056] 权利要求1中多肽分子通式，取n1＝3，n2＝1，x＝1，y＝1，z＝0，B1是Ala，B2是Lys。该多肽分子的结构为：

[0057]

[0058] 简称RC16。本实施例是阐述RC16的合成及其用于基因传输。运用多肽合成仪合成RC16，并用HPLC提纯。

[0059] 将10mg的RC16溶解于20mM的PBS缓冲液中(pH 5.0)，按照一定的氮磷比(N/P)将的RC16溶液与DNA混合，N/P值取0、1、5、10、20、30、40和50。将混合液室温下放置30min，使RC16与DNA充分结合，形成稳定的RC16/DNA复合物。该复合体的平均粒径为
540nm，zeta电位为22mV。
4

[0060] 将HepG2细胞接种于24孔板(8×10 细胞/孔)，放入培养箱，待细胞汇合度为70％，移去培养基，PBS缓冲液冲洗细胞两次后，加入无血清培养基。分别取不同N/P值下的RC16/DNA复合体加入各孔细胞中，继续培养4h，然后换上含10％血清培养基，继续培养
68h之后，移去培养基，用PBS缓冲液冲洗两次，然后每个孔加入1倍报告基因裂解缓冲液(1×reporter lysis buffer)，并放置在-80℃冰箱中30min。最后检测基因表达效率，RC16
5
对基因的最高表达效率为2.2×10(N/P 40)。

[0061] 实施例2

[0062] 权利要求1中多肽分子通式，取n1＝5，n2＝4，x＝7，y＝12，z＝5，B1是His，B2是Arg。n2＝4表示该分子为四交联多肽，简称为tetra-RC49，相应的单体分子简称RC49。

[0063] 其结构式为：

[0064]

[0065] 本实施例是阐述tetra-RC49的合成及其用于基因传输。其中tetra-RC49的结构式为：

[0066]

[0067] 首先，运用多肽合成仪合成RC49，用制备液相色谱进行提纯，制得单体多肽分子。 [0068] 将10mg提纯后的RC49溶解于去离子水中，浓度为10mg/ml；将400mg的偶氮二甲酰胺(N，N ,N’，N’-tetramethylazodicarboxamide)溶于DMSO中，配成浓度为0.1mg/ml。然后将两溶液混合，使RC49与偶氮二甲酰胺的摩尔比约为1∶100，室温下搅拌3天后，用去离子水透析(MWCO＝10000Da)除去副产物，1天后收集产物并真空冷冻干燥，得到交联的RC49，产物经HPLC提纯，得到四交联RC49(tetra-RC26)，其纯度在95％以上。 [0069] 运用与实施例1中相同的方法制备N/P值分别为0、1、5、10、20、30、40和50的tetra-RC49/DNA复合体，平均粒径为456nm，zeta电位分别为72mV。

[0070] 运用与实例1中相同的方法对tetra-RC49/DNA复合体在HEpG2细胞中进行基因7
表达测试，其最高表达效率为1.1×10(N/P 30)。

[0071] 实施例3

[0072] 权利要求1中多肽分子通式，取n1＝4，n2＝2，x＝2，y＝4，z＝3，B1是His，B2是Lys。n2＝2表示该分子为二交联多肽，简称为di-RC30，相应的单体分子简称为RC30，其结构式为：

[0073]

[0074] 本实施例是阐述di-RC30的合成及其用于基因传输。其中di-RC30的结构式为： [0075]

[0076] 首先，运用多肽合成仪合成RC30，并用HPLC提纯。

[0077] 将10mg提纯后的RC30溶解于去离子水中，浓度为50mg/ml；将24mg的偶氮二甲酰胺(N，N，N’，N’-tetramethylazodicarboxamide)溶于DMSO中，浓度为2mg/ml。然后将 两溶液混合，使RC30与偶氮二甲酰胺的摩尔比约为1∶52，室温下搅拌3天后，用去离子水透析(MWCO＝500Da)除去副产物，1天后收集产物并真空冷冻干燥，得到交联的RC30，产物经HPLC提纯，得到二交联RC30(di-RC30)，其纯度在95％以上。

[0078] 运用与实施例1中相同的方法制备N/P值分别为0、1、5、10、20、30、40和50的di-RC30/DNA复合体，平均粒径为230nm，zeta电位分别为43mV。

[0079] 运用与实例1中相同的方法对di-RC30/DNA复合体在HEpG2细胞中进行基因表达7
测试，其最高表达效率为2.2×10(N/P 30)。

[0080] 实施例4

[0081] 根据权利要求1中多肽分子通式，取n1＝3，n2＝3，x＝3，y＝6，z＝3，B1选择His，B2选择Lys，该多肽分子简称为tri-RC29，相应的单体分子简称RC29， [0082] 其结构式为：

[0083]

[0084] tri-RC29的结构式为：

[0085]

[0086] 首先，运用多肽合成仪合成RC29，并用HPLC提纯。

[0087] 将10mg提纯后的RC29溶解于去离子水中，浓度为50mg/ml；将20mg的偶氮二甲酰胺(N，N，N’，N’-tetramethylazodicarboxamide)溶于70μL的DMSO中，浓度为0.3mg/ml。然后将两溶液混合，使RC29与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶40，室温下搅拌5天后，用去离子水透析(MWCO＝1000Da)除去副产物，1天后将收集产物并冷冻干燥，制得交联的RC29。
产物用HPLC提纯分离出三交联RC29(tri-RC29)，并用MADI-TOF检测其纯度，tri-RC29的纯度在95％以上。

[0088] 运用与实施例1中相同的方法制备N/P值分别为0、1、5、10、20、30、40和50的tri-RC29/DNA复合体，平均粒径为147nm，zeta电位为58mV。

[0089] 运用与实例1中相同的方法对tri-RC29/DNA复合体在HEpG2细胞中进行基因表达测试，tri-RC29对基因的最高表达效率为5.3×108(N/P 30)。

[0090] 实施例5

[0091] 根据权利要求1中多肽分子通式，取n1＝2，n2＝4，x＝3，y＝6，z＝3，B1选择Ala，B2选择Arg，该多肽分子简称为tetra-RC25，相应的单体分子简称RC25。 [0092] 其结构式为

[0093]

[0094] tetra-RC25的结构式为

[0095]

[0096] 首先，运用多肽合成仪合成RC25，并用HPLC提纯。

[0097] 将10mg提纯后的RC25溶解于去离子水中，浓度为50mg/ml；将20mg的偶氮二甲酰胺(N，N，N’，N’-tetramethylazodicarboxamide)溶于DMSO中，浓度为0.3mg/ml。然后将两溶液混合，使RC25与偶氮二甲酰胺的摩尔比为1∶35，室温下搅拌10天后，用去离子水透析(MWCO＝1000Da)除去副产物，1天后将收集产物并冷冻干燥，制得交联的RC25。产物用HPLC提纯分离出四交联RC25(tetra-RC25)，并用MADI-TOF检测其纯度在95％以上。 [0098] 运用与实施例1中相同的方法制备N/P值分别为0、1、5、10、20、30、40和50的tetra-RC25/DNA复合体，平均粒径为221nm，zeta电位为61mV。

[0099] 运用与实例1中相同的方法对tertra-RC25/DNA复合体在HEpG2细胞中进行基因表达测试，tertra-RC25对基因的最高表达效率为和2.3×107(N/P 40)。

[0100] 实施例6

[0101] 多肽分子螺旋性检测。

[0102] 运用圆二色谱(Circular dichroism，CD)检测tri-RC29(结构式见实施例4)的二级结构。首先，室温下配置1mg/mL的多肽水溶液，在190-250nm远紫外区域进行扫描，扫描光程0.2cm，步长0.2nm，扫描速率为100nm·min-1。采用连续扫描方式，得到椭圆率，然后根据以下公式转换为摩尔椭圆率θM：

[0103]

[0104] 其中，θM为摩尔椭圆率，θobs为测出的椭圆率值，MRW为氨基酸残基分子量，c为多肽 的浓度(mg/mL)，l为广程长度(cm)。

[0105] tri-RC29在208nm和222nm处有负峰出现，表明其二级结构具有alpha螺旋性。2 -1
在222nm处，tri-RC29的平均残基椭圆率为37425deg.cm.dmol 。

[0106] 实施例7

[0107] tri-RC29(结构式见实施例4)与基因的结合强度检测。

[0108] 通过琼脂糖电泳来考察多肽与基因的结合效率或结合强度。首先，将10mg tri-RC29溶于20mM的10mL醋酸缓冲液，然后按照氮磷比分别为0、1、5、10、20、30、40和50配置一系列的多肽/DNA复合体，室温下放置30min使多肽与DNA有效地结合，配置浓度为1％的琼脂糖凝胶缓冲液(0.5×TBE缓冲液)，制作凝胶凝胶电泳(含溴化乙锭
0.5μg/mL)，电泳电压为80mV，60min后取出凝胶，在凝胶成像仪(Chem Genius，Evolve，Singapore)下观察并拍照。tri-RC29与DNA完全有效结合的最小N/P值为2。 [0109] 实施例6

[0110] 多肽/DNA复合体的毒性检测。

[0111] 应用四唑盐比色法(MTT)对tri-RC29(结构式见实施例4)和tri-RC29/DNA复4
合体进行细胞毒性评价。首先，将细胞接种于96孔板(1×10 细胞/孔)，常规培养，至
60-70％汇合度。细胞用PBS冲洗两次，加入无血清培养基，并将多肽、载药胶束或多肽/DNA复合体加入各孔。同时设空白对照组，除了不加入样品，其余操作均相同。继续培养4h后，移去培养基，换上含10％血清培养基，继续培养48h后，再用100μL新鲜培养基与20μL的MTT混合物替换，培养4h后小心吸弃孔内培养基，每孔加入150μL的DMSO，摇床震荡
15min，在酶标仪上，测量550nm和690nm处的吸光度。按以下公式计算细胞存活率： [0112]

[0113] 式中，A550和A690分别为在550nm和690nm处所测样品的吸光度。所有多肽或多肽/DNA复合体体系的细胞存活率均为80％以上，毒性不大。