纯化丙酮酸激酶的方法

摘要

本发明提供一种纯化诊断用丙酮酸激酶的方法，其包括如下步骤：(1)将发酵液调节pH、匀浆，(2)稳定化处理，(3)热冷处理，(4)加酸碱处理，(5)用PEG(聚乙二醇)沉淀法将酶从含有杂离子的酶中沉淀出来，将沉淀重悬，继续用PEG沉淀法洗去其中残余的杂离子，(6)酶沉淀经重悬，加入单宁酸使残留的部分PEG和单宁酸结合生成沉淀并离心除去，上清经冷冻升华干燥获得符合试剂盒纯度要求的诊断酶。该方法简单易行，可以很方便地从含有钠、钾、氨等离子和杂蛋白的发酵粗酶液中将酶提纯出来，获得符合诊断原料要求的酶。该方法酶的得率高，杂离子水平可控制，无需上柱脱盐，无需透析，易于扩大生产。

权利要求

1.一种纯化丙酮酸激酶的方法，其包括如下步骤：

(1)将由大肠杆菌BL21(DE3)-pET28bPK制备得到的发酵液匀浆，得粗酶液；

(2)对粗酶液进行稳定化处理，所述的稳定化处理包括：调节粗酶液的pH至

4.00-10.50，在粗酶液中同时加入终浓度为l-50mmol/l的钾盐、1-200mmol/l的镁盐和

2-50mmol/l的丙酮酸，以提高酶的稳定性，所述的钾盐包括硫酸钾、氯化钾、硝酸钾、醋酸钾中的一种或两种以上，所述的镁盐包括氯化镁、硝酸镁、硫酸镁、醋酸镁中的一种或两种以上；

(3)对进行稳定化处理后的粗酶液进行热冷处理，所述的热冷处理包括：将步骤(2)所得的粗酶液在50℃-60℃加热10-60分钟，使部分杂蛋白沉淀；之后，将酶液在-20℃--40℃冻结16-20小时，然后在25℃-30℃解冻3-5小时，粗酶液中有大量的杂蛋白发生变性失活并沉淀下来，在室温下5000G离心40-60分钟，去除此沉淀；

(4)对步骤(3)所得粗酶液进行酸碱处理，所述的酸碱处理包括：将步骤(3)所得到的粗酶液在25℃-30℃下调节pH4.00，保存4-10小时，将pH调节10.50，在25℃-30℃保温

20-50小时，用磷酸回调酶液的pH至7.0，杂蛋白发生变性失活并沉淀下来，此沉淀用离心的方法去除；

(5)在步骤(4)所得的粗酶液中，加入粗酶液体积25-50％的聚乙二醇溶解，静置，目的蛋白发生沉淀，离心，将含有杂离子的上清液弃除，收集沉淀；此沉淀用3倍体积的Tris-HCl缓冲液重悬，重复以上步骤1次，洗去沉淀中的少量杂离子，收集沉淀，即为酶泥，其中，所述聚乙二醇的分子量为1000-20000；

(6)将步骤(5)所得的酶泥用3倍体积的Tris-HCl悬起，加入酶泥体积0.5-30％的丹宁酸；聚乙二醇和丹宁酸形成沉淀，将此沉淀离心去除，收集上清液；此上清液经过真空冷冻升华获得适合血钾检测的原料酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，加入的丹宁酸的量为酶泥体积的1-20％。

说明书

纯化丙酮酸激酶的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种丙酮酸激酶的纯化方法。

背景技术

[0002] 在钾离子存在的条件下，丙酮酸激酶可催化磷酸烯醇式丙酮酸转化成丙酮酸(见下式，其中，PEP、ADP、Pyruvate、ATP分别为磷酸烯醇式丙酮酸、腺嘌呤二核苷酸磷酸、丙酮酸、三磷酸腺苷)，该酶的活性在一定条件下和钾离子的浓度呈线性相关，可用于检测人血清中钾离子的浓度，从而可用于在血钾试剂盒，因此该酶生产制备工艺研究有重要的实用意义。

[0003]

[0004] 通常，存在于丙酮酸激酶中的杂酶和一价离子(如钾离子、钠离子、铵离子)对酶法检测试剂盒的使用性能有干扰，因此必须将这些干扰因素排除，才可用于试剂盒的配制。

[0005] 中国专利申请CN101698837公开了一种丙酮酸激酶及其核苷酸序列，并具体公开了该酶的纯化方法，即发酵液经过匀浆、亲和吸附并洗脱、脱盐、冻干后获得符合要求的产品。本方法在具体实施过程中涉及亲和吸附柱以及脱盐柱的制备，并涉及纯化系统等设备，柱填料的成本和柱的维护成本比较高。而且，如果大规模生产该酶，柱前需要对粗酶液进行过滤处理(一般如果使用100微米直径的柱填料则要求样品过0.45微米的膜)，否则亲和吸附柱或脱盐柱容易被堵塞，这也是必须面对的问题。

[0006] 鉴于以上状况，改进工艺，避开过滤、上柱纯化等工序，用简易的方法去掉其中一些杂的蛋白并脱除其中的一些杂离子，制备出适合于血钾试剂盒要求的产品有重大的实用意义。本发明将针对以上问题，提供一种新的纯化诊断用丙酮酸激酶的方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种新的简单有效的纯化丙酮酸激酶的方法，该方法不需要将所述的丙酮酸激酶进行亲和吸附，也不需要凝胶脱盐，即可获得符合血钾试剂盒要求的酶。其中，血钾试剂盒对丙酮酸激酶的要求是：用该酶配成的试剂盒和公知的可靠的试剂盒测定血清中的钾离子浓度，测定结果要相近(偏离不得超过±10％，相对标准偏差不得超过5％)。

[0008] 所述的方法包括如下步骤：

[0009] (1)将发酵液匀浆，得粗酶液；

[0010] (2)对粗酶液进行稳定化处理；

[0011] (3)对进行稳定化处理后的粗酶液进行热冷处理；

[0012] (4)对步骤(3)所得粗酶液进行酸碱处理；

[0013] (5)用PEG(聚乙二醇)沉淀法将酶从含杂离子的粗酶中沉淀出来，将沉淀重悬，继续用PEG沉淀法洗去其中残余的杂离子，得酶泥；

[0014] (6)将步骤(5)所得的酶泥重悬，加入单宁酸使全部或绝大部分PEG和单宁酸结合生成沉淀并离心除去，上清液经冷冻升华干燥获得符合试剂盒纯度要求的诊断用酶。

[0015] 所述步骤(1)中，所述的发酵液可以购买得到，或通过现有技术制备而得，例如按照专利申请CN101698837中的方法进行制备；所述的匀浆可采用本领域常规的高压均质机按常规操作进行，例如控制工作压力在85±5个标准大气压，酶液在此连续均质机上匀浆一次(即一个循环)。

[0016] 所述步骤(2)中，对粗酶液进行稳定化处理包括：调节粗酶液的pH，同时加入适当浓度的稳定剂，以提高酶的稳定性。pH优选调节至4.00-10.50，可采用盐酸、醋酸、硝酸、磷酸、硫酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、丙酸、丁酸、丙二酸、丁二酸、乳酸进行调节。所述的稳定剂优选为钾盐、镁盐和丙酮酸，进一步优选为在粗酶液中同时加入终浓度为1-50mmol/l的钾盐、1-200mmol/l的镁盐和2-50mmol/l的丙酮酸。所述的钾盐包括但不限于硫酸钾、氯化钾、硝酸钾、醋酸钾中的一种或几种，所述的镁盐包括但不限于氯化镁、硝酸镁、硫酸镁、醋酸镁的一种或几种。加入稳定剂后，所述的粗酶液在50℃加热60分钟不失活，在pH为4.00时，可在25℃保存8小时而不失活，在pH为10.50时，可在25℃保存20小时而不失活。

[0017] 所述步骤(3)中，所述的热冷处理包括：将粗酶液在50℃-60℃加热10-60分钟，使部分杂蛋白沉淀；之后，将酶液在-20℃--40℃冻结16-20小时，然后在25℃-30℃下解冻3-5小时使融化，可采用水浴进行解冻。经过该步骤，粗酶液中有大量的杂蛋白发生变性失活并沉淀下来，此沉淀可用离心的方法去除。

[0018] 所述步骤(4)中，所述的酸碱处理包括：将以上粗酶液在25℃-30℃下调节pH4.0，保存4-10小时，将pH调节10.5，在25℃-30℃保温20-50小时，杂蛋白发生变性失活并沉淀下来，此沉淀可用离心的方法去除。

[0019] 所述步骤(5)包括：在以上粗酶液中，加入粗酶液体积25-50％(此处的“％”指“重量占体积的百分比”，若重量单位为克，体积单位则取毫升)的PEG溶解，静置，目的蛋白发生沉淀，离心，将含有杂离子的上清液弃除，收集沉淀；此沉淀用3倍体积的Tris-HCl缓冲液(Tris为三羟甲基氨基甲烷，HCl为氯化氢)重悬，重复以上步骤1次洗去沉淀中的少量杂离子，收集沉淀，即为酶泥。其中所述PEG的分子量优选为1000-20000，进一步优选为2000-10000，最优选为PEG2000、PEG6000或PEG10000。重悬指将沉淀加入缓冲也中进行搅拌，成为悬浮液。经过该步骤，去除了酶液中影响试剂和测值的杂离子(如钠离子、钾离子、铵离子等)。

[0020] 所述步骤(6)包括：将去除盐离子的酶泥用3倍体积的Tris-HCl悬起，加入酶泥体积0.5-30％(此处的“％”指“重量占体积的百分比”，若重量单位为克，体积单位则取毫升)的丹宁酸，优选为1-20％；聚乙二醇和单宁酸形成沉淀，将此沉淀离心去除，收集上清液；此上清液经过真空冷冻升华获得适合血钾检测的原料酶。在该步骤中，去除了酶中影响产品比活性的PEG。实施例

[0021] 下面通过具体的实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。

[0022] 1、实施例所用的仪器设备

[0023] 10升发酵罐(包括空压机、空气过滤器、蒸气发生器等配套设施)、1000毫升三角瓶5只、天平、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、沸水浴、电炉、-20℃冰箱、冷冻干燥机、高压均质机、落地式离心机、灭菌锅、细菌培养透气膜、分光光度计、pH计、制冰机。

[0024] 2、实施例中所用的试剂盒材料

[0025] 菌种培养基(LB培养基)1升：10克蛋白胨、5克酵母粉、10克氯化钠逐次加入并溶解到800毫升水中，用盐酸或氢氧化钠调节pH到7.0，加水到1000毫升，将此培养基均分到3个1000毫升的三角瓶中用透气膜封口，在灭菌锅中于121℃按常规操作要求灭菌15分钟。冷却待用。

[0026] 酶表达培养基(LB培养基)6升：60克蛋白胨、30克酵母粉、60克氯化钠逐次加入并溶解于5升水中，用盐酸或氢氧化钠调节pH到7.0，将其加入到10升发酵罐中按常规操作要求在121℃灭菌15分钟，控制冷凝水的量，使灭菌后总体积的达到大约6升。

[0027] 氨水：将浓氨水中加入等倍体积的去离子水，将此稀释后的氨水装于250毫升的补料瓶中(补料瓶不必灭菌，通过氨水即可将其中的杂菌杀灭)，共配制100毫升。此氨水在使用前连接碱管(也用氨水将管道中的气体排出同时对管道起消毒作用)。

[0028] 硫酸：配制浓度大约为2摩尔/升的硫酸，装于已经灭菌(此补料瓶和补料管提前在121℃空灭15分钟)的补料瓶中，共配制100毫升。

[0029] 冰醋酸：配制成20％浓度，共配制100毫升。

[0030] 1％氢氧化钾溶液：称取5克氢氧化钾溶解于500毫升去离子水中。

[0031] 重悬缓冲液2升(Tris-HCl，浓度50毫摩尔，pH7.5)：称取12.1克Tris，加入到1.6升水中，加热到25℃，在不断搅拌下用1M的盐酸调节pH到7.5，将此溶液加去离子水到
2升，继续用Tris或盐酸微调节pH到7.5。

[0032] 单宁酸：分析纯，分子量1700道尔顿。

[0033] 菌种：按照专利申请CN101698837的方法，获得重组宿主细胞——大肠杆菌BL21(DE3)——PET286PK。

[0034] 卡那霉素：取卡那霉素0.5克，用10克去离子水溶解，此液体用无菌滤膜过滤后分装于1毫升的无菌塑料小管中。冷冻保存。

[0035] IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)：取2.38克，用10克去离子水溶解，此液体用无菌滤膜过滤后分装于1毫升的无菌塑料小管中。冷冻保存。使用前解冻。

[0036] 聚乙二醇：分子量2000-10000道尔顿。

[0037] 磷酸。

[0038] 3、丙酮酸激酶的检测方法

[0039] (1)定义

[0040] 酶活：一定条件下，1分钟氧化1微摩尔NADH(还原型辅酶I，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的酶量，定义为1U。1KU＝1000U。

[0041] 比活力：每克(或每升)蛋白所含的酶活力单位。

[0042] (2)检测原理

[0043]

[0044]

[0045] 在反应体系中加入过量的乳酸脱氢酶，丙酮酸的生成速度通过NADH的减少速度反应出来，因此，检测340nm下NADH的浓度变化可间接计算出丙酮酸酶活力。(以上PEP、+ADP、Pyruvate、ATP、NADH、Lactate、NAD 分别代表磷酸烯醇式丙酮酸、腺嘌呤二核苷酸磷酸、丙酮酸、三磷酸腺苷、乳酸、氧化型辅酶I)。

[0046] (3)检测方法

[0047] 准备稀释液：准确称取6.06gTris，加入800mL去离子水，用盐酸调pH值到7.5，定容到1000mL，加牛血清白蛋白1克，搅拌溶解。

[0048] 试剂1的配制：在待用配制的容器中加入约800ml的去离子水，依次加入并溶解122毫摩尔三乙醇胺，26.67毫摩尔六水氯化镁、26.67毫摩尔氯化钾、18.66毫摩尔腺嘌呤二核苷酸磷酸的单钾盐、16.66毫摩尔磷酸烯醇式丙酮酸的单钾盐、调节pH至7.6，加乳酸脱氢酶10000U/L，加足去离子水到1000升。

[0049] 试剂2的配制：在待用配制的容器中加入约800ml的去离子水，称量Tris24.2克放入上述容器中，搅拌至完全溶解，然后用(浓度约3-4％)调pH至9.0(25℃)，上述容器中分别加入NADH 1.20g，搅拌至完全溶解。加入足量的去离子水至1000ml。

[0050] (4)酶活检测方法

[0051] 将试剂1、试剂2预热到37℃，按比例取900份R1，300份R2，混合(在比色杯中反应，光程1厘米)，在37℃迅速加入40份酶样，反应时间3分钟，测定反应液在340nm的吸光度变化率。酶活计算公式如下(本法的线性范围：300-1700U/L)。

[0052]

[0053] Vt ：反应液总体积(3.0ml)

[0054] ε ：摩尔吸光系数

[0055] Vs ：待测酶液的体积

[0056] d ：比色杯光径(1cm)

[0057] D ：稀释倍数

[0058] ΔA/min ：ΔA/min(待检样品)-ΔA/min(空白)(单位：ABS/min)

[0059] 实施例1

[0060] (1)丙酮酸激酶表达菌种：按照专利申请CN101698837的方法，获得重组宿主细胞——大肠杆菌BL21(DE3)——PET286PK。

[0061] (2)制备丙酮酸激酶粗酶液

[0062] 配制6升LB培养基加入到10升发酵罐中，在121℃灭菌15分钟，完全冷却后加入卡那霉素，使其终浓度为50微克/毫升。并同时配制1000毫升LB培养基装于3个1000毫升的三角瓶中，瓶口加封透气膜，121℃灭菌15分钟。

[0063] 上述大肠杆菌“BL21(DE3)——pET286PK”，接种于300毫升的菌种培养基中(接种前加卡那霉素到50微克/毫升)，共接3瓶(1瓶备用，一瓶用来跟踪检测菌体浓度)，在37℃，200转/分钟在摇床上培养，测定菌体浓度在OD600＝0.5±0.05时，将此菌液约300毫升接入6升的LB中。控制温度在37±0.5℃，pH控制在7.0±0.05，溶氧控制在30％以上，在发酵液取样细胞密度达到OD600＝2.0±0.1时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，使其在发酵液中的浓度达到1毫摩尔/升，之后继续培养诱导4小时后发酵完毕，此为粗酶液。此时测定丙酮酸激酶的活力在40KU/L以上。此液为丙酮酸激酶粗酶液。

[0064] (3)丙酮酸激酶的纯化

[0065] 将6升粗酶液(不足此体积加到6升)在65-95兆帕下于高压均质机上匀浆一次获得匀浆液，在匀浆液中加入氯化钾到1毫摩尔(/升)，加硫酸镁至1毫摩尔/升，加丙酮酸到2毫摩尔(/升)，搅拌溶解。用浓度为1％的氢氧化钾在搅拌下调节pH到7.0。将此酶液分盛两个6升的烧杯中，在沸水浴中边加热边搅拌，使温度升到50℃(此过程控制时间不超过5分钟)，其后，将此酶液放水浴锅中50℃保温60分钟，之后，立即将此酶液置冰水浴中在搅拌下冷却到40℃以下(控制此过程不超过5分钟)，将此酶液转移至塑料容器放-20℃冰箱冷冻，过夜(16小时)后，将此酶拿出，缓慢在25℃水浴解冻3小时。酶液继续用水浴加热到25℃，用磷酸缓慢调节pH至4.0，25℃静置4小时，用1％氢氧化钾将pH缓慢调节至10.5，在25℃保温20小时，用磷酸回调酶液的pH至7.0，此酶液在5000G下用离心40分钟将沉淀去除。获得上清总酶活约193KU。

[0066] 在以上酶液中加入粗酶液体积的0.5％(30克)的PEG(分子量2000道尔顿)，静置1小时，5000G离心30分钟，弃去沉淀，取上清。将上清中继续加入50％的PEG(3000克)，搅拌溶解，静置1小时，5000G离心30分钟，收集沉淀(大约120毫升)，弃去上清。将沉淀用1200毫升Tris-HCl(浓度50毫摩尔，pH7.5)，重悬，加420克PEG(分子量2000道尔顿)溶解，静置1小时，5000G离心30分钟，收集沉淀，此沉淀继续用1200毫升的Trs-HCl悬起，重复以上的步骤，获得含有PEG的酶泥。

[0067] 将以上酶泥用300毫升Tris-HCl悬起，溶解，总酶活约165KU，加单宁酸3克，用500毫摩尔的Tris干粉调节pH至7.0，此酶液在2-8℃静置16小时，10000G离心40分钟，收集上清约300毫升，总活力约150KU。

[0068] 酶液在冷冻升华条件下干燥，获得大约3.4克酶粉，比活力大约45KU/克，总活力153KU。相对于纯化投料总酶活，其收收率约为64％。经试剂盒验证可用于血钾检验(准确度、精密度均合格)。试剂盒验证结果参见表1。

[0069] 实施例2

[0070] (1)丙酮酸激酶表达菌种：按照专利申请CN101698837的方法，获得重组宿主细胞——大肠杆菌BL21(DE3)——PET286PK

[0071] (2)制备丙酮酸激酶粗酶液

[0072] 配制6升LB培养基加入到10升发酵罐中，在121℃灭菌15分钟，完全冷却后加入卡那霉素，使其终浓度为50微克/毫升。并同时配制1000毫升LB培养基装于3个1000毫升的三角瓶中，瓶口加封透气膜，121℃灭菌15分钟。

[0073] 上述大肠杆菌“BL21(DE3)——pET286PK”，接种于300毫升的菌种培养基中(接种前加卡那霉素到50微克/毫升)，共接3瓶(1瓶备用，一瓶用来跟踪检测菌体浓度)，在37℃，200转/分钟在摇床上培养，测定菌体浓度在OD600＝0.5±0.05时，将此菌液约300毫升接入6升的LB中。控制温度在37±0.5℃，pH控制在7.0±0.05，溶氧控制在30％以上，在发酵液取样细胞密度达到OD600＝2.0±0.1时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，使其在发酵液中的浓度达到1毫摩尔/升，之后继续培养诱导4小时后发酵完毕，此为粗酶液。此时测定丙酮酸激酶的活力在40KU/L以上。此液为丙酮酸激酶粗酶液。

[0074] (3)丙酮酸激酶的纯化

[0075] 将6升粗酶液在65-95兆帕下于高压匀浆仪上匀浆一次，在匀浆液中加入氯化钾到50毫摩尔(/升)，加硫酸镁至200毫摩尔/升，加丙酮酸到50毫摩尔(/升)，搅拌溶解，迅速用浓度为1％的氢氧化钾在搅拌下调节pH到7.0。将此酶液分盛两个6升的烧杯中，在沸水浴中边加热边搅拌，使温度升到60℃(此过程控制时间不超过5分钟)，其后，将此酶液放60℃的水浴锅中保温10分钟，之后，立即将此酶液置冰水浴中在搅拌下冷却到40℃以下(控制此过程不超过5分钟)，将此酶液转移至塑料容器放-20℃冰箱冷冻，过20小时后，将此酶拿出，缓慢在25℃水浴解冻5小时。酶液继续用水浴加热到25℃，用磷酸缓慢调节pH至4.0，25℃静置10小时，用1％氢氧化钾将pH缓慢调节至10.5，在25℃保温30小时，用盐酸回调酶液的pH至7.0，此酶液在5000G下离心40分钟将沉淀去除。获得上清总酶活约200KU。

[0076] 在以上酶液中加入粗酶液体积的15％(900克)的PEG(分子量2000道尔顿)，静置1小时，5000G离心30分钟，弃去沉淀，取上清。将上清中继续加入25％的PEG(1500克)，搅拌溶解，静置1小时，5000G离心40分钟，收集沉淀(大约120毫升)，弃去上清。将沉淀用1200毫升Tris-HCl(浓度50毫摩尔，pH7.5)，重悬，加420克PEG溶解，静置1小时，5000G离心60分钟，收集沉淀，此沉淀继续用1200毫升的Trs-HCl悬起，重复以上的步骤，获得含有PEG的酶泥(酶沉淀)。

[0077] 将以上酶泥用300毫升Tris-HCl悬起，溶解，总酶活约180KU。加单宁酸1.0克，用500毫摩尔的Tris调节pH至7.0，此酶液在2-8℃静置16小时，10000G离心40分钟，收集上清约300毫升，总活力约167KU。

[0078] 酶液在冷冻升华条件下干燥，获得大约5.9克酶粉，比活力大约27.0KU/克，总活力约159KU。相对于纯化投料总酶活，其收率大约66.3％。经试剂盒验证可用于血钾检验(准确度、精密度均合格)。试剂盒验证结果参见表1。

[0079] 实施例3

[0080] (1)丙酮酸激酶表达菌种：按照专利申请CN101698837的方法，获得重组宿主细胞——大肠杆菌BL21(DE3)——PET286PK

[0081] (2)制备丙酮酸激酶粗酶液

[0082] 配制6升LB培养基加入到10升发酵罐中，在121℃灭菌15分钟，完全冷却后加入卡那霉素，使其终浓度为50微克/毫升。并同时配制1000毫升LB培养基装于3个1000毫升的三角瓶中，瓶口加封透气膜，121℃灭菌15分钟。

[0083] 上述大肠杆菌“BL21(DE3)——pET286PK”，接种于300毫升的菌种培养基中(接种前加卡那霉素到50微克/毫升)，共接3瓶(1瓶备用，一瓶用来跟踪检测菌体浓度)，在37℃，200转/分钟在摇床上培养，测定菌体浓度在OD600＝0.5±0.05时，将此菌液约300毫升接入6升的LB中。控制温度在37±0.5℃，pH控制在7.0±0.05，溶氧控制在30％以上，在发酵液取样细胞密度达到OD600＝2.0±0.1时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，使其在发酵液中的浓度达到1毫摩尔/升，之后继续培养诱导4小时后发酵完毕，此为粗酶液。此时测定丙酮酸激酶的活力在40KU/L以上。此液为丙酮酸激酶粗酶液。

[0084] (3)丙酮酸激酶的纯化

[0085] 将6升粗酶液在65-95兆帕之下于高压均质机上匀浆一次，在匀浆液中加入醋酸钾到30毫摩尔(/升)，加硫酸镁至100毫摩尔/升，加丙酮酸到25毫摩尔(/升)，搅拌溶解，用浓度为1％的氢氧化钾在搅拌下调节pH到7.0。将此酶液分盛两个6升的烧杯中，在沸水浴中边加热边搅拌，使温度升到50℃(此过程控制时间不超过5分钟)，其后，将此酶液放50℃的水浴锅中保温30分钟，之后，立即将此酶液置冰水浴中在搅拌下冷却到40℃以下(控制此过程不超过5分钟)，将此酶液转移至塑料容器放-20℃冰箱冷冻，过16小时后，将此酶拿出，25℃水浴缓慢解冻5小时。酶液继续用水浴加热到25℃，用磷酸缓慢调节pH至4.0，25℃静置8小时，用1％氢氧化钾将pH缓慢调节至10.5，在25℃保温50小时，用盐酸回调酶液的pH至7.0，此酶液在5000G下离心40分钟将沉淀去除。获得总酶活约207KU。

[0086] 在以上酶液中加入粗酶液体积的10％(600克)的PEG(分子量10000道尔顿)，静置1小时，5000G离心30分钟，弃去沉淀，取上清。将上清中继续加入40％的PEG(2400克)，搅拌溶解，静置1小时，5000G离心40分钟，收集沉淀(大约120毫升)，弃去上清。将沉淀用1200毫升Tris-HCl(浓度50毫摩尔，pH7.5)，重悬，加420克PEG溶解，静置1小时，5000G离心40分钟，收集沉淀，此沉淀继续用1200毫升的Trs-HCl悬起，重复以上的步骤，获得含有PEG的酶泥。

[0087] 将以上酶泥用300毫升Tris-HCl悬起，溶解，获得总酶活174KU，加单宁酸4克，用500毫摩尔的Tris调节pH至7.0，此酶液在2-8℃静置16小时，10000G离心40分钟，收集上清约300毫升，总活力约143KU。

[0088] 酶液在冷冻升华条件下干燥，获得大约2.8克酶粉，比活力大约48.9KU/克，总活力约137KU。相对于纯化投料总酶活，其收率大约51.9％。经试剂和验证可用于血钾检验(准确度、精密度均合格)。试剂盒验证结果参见表1。

[0089] 实施例4

[0090] (1)丙酮酸激酶表达菌种：按照专利申请CN101698837的方法，获得重组宿主细胞——大肠杆菌BL21(DE3)——PET286PK。

[0091] (2)制备丙酮酸激酶粗酶液

[0092] 配制6升LB培养基加入到10升发酵罐中，在121℃灭菌15分钟，完全冷却后加入卡那霉素，使其终浓度为50微克/毫升。并同时配制1000毫升LB培养基装于3个1000毫升的三角瓶中，瓶口加封透气膜，121℃灭菌15分钟。

[0093] 上述大肠杆菌“BL21(DE3)——pET286PK”，接种于300毫升的菌种培养基中(接种前加卡那霉素到50微克/毫升)，共接3瓶(1瓶备用，一瓶用来跟踪检测菌体浓度)，在37℃，200转/分钟在摇床上培养，测定菌体浓度在OD600＝0.5±0.05时，将此菌液约300毫升接入6升的LB中。控制温度在37±0.5℃，pH控制在7.0±0.05，溶氧控制在30％以上，在发酵液取样细胞密度达到OD600＝2.0±0.1时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，使其在发酵液中的浓度达到1毫摩尔/升，之后继续培养诱导4小时后发酵完毕，此为粗酶液。此时测定丙酮酸激酶的活力在40KU/L以上。此液为丙酮酸激酶粗酶液。

[0094] (3)丙酮酸激酶的纯化

[0095] 将6升粗酶液(不足此体积加到6升)在90兆帕下于高压均质机上匀浆一次获得匀浆液，在匀浆液中加入氯化钾到1毫摩尔(/升)，加硫酸镁至1毫摩尔/升，加丙酮酸到2毫摩尔(/升)，搅拌溶解。用浓度为1％的氢氧化钾在搅拌下调节pH到7.0。将此酶液分盛两个6升的烧杯中，在沸水浴中边加热边搅拌，使温度升到50℃(此过程控制时间不超过5分钟)，其后，将此酶液放水浴锅中50℃保温60分钟，之后，立即将此酶液置冰水浴中在搅拌下冷却到40℃以下(控制此过程不超过5分钟)，将此酶液转移至塑料容器放-40℃冰箱冷冻20小时，将此酶拿出，在30度水浴5小时缓慢解冻。酶液继续用水浴加热到30℃，用磷酸缓慢调节pH至4.0，30℃静置4小时，用1％氢氧化钾将pH缓慢调节至10.5，在30℃保温50小时，用磷酸回调酶液的pH至7.0，此酶液在5000G下离心40分钟将沉淀去除。获得上清总酶活约189KU。

[0096] 在以上酶液中加入粗酶液体积的0.5％(30克)的PEG(分子量2000道尔顿)，静置1小时，5000G离心30分钟，弃去沉淀，取上清。将上清中继续加入50％的PEG(3000克)，搅拌溶解，静置1小时，5000G离心30分钟，收集沉淀(大约120毫升)，弃去上清。将沉淀用1200毫升Tris-HCl(浓度50毫摩尔，pH7.5)，重悬，加420克PEG(分子量2000道尔顿)溶解，静置1小时，5000G离心30分钟，收集沉淀，此沉淀继续用1200毫升的Trs-HCl悬起，重复以上的步骤，获得含有PEG的酶泥。

[0097] 将以上酶泥用300毫升Tris-HCl悬起，溶解，总酶活约165KU，加单宁酸3克，用500毫摩尔的Tris干粉调节pH至7.0，此酶液在2-8℃静置16小时，10000G离心40分钟，收集上清约300毫升，总活力约152KU。

[0098] 酶液在冷冻升华条件下干燥，获得大约3.4克酶粉，比活力大约43KU/克，总活力153KU。相对于纯化投料总酶活，其收收率约为61％。经试剂盒验证可用于血钾检验(准确度、精密度均合格)。

[0099] 效果例 丙酮酸激酶的应用效果评价

[0100] 丙酮酸激酶在血钾检测试剂盒中的应用效果评价方法

[0101] 实施例所得的酶粉，在配入试剂盒后，用来测定血清钾离子浓度，测值相对于“理论值”的误差波动和精密度需符合诊断试剂盒的要求，即标准偏差小于5％，测值上下波动小于±10％。本方法中，按专利申请CN101698837中对比例2测值作为“理论值”(这里也称为真值)，其中的酶源为日本东洋坊(TOYOBO)的来源于兔肌的丙酮酸激酶，此酶为公知的可用于血钾试剂盒检验的纯品。实施例和对比例2测定值的接近程度反应了纯化出的酶的应用效果(用实施例配成的试剂盒去检测样本的值和理论值越接近，说明其性能越好。)[0102] 试剂盒的制备

[0103] 按照表A的配方配制试剂盒反应液一(R1)和试剂盒反应液二(R2)，实施例和参照例1(即专利申请CN101698837中的对比例2)分别配制成液体形式即可。对比例1的丙酮酸激酶按专利申请CN101698837中的制备实施例1制备。对比例1的试剂盒反应液一和反应液二按专利申请CN101698837中的制备实施例7准备，即，反应液一和反应液二分别在如下条件下冷冻干燥：在普通冰箱中-10℃下冷冻2小时，然后在-40℃深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4LSC型冷冻干燥机中，以真空度0.04mbar、安全压力0.100mbar且冷阱温度-60℃的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干得到的试剂干粉可以在使用前用蒸馏水复溶成原液体形式的体积。冻干得到的试剂干粉，比液体形式的试剂保存的时间更长，包装要求较低，并且体积更小，运输更容易。

[0104] 表A

[0105]实施例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 参照例1
R1
Tris缓冲液(mmol/L，pH＝8.2) 100 100 100 100 250
PEP(mmol/L) 10 10 10 10 3.3
ADP(mmol/L) 10 10 10 10 3.15
α-酮戊二酸(mmol/L) 5.0 5.0 5.0 5.0 1.2
NADH(mmol/L) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.35
GLDH(U/ml) 30 30 30 30 11
PK(U/ml) 12 12 12 12 1.2
R2
Tris缓冲液(mmol/L，Ph＝9.0) 9 9 9 9 10
LDH(U/ml) 75 75 75 75 65
α-硝基酚半乳糖苷 10 10 10 10 5.5

[0106] 血清钾离子具体检测方法按照如下方法进行：

[0107] 将R1取200微升，加标本6微升，标本和R1在37℃保温300秒，加入R2，R1、R2和标本混合液在37℃条件下保温60秒，340nm条件下纪录吸光度数值A1，180秒记录吸光度数值A2，根据吸光度数值的变化，并按照下面的公式计算钾离子的浓度：

[0108] 钾离子浓度＝ΔA标本×校准液的钾离子浓度÷ΔA校准

[0109] 其中，ΔA＝A2-A1，即ΔA标本＝A2标本-A1标本，ΔA校准＝A2校准-A1校准。本测试实施例测量了两个待测标本：一个是3.50mmol/L的KCl水溶液校准品；另一个为健康状况良好的30岁女性的血清待测样本，抽取其10ml血液，静置至血细胞沉淀分层，取上层血清5ml用于对实施例及对比例所纯化的酶进行效果评价(将酶配于试剂盒，用试剂盒来检测样本中钾离子的含量，如果测定的相对标准偏差小于5％，平均值波动小于±10％，则认为可以接受)。

[0110] 表1试剂盒验证结果

[0111]

[0112] 表中的CV为标准偏差

[0113] 从表1数据可见，与理论值(参照例1测值)相比，实施例1、实施例2和实施例3测值波动在±10％内，精密度(CV)均小于5％，说明其酶可用于血钾试剂盒的配制。另外，三者测值和对比例1(其酶来自专利申请CN101698837中的制备实施例1，是用现有技术通过层析柱纯化所得)，其平均值与精密度和后者相近。说明用本发明提供的方法可替代用层析柱来纯化该酶的工艺。

[0114] 除此而外，在本发明的方法中，作为粗酶液的稳定剂，以硫酸钾、硝酸钾替代氯化钾或醋酸钾，浓度控制在1-50mmol/l，以氯化镁、硝酸镁或醋酸镁替代硫酸镁，浓度控制在1-200mmol/l时，同时加入丙酮酸2-50mmol/l，对粗酶液的稳定作用类似。粗酶液在50℃加热1小时，以及在60℃加热10分钟酶活保留率在95％以上，说明这些盐类对酶活稳定都是非常显著的，同样可获得可接受的纯化效果(参见表2和表3)。

[0115] 表2在不同条件下主要纯化条件设计

[0116]

[0117] 表2中各实施例的其它纯化条件同实施例3

[0118] 表3实施例4-16的纯化跟踪测试结果

[0119]

[0120] 总之，实施例1-16所得的酶粉，在配入试剂盒后，用来测定血清钾离子浓度，测值的误差波动和精密度均符合诊断试剂盒的要求，即标准偏差小于5％，测值上下波动不超过5％，远小于10％。说明本纯化工艺可以完全避开柱纯化过程获得比较可靠的符合血钾检验试剂要求的丙酮酸激酶，是可行的。

[0121] 本发明提供的纯化丙酮酸激酶的方法无需层析柱及柱填料，也不需要透析，简单易行。粗酶液经稳定剂处理、加热与冷冻、酸碱处理与PEG沉淀后，影响试剂盒检测的未知杂蛋白被灭活或去除，目的酶通过略高浓度的PEG沉淀出来，其中的杂离子(钾、钠、铵)留在上清中被弃除。酶沉淀中残余的PEG则通过单宁酸结合法去除，使得酶在冻干后的比活力不至于被过分稀释。整个工艺过程中的主要设备涉及离心机、热水浴、冷冻设备等均是常用的设备，无需用柱层析，避免了过滤、亲和层析、凝胶过滤脱盐等设备带来的不便(如纯化设备的购置与专门维护，填料的填装、清洗与再生，以及每批次纯化有限的上样量限制等)。由于制备过程简单，成本也较低。

[0122] 本发明提供的脱盐工艺，在原料的盐浓度较低(低于10％总浓度)的条件下获得