突变体酵母及使用其的物质生产方法

摘要

根据本发明，使用酵母生产目标生产物时，能够维持优良的生长速度以及发酵速度的同时还具有优良的目标生产物生产率。对于成为宿主导入编码目标生产物生产相关酶的外来基因、和能组成型表达的HAP4基因或其同源基因。突变体酵母优选的是与野生型相比降低了醇生产率的突变体。

权利要求

1.一种突变体酵母，其特征在于，导入编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的外来基因、和能组成型表达的编码序列号2所示的氨基酸序列的HAP4基因，使PDC1基因、或者同时使PDC1基因和PDC5基因缺损。

2.根据权利要求1所述的突变体酵母，其特征在于，属于酵母属。

3.根据权利要求1所述的突变体酵母，其特征在于，属于酿酒酵母的菌种。

4.一种使用酵母的物质生产方法，其特征在于，包含：培养权利要求1～3中的任一项所述的突变体酵母，在菌体内外生成乳酸的工序；和回收所述乳酸的工序。

说明书

突变体酵母及使用其的物质生产方法

技术领域

[0001] 本发明涉及对野生型酵母进行了使规定基因组成型表达这样的改变的突变体酵母及使用其的物质生产方法。

背景技术

[0002] 使用酵母等生产目标生产物时，制作以能组成型表达的方式导入了与该目标生产物生物合成相关的基因的突变体酵母，在适当的培养条件下培养突变体酵母，从菌体内或菌体外回收目标生产物。另外，以乙醇以外的物质作为目标生产物时，优选减少大量产生的乙醇。到现在为止，为了降低乙醇生产能力，已制作出破坏存在于乙醇生产路径中的丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等基因的菌株。然而，尤其如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)这种具有葡萄糖效应(Crabtree effect)的菌中，降低乙醇生产量时其繁殖、发酵能力也大幅度的下降，存在实用性低这样的问题。(非专利文献1：Ishida，N.et al.(2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.70，p1148-1153；非专利文献2：Flikweert，M.T.et al.(1996)Yeast12，p247-257、非专利文献3：Eri，A.etal.(1998)J.Ferment.Bioeng.86，p284-289；专利文献1：特表2003-500062号公报；专利文献2：特表2001-516584号公报；非专利文献4：
Skory，C.D.(2003)J.Ind.Microbiol.Biotechnol 30，p22-27)。另外，根据非专利文献1、非专利文献3以及非专利文献4，即使通过破坏乙醇生产路径的基因而能大幅度降低乙醇，所降低部分的大部分也未必都变成目标生产物。

[0003] 另一方面，也有通过将乙醇生产路径的阻断限于一部分，并增强目标生产物的代谢路径，从而提高目标生产物收率的报告(非专利文献5：Saitoh，S(2005)Appl.Environ.Microbiol.71，p2789-2792)，然而，目标生产物的收率虽然得到了提高，但存在乙醇的降低不充分，发酵速度也稍微下降这样的问题。

[0004] 专利文献1：特表2003-500062号公报

[0005] 专利文献1：特表2001-516584号公报

[0006] 非 专 利 文 献 1：Ishida，N.et al.(2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.70，p1148-1153

[0007] 非专利文献2：Flikweert，M.T.et al.(1996)Yeast 12，p247-257

[0008] 非专利文献3：Eri，A.et al.(1998)J.Ferment.Bioeng.86，p284-289[0009] 非专利文献4：Skory，C.D.(2003)J.Ind.Microbiol.Biotechnol 30，p22-27[0010] 非专利文献5：Saitoh，S(2005)Appl.Environ.Microbiol.71，p2789-2792发明内容

[0011] 所以，鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种突变体酵母及使用其的物质生产方法，其在使用酵母生产目标生产物时，能大幅度提高目标生产物的生产率的同时维持优良的生长速度以及发酵速度。

[0012] 为了达成上述目的，本发明人等进行锐意研究的结果，发现了通过导入与目标生产物生产相关的基因并组成型表达HAP4基因，能够维持生长速度以及发酵速度的同时大幅度提高该目标生产物的生产率的事实，从而完成了本发明。

[0013] 本发明包括以下内容。

[0014] (1)一种突变体酵母，导入了编码与目标生产物的生产相关的酶的外来基因、和能组成型表达的HAP4基因或其同源基因。

[0015] 上述(1)的突变体酵母优选的是与野生型相比醇生产率降低了的突变体。例如，通过降低与醇合成相关的酶的酶活性而能降低醇生产率。在此，作为与醇合成相关的酶可举出丙酮酸脱羧酶和/或醇脱氢酶。作为上述丙酮酸脱羧酶可举出选自PDC1基因、PDC5基因和PDC6基因中的至少一个基因所编码的酶。作为上述醇脱氢酶，可举出由ADH1基因所编码的酶。另外，作为上述(1)的突变体酵母优选使用属于酵母(Saccharomyces)属的酵母，尤其是属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株的酵母。另外，上述外来基因可举出编码具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质的基因。

[0016] (2)一种使用酵母的物质生产方法，包含：培养上述的本发明的突变体酵母，在菌体内外生成目标生产物的工序；和回收上述目标生产物的工序。

[0017] 上述(2)的物质生产方法中，能以有机酸作为目标生产物。而且，特别优选的是以乳酸作为目标生产物。并且，也能以乙醇以外的醇作为目标生产物。

[0018] 根据本发明，能够提供维持优良的生长速度以及发酵速度的同时还具有优良的目标生产物生产率的突变体酵母，并且，通过使用本发明的突变体酵母能以低成本生产目标生产物。

[0019] 本说明书包括作为本申请优先权基础的日本专利申请2008-113053号的说明书和/或附图所记载的内容。

附图说明

[0020] 图1为表示构建LDH基因导入/PDC1基因破坏用DNA片段的流程的示意图。

[0021] 图2为表示构建PDC5基因破坏用DNA片段的流程的示意图。

[0022] 图3为表示构建HAP4基因过度表达用DNA片段的流程的示意图。

[0023] 图4为表示对于LDH基因导入/PDC1基因破坏株的、HAP4导入株以及HAP4非导入株的发酵试验的结果的特性图。

[0024] 图5为表示对于LDH基因导入/PDC1以及PDC5基因破坏株的、HAP4导入株以及HAP4非导入株的发酵试验的结果的特性图。

具体实施方式

[0025] 下面详细说明本发明。

[0026] 本发明的突变体酵母导入了编码与目标生产物的生产相关的酶的外来基因、和能组成型表达的HAP4基因或其同源基因。在此，HAP4基因是编码构成被半活性化、葡萄糖抑制的Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-结合性复合体的亚基的HAP4蛋白质。已知该复合体具有各种各样的基因转录促进活性。在Gancedo JM(1998)Yeast carbon cataboliterepression.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(2)，p334-61中尤其对HAP4蛋白质以及上述复合体进行了详细叙述。

[0027] HAP4基因中的编码区域的碱基序列以及HAP4蛋白质的氨基酸序列分别表示于序列号1以及2。其中，作为以组成型表达的方式导入的HAP4基因并不限定于编码含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的基因，也可以编码包含相对于序列号2所示的氨基酸序列，例如具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选97％以上的同源性的氨基酸序列的、形成上述复合体并表现转录促进活性的蛋白质的基因。在此，同源性是指使用收纳了安装有blast算法的计算机程序以及基因序列信息的数据库，通过设定值(Default)的设定而求出的值。

[0028] 另外，作为HAP4基因也可以是编码含序列号2所示的氨基酸序列中1或多个(例如2～60个、优选2～50个、更优选2～40个、进一步优选2～30个、最优选2～15个)氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的、形成上述复合体并表现转录促进活性的蛋白质的基因。

[0029] 进而，作为HAP4基因并不限定于含序列号1所示的碱基序列的基因，也可以是对于由与序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列构成的聚核苷酸的全部或连续的一部分，在严格条件下杂交，编码形成上述复合体并表现转录促进活性的蛋白质的基因。在此，严格条件下是指形成所谓的特异性杂交物，不形成非特异性杂交物的条件。例如，可举出45℃、6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)下的杂交、其后的50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDS下的洗净，或者，作为这种条件还可以举出65～70℃、1×SSC下的杂交、其后的65～70℃、
0.3×SSC下的洗净。杂交能够以J.Sambrooket al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)所记载的方法等现有公知方法进行。

[0030] 其中，如上所述的具有规定的同源性的氨基酸序列、具有氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列等可通过对具有编码含序列号2所示的氨基酸序列蛋白质的碱基序列(例如，序列号1所示的碱基序列)的聚核苷酸，以该技术领域公知的手法进行改变而进行。另外，对于由与序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列构成的聚核苷酸的全部或连续的一部分，在严格条件下杂交的聚核苷酸，同样可通过将具有序列号1所示的碱基序列的聚核苷酸，以该技术领域公知的手法进行改变而进行。向碱基序列导入变异时可通过Kunkel法或Gapped duplex法等的公知手法或以其为基准的方法进行，例如使用利用定点突变诱导法的变异导入用试剂盒(例如Mutant-K、Mutant-G(均为商品名、TAKARA Bio公司制))等，或者使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒(商品名、TAKARA Bio公司制)导入变异。另外，作为变异导入方法也可以是使用EMS(乙基甲烷磺酸盐)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N亚硝基胍、其他的以致癌性化合物为代表的化学诱变剂的方法，也可以是利用X射线、阿尔法射线、贝塔射线、伽马射线、离子束为代表的放射线处理、紫外线处理的方法。

[0031] 另外，对于某蛋白质是否形成上述复合体并具有转录促进活性，例如可通过利用David S.McNabb等、Eukaryotic Cell，November 2005，p.1829-1839，Vol.4，No.11所公开的实验系进行确认。即，该文献中记载有通过构建Hap2p/Hap3p/Hap5p杂合三聚体之后起到Hap4蛋白质作用而形成上述复合体的同时表现上述转录促进活性。因此，利用该文献所记载的实验系，可容易地考察某蛋白质是否具有与HAP4蛋白质同等的功能。

[0032] 而且，上述的HAP4基因可通过现有公知的手法从酿酒酵母分离使用。并且，本发明中，代替上述的HAP4基因也可以使用HAP4基因的同源基因。作为HAP4基因的同源基因可举出乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)来源HAP4同源基因(参照Bourgarel，D.et al.，1999.Mol.Microbiol.31：1205-1215)以及汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)来源HAP4同源基因(参照Sybirna，K.et al.，2005.Curr.Genet.47：172-181)。这些HAP4同源基因的碱基序列以及该基因编码的HAP4同源蛋白质的氨基酸序列可以从Genbank等的公知数据库获取。

[0033] 对于以上说明的HAP4基因或其同源基因在宿主内的组成型表达，例如可举出利用组成型表达启动子的方法。即，可以采用在组成型表达启动子的控制下构建配置了HAP4基因或其同源基因的表达载体，使用该表达载体将宿主转化的方法。在此，组成型表达启动子是具有与宿主细胞的生长条件无关联地表达下游基因的功能的启动子。对于组成型表达启动子，可无特别限定地使用，根据宿主细胞的种类或所控制基因的种类等适宜选择即可。例如，作为酿酒酵母中的组成型表达启动子可举出ADH1启动子、HIS3启动子、TDH3启动子、CYC3启动子、CUP1启动子以及HOR7启动子等。

[0034] 其中，含上述的组成型表达启动子和HAP4基因或其同源基因的表达载体被导入于宿主时还可以具有调整HAP4基因或其同源基因表达的其他序列，具体有操纵基因、增强子、沉默子、核糖体结合序列、终止子等。

[0035] 在此，作为用于将HAP4基因或其同源基因以组成型表达的方式导入的宿主，只要是酵母就无特别的限定。作为可用作宿主的酵母例如可举出子囊菌门(Ascomycota)的子囊菌酵母、担子菌门(Basidiomycota)的担子菌酵母、或不完全菌纲(Fungi Imperfecti)的不完全菌酵母。优选为子囊菌酵母、尤其使用作为出芽酵母的酿酒酵母、产朊假丝酵母(Candida utilis)或毕赤酵母(Pichia pastris)等、作为裂殖酵母的粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomyces pombe)等。另外，作为宿主可以使用乳酸克鲁维酵母以及汉逊酵母。

[0036] 另外，作为宿主使用的酵母特优选为使用醇生产率降低了的突变株。在此，醇生产率降低了是指与野生型酵母相比、醇生产率显著降低了的意思。例如，可通过以降低与醇合成相关的酶的酶活性的方式对野生型酵母导入变异，从而降低醇生产率。作为与醇合成相关的酶可举出丙酮酸脱羧酶以及醇脱氢酶。这些丙酮酸脱羧酶以及醇脱氢酶中，通过降低其一或两个酶活性而能降低醇生产率。作为编码酿酒酵母来源丙酮酸脱羧酶的基因可举出PDC1基因、PDC5基因以及PDC6基因。作为编码酿酒酵母来源醇脱氢酶的基因可举出ADH1基因。

[0037] 通过使这些基因中的1个或多个基因缺损而能降低醇生产率。其中，作为基因的缺损方法无特别的限定，可举出使该基因缺失的方法、向该基因导入变异而表达非活性型酶的方法、使该基因的表达调节区域(例如启动子)缺失或变异的方法。另外，基因的缺损方法还包括在宿主细胞内表达该基因的siRNA(small interfering RNA)、反义RNA、核酶的方法。

[0038] 另外，本发明的突变体酵母具有编码与目标生产物的生产相关的酶的外来基因，能用于生产该目标生产物。作为目标生产物只要是能够以酵母生物合成的物质则无特别的限定，例如可举出乳酸、丙烯酸、乙酸、丙酮酸、3-羟丙酸、富马酸、琥珀酸、衣康酸、乙酰丙酸、己二酸、抗坏血酸以及柠檬酸等的有机酸以及1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇以及3-甲基-1-丁醇等的醇。

[0039] 其中，以乳酸为目标生产物时，作为外来基因可举出与乳酸合成相关的乳酸脱氢酶(LDH)基因。换言之，通过以LDH基因作为外来基因进行导入而对突变体酵母赋予乳酸生产能力。作为LDH根据生物的种类或者在生物体内存在各种同族体。作为本发明中所使用的LDH除了天然来源LDH以外还包括化学合成或者基因工程学人工合成的LDH。作为LDH优选为瑞士乳杆菌株(Lactobacillus helveticusK)、益生菌(Lactobacillus casei)、热克鲁维酵母(Kluyveromyces·thermotolerans)、德尔布有孢酵母(Torulaspora·delbrueckii)、粟酒裂殖酵母、米根霉(Rhizopus oryzae)等的原核生物或者霉菌等的真核生物来源，更优选为植物、动物、昆虫等的高等真核生物来源。例如，优选使用牛来源LDH(L-LDH)。通过将这些基因导入上述的酵母而能向该微生物赋予乳酸生成能力。

[0040] 另外，上述的外来基因可以是在组成型表达启动子的控制下导入的，也可以是在表达诱导型启动子的控制下导入的。其中，上述的外来基因无需在含Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-结合性复合体识别而结合的CCAAT共有序列的启动子的控制下导入。

[0041] 根据本发明的突变体酵母，由于组成型表达HAP4基因或其同源基因，所以大幅度提高目标生产物的生产率。尤其是降低了醇生产率的突变体酵母中通过组成型表达HAP4基因或其同源基因而能不导致生长速度以及发酵速度的降低就能够提高目标生产物的生产率。如此，通过利用本发明的突变体酵母而能大幅度提高目标生产物的收率，能显著削减目标生产物的生产成本。

[0042] 实施例

[0043] 下面使用实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的技术范围并不被以下的实施例所限定。

[0044] 〔实施例1〕

[0045] LDH基因导入/PDC1基因破坏用DNA片段的制作

[0046] 首先，对成为宿主的酵母导入乳酸脱氢酶(LDH)基因作为外来基因的同时，制作了用于破坏与醇合成相关的丙酮酸合成酶基因(PDC1基因)的DNA片段。

[0047] 具体为，以特开2003-259878号公报所公开的质粒pBTrp-PDC1-LDHKCB为模板，将融合了PDC1启动子、LDH基因以及TDH3终止子的DNA片段，以PCR进行扩增。该PCR中作为引物使用了TB215(5′-GAAACAGCTATGACCATGATTACG-3′：序列号3)和TB1497(5′-AAGCTCTTAAAACGGGAATTCCCCTAAGAAACCAT-3′：序列号4)(参照图1)。

[0048] 另一方面，以质粒pRS403(可从ATCC获取)为模板，扩增HIS3基因。该PCR中作为引物使用了TB1421(5′-ATGGTTTCTTAGGGGAATTCCCGTTTTAAGAGCTT-3′：序列号5)和TB422(5′-GACCAAGTTAGCTGGTCGAGTTCAAGAGAAAAAAAAAG-3′：序列号6)。

[0049] 另外，以上述pBTrp-PDC1-LDHKCB为模板，对PDC1基因的下游区域DNA片段以PCR进行了扩增。该PCR中作为引物使用了TB1147(5′-CCAGCTAACTTGGTCGACTTG-3′：序列号7)和TB019(5′-GCGCGTAATACGACTCACTAT-3′：序列号8)。

[0050] 以如上扩增的3种类的PCR产物为模板，利用Shevchuk，N.A.等的方法(Shevchuk，N.A.et al.(2004)Construction of long DNA moleculesusing long PCR-based fusion of several fragments simultaneously.Nucleic Acids Research 32(2)e19)，结合3种类的PCR产物。该PCR中作为引物使用了TB151(5′-CCTATCTCTAAACTTCAACACC-3′：序列号9)和TB152(5′-TCAGCAATAGTGGTCAACAACT-3′：序列号10)。其中，所得DNA片段含有PDC1启动子、LDH基因以及TDH3终止子以该顺序融合的区域、和作为选择标记的LEU2基因、以及作为重组用区域的PDC1基因的下游区域。以下、将该DNA片段称为「LDH基因导入/PDC1基因破坏用DNA片段」。

[0051] PDC5基因破坏用DNA片段的制作

[0052] 另外，本实施例中制造了用于破坏PDC5基因的DNA片段。具体是以酿酒酵母BY4742株(Invitrogen社)的基因组DNA为模板，分别将PDC5基因的5′上游非翻译区域DNA片段和3′下游非翻译区域DNA片段以PCR进行了扩增(参照图2)。使用的PCR用引物为，前者是TB604(5′-TTCGCATCTAAGGGGTGGTG-3′：序列号11)和TB607(5′-GCGTGTACGCATGTAACTTTGTTCTTCTTGTTATT-3′：序列号12)，后者是TB599(5′-CTAACATTCAACGCTAGACGGTTCTCTACAATTGA-3′：序列号13)和TB501(5′-TAAGAAGGCATGTTGGCCTCTGT-3′：序列号14)。

[0053] 另外，以特开2003-259878号公报公开的质粒pBHPH-PT为模板，将潮霉素抗性基因的表达盒以PCR进行了扩增。使用的PCR用引物为TB606(5′-AATAACAAGAAGAACAAAGTTACATGCGTACACGC-3′：序列号15)和TB598(5′-TCAATTGTAGAGAACCGTCTAGCGTTGAATGTTAG-3′：序列号16)。

[0054] 以如上扩增的3种PCR产物为模板，利用上述的Shevchuk，N.A.等的方法，结合了3种类的PCR产物。该PCR中作为引物使用了TB070(5′-GGAGACCCACTGTACAAC-3′：序列号17)和TB210(5′-GCAGCTGAAAGATAATAAGGTATG-3′：序列号18)。以下将该DNA片段称为「PDC5基因破坏用DNA片段」。

[0055] HAP4基因过度表达用DNA片段的制作

[0056] 另外，本实施例中制作了用于将酿酒酵母来源HAP4基因过度表达的DNA片段。具体是以酿酒酵母BY4742株的基因组DNA为模板，将含PDC6基因的一部分和其5′上游非翻译区域的DNA片段、含HAP4基因和其终止子区域的DNA片段、含TDH2启动子区域的DNA片段、含CTT1基因的5′上游非翻译区域的DNA片段，以PCR进行了扩增(参照图3)。使用的PCR用引物分别为TB1021(5′-CCTTGATGCGTGCGTAACC-3′：序列号19)和TB910(5′-AAACGCGTGTACGCATGTAATCTCATAAACCTATGCACTG-3′：序列号20)、TB911(5′-TCATATTCGACGATGTCGTCCGAACTACAGTTATCGCCTC-3′：序列号21)和TB679(5′-CACACAAACAAACAAAACAAAATGACCGCAAAGACTTTTCTAC-3′：序列号22)、TB680(5′-GTAGAAAAGTCTTTGCGGTCATTTTGTTTTGTTTGTTTGTGTG-3′：序列号23)和TB900(5′-ATATATCTGCAGGGATCCCTTGACGGGTATTCTGA-3′：序列号24)、TB899(5′-TCAGAATACCCGTCAAGGGATCCCTGCAGATATAT-3′：序列号25)和TB34
9(5′-CCATATTTTCGTTAGGTCATTT-3′：序列号26)。

[0057] 另外，以特开2003-259878号公报所公开的质粒pBble-LDHKCB为模板，将腐草霉素表达盒以PCR进行了扩增。使用的PCR用引物为TB909(5′-CAGTGCATAGGTTTATGAGATTACATGCGTACACGCGTTT-3′：序列号27)和TB912(5′-GAGGCGATAACTGTAGTTCGGACGACATCGTCGAATATGA-3′：序列号28)。

[0058] 以含如上扩增的PDC6基因的一部分和其5′上游非翻译区域的PCR产物、腐草霉素表达盒为模板，利用上述的Shevchuk，N.A.等的方法以PCR 进行了结合。使用的PCR 用引物为TB315(5′-ACCAGCCCATCTCAATCCATCT-3′：序列号29)和TB912。另外，以含如上扩增的HAP4基因和其终止子区域的PCR产物、含TDH2启动子区域的PCR产物以及含CTT1基因的5′上游非翻译区域的PCR产物为模板，同样以PCR进行了结合。使用的PCR用引物为TB911和TB316(5′-AGCGTATGGGTGATGAGAGTAC-3′：序列号30)。

[0059] 然后，进一步将如上结合的2个片段的DNA为模板，同样以PCR进行了结合。该PCR 中作为引物使用了TB948(5′-GTTGAAGTCGCCTGGTAGCC-3′：序列号31)和TB734(5′-TGTCCAGGCTACGTCGAATC-3′：序列号32)。将最终获得的DNA片段称为“HAP4基因过度表达用DNA片段”。

[0060] LDH基因导入/PDC1基因破坏株的制作

[0061] 使用Frozen-EZ Yeast Transformation II 试剂盒(ZYMORESEARCH公司制)，将上述LDH基因导入/PDC1基因破坏用DNA片段导入于BY4742株进行了转化。该转化是按照试剂盒所附带的操作指南进行的。转化后、在亮氨酸选择性培养基(SD-Leu)板上播种，在30℃下培养3天，选取转化体。由转化体调制基因组DNA，以PCR法确认了LDH基因导入/PDC1基因破坏用DNA片段整合到染色体。该PCR中作为位于LDH基因导入/PDC1基因破坏用DNA片段的外侧的引物使用了TB324(5′-CTCATACATGTTTCATGAGGGT-3′：序列号33)和TB304(5′-ACACCCAATCTTTCACCCATCA-3′：序列号34)。其结果、破坏了BY4742株中的PDC1基因，确认到了LDH基因整合到染色体中。以下，将该转化酵母称为“LDH基因导入/PDC1基因破坏株”。

[0062] LDH基因导入/PDC1以及PDC5基因破坏株的制作

[0063] 接着，使用PDC5基因破坏用DNA片段，对LDH基因导入/PDC1基因破坏株进行了转化。其中，转化方法与上述相同。转化后，向200μg/ml的含潮霉素的YPD培养基板播种，在30℃下培养3天，选取转化体。由转化体调制基因组DNA，以PCR法确认了PDC5基因破坏用DNA片段整合到染色体中。该PCR中作为位于PDC5基因破坏用DNA片段的外侧的引物使用了TB077(5′-GGAACCCATAGATGAAGAGG-3′：序列号35)和作为位于PDC5基因破坏用DNA片段内部的引物使用了TB434(5′-ATCCGCTCTAACCGAAAAGG-3′：序列号36)。其结果，确认到LDH基因导入/PDC1基因破坏株中的PDC5基因被破坏。以下、将该转化酵母称为“LDH基因导入/PDC1以及PDC5基因破坏株”。

[0064] HAP4基因导入株的制作

[0065] 接着，使用上述的HAP4基因过度表达用DNA片段，对上述LDH基因导入/PDC1基因破坏株以及LDH基因导入/PDC1以及PDC5基因破坏株进行了转化。其中，转化方法与上述相同。转化后，向100μg/ml的含腐草霉素YPD培养基板播种，30℃下培养3-5天，选取转化体。由转化体调制基因组DNA，以PCR法确认HAP4基因过度表达用DNA片段整合到染色体。该PCR使用了作为位于HAP4基因过度表达用DNA片段外侧的引物TB315和作为位于HAP4基因过度表达用DNA片段内部的引物TB1020(5′-TCCTGCGCCTGATACAGAAC-3′：序列号37)。其结果、确认到LDH基因导入/PDC1基因破坏株以及LDH基因导入/PDC1以及PDC5基因破坏株的染色体中已导入了HAP4基因过度表达用DNA片段。

[0066] 增殖试验

[0067] 对导入了如上制作的LDH基因导入/PDC1基因破坏株(本项中为HAP4非导入株)以及HAP4基因过度表达用DNA片段的LDH基因导入/PDC1基因破坏株(本项中为HAP4导入株)进行了比增殖速度的计算。具体为注入了YPD(酵母提取物1％、蛋白胨2％以及葡萄糖2％)液体培养基100ml的500ml容积带挡板烧瓶中植菌测定株，30℃、120rpm(振幅35mm)下15～20小时振荡培养后，在菌体浓度0.7～1.0％的状态下进行了收集。再次以相同条件下将测定株以菌体浓度0.01％的浓度进行植菌，增殖开始后约每2小时采样测定菌体浓度。比增殖速度是在增殖开始2～10小时之间，确认对数增殖期，以下式算出的。

[0068] [数学式1]

[0069]

[0070] 表1表示增殖试验的结果。如表1所示，HAP4导入株与HAP4非导入株相比基本具有同等的增殖速度。

[0071] [表1]

[0072]

[0073] 发酵试验1

[0074] 对导入了如上述制作的LDH基因导入/PDC1基因破坏株(本项中为HAP4非导入株)以及HAP4基因过度表达用DNA片段的LDH基因导入/PDC1基因破坏株(本项中为HAP4导入株)进行了发酵试验。具体为将测定株植菌于YPD培养基(酵母提取物1％、蛋白胨2％以及葡萄糖2％)，30℃下进行24小时的培养。培养结束后通过离心分离(2000g、3分)回收了菌体。

[0075] 接着，将25ml的发酵培养基(葡萄糖11％、酵母提取物1％以及碳酸钙4％)加入50ml容积的烧瓶中，以菌体浓度成为0.5％的方式进行接种，80rpm/分(振幅40mm)、34℃下进行了2～3天的发酵。发酵结束后，考察了乳酸和乙醇的生产量。其中，乳酸的收率是以下式计算的。

[0076] 乳酸收率(％)＝乳酸最高浓度(％)/加入的糖浓度(％)

[0077] 图4表示发酵试验的结果。从图4可看出，与HAP4非导入株相比，HAP4导入株的乳酸收率从62％提高至70％，乙醇最高浓度从2.2％降低到了1.4％。并且，发酵速度为同等程度。

[0078] 从该结果明确的是组成型表达HAP4基因的酵母中由于作为外来基因导入LDH基因而使乳酸生产能力得到了大幅度提高。

[0079] 发酵试验2

[0080] 对导入了如上制作的LDH基因导入/PDC1以及PDC5基因破坏株(本项中为HAP4非导入株)以及HAP4基因过度表达用DNA片段的LDH基因导入/PDC1以及PDC5基因破坏株(本项中为HAP4导入株)进行了发酵试验。本发酵试验中代替YPD培养基使用了YPE培养基(酵母提取物1％、蛋白胨2％以及乙醇1％)之外，与上述发酵试验1同样地进行。

[0081] 图5表示发酵试验的结果。从图5可看出，与HAP4非导入株相比，HAP4导入株的乳酸收率从77％提高至90％，乙醇最高浓度从0.09％降低到了0.03％。并且，发酵速度为同等程度。

[0082] 从该结果可明确的是组成型表达HAP4基因的酵母中由于作为外来基因导入LDH基因而使乳酸生产能力得到大幅度的提高。另外，与发酵试验1的结果(图4)相比较可明确的是组成型表达HAP4基因的酵母且醇生产率更低的酵母中，由于作为外来基因导入的LDH基因而乳酸生产能力得到进一步的大幅度提高。

[0083] 本说明书中所引用的所有发行物、专利以及专利申请将作为参考原样被包含于本说明书中。