BZ6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用

摘要

BZ6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用。将平板活化的BZ6-1接种到100mL YGPA液体培养基中，30℃过夜培养18h，按体积比1％接种到250mL YGPA培养液中，摇瓶培养18h后每隔2h作芽孢染色，检查芽孢的形成，待菌体数量达到1×109cfu mL-1，芽孢形成率达到80％的时候，按50％(V/M，单位：mL/g)的比例吸附到基质中制成固体菌剂。BZ6-1菌株对花生青枯病菌具有较强的抑制作用。

权利要求

1.BZ6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用，所述BZ6-1菌株是在培养基组成为糖蜜1.0g，蛋白胨0.05g，酵母膏0.05g，pH8.5，温度25℃培养21h所得。

2.根据权利要求1所述的BZ6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用，其特征在于将平板活化的BZ6-1接种到100mL YGPA液体培养基中，30℃过夜培养18h，按体积比

1％接种到250mL YGPA培养液中，摇瓶培养18h后每隔2h作芽孢染色，检查芽孢的形成，待

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菌体数量达到1×10cfumL ，芽孢形成率达到80％的时候，按50％(V/M，单位：m1/g)的比例吸附到基质中制成固体菌剂。

3.根据权利要求2所述的BZ6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用，其特征在于基质为泥炭，采用121℃湿热灭菌两次，每次1h。

说明书

BZ6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用

一、技术领域

[0001] 本发明属于植物农药技术领域，尤其涉及一种BZ6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用。二、背景技术

[0002] 花生青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种以土壤传播为主的细菌性病害【Hayward A C.Biology and Epidemiology of Bacterial wilt Caused by Pseudomonassolanacearum[J].Annu Rev Phytopathol，1991，29：65-87.】，是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一，被称为植物的“癌症”。目前对该病的防治主要以化学手段为主，但长期大量施用化学农药易产生抗药性和造成环境污染【Yoshida S，Hiradate S，Tsukamoto T，et al.Antimicrobial activity of culture filtrate of Bacillus amyloliquefaciens RC-2isolated from mulberry leaves[J].Biological Control，2001，91：181-182.】，因此生物防治受到国内外研究者的广泛重视。以往用于青枯病防治的生防菌株大多是根际微生物【李伟杰，姜瑞波.番茄青枯病拮抗菌的筛选[J].微生物学杂志，2007，27(1)：5-8.；易有金，刘如石，尹华群，等.烟草青枯病拮抗内生细菌的分离、鉴定及其田间防效[J].应用生态学报，2007，18(3)：554-558.；彭细桥，周国生，邓正平，等.烟草青枯病内生拮抗菌的筛选、鉴定及其防效测定[J].植物病理学报，2007，37(6)：670-674.】，易受环境的影响而防效不稳定【蔡燕飞，廖宗文，章家恩，等.生态有机肥对番茄青枯病及土壤微生物多样性的影响[J].应用生态学报，2003，
14(3)：349-353.；李长松.拮抗性细菌生物防治植物土传病害的研究进展[J].生物防治通报，1992，8(4)：168-172.】。许多研究已证明，健康植物体内存在大量的内生细菌，某些内生细菌可通过产生抗生素、水解酶类等抗菌活性物质在植株体内长期发挥生防作用；相对于腐生细菌、植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)等生防菌而言，内生细菌不易受环境的影响，可在植株体内定殖和传导，更有利于发挥生防作用，它们已成为植物病害生物防治的潜在资源菌【Sturz A V，Christie B R，Nowak J.Bacterial endophytes：potential role indeveloping sustainable systems of crop production[J].Critical Reviews in Plant Sciences，2000，19(1)：21-30.】。目前已在多种作物体内筛选到对植物病菌具有防病或诱导抗病作用的内生细菌，例如，陈夕军【陈夕军，胡长松，童蕴慧，等.水稻内生枯草芽孢杆菌对稻瘟病菌和稻恶苗病菌的抑制作用[J].2008，24(4)：339-344】等从水稻茎和根内分离到对稻瘟病菌和稻恶苗病菌具有较强抑制作用的两株枯草芽孢杆菌J215和G87菌株。陈敏【陈敏，许丽君，吴斌娟，等.黄瓜青枯病内生拮抗菌株HE-1的初步鉴定及培养优化条件[J].科技通报，2008，24(4)：489-493.】等从黄瓜体内分离到一株内生拮抗菌株HE-1对黄瓜青枯菌有较好的抗菌效果，然而对花生青枯病内生拮抗细菌的筛选却未见相关报道。本研究拟从花生植株体内筛选对花生青枯病有较强拮抗作用的内生菌株，研究其抗菌活性以及田间防治效果，旨在为花生青枯病的防治提供科学依据。
三、发明内容

[0003] 发明目的：本发明提供一种BZ6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用。

[0004] 技术方案：BZ6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用。解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)BZ6-1菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2009年01月22日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.2892。将平板活化的BZ6-1接种到100mL YGPA液体培养基中，30℃过夜培养18h，按体积比1％接种到250mL YGPA培养液中，摇瓶培养18h后每隔2h作芽孢染色，检查芽孢的形9 -1
成，待菌体数量达到1×10cfumL ，芽孢形成率达到80％的时候，按50％(V/M，单位：mL/g)的比例吸附到基质中制成固体菌剂。基质为泥炭，采用121℃湿热灭菌两次，每次1h。 [0005] 有益效果：BZ6-1菌株对花生青枯病菌具有较强的抑制作用。含有BZ6-1菌株的固体菌剂在实际使用过程中施用BZ6-1固体菌剂和固体菌剂+菌液浇灌进行田间小区试验的发病率分别为53.4％和30.0％，均显著低于灭菌固体对照，其中施用固体菌剂+菌液浇灌的处理防效达到62.3％，表明BZ6-1菌株花生青枯病菌具有较强的抑制作用。 [0006] 四、附图说明

[0007] 图1 BZ6-1菌株的16S rDNA全序列的系统发育树；

[0008] 图2 发酵时间对BZ6-1菌株的生长和拮抗圈直径的影响；

[0009] 图3 BZ6-1菌株产生的拮抗圈；

[0010] 五、具体实施方式

[0011] 以下结合实例对本发明作进一步的描述：

[0012] 实施例1：

[0013] 1材料与方法

[0014] 1.1菌种

[0015] 从中科院红壤生态实验站花生连作长期定位试验区采集健康花生植株，并利用南京农业大学植保学院植物病理实验室提供花生青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)作为筛选拮抗菌的指示菌。水稻稻瘟病菌(Magnaprothe grisea)，小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)，小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，小麦根腐病菌(Helminthosporium sativum)由扬州大学园艺与植保学院植物病理实验室提供。 [0016] 1.2培养基

[0017] 细菌培养基：YGPA培养基，葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母提取物5g，pH 7.2。真菌培养基：PDA培养基。

[0018] 1.3菌株的摇瓶培养

[0019] 将斜面生长的菌株用接种环接入50mL YGPA培养液(装在250mL三角瓶中)，8
30℃，200r/min振荡培养18h后，将培养液(1×10cfu/mL)以5％的接种量接入各种不同组成的发酵培养基中，30℃，200r/min培养48h。以未接种的发酵液作为对照，在600nm波长下测定发酵液的OD值。

[0020] 1.4内生细菌的分离

[0021] 首先以自来水冲洗花生植株，再用灭菌水冲洗后，用无菌刀把植株的表皮除去，切成5mm×5mm的组织块，在75％的酒精中浸泡1min，然后用0.1％升汞消毒2min，用灭菌水冲洗3次，加入10mL无菌水于灭菌的研钵中研磨。静置0.5h左右，取0.1mL浸出液涂抹YGPA培养基平板上，30℃恒温培养24-72h，以组织消毒后用灭菌水冲洗的第3次冲洗液作为CK，如长菌落，研磨液所长的菌落为非内生菌，弃去；若CK中无菌落，在研磨液中长出菌落是内生菌，根据菌落形态特征的不同挑取菌株，分别转接划线在YGPA培养基平板上划线2-3次进行纯化，挑取单菌落编号后用YGPA斜面培养基4℃保存。

[0022] 1.5菌株的筛选

[0023] 将分离得到的菌株采用点接法筛选，具体操作如下：将0.1mL青枯病液(30℃，8
200r/min，18h，浓度为1×10cfu/mL)涂布于YGPA培养基平板上，然后在每个平板上用无菌牙签均匀点接4个参试菌株，3个重复，30℃恒温培养24h后测定其拮抗圈直径。 [0024] 1.6 BZ6-1菌株的拮抗效能的测定

[0025] 1.6.1 BZ6-1菌株对花生青枯病原菌的拮抗效能 采用牛津杯平板扩散法(双[11]层营养琼脂) ，将平板底层倒一薄层YGPA固体培养基凝固后，每个平板放置3个灭菌
8
牛津杯，然后将培养48h的青枯病原菌(1×10cfu/mL)，采用混菌法加入YGPA培养基，凝固后将牛津杯取出，然后在每孔中加入0.2mL拮抗菌液(30℃，200r/min，18h，浓度为
8
1×10cfu/mL)，放至30℃恒温培养48h后，测定拮抗圈直径，3次重复。

[0026] 1.6.2 BZ6-1菌株对病原真菌的拮抗效能 分别将待测病原真菌接种于PDA固 体培养基中央，28℃培养24h后在新长成的菌丝周围打孔(Ф＝6mm)，将拮抗菌培养液注入孔内，每孔0.2mL，用未接菌的YGPA液体培养基作空白对照，28℃培养5d，测定其拮抗圈直径，3次重复。

[0027] 1.7内生细菌的鉴定

[0028] 1.7.1菌株的形态学观察 将内生菌接种在YGPA培养基平板上，于18h内进行革兰氏染色、观察菌体形态和菌落特征。

[0029] 1.7.2菌株的16S rDNA分析 菌体自斜面接种到YGPA培养基中，30℃，200r/min培养18h。镜检确定无杂菌后10000r/min离心15min收集菌体。菌体DNA的分离纯化使用 试剂盒。以所提取的BZ6-1菌株基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物F27/R1522进行扩增，引物如下：Primer 1，27f：5’-AGAGTTYGATCCTGGCTCAG-3’；Primer2，1522r：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR体系 为(50μL)：10×PCR缓冲 液5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，引物F27/R1522(0.5μmol/L)2μL，模板DNA(约50g/L)1μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，ddH2O至终体积50μL。PCR扩增程序：94℃5min；94℃5min，55℃1min，
72℃2min，30个循环；12℃冷却恒定。序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。将测序结果用BLAST软件与GenBank中的相关属种的16S rDNA序列进行比对。

[0030] 1.8抗菌物质的发酵条件

[0031] 1.8.1培养时间对BZ6-1菌株生长和拮抗效能的影响 用1mL无菌移液枪，向每8
瓶加入2mL培养18h的BZ6-1菌株培养液(1×10cfu/mL)。将接种后的拮抗菌液(3次重复)，30℃，200r/min培养48h。从0h开始，每隔3h取样，最后一起进行比浊和拮抗圈直径的测定。以拮抗菌OD值、拮抗圈直径数值为纵座标，培养时间为横座标，绘出BZ6-1菌株生长和拮抗圈直径的曲线图。

[0032] 1.8.2正交设计法优化内生细菌产抗菌物质的发酵条件 在确定了内生菌最佳培养时间基础上，设计了六因素五水平的正交试验，实验方案见表1，这些因素包括培养基中C源、N源、培养基初始pH、装液量及培养温度。3次重复。

[0033] 表1正交设计表[L25(65)]

[0034]

[0035] 1.9田间防治试验

[0036] 1.9.1固体菌剂的制备 将平板活化的BZ6-1接种到100mL YGPA液体培 养基中，30℃过夜培养18h，按1％接种到250mL YGPA培养液中，摇瓶培养18h后每隔2h作芽孢染色，检查芽孢的形成，待菌体数量达到1×109cfu mL-1，芽孢形成率达到80％的时候，按50％(V/M，单位：mL/g)的比例吸附到基质中制成固体菌剂，灭菌的固体菌剂为对照。基质为泥炭，采用121℃湿热灭菌两次，每次1h。

[0037] 1.9.2田间防治试验设计 利用花生多年连作且发病严重的土壤制作1m2小区，设3个处理，处理1为固体菌剂作基肥施用；处理2为固体菌剂作基肥施用，并在发病前浇灌BZ6-1菌液(108cfu mL-1，100mL/株)，其它处理浇灌灭菌菌液；处理3为对照，灭菌固体菌剂作基肥施用。每小区200g，4次重复，随机排列，常规行距，每个小区定植30棵。花生成熟期调查植株发病情况，计算发病率。

[0038] 2结果与分析

[0039] 2.1内生菌的分离与筛选

[0040] 从健康花生植株体内共分离到37株内生菌株，经室内平板拮抗试验，得到8株对花生青枯病菌生长有较强抑制作用的内生细菌。其中BZ6-1菌株抗菌活性最强，拮抗圈直径接近16mm。同时从表2可以看出，BZ6-1菌株对水稻稻瘟病菌(Magnaprothe grisea)，小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)，小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，小麦根腐病菌(Helminthosporium sativum)的生长也有强烈的抑制作用，表明它是一种广谱拮抗菌。因此，BZ6-1菌株被选用于进一步的研究。

[0041] 表2BZ6-1菌株的抑菌谱

[0042]

[0043] 2.2BZ6-1菌株的鉴定

[0044] 2.2.1培养特征及菌体形态观察 经过革兰氏染色，显微镜观察表明其为革兰氏+阳性(G)，短杆状，大小为0.6～0.7μm×2.0～2.5μm，产芽孢。在YGPA培养基上呈乳白色半透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则。

[0045] 2.2.216S rDNA基因序列测定与分析 以BZ6-1菌株基因组DNA为模板，用细菌的通用引物进行PCR扩增，扩增产物经上海博亚测序，测得16S rDNA扩 增片段长度为1458bp。使用BLASTN程序进行比对和构建系统发育树(图1)，表明BZ6-1菌株与Bacillus spp.聚为一类，且与登陆号为NC009725的Bacillusamyloliquefaciens菌株亲缘关系最近，同源性超过99％，结合BZ6-1菌株的形态特征，可初步将BZ6-1菌株归为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，注册号为(CGMCC No.2892)。 [0046] 2.3BZ6-1菌株产抗菌活性物质的发酵条件

[0047] 2.3.1培养时间对内生菌生长和拮抗圈直径的影响 培养时间对内生菌生长和拮抗圈直径影响的结果表明(图2)，BZ6-1菌株培养6h开始进入对数生长期，培养18h进入生长平台期。在发酵初期，抗菌活性物质产生很少，当进入对数生长期，内生菌产抗菌活性物质大量产生，在培养21h时抗菌活性物质进入平衡期，拮抗圈直径达到28.0mm。 [0048] 2.3.2正交设计法优化内生细菌产抗菌活性物质的发酵条件 将培养基C源、N源、初始pH、装液量和培养温度作五水平六因素正交试验，结果表明各因素对拮抗圈直径影响的程度依次为C源＞N源＞温度＞装液量＞初始pH。由表3可知，C源、N源对拮抗圈直径影响达显著水平(F＞F0.05)，初始pH、装液量和培养温度对拮抗圈直径影响较小，未达到显著水平。其中试验2及C源为糖蜜、N源为蛋白胨加酵母膏，初始pH为7.0，装液量为50mL，温度为25℃的条件下，平均拮抗圈直径达32mm，见图3。通过正交试验分析，综合五水平六因素对BZ6-1菌株产抗菌活性物质的影响，确定最佳培养基(％)为：糖蜜1.0g，蛋白胨0.05g，酵母膏0.05g，pH 8.5，温度25℃，装液量为50mL/250mL。以优化后的培养基和发酵时间培养内生细菌BZ6-1菌株作抗菌试验，BZ6-1菌株对花生青枯菌拮抗圈直径达
34.0mm，表明优化后的条件能有效提高BZ6-1菌株的拮抗效能。

[0049] 表3正交试验方差分析结果

[0050]方差来源 偏差平方和 自由度 F值 显著性
C源 26.160 4 14.864 *
N源 14.160 4 8.045 *
pH 1.760 4 1.000
装液量 7.760 4 4.409
温度 6.960 4 3.955
误差 1.76 4

[0051] 2.4BZ6-1菌对花生青枯病的防治效果

[0052] 从表4可以看出，施用BZ6-1固体菌剂和固体菌剂+菌液浇灌进行田间小区试验的发病率分别为53.4％和30.0％，均显著低于灭菌固体对照，其中施用固体 菌剂+菌液浇灌的处理防效达到62.3％，表明BZ6-1菌株花生青枯病菌具有较强的抑制作用。 [0053] 表4BZ6-1菌剂对花生青枯病防治效果

[0054]处理 发病率(％) 防效(％)
施用固体菌剂 53.4±9.72b 33.0％
施用固体菌剂+菌液浇灌 30.0±4.71c 62.3
灭菌固体菌剂对照 79.7±14.15a

[0055] 3讨论与结论

[0056] 芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的细菌能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、类噬菌体颗粒和细菌素等，具有抗细菌、真菌、病毒和支原体的功能。芽孢杆菌易于繁殖，适应环境能力强，因而在生物防治中起着重要的作用，具有很大的开发利用价值。此外，绝大多数芽孢杆菌对人畜无毒，具有很强的环境适应性和环境友好性。近年来对解淀粉芽孢杆菌产抗真菌活性物质的研究较多，能够有效抑制尖孢镰刀菌、核盘菌、灰霉病、根腐病等真菌病害，而对抑制细菌性病害的有关报道较少。本试验从花生健康植株体内分离出对青枯病菌有较强的抑制作用内生细菌BZ6-1菌株，通过形态观察和16S rDNA初步确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens BZ6-1)。发酵液除对花生青枯病菌有较强的拮抗作用外，对其他植物病原菌也有较好的拮抗作用，具有较广的抗菌谱。解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株有内生孢子，有利于储存和运输，对研发成生物农药和生物肥料治理花生青枯病有较好的应用前景。

[0057] 作为内生生防菌，必须在环境中有较强的竞争力，提高菌株生长能力和拮抗性能对其在田间存活和定殖以及提升商品化程度有着重要意义。因此，对BZ6-1菌株的培养条件进行优化时，发现C源、N源对BZ6-1菌株产拮抗活性物质影响显著，而pH、装液量和培养温度影响较小，表明BZ6-1对环境酸碱度，含氧量以及生长温度有较宽的适应范围。田间生防试验还发现施用固体菌剂+菌液浇灌的处理对花生青枯病防治效果达62.3％，显著高于单施固体菌剂的处理，表明在田间应用生防菌时，后期再次浇灌拮抗菌剂，防治效果会更佳。

[0058] 由于生防菌易受不同地区生态条件的影响，往往存在着防治效果不够稳定的问题。因此，今后还应加强生防菌剂在田间的使用条件和使用技术方面的研究工作，以期达到稳定的防病增产效果。