银杏内酯B的一种用途转让专利
申请号 : CN200910092750.5
文献号 : CN102018702B
文献日 : 2012-07-18
发明人 : 杨宝学 , 周虹 , 高晋生 , 雷天落
申请人 : 北京大学
摘要 :
本发明公开了银杏内酯B在制备预防和/或治疗常染色体显性遗传多囊肾病的药物中的应用。本发明应用MDCK囊泡模型筛选发现银杏内酯B抑制囊泡形成和生长，实验结果表明，银杏内酯B对MDCK囊泡形成和生长具有明显的抑制作用，且其作用呈剂量效应关系；银杏内酯B对MDCK细胞无细胞毒性作用，说明银杏内酯B抑制囊泡的作用与其细胞毒性无关；银杏内酯B不明显诱导MDCK细胞凋亡，证实银杏内酯B抑制囊泡的作用与其促进细胞凋亡无关；银杏内酯B能够促进MDCK细胞或囊泡形成小管样结构，作用呈剂量效应关系；而且银杏内酯B对胚胎肾囊泡生长也具有抑制作用。银杏内酯B为开发预防和/或治疗常染色体显性遗传多囊肾病的特效药物提供实验数据。
权利要求 :
1.银杏内酯B在制备预防和/或治疗常染色体显性遗传多囊肾病的药物中的应用。
2.银杏内酯B在制备抑制细胞形成囊泡和/或抑制囊泡生长的药物中的应用；所述细胞为犬肾细胞或小鼠胚胎肾细胞。
说明书 :
银杏内酯B的一种用途
技术领域
[0001] 本发明涉及银杏内酯B的一种用途。
[0002] 背景技术
[0003] 一、银杏内酯B的化学特征和药理作用
[0004] 1、银杏内酯B的一般特性
[0005] 银杏内酯(ginkgolides)是从银杏中提取得到的一种萜类内酯类化合物，包括银杏内酯A、B、C、J、K、L和M，银杏内酯是血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)抑制剂，其中，银杏内酯B(ginkgolideB，GB，银杏内酯B的化学结构式如图1所示)是银杏内酯中药理活性最强的一种(van Beek TA.Ginkgolides and bilobalide：their physical，chromatographic and spectroscopic properties.Bioorg Med Chem，
2005，13(17)：5001-12.Vogensen SB，Stromgaard K，Shindou H，et al.Preparation of7-substituted ginkgolide derivatives：potent platelet activating factor(PAF)receptor antagonists.J Med Chem，2003，46(4)：601-8.)。研究表明，银杏内酯B具有抗炎、抗氧化、抗过敏、神经保护等作用(Xia SH，Fang DC.Pharmacological action and mechanisms of ginkgolide B.Chin Med J，2007，120(10)：922-8.)。
2005，13(17)：5001-12.Vogensen SB，Stromgaard K，Shindou H，et al.Preparation of7-substituted ginkgolide derivatives：potent platelet activating factor(PAF)receptor antagonists.J Med Chem，2003，46(4)：601-8.)。研究表明，银杏内酯B具有抗炎、抗氧化、抗过敏、神经保护等作用(Xia SH，Fang DC.Pharmacological action and mechanisms of ginkgolide B.Chin Med J，2007，120(10)：922-8.)。
[0006] 2、银杏内酯B的抗炎作用
[0007] 许多研究发现，银杏内酯B具有抗炎作用，机体炎症反应与炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等密切相关。其中，IL-8是最主要的炎症因子，对中性粒细胞有明显趋化和功能活化作用。研究发现(Mao YJ，Wang L，Wang WJ.Effect of ginkgolide B on the function of rat aorta smooth cells and U937 cells stimulated by oxLDL.Yao Xue Xue Bao，2006，41(1)：36-40.)，OX-LDL(氧化型LDL)可诱导U937细胞分泌炎症趋化因子如MCP-1、IL-8等，银杏内酯B能够抑制此过程，其机制可能与抑制PAF受体相关。另外，4-羟基壬烯醛能够刺激支气管上皮细胞IL-8的表达，银杏内酯B能够通过抑制ERK 1-AP 1信号通路减少IL-8(Yu L，Xiong LH，Ran PX.The mechanism of inhibition by ginkgolide B on interleukin-8 production induced by4-hydroxynonenal in bronchial epithelial cells.zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，2008，31(5)：372-7.)。
[0008] TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，LPS(脂多糖)是较强的刺激剂。银杏内酯B能够抑制LPS诱导的小鼠腹膜巨噬细胞TNF-α产生，并能抑制LPS(脂多糖)诱导的大鼠胸膜多形核白细胞NF-KB激活(Nie ZG，Peng SY，Wang WJ.Effects of ginkgolide B on lipopolysaccharide-induced TNFalpha productionin mouse peritoneal macrophages and NF-kappaB activation in rat pleuralpolymorphonuclear leukocytes.Acta Pharmacol Sin(Chin)，2004，39(6)：415-8.)。银杏内酯B能够抑制慢性炎症性肉芽肿模型小鼠血清、U937细胞中IL-1β和TNF表达，并显著抑制慢性炎症性肉芽肿模型小鼠的血管生成(Ou-Yang XY，Wang WJ，LiaoWH，et al.Inhibitory effect of ginkgolide B on angiogenesis in chronic inflammation.Yao Xue Xue Bao，2005，40(4)：311-5.)。
[0009] 此 外，研 究 还 发 现 (Peng SY，Zhang FY，Ou-Yang XY，et al.Effect of ginkgolide Bon the platelet-activating factor induced changes of chemotaxis and2+
cytoskeleton ofmacrophages.Acta Pharmacol Sin(Chin)，2006，41(2)：156-60.)，在Ca存在的条件下，银杏内酯B可抑制PAF诱导的鼠类腹膜巨噬细胞中F-actin(丝状肌动蛋白)聚合，从而抑制腹膜巨噬细胞的趋化，发挥其抗炎作用。银杏内酯B能够诱导PMN(人体多形核白细胞)中一系列信号变化，如酪氨酸磷酸化、磷脂酶D活化、钙瞬变、p38活化等，可能与PMN防御有关(Lenoir M，Muntaner O，Pedruzzi E，et al.Ginkgolide B stimulates signaling events in neutrophils and primes defense activities.Biochem Biophys Res Commun，2005，335(4)：1149-54.)。
cytoskeleton ofmacrophages.Acta Pharmacol Sin(Chin)，2006，41(2)：156-60.)，在Ca存在的条件下，银杏内酯B可抑制PAF诱导的鼠类腹膜巨噬细胞中F-actin(丝状肌动蛋白)聚合，从而抑制腹膜巨噬细胞的趋化，发挥其抗炎作用。银杏内酯B能够诱导PMN(人体多形核白细胞)中一系列信号变化，如酪氨酸磷酸化、磷脂酶D活化、钙瞬变、p38活化等，可能与PMN防御有关(Lenoir M，Muntaner O，Pedruzzi E，et al.Ginkgolide B stimulates signaling events in neutrophils and primes defense activities.Biochem Biophys Res Commun，2005，335(4)：1149-54.)。
[0010] 3、银杏内酯B的抗氧化作用
[0011] 在神经细胞氧化损伤模型中，不同浓度的银杏内酯B均可提高H2O2损伤的神经细胞存活率(Wu XM，Chen HS，Jing SY，et al.Effects of ginkgolides against injury ofneurocytes induced by H2O2 and expression of immediate early genes.Chin J ClinPhamacol Ther，2003，8(4)：401-4.)。在乙醇诱导的Hep G2细胞氧化损伤中，低浓度(5-25μM)的银杏内酯B能够抑制细胞内活性氧的产生并抑制细胞凋亡，但高浓度(50-100μM)的银杏内酯B作用相反，提示应选用合适的剂量(Chan WH，HsuuwYD.Dosage effects of ginkgolide B on ethanol-induced cell death in human hepatomaG2cells.Ann N Y Acad Sci，2007，1095：388-98.)。
[0012] 4、银杏内酯B的抗过敏作用
[0013] 银杏内酯B与抗氧化剂ASX(类胡萝卜素虾青素)联用能够抑制T细胞激活， 优于西替利嗪(CTZ)与氮卓斯汀(AZE)联用，提示可用于哮喘症新药开发(MahmoudFF，Haines DD，Abul HT，et al.In vitro effects of astaxanthin combined with ginkgolideB on T lymphocyte activation in peripheral blood mononuclear cells from asthmaticsubjects.J Pharmacol Sci，2004，94(2)：129-36.)。
[0014] 5、银杏内酯B的血管保护作用
[0015] 银杏内酯对大鼠短暂性及永久性局灶性大脑中动脉阻塞模型及小鼠不完全性脑缺血模型均具有保护作用(Xu JP，Sun LS，Yang XM.Protective effects of ginkgolideon cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.Chin J Integr Tradit West Med IntensiveCrit Care，2003，10(1)：31-3.Wu XF，Wang QJ，Lou FC.Protective effect of ginkgolideson rat focal brain ischemia.J China Pharm Univ，2001，32(2)：141-5.)。银杏内酯B可以选择性抑制血管平滑肌细胞内钙增加，并能非选择性减轻血管加压素作用(Wang Y，Yu YQ，Xu JG.Inhibition of intracellular calcium elevation and blunting of vasopressorresponse due to serotonin by ginkgolide B.Planta Med，2002，68(6)：501-4.)。银杏内酯B还可增加缺血-再灌注大鼠的左心功能与Bcl-2表达、减少梗阻面积与乳酸脱氢酶释放，从而发挥心脏保护作用(Hao Y，Sun Y，Xu C，et al.Improvement of ContractileFunction in Isolated Cardiomyocytes From Ischemia-Reperfusion Rats by Ginkgolide BPretreatment.J Cardiovasc Pharmacol，
2009，doi：10.1097/FJC.0b013e3181a91410.)。但研究发现(Jihye KIM，Qun LI，Cindy X FANG，et al.Paradoxical effects of ginkgolide Bon cardiomyocyte contractile function in normal and high-glucose environments.ActaPharmacologica Sinica，
2006，27(5)：536-42.)，不同浓度的银杏内酯B作用不同。在高糖(25.5mmol/L葡萄糖)培
2+
养环境中，心肌肌质网Ca -ATP酶表达显著增加，0.5-1.0μg/mL银杏内酯B可以减少心肌
2+
肌质网Ca -ATP酶表达。在低糖(5.5mmol/L葡萄糖)培养环境中，2.0μg/mL银杏内酯B可以增加心肌肌质网Ca-ATP酶表达。在高糖培养环境中，两种浓度的银杏内酯B均能抑制+ 2+
Na-Ca 交换器(NCX)表达。
2009，doi：10.1097/FJC.0b013e3181a91410.)。但研究发现(Jihye KIM，Qun LI，Cindy X FANG，et al.Paradoxical effects of ginkgolide Bon cardiomyocyte contractile function in normal and high-glucose environments.ActaPharmacologica Sinica，
2006，27(5)：536-42.)，不同浓度的银杏内酯B作用不同。在高糖(25.5mmol/L葡萄糖)培
2+
养环境中，心肌肌质网Ca -ATP酶表达显著增加，0.5-1.0μg/mL银杏内酯B可以减少心肌
2+
肌质网Ca -ATP酶表达。在低糖(5.5mmol/L葡萄糖)培养环境中，2.0μg/mL银杏内酯B可以增加心肌肌质网Ca-ATP酶表达。在高糖培养环境中，两种浓度的银杏内酯B均能抑制+ 2+
Na-Ca 交换器(NCX)表达。
[0016] 6、银杏内酯B的神经保护作用
[0017] β-淀粉样多肽可通过AC-cAMP-PKA信号通路激活高电压依赖的钙离子通道，使内钙增加诱导钙超载导致神经毒性，银杏内酯B能够抑制β-淀粉样多肽诱导的钙超载，发挥神经保护作用(Chen L，Liu CJ，Tang M，et al.Action of beta-amyloidpeptide(1-40)on I(HVA)and its modulation by ginkgolide B.Acta Physiol Sin(Chin)，2006，58(1)：14-20.)。银杏内酯还可通过减轻β-淀粉样蛋白相关肽对胆碱能传递的 抑制效应 而产生抗 遗忘作 用(Lee TF，Chen CF，Wang LC.Effect of ginkgolides onbeta-amyloid-suppressed acetylocholine release from rat hippocampal slices.PhytotherRes，2004，18(7)：556-60.)。研究发现，银杏内酯B能够通过抑制细胞内钙增加、上调钙结合蛋白D28K mRNA，保护6-羟基多巴(6-hydroxydopamine，
6-OHDA)作用的PC 12细胞(Meng H，Li C，Feng L，et al.Effects of Ginkgolide B on 6-OHDA-inducedapoptosis and calcium over load in cultured PC 12.Int J Dev Neurosci，2007，25(8)：509-14.)。在局部脑缺血星形细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达增加，银杏内酯B能够通过抑制GFAP表达而发挥神经保护作用(Zhang JG，Li SQ，Wng SR，et al.The effect of ginkgolide B on astrocyte GFAP expression after the focal cerebralischemia.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2007，38(2)：284-6，301.)。在
2+
大鼠海马神经末梢，银杏内酯B能够激活PKA，通过作用于电压依赖性N、P/Q型Ca 通道促
2+ 2+
进Ca 进入，从而促进谷氨酸释放。同时证明银杏内酯B能够促进Ca 载体介导的谷氨酸
2+
释放，提示银杏内酯B可直接作用于Ca 下游的分泌器官(Wang SJ，ChenHH.Ginkgolide B，a constituent of Ginkgo biloba，facilitates glutamate exocytosis fromrat hippocampal nerve terminals.Eur J Pharmacol，2005，514(2-3)：141-9.)。 [0018] NO既是机体内源性活性介质，也是一种内源性神经递质，在许多病理和生理过程中NO具有双重作用。研究发现(Xu Y，Tao YX.Involvement ofthe NMDAreceptor/nitric oxide signal pathway in platelet-activating factor-induced neurotoxicity.Neuroreport.2004，15(2)：263-6.)，银杏内酯B抑制长期暴露于PAF的神经元中NO合成酶活性，减少过量的NO的神经毒性。银杏内酯还可时间-剂量依赖性抑制LPS、IFN-α、TNF-α、IL-1及IL-2诱导的星状细胞瘤和SK-N-SH人神经母细胞瘤中NO产生，从而抑制NO神经毒性作用(Zhao HW，Li XY.Ginkgolide A，B，and huperzine Ainhibit nitric oxide-induced neurotoxicity.Int Immunopharmacol，2002，2(11)：
1551-6.)。神经递质L-Glu可导致培养的大鼠小脑神经元大量死亡，预先给予EGb761或银杏内酯可明显降低Glu的神经毒性(Chandrasekaran K，Mehrabian Z，Spinnewyn B，et al.Neuroprotective effects of bilobalide，a component of Ginkgo biloba extract(EGb 761)in global brain ischemia and in excitotoxicity-induced neuronal death.Pharmacopsychiatry，2003，36(Suppl 1)：S89-94.)。
6-OHDA)作用的PC 12细胞(Meng H，Li C，Feng L，et al.Effects of Ginkgolide B on 6-OHDA-inducedapoptosis and calcium over load in cultured PC 12.Int J Dev Neurosci，2007，25(8)：509-14.)。在局部脑缺血星形细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达增加，银杏内酯B能够通过抑制GFAP表达而发挥神经保护作用(Zhang JG，Li SQ，Wng SR，et al.The effect of ginkgolide B on astrocyte GFAP expression after the focal cerebralischemia.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2007，38(2)：284-6，301.)。在
2+
大鼠海马神经末梢，银杏内酯B能够激活PKA，通过作用于电压依赖性N、P/Q型Ca 通道促
2+ 2+
进Ca 进入，从而促进谷氨酸释放。同时证明银杏内酯B能够促进Ca 载体介导的谷氨酸
2+
释放，提示银杏内酯B可直接作用于Ca 下游的分泌器官(Wang SJ，ChenHH.Ginkgolide B，a constituent of Ginkgo biloba，facilitates glutamate exocytosis fromrat hippocampal nerve terminals.Eur J Pharmacol，2005，514(2-3)：141-9.)。 [0018] NO既是机体内源性活性介质，也是一种内源性神经递质，在许多病理和生理过程中NO具有双重作用。研究发现(Xu Y，Tao YX.Involvement ofthe NMDAreceptor/nitric oxide signal pathway in platelet-activating factor-induced neurotoxicity.Neuroreport.2004，15(2)：263-6.)，银杏内酯B抑制长期暴露于PAF的神经元中NO合成酶活性，减少过量的NO的神经毒性。银杏内酯还可时间-剂量依赖性抑制LPS、IFN-α、TNF-α、IL-1及IL-2诱导的星状细胞瘤和SK-N-SH人神经母细胞瘤中NO产生，从而抑制NO神经毒性作用(Zhao HW，Li XY.Ginkgolide A，B，and huperzine Ainhibit nitric oxide-induced neurotoxicity.Int Immunopharmacol，2002，2(11)：
1551-6.)。神经递质L-Glu可导致培养的大鼠小脑神经元大量死亡，预先给予EGb761或银杏内酯可明显降低Glu的神经毒性(Chandrasekaran K，Mehrabian Z，Spinnewyn B，et al.Neuroprotective effects of bilobalide，a component of Ginkgo biloba extract(EGb 761)in global brain ischemia and in excitotoxicity-induced neuronal death.Pharmacopsychiatry，2003，36(Suppl 1)：S89-94.)。
[0019] 研 究 发 现 (Bate C，Salmona M，Williams A.Ginkgolide B inhibits the neurotoxicityofprions or amyloid-betal-42.J Neuroinflammation，2004，1(1)：4.)，PAF拮抗剂银杏 内酯B还可能用于阿尔茨海默尔病或朊病毒病治疗。神经干细胞(NSCs)和单细胞克隆神经球可被银杏内酯B诱导分化为神经元(Jin GH，Huang Z，Tan XF，et al.Effects of Ginkgolide on the development of NOS and AChE positive neurons in theembryonic basal forebrain.Cell Biol Int，2006，30(6)：500-4.)。银杏内酯B可促进神经干细胞(NSCs)分化为GFAP阳性的星形胶质细胞(Yoshida H，Imaizumi T，Tanji K，et al.Platelet-activating factor enhances the expression of nerve growth factor in normalhuman astrocytes under hypoxia.Brain Res Mol Brain Res，2005，133(1)：95-101.)。
[0020] 7、银杏内酯B潜在毒性作用
[0021] 银杏内酯B仅有一些微弱的副作用，包括呃逆、头痛、嗜睡、虚弱等(Guinot P.Clinical experience with platelet-activating factor antagonists.Past，present and nearfuture.Clin Rev Allergy 1994；12：397-417.Brown SL，Jala VR，Raghuwanshi SK，et al.Activation and regulation of platelet-activating factor receptor：role of G(i)and G(q)inreceptor-mediated chemotactic，cytotoxic，and cross-regulatory signals.J Immunol，2006，177(5)：3242-9.)。银杏内酯B体外可抑制胚胎干细胞增殖与胚泡发育，体内导致胚胎发育损伤(Chan WH.Ginkgolide B induces apoptosis and developmental injury inmouse embryonic stem cells and blastocysts.Hum Reprod，2006，21(11)：2985-95.)。
[0022] 二、常染色体显性遗传多囊肾病发病机制和治疗进展
[0023] 常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一种常见的单基因遗传疾病，在国外的发病率高达1/1000-1/400，占我国终末期肾衰竭病因的第4位。目前，已发现三个基因与ADPKD发病有关，其中PKD1基因(polycystic kidney disease 1)定位于染色体16p13.3，该基因的突变约占ADPKD的85％；PKD2基因定位于4q21-23，该基因的突变约占ADPKD的15％；PKD3基因的突变仅发现数个家系，尚未定位。ADPKD病变以双肾多发性进行性囊泡为主要特征，引起肾功能改变，终末期导致肾衰，常伴有肝、脾、胰等器官囊性病变以及心脑血管病变。目前，除应用肾移植和透析治疗终末期肾衰，尚无特效疗法阻止囊泡的发生和生长。因此，延缓ADPKD发病、甚至逆转ADPKD的病程是国内外该领域的研究热点。
[0024] PKD1基因与PKD2基因编码的蛋白分别称为多囊蛋白1(polycystin-1，PC1)和多囊蛋白2(polycystin-2，PC2)。其中，PC1是肾小管上皮细胞膜受体，主要亚细胞定位于肾上皮细胞纤毛、紧密连接部、粘着连接、桥粒、粘着斑等；PC2具有 钙离子通道的作用，主要亚细胞定位于纤毛、内质网、中心体等。在肾小管上皮细胞纤毛处，PC1与PC2相互作用组成功能复合体，PC1可感知肾小管腔内液体对纤毛的机械刺激，并将信号传递给PC2，PC2介导2+ 2+ 2+ 2+ 2+
Ca 内流，Ca 内流进一步引起细胞内质网Ca 的释放，维持胞内Ca 浓度至正常水平。Ca
2+
水平正常的细胞内，Ca 能够通过抑制腺苷酸环化酶6来抑制cAMP的生成，同时还可以激
2+
活磷酸二酯酶(PDE)而降解cAMP，因此，细胞内Ca 能够负向调节细胞内cAMP的浓度。当
2+ 2+
PKD1基因或PKD2基因发生突变时，细胞内Ca 浓度降低，Ca 负向调节cAMP的作用减弱，细胞内cAMP浓度增高。增高的细胞内cAMP活化蛋白激酶A(PKA)，PKA可以激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路而促进囊泡上皮细胞的增殖；PKA还可以激活囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)促进氯离子分泌至囊腔，提高囊泡内渗透压，引起钠和水继发性向囊泡内转运而促进囊液的分泌，最终导致多囊肾的病理学改变。另有研究表明，PC1在PC2的参与下可作用于蛋白质酪氨酸激酶(JAK2)，通过信号转导和转录激活因子1(STAT1)上调p21waf基因的表达，p21可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)而使G1期延长，从而抑制细胞增殖[51]
。PC1还可以在PC2的参与下作用于JAK2，通过信号转导和转录激活因子3(STAT3)促进肝细胞生长因子(HGF)介导的肾小管分化。当PKD1基因或PKD2基因发生突变时，p21waf基因的表达减少，细胞增殖增加，同时肾小管分化减少，促进多囊肾的发生。PC1可通过与结节性硬化症(TSC2)基因和mTOR形成复合物而抑制mTOR的活性，从而调节mTOR信号通路。
在ADPKD中，PC1的缺失会导致mTOR信号通路的异常激活，使细胞过度增殖(Bhunia AK，Piontek K，Boletta A，et al.PKD1induces p21(waf1)and regulation of the cell cycle via direct activation of the JAK-STATsignaling pathway in a process requiring PKD2.Cell，2002，109(2)：157-68.)。在正常的肾小管上皮细胞中，PC1参与β-连环素(β-catenin)和E-钙粘附分子(E-cadherin)形成复合物的过程，维持细胞连接；PC1还可以上调糖原合成酶激酶3β(GSK3β)活性促进β-catenin的降解，从而保持细胞质内β-catenin浓度的较低水平(MostovKE.mTOR is out of control in polycystic kidney disease.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(14)：5247-8.)。在ADPKD中，PC1的缺失可以使细胞连接损伤、胞质内β-catenin浓度升高，同时Wnt信号通路异常激活，Wnt通过Dishevelled蛋白拮抗β-catenin降解复合物(APC/Axin)的形成而阻断β-catenin降解也可使β-catenin在细胞质内聚集，经转录入核促进细胞过度增殖。因此根据多囊肾的发病机制，可以通过抑制 囊泡上皮细胞增殖和囊液分泌等方法来筛选治疗ADPKD的药物(见图2)。
Ca 内流，Ca 内流进一步引起细胞内质网Ca 的释放，维持胞内Ca 浓度至正常水平。Ca
2+
水平正常的细胞内，Ca 能够通过抑制腺苷酸环化酶6来抑制cAMP的生成，同时还可以激
2+
活磷酸二酯酶(PDE)而降解cAMP，因此，细胞内Ca 能够负向调节细胞内cAMP的浓度。当
2+ 2+
PKD1基因或PKD2基因发生突变时，细胞内Ca 浓度降低，Ca 负向调节cAMP的作用减弱，细胞内cAMP浓度增高。增高的细胞内cAMP活化蛋白激酶A(PKA)，PKA可以激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路而促进囊泡上皮细胞的增殖；PKA还可以激活囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)促进氯离子分泌至囊腔，提高囊泡内渗透压，引起钠和水继发性向囊泡内转运而促进囊液的分泌，最终导致多囊肾的病理学改变。另有研究表明，PC1在PC2的参与下可作用于蛋白质酪氨酸激酶(JAK2)，通过信号转导和转录激活因子1(STAT1)上调p21waf基因的表达，p21可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)而使G1期延长，从而抑制细胞增殖[51]
。PC1还可以在PC2的参与下作用于JAK2，通过信号转导和转录激活因子3(STAT3)促进肝细胞生长因子(HGF)介导的肾小管分化。当PKD1基因或PKD2基因发生突变时，p21waf基因的表达减少，细胞增殖增加，同时肾小管分化减少，促进多囊肾的发生。PC1可通过与结节性硬化症(TSC2)基因和mTOR形成复合物而抑制mTOR的活性，从而调节mTOR信号通路。
在ADPKD中，PC1的缺失会导致mTOR信号通路的异常激活，使细胞过度增殖(Bhunia AK，Piontek K，Boletta A，et al.PKD1induces p21(waf1)and regulation of the cell cycle via direct activation of the JAK-STATsignaling pathway in a process requiring PKD2.Cell，2002，109(2)：157-68.)。在正常的肾小管上皮细胞中，PC1参与β-连环素(β-catenin)和E-钙粘附分子(E-cadherin)形成复合物的过程，维持细胞连接；PC1还可以上调糖原合成酶激酶3β(GSK3β)活性促进β-catenin的降解，从而保持细胞质内β-catenin浓度的较低水平(MostovKE.mTOR is out of control in polycystic kidney disease.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(14)：5247-8.)。在ADPKD中，PC1的缺失可以使细胞连接损伤、胞质内β-catenin浓度升高，同时Wnt信号通路异常激活，Wnt通过Dishevelled蛋白拮抗β-catenin降解复合物(APC/Axin)的形成而阻断β-catenin降解也可使β-catenin在细胞质内聚集，经转录入核促进细胞过度增殖。因此根据多囊肾的发病机制，可以通过抑制 囊泡上皮细胞增殖和囊液分泌等方法来筛选治疗ADPKD的药物(见图2)。
[0025] 目前，治疗ADPKD的研究仍处于探索阶段，治疗策略主要是根据其发病机制集中2+
在抗细胞增殖、抑制囊液分泌、调节胞内Ca 浓度和减轻继发病变等方面。下面从这几个方面进行阐述：
在抗细胞增殖、抑制囊液分泌、调节胞内Ca 浓度和减轻继发病变等方面。下面从这几个方面进行阐述：
[0026] 1、抗细胞增殖
[0027] ADPKD囊泡上皮细胞的增殖可能涉及多种生长因子，如表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)能够刺激囊泡上皮细胞的增殖，其机制与表皮生长因子受体Erb B/EGFR(epidermal growth factor receptor)、Src、MEK促分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase)等的酪氨酸激酶活性密切相关。因此，酪氨酸激酶抑制剂在ADPKD的治疗中具有很大的潜力。如Wilson等研究发现Erb B2抑制剂可以恢复多囊肾囊泡细胞的正常结构并改善其功能(BocaM，D′Amato L，Distefano G，et al.Polycystin-1 induces cell migration by regulatingphosphatidylinositol3-kinase-dependent cytoskeletal rearrangements andGSK3beta-dependent cell cell mechanical adhesion.Mol Biol Cell，2007，18(10)：4050-61.)。 另有 研 究发现，Src抑制剂可以修复多囊肾肾脏的异常上皮细胞(Wilson SJ，Amsler K，Hyink DP，et al.Inhibition of HER-2(neu/ErbB2)restores normal functionand structure to polycystic kidney disease(PKD)epithelia.Biochim Biophys Acta，2006，1762(7)：
647-55.)。MEK抑制剂能够抑制pcy多囊肾小鼠的囊泡细胞增殖，延缓其肾功衰竭(Sweeney WE Jr，von Vigier RO，Frost P，Avner ED.Src inhibitionameliorates polycystic kidney disease.J Am Soc Nephrol，2008，19(7)：1331-41.)。其他如雷帕霉素(Omori S，Hida M，Fujita H，et al.Extracellular signal-regulated kinaseinhibition slows disease progression in mice with polycystic kidney disease.J Am SocNephrol，
2006，17(6)：1604-14.)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂(Berthier CC，Wahl PR，Le Hir M，et al.Sirolimus ameliorates the enhanced expression ofmetalloproteinases in a rat model of autosomal dominant polycystic kidney disease.Nephrol Dial Transplant，2008，23(3)：880-9.)、细胞凋亡蛋白酶抑制剂(Bukanov NO，Smith LA，Klinger KW，et al.Long-lasting arrest of murine polycystic kidney diseasewith CDK inhibitor roscovitine.Nature，2006，444(7121)：949-52.)等也可以通过影响细胞增殖而起到治疗ADPKD的作用。
647-55.)。MEK抑制剂能够抑制pcy多囊肾小鼠的囊泡细胞增殖，延缓其肾功衰竭(Sweeney WE Jr，von Vigier RO，Frost P，Avner ED.Src inhibitionameliorates polycystic kidney disease.J Am Soc Nephrol，2008，19(7)：1331-41.)。其他如雷帕霉素(Omori S，Hida M，Fujita H，et al.Extracellular signal-regulated kinaseinhibition slows disease progression in mice with polycystic kidney disease.J Am SocNephrol，
2006，17(6)：1604-14.)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂(Berthier CC，Wahl PR，Le Hir M，et al.Sirolimus ameliorates the enhanced expression ofmetalloproteinases in a rat model of autosomal dominant polycystic kidney disease.Nephrol Dial Transplant，2008，23(3)：880-9.)、细胞凋亡蛋白酶抑制剂(Bukanov NO，Smith LA，Klinger KW，et al.Long-lasting arrest of murine polycystic kidney diseasewith CDK inhibitor roscovitine.Nature，2006，444(7121)：949-52.)等也可以通过影响细胞增殖而起到治疗ADPKD的作用。
[0028] 2、抑制囊液分泌
[0029] 囊 性 纤 维 化 跨 膜 转 导 调 节 因 子 (cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator，CFTR)是一种cAMP激活的ATP门控性氯离子通道，在肾上皮细胞顶膜表达。在ADPKD发病机制中，血管加压素等可激活腺苷酸环化酶，使胞内cAMP浓度增加、PKA被激活；PKA可激活位于囊泡上皮细胞顶膜的CFTR使氯离子分泌至囊腔，提高囊泡内渗透压，引起钠和水继发性向囊泡内转运，并在囊泡内蓄积，而囊液的蓄积导致了囊泡上皮细胞代偿性增生。因此，抑制CFTR可以有效地治疗ADPKD。许多研究表明，CFTR过度表达在多囊肾发病中起着非常重要的作用。犬肾细胞(MDCK细胞)PKD模型、体外胚胎肾模型和PKD小鼠模型均证实CFTR抑制剂显著抑制囊泡在体外和体内的形成和生长(Tao Y，Kim J，Faubel S，et al.Caspase inhibition reduces tubular apoptosis and proliferation and slows diseaseprogression in polycystic kidney disease.PNAS，2005，102(19)：6954-9.)。其他如血管加压素V2受体(V2R)拮抗剂(Yang B，Sonawane ND，Zhao D，et al.Small-moleculeCFTR inhibitors slow cyst growth in polycystic kidney disease.J Am Soc Nephrol，2008，19(7)：1300-10.)、生长抑素类似物(Wang X，Wu Y，Ward C J，et al.Vasopressindirectly regulates cyst growth in polycystic kidney disease.J.Am Soc Nephrol，2008，19(1)：102-8.)等也可以通过调节囊液分泌而用来治疗ADPKD。 [0030] 3、调节胞内Ca2+浓度
[0031] ADPKD发病中，PKD1基因或PKD2基因发生突变，细胞内Ca2+浓度降低，低水平细胞2+
内Ca 通过影响细胞内与细胞分化生长、基因表达和细胞膜蛋白功能调控相关的信号传导通路，引起囊泡形成、囊泡上皮细胞异常增殖和囊泡液体过度分泌，继而导致多囊肾病理学
2+ 2+
改变。可运用Ca 通道激动剂、Ca 载体(Ruggenenti P，Remuzzi A，Ondei P，et al.Safety and efficacy of long-acting somatostatin treatment inautosomal-dominant polycystic kidney disease.Kidney Int，2005，68(1)：206-16.)、PDE激动剂(Yamaguchi T，Hempson SJ，Reif GA，et al.Calcium restores a normalproliferation phenotype in human polycystic kidney disease epithelial cells.J Am SocNephrol，2006，
2+
17(1)：178-87.)等通过上调胞内Ca 浓度来治疗ADPKD。另外，Crews小组发现，雷公藤
2+
内酯可以通过促进PC2介导的细胞内Ca 的释放和促进P21的表达(P21是CDK的抑制物)从而发挥抑制细胞增殖的作用，此过程不依赖PC1的表达，提示雷公藤内酯可用于治疗ADPKD(Cheng J，Grande JP.Cyclic nucleotidephosphodiesterase(PDE)inhibitors：
novel therapeutic agents for progressive renal disease.Exp Biol Med，2007，
232(1)：38-51.)。
内Ca 通过影响细胞内与细胞分化生长、基因表达和细胞膜蛋白功能调控相关的信号传导通路，引起囊泡形成、囊泡上皮细胞异常增殖和囊泡液体过度分泌，继而导致多囊肾病理学
2+ 2+
改变。可运用Ca 通道激动剂、Ca 载体(Ruggenenti P，Remuzzi A，Ondei P，et al.Safety and efficacy of long-acting somatostatin treatment inautosomal-dominant polycystic kidney disease.Kidney Int，2005，68(1)：206-16.)、PDE激动剂(Yamaguchi T，Hempson SJ，Reif GA，et al.Calcium restores a normalproliferation phenotype in human polycystic kidney disease epithelial cells.J Am SocNephrol，2006，
2+
17(1)：178-87.)等通过上调胞内Ca 浓度来治疗ADPKD。另外，Crews小组发现，雷公藤
2+
内酯可以通过促进PC2介导的细胞内Ca 的释放和促进P21的表达(P21是CDK的抑制物)从而发挥抑制细胞增殖的作用，此过程不依赖PC1的表达，提示雷公藤内酯可用于治疗ADPKD(Cheng J，Grande JP.Cyclic nucleotidephosphodiesterase(PDE)inhibitors：
novel therapeutic agents for progressive renal disease.Exp Biol Med，2007，
232(1)：38-51.)。
[0032] 4、减轻继发病变
[0033] ADPKD囊泡的生长与组织的重建需要基质的降解与重组，由于金属蛋白酶能够降解基质，使囊泡容易在组织中增大，并使周围组织重构，因此可运用金属蛋白酶抑制剂来治疗ADPKD(Leuenroth SJ，Okuhara D，Shotwell JD，et al.Triptolide is a traditional Chinese medicine-derived inhibitor of polycystic kidney disease.PNAS，2007，104(11)：4389-94.)。一些降糖降脂药也可通过调节基质积聚而缓解ADPKD症状(Nakamura T，Ushiyama C，Suzuki S，et al.Elevation of serum levels of metalloproteinase-1，tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and type IV collagen，and plasma levels of metalloproteinase-9 in polycystic kidney disease.Am J Nephrol，2000，
20(1)：32-6.Muto S，Aiba A，Saito Y，et al.Pioglitazone improves the phenotype and molecular defects of a targeted Pkd1 mutant.Hum Mol Genet，2002，11(15)：
1731-42.)。ADPKD发病过程往往伴随着组织重构和血管增生，而血管内皮生长因子(VEGF)是主要的促血管生成因子，研究发现，应用VEGF抑制剂可抑制Han：SPRD大鼠(Cy/+)囊泡的形成与生长(Yuan ZZ，Xu CG，Gao CF，Mei CL.Effect of lovastatin on proliferation and extracellular matrix secretion in cyst-lining epithelial cells of autosomal dominant polycystic kidney disease.Acad J Sec Mil Med Univ，
2006，27(1)：111-2.)。ADPKD患者肾囊泡的形成与扩大可激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)，使血管硬化而导致高血压、左心室肥厚。动物实验已证实，应用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)或血管紧张素受体阻断剂(angiotensin receptor blocker，ARB)控制血压可能延缓多囊肾肾功能衰竭，但一些临床研究未证实其作用(Tao Y，Kim J，Yin Y，et al.VEGF receptor inhibition slows the progression of polycystic kidney disease.Kidney Int，2007，72(11)：1358-66.)。
20(1)：32-6.Muto S，Aiba A，Saito Y，et al.Pioglitazone improves the phenotype and molecular defects of a targeted Pkd1 mutant.Hum Mol Genet，2002，11(15)：
1731-42.)。ADPKD发病过程往往伴随着组织重构和血管增生，而血管内皮生长因子(VEGF)是主要的促血管生成因子，研究发现，应用VEGF抑制剂可抑制Han：SPRD大鼠(Cy/+)囊泡的形成与生长(Yuan ZZ，Xu CG，Gao CF，Mei CL.Effect of lovastatin on proliferation and extracellular matrix secretion in cyst-lining epithelial cells of autosomal dominant polycystic kidney disease.Acad J Sec Mil Med Univ，
2006，27(1)：111-2.)。ADPKD患者肾囊泡的形成与扩大可激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)，使血管硬化而导致高血压、左心室肥厚。动物实验已证实，应用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)或血管紧张素受体阻断剂(angiotensin receptor blocker，ARB)控制血压可能延缓多囊肾肾功能衰竭，但一些临床研究未证实其作用(Tao Y，Kim J，Yin Y，et al.VEGF receptor inhibition slows the progression of polycystic kidney disease.Kidney Int，2007，72(11)：1358-66.)。
[0034] 根据ADPKD的发病机制与治疗策略，筛选囊泡形成和生长抑制剂，研发治疗ADPKD的新药物是目前该领域的研究热点。
[0035] 发明内容
[0036] 本发明的目的是提供银杏内酯B的一种用途。
[0037] 本发明所提供的银杏内酯B的用途具体为：
[0038] 1)以银杏内酯B为活性成分的预防和/或治疗常染色体显性遗传多囊肾病的药 物；
[0039] 2)银杏内酯B在制备预防和/或治疗常染色体显性遗传多囊肾病的药物中的应用；
[0040] 3)以银杏内酯B为活性成分的抑制囊泡形成和/或生长的药物；
[0041] 4)银杏内酯B在制备抑制囊泡形成和/或生长的药物中的应用。
[0042] 上述用途中，所述细胞为犬肾细胞或小鼠胚胎肾细胞。
[0043] 上述预防和/或治疗常染色体显性遗传多囊肾病的药物可通过注射或口服的方式导入机体。
[0044] 所述预防和/或治疗常染色体显性遗传多囊肾病的药物的用量一般为：20-100mg/人/天(注射)或200-1000mg/人/天(口服)。
[0045] 本发明应用MDCK囊泡模型筛选得到抑制囊泡形成和生长的银杏内酯B，通过MTT法确定该化合物的毒性和对正常细胞生长分化的影响；用MDCK小管生成实验研究银杏内酯B对肾上皮细胞分化的影响；通过体外胚胎肾模型确定银杏内酯B的整体肾内药理活性；为开发预防和/或治疗常染色体显性遗传多囊肾病的特效药物提供实验数据。实验结果表明，银杏内酯B对MDCK囊泡形成和生长具有明显的抑制作用，且其作用呈剂量效应关系；
银杏内酯B对MDCK细胞无细胞毒性作用，说明银杏内酯B抑制囊泡的作用与其细胞毒性无关；银杏内酯B不明显诱导MDCK细胞凋亡，证实银杏内酯B抑制囊泡的作用与其促进细胞凋亡无关；银杏内酯B能够促进MDCK细胞或囊泡形成小管样结构，作用呈剂量效应关系；
而且银杏内酯B对胚胎肾囊泡生长也具有抑制作用。
银杏内酯B对MDCK细胞无细胞毒性作用，说明银杏内酯B抑制囊泡的作用与其细胞毒性无关；银杏内酯B不明显诱导MDCK细胞凋亡，证实银杏内酯B抑制囊泡的作用与其促进细胞凋亡无关；银杏内酯B能够促进MDCK细胞或囊泡形成小管样结构，作用呈剂量效应关系；
而且银杏内酯B对胚胎肾囊泡生长也具有抑制作用。
[0046] 附图说明
[0047] 图1为银杏内酯B的化学结构式
[0048] 图2为ADPKD的发病机制
[0049] 图3为MDCK囊泡与细胞集落
[0050] 图4为银杏内酯B对MDCK囊泡形成的抑制作用
[0051] 图5为银杏内酯B对囊泡生长的抑制作用
[0052] 图6为银杏内酯B对囊泡生长的抑制作用曲线
[0053] 图7为银杏内酯B对囊泡生长的可逆性抑制作用曲线
[0054] 图8为MTT法检测银杏内酯B对MDCK细胞的细胞毒性
[0055] 图9为银杏内酯B对MDCK细胞凋亡的诱导作用图片
[0056] 图10为银杏内酯B对MDCK细胞凋亡的诱导作用
[0057] 图11为银杏内酯B对MDCK小管生成的促进作用
[0058] 图12为银杏内酯B对囊泡形成小管样结构的促进作用
[0059] 图13为银杏内酯B对囊泡形成小管样结构的促进作用图片
[0060] 图14为银杏内酯B对MDCK细胞信号转导通路的调节作用
[0061] 图15为小鼠胚胎肾囊泡模型示意图
[0062] 图16为小鼠胚胎肾囊泡的形成过程
[0063] 图17为银杏内酯B对胚胎肾囊泡生长的抑制作用
[0064] 图18为银杏内酯B抑制小鼠胚胎肾囊泡发展的剂量效应
具体实施方式
[0065] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0066] 实施例1、银杏内酯B对MDCK囊泡形成和生长的抑制作用
[0067] 一、银杏内酯B能够抑制囊泡的形成，作用呈剂量效应关系
[0068] 1、囊泡形成抑制实验
[0069] 犬肾细胞(MDCK)在三维基质胶中培养时受cAMP刺激形成囊泡，并可持续生长。forskolin是腺苷酸环化酶的激活剂，腺苷酸环化酶可介导cAMP的生成，因此forskolin可促进MDCK囊泡形成和生长，其囊泡特性与多囊肾囊泡的特性相似，是筛选评价化合物治疗多囊肾药理活性的最佳体外模型。
[0070] 将MDCK细胞(购自美国ATCC公司，商品目录号CCL-34)分别培养于含有10μM -8forskolin(佛司可林，购自Sigma公司，货号F6886)和浓度分别为0M、12.5×10 M、-7 -6
5×10 M和2×10 M的银杏内酯B(购自Sigma公司，商品目录号G6910)的三维基质胶(Purecol Collagen，购自Inamed Biomaterials Fremont公司，货号5409)中，每孔大约
400个细胞，培养4-5天后，在仅含有10μM forskolin的孔中形成MDCK细胞的囊泡模型。
每个剂量重复3个孔。培养第6天时计数圆形囊泡(直径大于50μm)和非囊泡细胞的集落，计算囊泡占总细胞集落(囊泡和非囊泡集落)的百分率。实验设三次重复，结果表明，囊泡占总细胞集落的百分率为33.82±0.93％。囊泡与非囊泡细胞的形态如图3所示。其中，control表示该孔中加入不含forskolin的培养液，forskolin表示该孔中加入含10μM forskolin的培养液。银杏内酯B对MDCK囊泡形成的抑制作用如图4所示。从图4中可以看出，银杏内酯B可以明显减少forskolin诱导的MDCK囊泡数目，且抑制作用呈剂量效应关系(图中黑色部分)，但银杏内酯B不影响总集落数(包括囊泡和非囊泡集落，图中白色和黑色部分的总和)。以上结果说明，银杏内酯B对MDCK囊泡形成具有明显的 抑制作用，但没有细胞毒性。
5×10 M和2×10 M的银杏内酯B(购自Sigma公司，商品目录号G6910)的三维基质胶(Purecol Collagen，购自Inamed Biomaterials Fremont公司，货号5409)中，每孔大约
400个细胞，培养4-5天后，在仅含有10μM forskolin的孔中形成MDCK细胞的囊泡模型。
每个剂量重复3个孔。培养第6天时计数圆形囊泡(直径大于50μm)和非囊泡细胞的集落，计算囊泡占总细胞集落(囊泡和非囊泡集落)的百分率。实验设三次重复，结果表明，囊泡占总细胞集落的百分率为33.82±0.93％。囊泡与非囊泡细胞的形态如图3所示。其中，control表示该孔中加入不含forskolin的培养液，forskolin表示该孔中加入含10μM forskolin的培养液。银杏内酯B对MDCK囊泡形成的抑制作用如图4所示。从图4中可以看出，银杏内酯B可以明显减少forskolin诱导的MDCK囊泡数目，且抑制作用呈剂量效应关系(图中黑色部分)，但银杏内酯B不影响总集落数(包括囊泡和非囊泡集落，图中白色和黑色部分的总和)。以上结果说明，银杏内酯B对MDCK囊泡形成具有明显的 抑制作用，但没有细胞毒性。
[0071] 2、囊泡生长抑制实验
[0072] 将MDCK细胞培养于含有10μM forskolin的三维基质胶中，培养4-5天后即可形成直径为50-100μm的圆形囊泡；然后再在细胞培养板中加入终浓度分别为0M、-7 -7 -61.25×10 M、5×10 M和2×10 M的银杏内酯B继续培养。每日换新鲜的含有银杏内酯B和forskolin的培养液，隔天跟踪照相各个囊泡并测量囊泡直径以评价银杏内酯B抑制囊泡生长的效果，共观察8-12天。每个剂量重复3个孔，每孔计数10个以上囊泡，作囊泡生长曲线。实验设三次重复，银杏内酯B对囊泡生长的抑制作用如图5所示。其中，第一排表示第4-12天用仅含forskolin的培养液培养，第二排表示第4-12天用含有银杏内酯B和forskolin的培养液培养，第三排表示第4-7天用含有银杏内酯B和forskolin的培养液培养，第8-12天只用含forskolin的培养液培养。银杏内酯B对囊泡生长的抑制作用曲线如图6所示。结果表明，MDCK细胞在含有10μM forskolin的三维基质胶中培养4天后即可形成圆形囊泡，且囊泡呈进展性生长(见图5第一排细胞)，从图6中可以看出，银杏内酯B能够明显抑制囊泡生长。
[0073] 二、银杏内酯B能够可逆地抑制囊泡的生长，作用呈剂量效应关系 [0074] 将MDCK细胞培养于含有10μM forskolin的三维基质胶中，培养4天后即可形成-7圆形的囊泡；从第4天开始在细胞培养板中加入终浓度为1.25×10 M的银杏内酯B继续培养，每日换新鲜的含有银杏内酯B和forskolin的培养液；到第8天时，在细胞培养板中只加入终浓度为10μM的forskolin，而不加入银杏内酯B，直至第12天。每天测量囊泡直径，实验设三次重复，银杏内酯B可逆性抑制囊泡生长的情况如图7所示。其中，实心球曲线表示同时加入终浓度为10μM的forskolin和银杏内酯B，空心球曲线表示只加入终浓度为10μM的forskolin而没加入银杏内酯B。结果表明，去掉银杏内酯B后，囊泡可恢复生长，说明银杏内酯B并未损伤囊泡上皮细胞，表明银杏内酯B对囊泡生长的抑制作用是可逆的。
[0075] 实施例2、银杏内酯B的细胞毒性、对细胞生长与分化的影响
[0076] 1、通过MTT法确定银杏内酯B的细胞毒性
[0077] 将对数期的MDCK细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔含有4×103个细胞，每孔给予200μl MDCK细胞培养液(由DMEM培养基(购自美国Invitrogen公司，商 品目录号12100-046)和F12培养基(购自美国Invitrogen公司，商品目录号21700-075)等体积混合而成)，置于37℃的5％CO2培养箱中培养24小时。然后在细胞培养板中加入终浓度分-4 -5 -6 -7
别为1×10 M、1×10 M、1×10 M和1×10 M的银杏内酯B 20μl，继续培养24小时。除去上清，加入200μl MDCK细胞培养液和20μl浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续培养3小时。
除去上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上100转/分振荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪检测各孔OD值(检测波长为492nm)，设置调零孔(培养基、MTT和二甲基亚砜)和对照孔(细胞、相同浓度的银杏内酯B的溶解介质、培养基、MTT和二甲基亚砜)，每组设定5个复孔。按照下述公式计算抑制率：抑制率＝[(对照孔-调零孔)-(给药孔-调零孔)]/(对照孔-调零孔)×100％。实验设三次重复，加入银杏内酯B后细胞的MTT结果如-5
图8所示。其中，control表示用不含银杏内酯B的培养液培养。结果表明，1×10 M以下浓度的银杏内酯B对MDCK细胞无细胞毒性作用，说明银杏内酯B抑制囊泡的作用与其细胞毒性无关。
别为1×10 M、1×10 M、1×10 M和1×10 M的银杏内酯B 20μl，继续培养24小时。除去上清，加入200μl MDCK细胞培养液和20μl浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续培养3小时。
除去上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上100转/分振荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪检测各孔OD值(检测波长为492nm)，设置调零孔(培养基、MTT和二甲基亚砜)和对照孔(细胞、相同浓度的银杏内酯B的溶解介质、培养基、MTT和二甲基亚砜)，每组设定5个复孔。按照下述公式计算抑制率：抑制率＝[(对照孔-调零孔)-(给药孔-调零孔)]/(对照孔-调零孔)×100％。实验设三次重复，加入银杏内酯B后细胞的MTT结果如-5
图8所示。其中，control表示用不含银杏内酯B的培养液培养。结果表明，1×10 M以下浓度的银杏内酯B对MDCK细胞无细胞毒性作用，说明银杏内酯B抑制囊泡的作用与其细胞毒性无关。
[0078] 2、Tunel试剂盒(购自Roche公司，货号11 684 795 910)确定银杏内酯B对细胞凋亡的影响
[0079] 将MDCK细胞培养于由等体积的DMEM培养基和F12培养基组成的培养液中，当细-7 -7 -6胞密度达到30-50％时分别加入浓度为1.25×10 M、5×10 M、2×10 M的银杏内酯B，继续培养48小时；倒去培养液，用PBS洗涤细胞一次，然后在15-25℃的条件下，用体积百分含量为4％的多聚甲醛(固定液)固定细胞60分钟。再用PBS洗涤一次，加入含有0.1％体积百分含量Triton X-100的0.1％质量百分含量的柠檬酸钠剂(透化液)，冰上(2-8℃)孵育2分钟。除去透化液，银杏内酯B处理的实验组、阳性对照组分别加入50μl TUNEL检测液，阴性对照组加入50μl荧光标记液(Label solution)，在潮湿的环境中，37℃避光孵育60分钟。用PBS洗涤3次，用抗荧光淬灭封片液(购自Beyotime，货号P0126)封片后荧光显微镜下观察、计数、照相。在光学显微镜下，凋亡细胞的细胞核被染成棕黄色，可见细胞核形态呈碎点状。在荧光显微镜下，选择450-500nm的激发波长和515-565nm的发射波长，凋亡细胞显示绿色荧光。随机选取5个高倍视野，统计各组(实验组、阳性对照组和阴性对照组)的凋亡细胞数并做统计分析。实验设三次重复，银杏内酯B对MDCK细胞凋亡的诱导作用如图9和图10所示。图9和图10中，control表示阴性对照组细胞的凋亡情况，gentamycin表示阳性对照组细胞的凋亡情况，银 杏内酯B表示加入银杏内酯B的实验组细胞的凋亡情况。结果表明，银杏内酯B不明显诱导MDCK细胞凋亡，证实银杏内酯B抑制囊泡的作用与其促进细胞凋亡无关。
[0080] 3、MDCK小管生成实验证实银杏内酯B能够促进MDCK形成小管样结构，作用呈剂量效应关系
[0081] 将MDCK细胞在分别含有1.25×10-7M、5×10-7M、2×10-6M的银杏内酯B和3T3成纤维细胞培养液(用含10％胎牛血清的DMEM培养液(购自美国Invitrogen公司，商品目录号12100-046，培养3T3成纤维细胞3日，所得培养液即为3T3成纤维细胞培养液)的三维基质胶中培养15天，每日换新鲜的含有银杏内酯B和3T3成纤维细胞培养液的培养液并照相，每孔跟踪10个以上小管，通过小管计数来评价银杏内酯B对MDCK细胞分化的影响。实验设三次重复，银杏内酯B对MDCK小管生成的促进作用如图11所示。其中，control表示用不含银杏内酯B的3T3成纤维细胞培养液培养MDCK细胞15天。结果表明，银杏内酯B能够促进MDCK细胞形成小管样结构，作用呈剂量效应关系。
[0082] 4、MDCK小管生成实验证实银杏内酯B能够促进囊泡形成小管样结构，作用呈剂量效应关系
[0083] 将MDCK细胞培养于含有10μM forskolin的三维基质胶中，培养4天后即可形-7 -7成直径为50-100μm的圆形囊泡；停止加forskolin，换成分别含有1.25×10 M、5×10 M、-6
2×10 M银杏内酯B的HGF或3T3成纤维细胞培养液继续培养，每日换新鲜的含有银杏内酯B的HGF或3T3成纤维细胞培养液。MDCK囊泡在3T3成纤维细胞培养液中出芽、突触、成索和成管，类似于肾脏上皮细胞小管生成过程。15天后，统计所形成的小管个数和小管的长度。实验设三次重复，银杏内酯B对囊泡形成小管样结构的促进作用如图12和13所示。
图12中，control表示用不含银杏内酯B的3T3成纤维细胞培养液培养4天的MDCK囊泡
15天。结果表明，银杏内酯B能够促进囊泡形成小管样结构，作用呈剂量效应关系。 [0084] 5、银杏内酯B的作用靶点和机制
2×10 M银杏内酯B的HGF或3T3成纤维细胞培养液继续培养，每日换新鲜的含有银杏内酯B的HGF或3T3成纤维细胞培养液。MDCK囊泡在3T3成纤维细胞培养液中出芽、突触、成索和成管，类似于肾脏上皮细胞小管生成过程。15天后，统计所形成的小管个数和小管的长度。实验设三次重复，银杏内酯B对囊泡形成小管样结构的促进作用如图12和13所示。
图12中，control表示用不含银杏内酯B的3T3成纤维细胞培养液培养4天的MDCK囊泡
15天。结果表明，银杏内酯B能够促进囊泡形成小管样结构，作用呈剂量效应关系。 [0084] 5、银杏内酯B的作用靶点和机制
[0085] 利用Western印迹技术，检测银杏内酯B对囊泡上皮细胞信号转导通路的影响。具体实验过程如下：
[0086] 将MDCK细胞培养至70％细胞密度，换无血清培养液培养24小时，然后分别加入含10μM forskolin的培养液，同时分别给予银杏内酯B，使其在培养基中的终浓度分别为-7 -7 -60M、1.25×10 M、5×10 M和2×10 M，同时以不含forskolin的培养液培 养的MDCK细胞作为control组，上述各组均刺激240min。
[0087] 提取上述各组细胞的总蛋白，用Bradford法作蛋白定量。SDS-PAGE电泳、转膜，加相应一抗(p-ERK，sc7383、ERK2，sc-153、B-raf，sc-166、Raf-1，sc-227和β-actin，sc47778，上述各抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司)和二抗(购自美国Amersham公司，商品目录号NA934VS)。用ECL PLUS(购自美国GE Healthcare公司，商品目录号ALSZR004-096412)化学发光，显影、定影。通过检测B-raf、Raf-1和p-ERK蛋白水平发现银杏内酯B对Ras-B-Raf-MEK-ERK信号通路的影响。在ADPKD中，B-raf表达增加、Raf-1表达减少，而银杏内酯B可以下调B-raf，上调Raf-1，并可抑制p-ERK磷酸化，结果如图14所示。
[0088] 实施例3、通过体外胚胎肾模型确定银杏内酯B对胚胎肾囊泡生长的抑制作用 [0089] 第1天下午将6周龄ICR小鼠(购自北京大学医学部实验动物中心)按照1∶1的数量进行雌雄同笼交配，第2天早上观察雌鼠是否有阴栓，若有阴栓泽表示雌鼠已怀孕半日，将没有阴栓的小鼠先分笼，下午再合笼，第二日再观察；将怀孕雌鼠继续单独喂养13天，第13天取胚胎肾用transwell板培养。
[0090] 取上述13.5天的小鼠胚胎肾在100μm的8-Br-cAMP(购自Sigma公司，货号B-1381)作用下，在肾组织中形成多发性、进行性生长的肾囊泡，可作为评价银杏内酯B预防和/或治疗ADPKD的体外整体器官模型。同时以不用8-Br-cAMP处理的小鼠胚胎肾作为对照。胚胎肾囊泡模型的示意图如图15所示。小鼠胚胎肾的囊泡形成过程如图16所示。其中，control表示没有用8-Br-cAMP处理的胚胎肾，8-Br-cAMP表示用100μm的8-Br-cAMP处理过的胚胎肾。
[0091] 将上述形成囊泡的胚胎肾分别用浓度为1.25×10-7M、5×10-7M、2×10-6M的银杏内酯B处理，实验设三次重复，银杏内酯B对胚胎肾囊泡生长的抑制作用如图17和18所示。图17中，control表示未用8-Br-cAMP和银杏内酯B处理的胚胎肾；8-Br-cAMP表示-7只用8-Br-cAMP处理，而未用银杏内酯B处理的胚胎肾；银杏内酯B 1.25×10 、银杏内酯-7 -6
B 5×10 、银杏内酯B 2×10 分别表示同时用8-Br-cAMP和相应浓度的银杏内酯B处理的胚胎肾。
B 5×10 、银杏内酯B 2×10 分别表示同时用8-Br-cAMP和相应浓度的银杏内酯B处理的胚胎肾。
[0092] 结果表明，银杏内酯B能够抑制8-Br-cAMP诱导的13.5天的小鼠胚胎肾组织内的囊泡形成，且抑制作用随银杏内酯B浓度的增加而增强。