一种青黛饮片及其制备方法

摘要

本发明提供了一种青黛饮片以及该饮片的制备方法。本发明青黛饮片服用方便，定量可控，具有较高的分散性和溶出度，与青黛传统饮片相比，本发明青黛饮片在胃、十二指肠中的吸收效果更好，并且同等剂量的本发明青黛饮片能够更好地降低四氯化碳所致小鼠急性肝脏损伤模型动物ALT、AST。

权利要求

1.一种青黛饮片，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药及辅料制备而成：

148.16-296.34份青黛、148.16-296.34份聚乙二醇-6000、16.66-2370.72份亲水性载体、0.33-3.34份十二烷基硫酸钠、19.99-40.01份崩解剂；其中，所述的崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠或者交联聚乙烯吡咯烷酮中的一种或二种以上的混合；亲水性载体为聚乙烯吡咯烷酮或者羟丙基甲基纤维素；它是由如下制备步骤制备而成：(1)称取148.16-296.34青黛和148.16-296.34份聚乙二醇-6000，制备固体分散中间体；

(2)将固体分散中间体过筛后，加入16.66-2370.72份亲水性载体、19.99-40.01份崩解剂及0.33-3.34份十二烷基硫酸钠，混匀，制粒，过筛，低温干燥，取出，整粒，压制成片，即得。

2.根据权利要求1所述的青黛饮片，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药及辅料制备而成：

148.16-296.34份青黛、148.16-296.34份聚乙二醇-6000、16.66-59.268份亲水性载体、0.33-3.34份十二烷基硫酸钠、19.99-40.01份崩解剂；所述的崩解剂为交联聚乙烯吡咯烷酮，所述的亲水性载体为羟丙基甲基纤维素。

3.根据权利要求2所述的青黛饮片，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药及辅料制备而成：

222.25份青黛、222.25份聚乙二醇-6000、25份羟丙基甲基纤维素、0.5份十二烷基硫酸钠、30份交联聚乙烯吡咯烷酮。

4.权利要求1-2任意一项所述的青黛饮片的制备方法，其特征在于：它包括如下制备步骤：(1)称取148.16-296.34青黛和148.16-296.34份聚乙二醇-6000，制备固体分散中间体；

(2)将固体分散中间体过筛后，加入16.66-2370.72份亲水性载体、19.99-40.01份崩解剂及0.33-3.34份十二烷基硫酸钠，混匀，制粒，过筛，低温干燥，取出，整粒，压制成片，即得。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：它包括如下制备步骤：

(1)称取148.16-296.34青黛和148.16-296.34份聚乙二醇-6000，制备固体分散中间体；

(2)将固体分散中间体过筛后，加入16.66-59.268份亲水性载体、19.99-40.01份崩解剂及0.33-3.34份十二烷基硫酸钠，混匀，制粒，过筛，低温干燥，取出，整粒，压制成片，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：它包括如下制备步骤：

(1)取222.25份过200目的青黛，222.25份聚乙二醇-6000，混匀，加热至聚乙二醇-6000呈熔融状态，搅拌，立即置于0℃环境中骤冷至固化，粉碎，得固体分散中间体；

(2)将固体分散中间体过3号筛，加入25份羟丙基甲基纤维素、0.5份十二烷基硫酸钠、30份交联聚乙烯吡咯烷酮，用30-95％V/V乙醇水溶液湿法制粒，过40目筛，45℃下干燥，取出，整粒，压制成片，即得。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的乙醇水溶液的浓度为50％V/V。

说明书

一种青黛饮片及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种青黛饮片以及该饮片的制备方法，属于药物领域。

背景技术

[0002] 青黛是爵床科植物马蓝Bapicacanthus cusia(Nees)Bremek.、蓼科植物蓼蓝Polygonum tinctorium Ait.或十字花科植物菘蓝，Isatis indigotica Fort.的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末或团块，性味咸，寒，归肝经，具有清热解毒、凉血止血、清肝泻火之功效。用于温病热盛、斑疹、吐血、咯血、小儿惊痫，疮肿、湿疹。近年来，对青黛研究发现，青黛的药理作用主要有抗菌，抗肿瘤和改善实验性肾小球肾炎。临床上主要用于鼻衄，上消化道出血，口疮，脓包疮，流行性的腮腺炎，中耳炎，骨折所致张力性水泡，癫痫，银屑病，慢性粒细胞白血病等。

[0003] 现代研究表明，青黛是由10％左右的有机成分和90％左右的无机成分组成的。其中，有机成分主要为靛蓝(indigo)C16H10N2O2，、靛玉红(indirubin)C16H10N2O2、色氨酮(tryptanthrin)C15H8N2O2、异靛蓝(isoindigo)C16H10N2O2、靛红(istain)C8H5NO2、N-苯基萘胺(N-PHenyl-2-napHthylamine)C16H13N、十九烷C19H40、α-谷甾醇、β-谷甾醇等，目前研究认为靛蓝和靛玉红为青黛最主要的两种有效成分，青黛的法定质量标准也以这两种成分做含量要求。无机成分70％以上的碳酸钙包括[Fe2(CO3)3、Al2(CO3)3等]、约10％的二氧化硅、约3％～5％的水分。以上成分均难溶于水。正是由于青黛的水不溶性，传统使用青黛的方法主要还是入丸散服用，正如在《本草蒙筌》中对青黛的记载：合丸制散随宜。“青黛不宜入汤剂的考证”，闵志强，等，四川中医，第28卷第1期，第52-54页，2010年，笔者对传统及现代应用统计后认为，青黛正确的临床用法应为：内服时宜入丸散，或直接以汤剂冲服；含有青黛的制剂入药时应直接以粉末入药或经有机溶剂提取后入药。

[0004] 当前，在内服使用青黛时，多是将青黛以汤剂冲服，或者将青黛直接制备成丸剂、散剂或者胶囊剂等制剂使用。但是，青黛中的靛蓝、靛玉红等有效成分在水、醇中溶解性差，导致了现有青黛饮片及制剂中药物的溶出度低，难以吸收，使得药物的吸收率较差；并且，青黛传统饮片呈粉末状，不利于直接吞服，且其质轻，以汤剂冲服时容易浮在汤汁表面，不方便患者饮用，特别是不适用于儿童、老人及吞咽困难的病人。

[0005] 为了解决使用青黛时存在的问题，亟需一种服用方便、溶出度及吸收率高的新型青黛饮片。

[0006] 有文献报道了利用固体分散技术来改善青黛脂溶性提取物的溶解性(“青黛脂溶性提取物固体分散体制备及溶解性研究”，周海云等，时珍国医国药，第18卷11期，第2756-2758页，2007年)，首先用醇提的方法对青黛脂溶性成分进行提取纯化，采用超细共研磨法、共沉淀法和普通研磨法将青黛95％醇提物制备成分散体系，比较了三种方法对靛玉红的表观溶解度的影响，实验表明，制备得到的超细共研磨物和共沉淀物中，靛玉红的表观溶解度明显高于普通研磨混合物。其中，共研磨法需要持久的超细粉碎，生产成本较高；
而普通研磨法，相对于共研磨法省去了超细粉碎，操作工序相对简便，但该方法不能改善靛玉红的溶解度；共沉淀法中所使用的PVP类材料，价格为PEG的3-5倍，且该方法中需要使用大量有机溶剂，生产完成后，还需将这些溶剂挥发完全，否则会危害人体健康，还会降低药物的分散度，该方法操作复杂，生产成本高。并且，以上三种方法均需要对青黛脂溶性成分进行提取，进一步加大了生产成本。

[0007] 目前，还没有将青黛原粉以分散片的形式制备成饮片的报道，也没有将青黛原粉制成固体分散体的相关报道。

发明内容

[0008] 本发明的技术方案是提供了一种青黛饮片。本发明的另一技术方案是提供了一种青黛饮片的制备方法。

[0009] 本发明提供了一种青黛饮片，它是由下述重量配比的原料药及辅料制备而成：

[0010] 148.16-296.34份青黛、148.16-296.34份聚乙二醇-6000、16.66-2370.72份亲水性载体、0.33-3.34份十二烷基硫酸钠、19.99-40.01份崩解剂；其中，所述的崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠或者交联聚乙烯吡咯烷酮中的一种或二种以上的混合；亲水性载体为聚乙烯吡咯烷酮或者羟丙基甲基纤维素。

[0011] 进一步地，它是由下述重量配比的原料药及辅料制备而成：

[0012] 148.16-296.34份青黛、148.16-296.34份聚乙二醇-6000、16.66-59.268份亲水性载体、0.33-3.34份十二烷基硫酸钠、19.99-40.01份崩解剂；所述的崩解剂为交联聚乙烯吡咯烷酮，所述的亲水性载体为羟丙基甲基纤维素。

[0013] 进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药及辅料制备而成的饮片：

[0014] 222.25份青黛、222.25份聚乙二醇-6000、25份羟丙基甲基纤维素、0.5份十二烷基硫酸钠、30份交联聚乙烯吡咯烷酮。

[0015] 本发明还提供了一种制备上述青黛饮片的方法，它包括如下制备步骤：

[0016] (1)称取148.16-296.34青黛和148.16-296.34份聚乙二醇-6000，制备固体分散中间体；

[0017] (2)将固体分散中间体过筛后，加入16.66-2370.72份亲水性载体、19.99-40.01份崩解剂及0.33-3.34份十二烷基硫酸钠，混匀，制粒，过筛，低温干燥，取出，整粒，压制成片，即得。

[0018] 进一步地，它包括如下制备步骤：

[0019] (1)称取148.16-296.34青黛和148.16-296.34份聚乙二醇-6000，制备固体分散中间体；

[0020] (2)将固体分散中间体过筛后，加入16.66-59.268份亲水性载体、19.99-40.01份崩解剂及0.33-3.34份十二烷基硫酸钠，混匀，制粒，过筛，低温干燥，取出，整粒，压制成片，即得。

[0021] 进一步优选地，它包括如下制备步骤：

[0022] (1)取222.25份过200目的青黛，222.25份聚乙二醇-6000，混匀，加热至聚乙二醇-6000呈熔融状态，搅拌，然后立即置于0℃环境中骤冷至固化，粉碎，得固体分散中间体；

[0023] (2)将固体分散中间体过3号筛，加入25份羟丙基甲基纤维素、0.5份十二烷基硫酸钠、30份交联聚乙烯吡咯烷酮，用30-95％V/V浓度的乙醇水溶液湿法制粒，过40目筛，45℃下干燥，取出，整粒，压制成片，即得。

[0024] 其中，所述乙醇水溶液的浓度为50％V/V。

[0025] 本发明青黛饮片直接将青黛原粉制备成分散片，青黛不需提取、纯化；将青黛原粉制备固体分散体，避免了对有效部位的提取过程，且生产方法简便，对生产设备无特殊要求，极大地节约了生产成本；本发明青黛饮片是由青黛原粉与PEG6000均匀分散后，与辅料混合制备而得，通过在辅料方面的优化，能够极大的改善靛蓝和靛玉红的溶出度，取得了意料不到的技术效果；临床服用更方便，可直接替代青黛传统饮片，能够含于口中吮服或吞服，或者加水分散后口服，适用于各类患者服用；具有较高的分散性和溶出度，在胃、十二指肠中的吸收效果更好，并且同等剂量的本发明青黛饮片能够更好地降低四氯化碳所致小鼠急性肝脏损伤模型动物ALT、AST，为临床提供了一种新的用药选择。

[0026] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的上述基本技术思想前提下，还可以作出其它多种形式的修改、替换和变更。

[0027] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0028] 图1空白溶剂HPLC图谱

[0029] 图2靛蓝专属性考察图谱

[0030] 图3靛玉红专属性考察图谱

[0031] 图4青黛饮片专属性考察图谱

[0032] 图5靛蓝标准曲线

[0033] 图6靛玉红标准曲线

[0034] 图7四氯化碳致小鼠急性肝损伤试验肝脏HE染色(空白对照组)，100×[0035] 图8四氯化碳致小鼠急性肝损伤试验肝脏HE染色(模型组)，100×

[0036] 图9四氯化碳致小鼠急性肝损伤试验肝脏HE染色(青黛原剂型组)，100×[0037] 图10四氯化碳致小鼠急性肝损伤试验肝脏HE染色(本发明青黛饮片组)，100×[0038] 图11人工胃液HPLC图谱

[0039] 图12胃灌注实验中靛蓝、靛玉红混合对照品的专属性考察图谱

[0040] 图13原剂型胃灌注液(灌注前)靛蓝、靛玉红的专属性考察图谱

[0041] 图14本发明青黛饮片胃灌注液(灌注前)靛蓝、靛玉红的专属性考察图谱[0042] 图15原位灌注实验中靛蓝标准曲线

[0043] 图16原位灌注实验中靛玉红标准曲线

[0044] 图17人工十二指肠液HPLC图谱

[0045] 图18十二指肠灌注实验中靛蓝、靛玉红混合对照品甲醇溶液专属性考察图谱[0046] 图19原剂型十二指肠灌注液(灌注前)靛蓝、靛玉红的专属性考察图谱[0047] 图20本发明青黛饮片十二指肠灌注液(灌注前)靛蓝、靛玉红的专属性考察图谱具体实施方式

[0048] 实施例1 本发明青黛饮片的制备

[0049] 取PEG6000 222.25g，青黛(过200目)222.25g，混匀，加热到85℃，PEG6000熔融后，于0℃环境中冷却30min，粉碎，过3号筛，加入30g PVPP，25g HPMC，0.5g十二烷基硫酸钠，以50％乙醇为粘合剂湿法制粒，过40目筛，45℃干燥5h，取出，整粒，压制成1000片，即得。

[0050] 本发明中所有的乙醇均为乙醇水溶液，其百分含量均为体积含量。

[0051] 实施例2 本发明青黛饮片的制备

[0052] 取PEG6000 148.16g，青黛(过200目)296.34g，混匀，加热至PEG6000熔融后，骤冷至固化，粉碎，过3号筛，加入19.99g PVPP，16.66g HPMC，0.33g十二烷基硫酸钠，以30％乙醇为粘合剂湿法制粒，过40目筛，45℃干燥5h，取出，整粒，压制成1000片，即得。

[0053] 实施例3 本发明青黛饮片的制备

[0054] 取PEG6000 296.34g，青黛(过200目)148.16g，混匀，加热至PEG6000熔融后，骤冷至固化，粉碎，过3号筛，加入40.01g PVPP，2370.72g HPMC，3.34g十二烷基硫酸钠，以95％乙醇为粘合剂湿法制粒，过40目筛，45℃干燥5h，取出，整粒，压制成1000片，即得。

[0055] 实施例4 本发明青黛饮片的制备

[0056] 取PEG6000 296.34g，青黛(过200目)148.16g，混匀，加热至PEG6000熔融后，骤冷至固化，粉碎，过3号筛，加入40.01g PVPP，59.268g HPMC，3.34g十二烷基硫酸钠，以70％乙醇为粘合剂湿法制粒，过40目筛，45℃干燥5h，取出，整粒，压制成1000片，即得。

[0057] 实施例5 本发明青黛饮片制备工艺的考察

[0058] 1、崩解剂的筛选

[0059] 【实验方法】将青黛分别加入PVPP、CCMC-Na、CMS-Na三种崩解剂，混合均匀，崩解剂含量为片重的6％，以5％PVP乙醇(50％)溶液为粘合剂，湿法制粒(40目)。60℃烘箱中-2干燥5个小时，取出，整粒。制成饮片，片剂硬度控制在4Kg·mm ，使每片含青黛药粉0.2g，片重0.5g。

[0060] 崩解时间测定方法：将1片饮片放置在20±1℃的100ml水中。振摇，计算崩解时间。

[0061] 分散均匀性测定方法：将崩解后的药液，过2号筛以测定分散均匀性(《中华人民共和国药典》2005版二部附录ⅩC)。

[0062] 【实验结果】结果见表1，从表1可看出三种崩解剂压片后均得到外观平整、光洁的饮片，且都能在20±1℃的100ml水中迅速崩解，，但崩解后未能形成均匀的混悬液，溶液底部有部分沉淀，崩解快慢为PVPP＞CCMC-Na＞CMS-Na。所以崩解剂暂定为PVPP。

[0063] 表1 不同崩解剂对饮片分散效果的影响

[0064]

[0065] 由于采用6％PVPP作为崩解剂制备的分散片水中崩解效果较好，所以无需进行进一步考察，最终PVPP用量定为片重的6％。

[0066] 2、助悬剂的筛选

[0067] 【实验方法】称取青黛(过200目筛)药粉适量，加入片重6％的PVPP，再分别加入10％的阿拉伯胶，10％的阿拉伯胶及3％聚乙二醇1500，3％的海藻酸钠，6％的羟丙甲纤维素，6％的泊洛沙姆以5％PVP50％乙醇溶液做粘合剂。湿法制粒，过40目筛，50℃鼓风干燥
5个小时。取出，整粒，压片。观察饮片外观、崩解时间是否符合药典要求、崩解后的溶液是否为均匀的混悬液。

[0068] 【实验结果】不同助悬剂对青黛饮片分散效果的影响结果见表2。从结果可以看出，加入助悬剂后，混悬情况较未加入助悬剂时有所改善，但并没有完全解决青黛的沉淀问题，混悬液仍有少量的沉淀存在。

[0069] 表2 不同助悬剂对青黛饮片分散效果的影响结果

[0070]

[0071] 实验表明，添加助悬剂并不能完全解决分散片中的沉淀问题，需要利用其他方法进行处理。

[0072] 3、药物与辅料混合方式的筛选

[0073] 实验以混悬性和溶出度为指标考察固体分散体对青黛饮片分散性能的影响。

[0074] 【实验方法】制备固体分散体：按1∶1比例称取青黛、PEG-6000适量，研钵中研磨15min左右，倒入烧杯中置85℃水浴75min，适当搅拌。取出烧杯立即放0℃环境中冷却30min。取出粉碎，过3号筛，即得。

[0075] 物理混合物：按1∶1比例称取青黛、PEG-6000适量，研钵中研磨15min左右，即得。

[0076] 制粒压片：将固体分散体和物理混合体分别加入片重5％的HMPC和6％的PVPP，用50％乙醇作为粘合剂，湿法制粒，过40目筛。45℃鼓风干燥箱中干燥5小时，取出整粒，压片，片剂硬度控制在4Kg·mm-2，使每片含青黛药粉0.2g，片重0.5g。

[0077] 考察饮片外观、崩解时间是否符合药典要求、崩解后的溶液是否为均匀的混悬液。

[0078] ①【溶出度测定方法】HPLC法测定样品中靛蓝和靛玉红的含量：色谱条件：色谱柱：ZORBAX Extend-C18(4.6×250mm，5μm)；检测波长：288nm，流动相：甲醇∶水(70∶30)，流速：1.0ml·min-1，柱温为25℃。(方法学考察见实施例5)

[0079] 溶出度(％)＝(A*C)/(AS*W)*100

[0080] 其中A：样品的峰面积；AS：标准品溶液的峰面积；C：标准品溶液的浓度；W：片剂的标示量

[0081] 样品的制备：分别取两种混合方式制成的饮片各2片，放入溶出仪中。温度37℃，转速100转/min，溶出时间为90min，溶出介质为900ml的1‰的盐酸溶液。90min后吸取溶出液，0.45μm滤膜滤过，取10ml过滤后的溶出液转移置称量瓶中，85℃的水浴蒸干。用胶头滴管吸取适量的N，N-二甲基甲酰胺溶液溶解称量瓶中的固体物，将溶液转移至5ml的容量瓶中，反复清洗数次，直至溶液无色。用N，N-二甲基甲酰胺溶液定容至5ml，过0.45μm的滤膜即得。

[0082] 药材样品的制备：精密称取青黛药粉5mg左右置10ml的容量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺溶液定容至10ml后超声溶解30分钟，过0.45μm的滤膜即得。

[0083] 标准品的制备：分别称取靛蓝10mg、靛玉红1mg置称量瓶中，用胶头滴管吸取适量的N，N-二甲基甲酰胺溶液溶解称量瓶中的固体物，将溶液转移至100ml的容量瓶中反复清洗数次，直至溶液无色。用N，N-二甲基甲酰胺溶液定容至100ml(作为母液使用)，精密量取标准品溶液各1ml置10ml的容量瓶中，定容。过0.45μm的滤膜即得。

[0084] 【实验结果】固体分散技术对饮片性能影响考察结果见表3。从结果可见，使用固体分散技术制备的饮片溶解后可迅速崩解并形成均一混悬液，无沉淀出现，靛蓝及靛玉红的溶出度均较物理混合制备的饮片有明显提高。所以可见固体分散技术对药物溶出度提高有明显作用。

[0085] 表3 固体分散技术对饮片性能影响考察结果

[0086]

[0087] ②溶出介质的筛选

[0088] 【试验方法】取固体分散技术制备的青黛饮片各6片，溶出介质为0.5％吐温80溶液、0.5％和1％十二烷基硫酸钠溶液。溶出介质事先超声以排除溶解在溶出介质中的空气。用量筒分别量取900ml的溶出液倒入6个溶出杯中，启动搅拌桨，转速为100r/min，温度37℃等转速平稳后加入青黛饮片。90分钟后吸取溶出液过0.45μm的滤膜即得。

[0089] 【试验结果】饮片在不同溶出介质溶出度考察结果见表4。从结果可见，靛玉红在3种溶出介质中溶出度相差不大，但靛蓝溶出度在1％十二烷基硫酸钠溶液中最高，所以最终选择用1％十二烷基硫酸钠溶液作为测定溶出度时的溶出介质。

[0090] 表4 饮片在不同溶出介质溶出度考察结果(n＝2)

[0091]

[0092] ③饱和溶解度的测定

[0093] 配置足量的1％十二烷基硫酸钠溶液，超声溶解脱气后，分别分装在3个500ml的锥形瓶中，每瓶装300ml。称取3份3g左右的青黛药粉，分别倒入3个锥形瓶中，用磁力搅拌器搅拌5个小时后静置12个小时，备用。吸取25ml上清液，85℃水浴蒸干，用N-N二甲基甲酰胺溶液溶解，并定容为10ml，过0.45μm的滤膜既得。采用高效液相色谱法测定标准品和样品中靛蓝和靛玉红的含量，计算饱和溶解度。

[0094] 溶出介质饱和溶解度测定结果见表5。根据表5溶出度折算饮片中靛蓝和靛玉红在1％十二烷基硫酸钠溶液中的溶解度大约为5.6、0.3μg/m1，大大低于二者的饱和溶解度，所以符合溶出度要求的漏槽条件。

[0095] 表5 溶出介质饱和溶解度测定结果(n＝3)

[0096]

[0097] 4、PEG-6000用量考察

[0098] 【试验目的】为考察PEG用量对分散效果的影响，故设计该实验。

[0099] 【试验方法】制备固体分散体：分别按1∶1、1∶2及2∶1比例称取青黛、PEG-6000适量，研钵中研磨15min左右，倒入烧杯中置85℃水浴75min，适当搅拌。取出烧杯立即放0℃环境中冷却30min。取出粉碎，过3号筛，即得。

[0100] 制粒压片：将上述所得固体分散体加入片重5％的HPMC和6％的PVPP；用50％乙醇作为粘合剂，湿法制粒，过40目筛。45℃鼓风干燥箱中干燥5小时，取出整粒，压片，片剂-2硬度控制在4Kg·mm ，片重0.5g。

[0101] 利用HPLC测定靛蓝与靛玉红的溶出度进行比较。

[0102] 【试验结果】

[0103] 表6 PEG6000用量考察结果(n＝3)

[0104]

[0105] 从表6可知，用PEG6000∶青黛药粉＝1∶1制备的分散片，辅料用量较少且溶出效果较好，所以最终选择该比例。

[0106] 5、亲水性载体考察

[0107] (1)亲水性载体种类的筛选

[0108] 【试验方法】将固体分散体分别加入片重5％的HMPC和PVPP，5％的PVP和PVPP，用50％乙醇作为粘合剂，湿法制粒，过40目筛。45℃鼓风干燥箱中干燥5小时，取出整粒，-2压片，片剂硬度控制在4Kg·mm ，使每片含青黛药粉0.2g，片重0.5g。

[0109] 利用HPLC测定靛蓝与靛玉红的溶出度进行比较(测定方法见实施例5)。

[0110] 【试验结果】试验结果见表7。从结果可知HPMC制备的饮片溶出度大大高于PVP，所以亲水载体选择HPMC。

[0111] 表7 不同处方饮片性能考察结果(n＝3)

[0112]

[0113] (2)亲水性载体用量的筛选

[0114] 【试验方法】制备固体分散体：按1∶1比例称取青黛、PEG-6000适量，研钵中研磨15min左右，倒入烧杯中置85℃水浴75min，适当搅拌。取出烧杯立即放0℃环境中冷却30min。取出粉碎，过3号筛，等量分为三份，即得。

[0115] 制粒压片：将上述所得固体分散体①按固体分散体：HPMC(17.78∶1)加入HPMC及片重6％的PVPP；②按固体分散体：HPMC(10∶1)加入HPMC及片重6％的PVPP；③按固体分散体：HPMC(1∶4)加入HPMC及片重6％的PVPP；用50％乙醇作为粘合剂，湿法制粒，-2过40目筛。45℃鼓风干燥箱中干燥5小时，取出整粒，压片，片剂硬度控制在4Kg·mm ，片重0.5g。

[0116] 利用HPLC测定靛蓝与靛玉红的溶出度进行比较。

[0117] 【试验结果】表8辅料用量考察结果(n＝3)

[0118]

[0119] 从表8可见，不同辅料用量所得分散片溶出度效果差异较小(＜5％)，但考虑到若辅料用量过大，每日日服分散片量较多，不方便病人服用，所以最终选择固体分散体与HPMC比例为17.78∶1，即HPMC占片重的5％w/w。

[0120] 6、增溶性辅料的考察

[0121] 预试验时发现十二烷基硫酸钠可增加青黛饮片的溶出度，也有文献表明十二烷基硫酸钠可增加靛蓝在制剂中的溶出。设计实验考察0.1％和0.5％的十二烷基硫酸钠对青黛饮片溶出度的影响。

[0122] 【实验方法】

[0123] 将固体分散体加入片重5％的HMPC和6％PVPP，再分别加入片重0.1％和0.5％十二烷基硫酸钠用50％乙醇作为粘合剂，湿法制粒，过40目筛。45℃鼓风干燥箱中干燥5-2小时，取出整粒，压片，片剂硬度控制在4Kg·mm ，使每片含青黛药粉0.2g，片重0.5g。

[0124] 利用HPLC测定靛蓝与靛玉红的溶出度进行比较。

[0125] 【试验结果】

[0126] 增溶性辅料对溶出度影响考察结果见表9。从结果可以看出，加入不同量的十二烷基硫酸钠后靛蓝及靛玉红的溶出度均较以前有一定程度提高，但二者提高程度基本相当，考虑到辅料用量应尽量小和安全性，拟定0.1％十二烷基硫酸钠为增溶剂。

[0127] 表9 增溶性辅料对溶出度影响考察结果

[0128]

[0129] 7、小结

[0130] 文献：“青黛脂溶性提取物固体分散体制备及溶解性研究”中公开了，将青黛脂溶性成分与PEG6000分散后，再加上大剂量的HPMC经普通混合制得的分散体，并未改善靛玉红的溶解度。而在本发明中，采用固体分散技术，将青黛与PEG6000分散后，再加上小剂量的HPMC及其他辅料，通过普通混合制得的分散片，与物理混合物相比，靛蓝和靛玉红具有较高的溶出度。表明，本发明青黛饮片中，特殊的原辅料组合，改善了青黛有效成分的溶解性，与上述文献相比，本发明取得了意料不到的技术效果。

[0131] 实施例6 本发明青黛饮片溶出度的测定

[0132] 取三批青黛饮片(实施例1制得)各6片，溶出介质为1％十二烷基硫酸钠溶液。溶出介质事先超声以排除溶解在溶出介质中的空气。用量筒分别量取900ml的溶出液倒入
6个溶出杯中，启动搅拌桨，转速为100r/min，温度37℃等转速平稳后加入饮片。90分钟后及时吸取溶出液过0.45μm的滤膜，计算溶出率既得，结果见表10。(具体测定方法参见实施例2)

[0133] 表10 青黛饮片溶出度测定结果

[0134]

[0135] 实施例7 本发明青黛饮片的重量差异

[0136] 按《中华人民共和国药典》2005年版二部(附录ⅠA)片剂项下的规定，对本品三批样品(实施例1制得)的重量差异等进行了检查，结果见表11。

[0137] 表11 青黛分散片重量差异检查结果

[0138]

[0139] 由以上结果可知，本发明青黛饮片片重均匀，方便患者定量使用。实施例8本发明青黛分散片含量测定的方法学考察

[0140] 1、实验材料与仪器

[0141] 岛津系列高效液相色谱仪(SPD-10AVP检测器、LC-10ATVP泵、CTO-10ASVP柱温箱)；KQ-400DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱：ZORBAX Extend-C18(4.6×250mm，5μm)；靛蓝(批号：110716-200509，中国药品生物制品检定所)；靛玉红(批号：110717-200204，中国药品生物制品检定所)；青黛饮片(实施例1制得)。

[0142] 2、实验内容

[0143] 【色谱条件】

[0144] (1)检测波长的选择对靛蓝标准品、靛玉红标准品进行紫外全波长扫描。结果靛蓝和靛玉红分别在288nm和292.5nm处有最大吸收，经综合考虑决定以288nm为检测波长。

[0145] (2)色谱柱选择 以同样色谱条件，同一对照品溶液，对三种常用色谱柱进行考察，结果安捷伦色谱柱分离效果最好，最终选用安捷伦色谱柱。

[0146] (3)流动相 试验考察了流动相中甲醇与水的两种比例(72∶28与70∶30)，结果各项数据均合格，但是甲醇∶水＝72∶28时靛蓝的峰略微受前面溶剂峰影响，故最终确定流动相为甲醇∶水(70∶30)。

[0147] (4)流速、柱温选择流速1.0ml·min-1，柱温25℃。

[0148] (5)进样量 由于本试验采用的仪器为岛津液相色谱仪(型号：SPD-10AVP检测器、LC-10ATVP泵、CTO-10ASVP柱温箱)，为手动进样，其定量环为20μl为了确保进样量准确，故确定进样量20μl。

[0149] 【供试品溶液制备】

[0150] 由于之前实验室对青黛原饮片已进行过含量检测方法的详细考察，根据当时考察结果，用N，N-二甲基甲酰胺进行超声提取效果较好，所以本供试品溶液配制方法直接定为：称取青黛饮片粉末0.1g，加入N，N-二甲基甲酰胺80ml，超声30min，流水冷却，定容至100ml，取2ml稀释至10ml，用0.22μm微孔滤膜过滤即得。

[0151] 【专属性】

[0152] 分别配制空白溶剂、靛蓝标准品溶液、靛玉红标准品溶液、供试品溶液，以上述色谱条件进行试验，表明该方法专属性很好，各成分和溶剂之间干扰。(见图1-4)[0153] 【线性与范围】

[0154] 分别精密称取靛蓝、靛玉红对照品4.48、6.55mg，置两个100ml量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺超声使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取5.0ml置50ml量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀；再精密吸取0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ml分别置10ml量瓶中，-1以上述色谱条件进样测定，以进样浓度(μg·ml )为X，峰面积(mv)为Y，做线性回归，公
2
式分别为：Y＝97107X+7030.3，Y＝118298X-4231.1，r ≥0.999，故靛蓝和靛玉红分别在-1 -1 -1 -1
0.28μg·ml ～4.48μg·ml ，0.33μg·ml ～6.55μg·ml 范围内线性关系良好。(见图5-6)

[0155] 【准确度】

[0156] 按照药典要求，采用加样回收率试验来考察方法准确度，在已知含量的供试品中加入一定量的标准品，得到三种浓度溶液，按照上述色谱条件每种平行测定3次共9次，均符合药典要求。结果见表12。

[0157] 表12 加样回收率

[0158]

[0159] 【精密度】

[0160] (1)重复性

[0161] 按照药典要求，取同一供试品溶液，按照上述色谱条件，平行测定6次，靛蓝和靛玉红RSD(％)分别为0.31％和1.74％，均符合药典要求。

[0162] (2)重现性

[0163] 取同一供试品溶液，按照上述色谱条件，制备6个样品，分别进行测定，靛蓝和靛玉红RSD(％)分别为1.07％和2.93％，均符合药典要求。

[0164] 以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

[0165] 实验例1本发明青黛饮片与青黛原剂型抗四氯化碳致小鼠急性肝损伤试验[0166] 1、试验材料

[0167] 【动物】试验选用昆明种小鼠，48只，雌雄各半，体重18～22g，购于四川大学实验动物中心(实验动物生产许可证号SCXK(川)2004-09)，动物到达后饲养于成都百康医药工业药理毒理研究院大小鼠动物房，动物使用许可证号SYXK(川)2008-008，喂养鼠全价颗粒饲料。

[0168] 【药品及试剂】

[0169] 青黛：四川江油恒源药业提供，批号：090301。试验时取青黛药粉适量，加纯化水配置成1g/ml混悬液即可。

[0170] 本发明青黛饮片粉末：试验时取青黛饮片(实施例1制得)粉末适量(含青黛药粉44.45％)，加纯化水配置成含青黛1g/ml混悬液即可。

[0171] 门冬氨酸氨基转移酶(AST)IFCC法检测试剂盒(速率法)：规格：R1：60ml/支，R2：45ml/支，批号：0908201四川省迈克科技有限责任公司

[0172] 碱性磷酸酶(ALP)AMP法检测试剂盒(速率法)：规格：R1：60ml/支，R2：45ml/支，批号：0908181四川省迈克科技有限责任公司

[0173] 组织标本固定液(FAA液)：分别量取95％乙醇5895ml、甲醛800ml、冰乙酸400ml和纯化水905ml倒入塑料桶，混匀即可。

[0174] 脱水试剂：取95％乙醇用纯化水稀释配成70％、80％和90％乙醇溶液。

[0175] 透明试剂：二甲苯(AR级)，批号：20081010，规格：500ml/瓶，成都科龙化工试剂厂生产。

[0176] 苏木素染液：称取苏木素1.2g，加入450ml纯化水混匀，再先后加入碘酸钠0.24g、硫酸铝钾30g，待其完全溶解，最后加入甘油150ml，搅拌混匀，即得。

[0177] 伊红染液：量取95％乙醇505ml和纯化水95ml，混匀，加入伊红3g，搅匀使溶解，即得。

[0178] 盐酸-乙醇分化液：取95％乙醇438ml和纯化水156ml，混匀，再缓慢加入浓盐酸6ml，搅拌混匀，即得。

[0179] 封片试剂：中性树胶，批号：061110，规格：100g/瓶，中国上海标本模型厂生产。

[0180] 盖玻片清洗液：取纯化水500ml，加入重铬酸钾50g，搅拌、溶解、混匀，再向其中缓慢加入浓硫酸50ml，搅拌混匀即可。

[0181] 【仪器】

[0182] TMS-1024i型全自动生化分析仪；常州中威TSJ-III电脑自动组织脱水机；

[0183] 常州中威BMJ-III型包埋机；常州中威PHY-III病理组织漂烘仪；

[0184] 徕卡RM2126轮转式切片机；北京永光明202-O型台式干燥箱；

[0185] 日本奥林巴斯BX41-32P02显微镜；常州中威BMJ-III型冷冻台。

[0186] 2、试验方法与结果

[0187] 【试验方法】

[0188] 取健康昆明种小鼠48只，随机分为空白对照组、模型组、青黛原剂型组和青黛饮片组，按表13进行给药。于末次给药6h后，小鼠按0.1ml/10g腹腔注射0.08％CCl4花生油溶液进行造模。小鼠造模后，禁食过夜不禁水，24h后全部小鼠称重后，摘眼球取血，离心，分离出血清，测定ALT、AST。采血后，迅速解剖，取出肝脏，称重，计算脏器指数。肝脏固定3天后，进行组织样本取材。将切取好的组织块分类放入脱水盒内，并装入对应的蜡块标签。进行脱水、透明及浸蜡，常规石蜡包埋，组织切片，厚0.4μm，每个蜡块切取一张切片，H.E.染色，中性树胶封片。光学显微镜检查肝组织有无肝细胞变性坏死、肝小叶炎细胞浸润、胆小管扩张淤胆、肝血窦增宽充血、汇管区纤维增生、胆管及血管增生、胆管上皮变性坏死及汇管区炎细胞浸润等指标，并对以上病变程度进行分级评分，评分标准见表14。BI-2000医学图像分析系统进行图像采集。数据统计时首先进行正态性检验，符合正态则采用excel中F检验进行方差齐性检验，然后选择t检验进行统计，不符合正态性检验则采用非参数检验进行统计。

[0189] 表13 青黛抗四氯化碳致小鼠急性肝损伤试验给药方案

[0190]

[0191] 表14 小鼠肝脏病理组织学检查评分表

[0192]

[0193] 【结果】

[0194] 脏器指数检查结果显示，与空白组比较，模型组小鼠肝脏脏器指数极显著性升高，表明急性肝损伤模型造模成功。与模型组比较，青黛原剂型组及饮片组未见统计学差异，表明两种剂型青黛药液对急性肝损伤模型小鼠肝脏脏器指数无明显作用，结果见表15。

[0195] 表15不同剂型青黛抗四氯化碳致小鼠急性肝损伤试验肝脏脏器指数检测结果[0196]组别 空白对照组 模型组 青黛原剂型组 青黛饮片组
脏器指数(10g/g) 0.44±0.036 0.53±0.078△△△ 0.51±0.064 0.53±0.054[0197] 注：模型组与空白组比较△△△P＜0.001

[0198] 肝功能检测结果显示，与空白组比较，模型组小鼠ALT和AST均极显著性升高，表明急性肝损伤模型造模成功。与模型组比较，青黛原剂型组及饮片组分别能明显和显著降低小鼠ALT，显著和极显著降低小鼠AST，表明青黛有对抗四氯化碳致小鼠急性肝损伤作用，其中青黛饮片效果优于原剂型青黛药粉，结果见表16。

[0199] 表16不同剂型青黛抗四氯化碳致小鼠急性肝损伤试验肝功检测结果

[0200]组别 空白对照组 模型组 青黛原剂型组 青黛饮片组
ALT(U/L)
40.60±5.92 279.58±156.66△△△ 159.02±90.44* 119.96±31.66**
AST(U/L)
128.23±23.30 572.90±226.65△△△ 312.50±124.94** 278.70±63.01***[0201] 注：模型组与空白组比较△△△P＜0.001，给药组与模型组比较*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。

[0202] 病理检查结果显示：①取样时肉眼观察：空白对照组小鼠鼠肝脏外观轮廓、质地及颜色正常。模型组、青黛原剂型组及饮片组小鼠肝脏外观均发现有明显肿胀，颜色呈淡黄色。

[0203] ②镜下观察结果描述：

[0204] 空白组：可见肝小叶完整，界板无破坏，小叶轮廓清楚，其中央静脉及汇管区仍保持正常分布，血管内皮完整清晰，肝细胞索排列整齐，核膜、核仁清楚，胞质丰富、淡染。(见图7)

[0205] 模型组：可见肝小叶结构紊乱不清，肝细胞浊肿、空泡、嗜酸性变，坏死明显，呈带状或大片状分布，并伴有弥漫性炎细胞浸润，血管内皮中度变性、坏死脱落。(见图8)[0206] 原剂型组：可见肝脏中央静脉血管内皮坏死脱落，血管周肝细胞浊肿，空泡变性，呈带状分布，少量肝细胞坏死，仅可见炎细胞轮廓，核消失，肝细胞坏死区伴有少量散在的炎细胞浸润；病理改变性质同模型组基本一致，但程度较轻。(见图9)

[0207] 饮片组：可见肝脏中央静脉血管内支轻度坏死脱落，管周肝细胞浊肿，空泡变性，成小灶状分布，少量肝细胞坏死，核消失；病理改变性质同模型组基本一致，但程度较轻。(见图10)

[0208] 组织病理学检查综合肉眼与镜下所见，模型组肝脏病理损害显著，与空白对照组比较其肝脏病变程度综合评分极显著升高，说明造模成功。各给药组与模型组比较，肝脏病理损害的病变程度综合评分均有下降，其中饮片组降低有极显著差异，原剂型组的降低有显著差异，说明两种剂型的青黛均能减轻四氯化碳所致小鼠肝脏病理性损伤，其中饮片剂型效果更佳，结果见表17。

[0209] 表17不同剂型青黛抗四氯化碳致小鼠急性肝损伤试验病理检查结果

[0210]组别 空白对照组 模型组 青黛原剂型组 青黛饮片组
评分合计(分) 0.00±0.00 6.27±1.01△△△ 4.36±1.50** 4.25±0.97***[0211] 注：模型组与空白组比较△△△P＜0.001，给药组与模型组比较*P＜0.05**P＜0.01 ***P＜0.001

[0212] 3、小结

[0213] 综上，可以看出两种剂型的青黛均能降低四氯化碳所致小鼠急性肝脏损伤模型动物ALT、AST，减轻病理性损伤，其中饮片剂型效果更佳。本发明青黛饮片能使药物溶出增加，更利于有效成份的吸收。

[0214] 实验例2本发明青黛饮片与青黛原剂型在大鼠原位灌注模型吸收比较试验[0215] 1、试验材料

[0216] 【动物】

[0217] 试验选用SD大鼠，雌雄各半，体重180～220g，购于四川大学实验动物中心(实验动物生产许可证号SCXK(川)2004-09)，动物到达后饲养于成都百康医药工业药理毒理研究院大小鼠动物房，动物使用许可证号SYXK(川)2008-008，喂养鼠全价颗粒饲料。

[0218] 【仪器】

[0219] 岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪 岛津国际贸易(上海)有限公司

[0220] 岛津AUW120D型电子天平 岛津(香港)有限公司

[0221] 郑州长城SHB-III型循环水多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司

[0222] 天津恒奥HS10260D型超声波 天津市恒奥科技发展有限公司

[0223] TDL-5-A型离心机 上海安亭科学仪器厂

[0224] 法国MILLIPORE SIMS50000纯水器 法国MILLIPORE公司

[0225] 恒流蠕动泵 保定兰格恒流有限公司

[0226] 【药品及主要试剂】

[0227] 青黛：四川江油恒源药业提供，批号：090301。

[0228] 青黛饮片粉末：青黛饮片由实施例1制得。

[0229] 人工胃液(不含胰胃白酶)：按中国药典2005版二部附录XA项下配制，不加胃蛋白酶；(取稀盐酸(盐酸234ml加水至1000ml)16.4ml，加水约800ml，摇匀后加水稀释成1000ml，既得。)

[0230] 人工肠液(不含胰蛋白酶)：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，既得。

[0231] 青黛原剂型胃灌注液：称取青黛药粉1g于棕色容量瓶中，加入人工胃液至100ml，振摇使均匀，既得。(以下所述的“青黛原剂型饮片”是指将青黛药粉直接用药。)[0232] 本发明青黛饮片胃灌注液：称取本发明青黛饮片药粉2.3g于棕色容量瓶中，加入人工胃液至100ml，振摇使均匀，既得。

[0233] 青黛原剂型肠灌注液：称取青黛药粉1g，加入人工肠液100ml，振摇使均匀，既得。

[0234] 本发明青黛饮片肠灌注液：称取本发明青黛饮片药粉2.3g，加入人工肠液100ml，振摇使均匀，既得。

[0235] N，N-二甲基甲酰胺：规格：500ml/瓶，批号：20090804，成都市科龙化工试剂厂提供。

[0236] 色谱甲醇：规格：4L/瓶，北京迪科马科技有限公司提供。

[0237] 靛蓝对照品：规格：20mg/瓶，批号：110716-200509，中国药品生物制品检定所提供。

[0238] 靛玉红对照品：规格：20mg/瓶，批号：110717-200204，中国药品生物制品检定所提供。

[0239] 戊巴比妥钠：规格：25g/瓶，批号：050604，北京化学试剂分公司(德国)进口分公司生产。

[0240] 2、试验方法与结果

[0241] (1)大鼠原位胃灌注试验

[0242] ①试验方法

[0243] 取体重200±20g的SD大鼠8只，雌雄各半，实验前禁食不禁水16h，腹腔注射4mg/ml戊巴比妥钠溶液40mg/kg/10ml，麻醉后固定。沿腹中线切开腹腔，暴露胃，在贲门、幽门两处各切一小口，用人工胃液将胃洗净，结扎贲门。用注射器吸取胃灌注液2ml，从幽门小口注射到胃内，使混合均匀，结扎幽门。将胃放回腹腔，保持体温37℃左右。2h后取出胃，将胃内容物转移至50ml烧杯中，用人工胃液少量多次地洗涤胃内部，将洗涤液一并转入25ml量瓶，用人工胃液定容，得终浓度为Ct的胃灌注样品。以胃灌注液中靛蓝、靛玉红浓度为初浓度C0，计算平均吸收百分率。

[0244] ②胃灌注液中靛蓝、靛玉红浓度的HPLC测定

[0245] 【色谱条件】同实施例5中靛蓝、靛玉红测定方法。

[0246] 【标准品的制备】

[0247] 分别称取靛蓝10.04mg、靛玉红1.10mg置称量瓶中，用胶头滴管吸取适量的N，N-二甲基甲酰胺溶液溶解称量瓶中的固体物，将溶液转移至100ml的容量瓶中反复溶解数次，直至溶液无色。用N，N-二甲基甲酰胺溶液定容至100ml(作为母液使用)，精密量取标准品溶液各1ml置10ml的容量瓶中，定容。过0.45μm的滤膜即得。

[0248] 【供试品溶液的制备】

[0249] 吸取0.5ml人工胃液、0.5ml胃灌注液(灌注前)、5ml胃灌注液(灌注后)，水浴蒸干，用少量N，N-二甲基甲酰胺多次超声使溶解，合并药液，定容成10ml(灌注液3000r离心10min)，过0.45μm的滤膜即得。

[0250] 【方法专属性考察】

[0251] 取人工胃液、靛蓝靛玉红对照品甲醇溶液、原剂型及饮片胃灌注前后样品，分别进样，在上述色谱条件下分离测定，色谱图见图11～14。人工胃液中成分不干扰药物测定，靛蓝、靛玉红的保留时间分别约12、20min，胃灌注样品溶液中靛蓝、靛玉红的保留时间一致。

[0252] 【标准曲线及线性范围】

[0253] 分别精密吸取靛蓝、靛玉红混合对照品贮备液适量，置6个10ml棕色量瓶中，用甲醇释定容，摇匀，得浓度分别为靛蓝/靛玉红2.008/0.22、4.016/0.44、6.024/0.66、8.032/0.88、10.04/1.1、20.08/2.2μg/ml列标准工作液。10μl进样测定，以峰面积A对靛蓝及靛玉红浓度C(μg/ml)进行线性回归，得靛蓝标准曲线方程：A＝66421C+1111.4，R＝
0.9999(n＝6)，线性范围为2.008～20.08μg/ml；靛玉红标准曲线A＝77938C-1924.2，R＝0.9999(n＝6)，线性范围为0.22～2.2μg/ml。(见图15～16。)

[0254] 【稳定性试验】

[0255] 配制青黛原剂型及青黛饮片胃灌注液，置37℃水浴中避光保温2.5h，分别于0h和2.5h吸取1ml灌注液(每次吸取前振摇使溶液均匀)，水浴蒸干，用少量N，N-二甲基甲酰胺多次超声使溶解，合并药液，定容成10ml(灌注液3000r离心10min)，过0.45μm的滤膜后进行测定，考察胃灌注液稳定性。青黛原剂型及青黛饮片胃灌注液在37℃条件下，避光保温2.5h，靛蓝及靛玉红的剩余率均大于97％(n＝2)，满足样品分析要求，结果见表18。

[0256] 表18 胃灌注液稳定性试验结果(n＝2)

[0257]

[0258] 【精密度试验】

[0259] 制备青黛原剂型胃灌注液样品，于1d内重复测定5次，计算日内精密度；每日测定1次，连续测定5d，计算日间精密度，结果见表19。结果靛蓝、靛玉红日内及日间精密度均小于3％，满足样品分析要求。

[0260] 表19 胃灌注液精密度试验结果(n＝5)

[0261]

[0262] ③原位胃灌注试验结果

[0263] 根据公式吸收率＝(C0×V0-Ct×Vt)/(C0×V0)×100％，计算两种剂型的胃灌注液在大鼠胃中的吸收率。结果显示，青黛原剂型胃灌注液平均吸收率较小(靛蓝3.48％，靛玉红3.35％)，而青黛饮片胃灌注液在大鼠胃中平均吸收率分别为靛蓝4.62％，靛玉红5.79％，均高于原剂型，说明青黛饮片在大鼠胃中的吸收效果优于青黛原剂型饮片，结果见表20。

[0264] 表20 大鼠原位胃灌注液试验结果

[0265]

[0266] ④小结

[0267] 本部分建立了原位胃灌注样品的HPLC测定方法，该法快速灵敏、专属性强，能达到药物分析的要求。检测结果显示，与青黛原剂型饮片比较，青黛饮片在胃中的吸收效果更好。

[0268] (2)大鼠原位肠灌注试验

[0269] ①试验方法

[0270] 取体重200±20g的SD大鼠8只，雌雄各半，实验前禁食不禁水16h，腹腔注射4mg/ml戊巴比妥钠溶液40mg/kg/10ml，麻醉后固定。沿腹中线切开腹腔，分离十二指肠，于两端各切一小口，在上端小口处插管、结扎。用37℃人工肠液缓缓洗去肠管内容物至净。在实验肠管下端小口处插管、连同上端插管、装有10ml肠灌注液的玻璃瓶，形成回路，开动蠕动泵，控制循环速度为2.5ml/min。循环2h后，用生理盐水将肠中药液冲洗干净，与玻璃瓶中药液合并，用人工肠液定容为50ml，得终浓度为Ct的胃灌注样品。以胃灌注中液靛蓝、靛玉红浓度为初浓度C。，计算平均吸收百分率。

[0271] ②十二指肠灌注液中靛蓝、靛玉红浓度的HPLC测定

[0272] 【色谱条件】同实施例5中靛蓝、靛玉红测定方法。

[0273] 【标准品的制备】同“胃灌注液中靛蓝、靛玉红浓度的HPLC测定-标准品的制备”。

[0274] 【供试品溶液的制备】

[0275] 吸取0.5ml人工十二指肠液、0.5ml十二指肠灌注液(灌注前)、10ml十二指肠灌注液(灌注后)，水浴蒸干，用少量N，N-二甲基甲酰胺多次超声使溶解，合并药液，定容成10ml(灌注液3000r离心10min)，过0.45μm的滤膜即得。

[0276] 【方法专属性考察】

[0277] 取人工十二指肠液、靛蓝及靛玉红对照品溶液、原剂型及饮片十二指肠灌注前后样品，分别进样，在上述色谱条件下分离测定，色谱图见图17～20。人工十二指肠液中成分不干扰药物测定，靛蓝、靛玉红的保留时间分别约12、20min，十二指肠灌注样品溶液中靛蓝、靛玉红的保留时间一致。

[0278] 【标准曲线及线性范围】同“胃灌注液中靛蓝、靛玉红浓度的HPLC测定-标准曲线及线性范围”。

[0279] 【稳定性试验】

[0280] 配制青黛原剂型及青黛饮片十二指肠灌注液，置37℃水浴中避光保温2.5h，考察十二指肠灌注液稳定性。青黛原剂型及青黛饮片十二指肠灌注液在37℃条件下，避光保温2.5h，靛蓝及靛玉红的剩余率均大于98％(n＝2)，满足样品分析要求，结果见表21。

[0281] 表21 十二指肠灌注液稳定性试验结果(n＝2)

[0282]

[0283] 【精密度试验】

[0284] 制备青黛原剂型十二指肠灌注液样品，于1d内重复测定5次，计算日内精密度；每日测定1次，连续测定5d，计算日间精密度，结果见表22。结果靛蓝、靛玉红日内及日间精密度均小于3％，满足样品分析要求。

[0285] 表22 十二指肠灌注液稳定性试验结果(n＝5)

[0286]

[0287] ③原位十二指肠灌注试验结果

[0288] 根据公式吸收率＝(C0×V0-Ct×Vt)/(C0×V0)×100％，计算两种剂型的十二指肠灌注液在大鼠十二指肠中的吸收率。结果显示，青黛原剂型十二指肠灌注液平均吸收率较小(靛蓝7.73％，靛玉红8.10％)，而青黛饮片十二指肠灌注液在大鼠十二指肠中平均吸收率分别为靛蓝8.37％，靛玉红14.04％，均高于原剂型灌注液，说明青黛饮片在大鼠十二指肠中的吸收效果优于青黛原剂型饮片，结果见表23。

[0289] 表23 大鼠原位十二指肠灌注液试验结果

[0290]

[0291] ④小结

[0292] 本部分建立了原位肠灌注样品的HPLC测定方法，该法快速灵敏、专属性强，能达到药物分析的要求。检测结果显示，与青黛原剂型饮片比较，青黛饮片在十二指肠中的吸收效果更好。

[0293] 在抗急性肝损伤试验中，本发明青黛饮片与原剂型饮片均能降低四氯化碳所致小鼠急性肝脏损伤模型动物ALT、AST，减轻病理性损伤，其中以本发明青黛饮片效果更佳；在原位胃灌注、原位肠灌注试验中，本发明青黛饮片的靛蓝及靛玉红在大鼠的胃及十二指肠中的吸收率均高于原剂型饮片，结果表明：与青黛原剂型饮片相比，本发明青黛饮片的吸收效果更好。

[0294] 综上所述，本发明青黛饮片改善了有效成分的溶解性，提高了药物的吸收率，能够发挥比原剂型饮片更好的治疗效果，为临床提供了一种新的用药选择。